TRABAJO PRCTICO N 7: PROBLEMAS DE CINTICA ENZIMTICA

Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cintica enzimtica, tanto de las
clases tericas como de los prcticos de enzimologa 1, 2 e isoenzimas. Asimismo,
deben practicar la resolucin de problemas. Los que se incluyen en esta gua son
algunos ejemplos resueltos que se discutirn en clase prctica, pero se sugiere la
resolucin de los otros problemas propuestos en la gua y la interpretacin de los
grficos resultantes de los prcticos anteriores.
Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolucin de
problemas.
Problema 1:
1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparicin se mide
cada 30 seg. durante 3 min. Se prepar en tubos de ensayo una serie de seis tubos con
1.5 g de enzima (peso mol 30,000) aadindose un mismo volumen de disolucin de
sustrato a distintas concentraciones. Los resultados estn resumidos en la tabla.
Cules son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentracin de
sustrato?
Tiempo (min)
0

0.5
1
1.5
2.0
2.5
3
Conc. Inicial
(moles ml-1)

S
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.0

S
0.49
1.05
1.66
2.23
2.81
3.40
2.32

S
0.71
1.52
2.36
3.18
4.00
4.55

Sustrato transformado (mol)

3
4
S
S
1.10
1.36
2.24
2.74
3.48
12.66
38.50

S
1.45
3.00
200.00

Solucin: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolucin

testigo (0S) en el tiempo correspondiente.
1

S
0.4
9
0.9
5
1.4
6
1.9
3
2.4
1
2.9

S
0.7
1
1.4
2
2.1
6
2.8
8

S
1.3
6
2.6
4

3.6
-

1.1
2.1
4
3.2
8

1.45
2.90

Paso 2. Representar moles de sustrato transformado para cada concentracin frente al

tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos.
1

Sustrato transformado (mol)

4
5

S
3

Tiempo (minutos)
De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada
concentracin de sustrato en el tramo lineal de cada curva. Estos valores sern las pendientes
de las porciones lineales y sern tambin las velocidades iniciales.
[1S]
2.32
2
[ S]
4.55
3
[ S] 12.66
[4S] 38.50
[5S] 200.00

x
x
x
x
x

10-3 M
10-3 M
10-3 M
10-3 M
10-3 M

V= 0.95 mol min-1

2
V= 1.44 mol min-1
3
V= 2.31 mol min-1
4
V= 2.64 mol min-1
5
V= 2.90 mol min-1

Velocidad inicial (mol min-1)

Estos valores se representan unos frente a otros

Conc. Sustrato (M x 103)

Problema 2:
v0 = Vmx [S]
Km + [S]
Utilizando la ecuacin de Micaelis-Menten, calcular el cambio en la [S] necesaria para
aumentar la velocidad de una reaccin del 10 al 90 % de la velocidad mxima.
SOLUCIN
Poniendo v0 = 0,1 Vmx
Entonces

[S]
= 0,1
Km + [S]
[S] = (Km + [S]) . 0,1
[S] = 0,1 Km + 0,1 [S]
[S] - 0,1 [S] = 0,1 Km
0,9 [S] = 0,1 Km
9 [S] = Km

Es decir,
Poniendo
entonces

[S] = Km / 9
v0 = 0,9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km,
[S]90% = 9 Km = 81
[S]10%
Km/9

Es decir, se debe aumentar la [S] 81 veces.

Problema 3:
Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reaccin catalizada
por una enzima hipottica son:
[S] (moles/l) V (moles/min)
5x10-2
0.25
5x10-3
0.25
-4
5x10
0.25
5x10-5
0.20
-6
5x10
0.071
5x10-7
0.0096
a) Cul es la velocidad mxima para esta reaccin?
b) Por qu la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M
c) Cul es la concentracin de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M?
d) Cul es la Km de la enzima?
e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6
3

y [S]=1x10-1
f) Calcular la concentracin de producto formado en los cinco primeros minutos de reaccin
utilizando 10 ml de una disolucin de sustrato 2x10-3 M.
SOLUCIN
a) Vmax = 0.25 mol/min, ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta.
b) Porque todos los enzimas est ocupados transformando un sustrato.
c) Cero, todos los enzimas ocupados, a esa [S] se da la Vmax.
d) Empleando la ecuacin de Michaelis, utilizando la velocidad 0.20, 0.070 0.0096 y sus
correspondientes [S], como sabemos la Vmax, obtenemos una Km 0 1,25 x 10-5 moles/l.
e) Sabiendo la Km y Vmax, aplicamos Michaelis utilizando esas [S], y
obtenemos: V = 0,018 mol/min y V = 0,25 mol/min.
f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0,25 mol/min. En 5 min 0,25 x 5 = 1,25 mol. Tenemos 10 ml
de sustrato, luego 1,25 mol / 10-2 l = 1,25 x 102 mol/l

Problema 4:
Se estudi la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la reaccin:
CO(NH2)2+H2O <=> CO2+2NH2
en funcin de la concentracin de urea, con los resultados siguientes:
Concