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CUESTIONARIO 7 (TINCIONES)

1. Describa los dos tipos generales de fijacin e indique Cul empleara para bacterias y para protozoarios? Las dos principales formas de fijacin son por calor, donde se realiza una fina extensin de una gota de muestra liquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire, despus, la preparacin se pasa rpidamente por la flama de un mechero, el calor mata a la clula y la adhiere al portaobjetos. La otra forma, la otra forma es la qumica, la cual no daa demasiado al microorganismo y se realiza aadiendo una gota de fijador a la muestra, una gota de cido oxlico, formaldehido. As entonces la empleada para bacterias es la fijacin por calor mientras que para los protozoarios la fijacin qumica. 2. Porque hay que esperar que los colorantes bsicos sean ms eficaces en condiciones alcalinas? Si hablamos un poco sobre las propiedades de la membrana en microorganismos, pensemos que la carga exterior de la clula es positiva ya que se encuentran protones en el exterior de ella misma para poder realizar el intercambio de sustancias que requiere el microorganismo para su funcionamiento, mientras que en el interior se encuentra una carga negativa por OH- disociados as como grupos fosfato en el medio interno de la clula; un colorante bsico tiene una carga positiva y en efecto requiere de condiciones bsicas para poder funcionar ya que al disminuir la acidez (hacia medio bsico) aumenta la carga negativa momentneamente al exterior de la clula por lo que aumenta la atraccin de la membrana por la apetencia de colorantes bsicos as como el interior. Cabe mencionar que las clulas bacterianas son abundantes en cidos nucledos, los cuales portan cargas negativas en forma de grupo fosfato; stos se combinan con colorantes bsicos de carga (+). Los colorantes cidos no tien a la clula bacteriana y, por tanto, pueden utilizarse para teir al fondo con un color de contraste. 3. De tres ejemplos de colorantes bsicos, cidos y neutros. Entre los bsicos podemos tener: la safranina, la fucsina bsica y el cristal violeta. Entre los cidos podemos tener: la eosina, la fucsina cida y el rojo congo. En los neutros: tenemos el colorante de Romanosky. 4. De las tinciones empleadas en la practica e identifique cual es el colorante primario, el secundario o mordente usado en cada una de ellas. En la tincin de gram se tiene: que el colorante primario es el cristal violeta, el colorante secundario es la safranina mientras que el mordente es el lugol. En la tincin de Ziehl-Neelsen: el colorante primario es la fucsina, mientras que el colorante secundario es un color de contraste de preferencia de color azul. Tincin de esporas: el colorante primario es el verde de malaquita y el colorante secundario es la safranina. Tcnica de rojo congo: el colorante primario es el rojo congo mientras y el mordente de capsula. Coloracin de grnulos metalocromicos: el colorante primario es el colorante de Albert y el mordente es el lugol. 5. Mtodo alternativo de Ziehl-Neelsen 1. Se cubre el portaobjetos con la muestra celular bacteriana en solucin de carbofucsina 2. se tie durante 30 min aproximadamente. 3. Se lava con agua y posteriormente se agrega H2SO4 al 20% hasta que la pelcula sea amarilla. 4. se realiza un tratamiento con alcohol al 95% por 2 min y se lava con agua. 5. se realiza una tincin de contraste con azul de metileno por 30 seg. , se lava y se deja secar. 6. Que sustancias suelen usarse como mordentes? y de 3 ejemplos Son sustancias que aumentan la afinidad o la atraccin entre la clula y el colorante que por lo general forman complejos ejemplos bsicos son: cidos, bases, sales metlicas y lugol.

7. Indique el mtodo usado para tincin de flagelos. Tambin se le denomina la tincin de Lefson por su descubridor; primero el frotiz se deja secar al aire sin calentamiento para evitar la desproteinizacin del flagelo (flagelina), se fija qumicamente la suspensin bacteriana mediante formol y se realiza una extensin en el porta, posteriormente se cubre la preparacin con una mezcla de cido frmico y el colorante rosa-anilina. La accin del cido es que a los flagelos los engrasa y engruesa mediante que el colorante rosa-anilina los tie ya que se precipita y se deposita en los flagelos, por ltimo se deja secar al aire. 8. Que son los grnulos meta-cromticos, que otros nombres reciben y que colorantes se usan para la
tincin?

Las bacterias comnmente almacenan materiales de reserva en forma de grnulos insolubles depositados como polmeros neutros y osmticamente inertes, los grnulos se usan como fuente de carbono cuando se restablece la sntesis de protenas y del cido nucleico, tambin muchas bacterias acumulan grnulos de polifosfatos las cuales son reservas de fosforo inorgnico que puede emplearse en la sntesis de ATP. Estos grnulos se conocen a veces como grnulos de volutina o grnulos metalocromaticos debido a que se tien de rojo con un colorante azul, son caractersticos de las corinebacterias. Los colorantes que se utilizan son tionina, cristal violeta, violeta de metilo, safranina, fucsina bsica etc.

9. A que se le conoce como tincin negativa y porque recibe ese nombre? Tambin llamada como tincin de capsula, de tinta china rojo congo; como uno de sus nombres los indica es un tincin para observar la capsula de algunos microorganismos, en esta tincin especial se tie todo aquel material que no es la capsula del microorganismo, quedando un campo negro alrededor de la transparente capsula (en el caso de la tcnica con tinta china) ya que la capsula se encuentra compuesta por ciertos mucopolisacaridos que son impermeables y no se tien con estos compuestos. Estos colorantes usados en la tcnica son suspensiones por no estar totalmente solubilizados (como la tinta china). Se le llama negativa por el simple hecho de parecerse a un negativo de las fotos caseras, en la que la persona se ve transparente, mientras que todo el campo exterior de la persona se observa obscuro.
10. Indique como se realiza el mtodo de tinta china para observar la capsula. Se realiza una preparacin en fresco del microorganismo, se aade posteriormente tinta china, las partculas de carbn de la tinta china no pueden teir la capsula por tener mucopolisacaridos impermeables de manera de que solo se obscurece el fondo. Al observar en el microscopio se observan los microorganismos como zonas claras alrededor de la misma.

Qu es una tincin? -Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos biolgicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. -Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o incluso para resaltar organelos dentro de clulas individuales. -Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Las dos principales formas de fijacin son por calor, donde se realiza una fina extensin de una gota de muestra liquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire, despus, la preparacin se pasa rpidamente por la flama de un mechero, el calor mata a la clula y la adhiere al portaobjetos. La otra forma es la qumica, la cual no daa demasiado al microorganismo y se realiza aadiendo una gota de fijador a la muestra, una gota de cidos, formaldehido y alcoholes. As entonces la empleada para bacterias es la fijacin por calor mientras que para los protozoarios la fijacin qumica. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. -Los colorantes son sales compuestas por un in positivo y un in negativo, uno de los cuales est coloreado y se conoce como cromfero, el color de los denominados colorantes bsicos est en el in positivo (tien componentes cidos) (Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina), en los colorantes cidos est en el in negativo (tien componentes bsicos) (. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo) y los neutros son sales compuestas de un colorante cido y uno bsico (colorante de Romanosky). -Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico y lugol. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar el colorante. -Parte auxcroma (reactiva), es responsable, en primer lugar del tipo y velocidad de reaccin entre la fibra celulsica y el colorante. -Tincin simple son aquellas que utilizan un solo colorante y tienen por misin poner en evidencia la morfologa bacteriana. Adecuada para la observacin y /o recopilacin microbiolgica general. -Tincin diferencial. La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas pero no tiene efecto sobre las clulas que an retienen el colorante primario. - La reaccin de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoico. El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico

es muy difcil de remover. Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de lipopolisacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se aade, las clulas Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tincin, las clulas Gram positivas sern del color del cristal violeta, o colorante primario, y las clulas Gram negativas sern del color de la safranina que es el colorante de contraste. 1. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar. 2. Aadir 1 2 gotas de cristal violeta a la preparacin, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. 3. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparacin con la pzeta sobre el recipiente de plstico para tinciones. 4. Agregar 1 2 gotas de solucin lugol a la preparacin, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, lava. 5. Con cuidado, aadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparacin durante 10 segundos. 6. Aadir el colorante de contraste, safranina (1 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. Lava con la pizeta. 7. Dejar secar al aire y observar al microscopio. -Tincin de Ziehl-Neelsen Coloracin diferencial til en la identificacin de Micobacterias aunque no permite la diferenciacin de distintas especies. La caracterstica de cido-resistencia de estos microorganismos hacen de esta coloracin un mtodo rpido en el diagnstico, presuntivo, de infeccin micobacteriana. Sin embargo, debe subrayarse que es un diagnstico presuntivo puesto que la falta de bacilos cido-resistentes en la coloracin no excluye la presencia de estos. (Los microorganismos teidos con el primer colorante rosa o rojo son los cidos resistentes, presuntivamente micobacterias. Los otros organismos o clulas de la tincin son de color azul.) 1. La muestra puede extenderse directamente en el portaobjetos o bien concentrarla y examinar el sedimento. 2. Se prepara el frotis de forma habitual y se fija por calor o con alcohol metlico. El portaobjetos que debe contener la preparacin debe ser nuevo o extremadamente limpio. 3. Cubrir la preparacin con Fucsina Bsica Fenicada solucin segn Ziehl y calentar hasta observar emisiones de vapor pero evitando ebullicin. Mantener caliente la preparacin (10-15 minutos). 4. Lavar con agua. 5. Decolorar con Alcohol-Clorhdrico 8:2 durante 1 minuto aproximadamente o bien hasta que ya no aparezca un color rojo, a continuacin lavar con agua. 6. Se realiza una tincin de contraste con Azul de Metileno Fenicado (3-4 minutos). 7. Lavar de nuevo con agua, secar al aire y observar con objetivo de inmersin. -Tincin de SCHAEFFER-FULTON (tincin de esporas). Se utiliza en la identificacin de especies esporuladas, principalmente en la identificacin de bacilos Grampositivos anaerobios. (Las esporas se tien de color verde y el resto del microorganismo queda teido de color rosa o rojo).

1. La muestra puede extenderse directamente en el portaobjetos o bien concentrarla y examinar el sedimento. 2. Se prepara el frotis de forma habitual y se fija por calor. 3. Cubrir la preparacin con el colorante Verde de Malaquita (solucin acuosa al 7,6%) y calentar de forma que el disolvente del colorante se evapore. 4. Lavar con agua. 5. Se realiza una tincin de contraste con safranina O solucin segn Gram-Hucker durante 1 minuto aproximadamente. 6. Lavar de nuevo con agua, secar al aire y observar. -tincin de rojo congo. Utilizada para la identificacin de K.pneumoniae, ya que al igual que la tincin de tinta china, el colorante ser el nico que pueda penetrar al cuerpo del bacilo sin lograr teir la cpsula. (el bacilo se observar de color rojo y la cpsula como un halo transparente). 1. colocar una gota de rojo congo en un portaobjetos. 2. Hacer una suspensin con la cepa, fijar. 3. adicionar mordiente de cpsula por 3 minutos. 4. Secar y observar. -Tinta china. Se usa ampliamente para poder llevar a cabo la observacin de la presencia o ausencia de cpsula. Ya que el color de la tinta china es negro esto nos va a permitir la penetracin del colorante en ella as que ser la nica parte del m.o. no teido. (La cpsula se observar como una zona transparente alrededor del m.o. que se teir de negro). 1. En un portaobjetos poner una pequea muestra, una gota de tinta china y un cubreobjetos, observar en seco fuerte con lente de inmersin. -Los preparados bacterianos incoloros contra un fondo coloreado se denomina tincin negativa, una tcnica valiosa para la observacin de formas generales, tamaos y las cpsulas celulares. Las distorsiones del tamao y forma de las clulas disminuyen al mnimo porque no se requiere la fijacin y las clulas no captan el colorante. -Tincin de Loeffler. Se usa para poder llevar a cabo la diferenciacin del gnero Corynebacterium por medio de la presencia de los grnulos metacromticos con ayuda del colorante de Loeffler. (Los grnulos toman el colorante rpidamente y aparecen de color azul intenso, si se sobreti disminuye el contraste con el citoplasma). 1. Cubrir el frotis de azul de metileno y dejarlos durante 1 minuto. 2. Lavar con agua y dejar secar; observar la preparacin. Tinciones Estructurales Estructura Flagelos Esporas Cpsula Corpsculos Grnulos Metacromticos Tincin Mtodo de Fontana-Tribondeau Mtodo de Leifson Mtodo de Moeller Mtodo de Wirtz-Conklin Schaeffer-Fulton Mtodo de Hiss Mtodo de la Tinta china Rojo congo Mtodo de Albert Mtodo de Loeffler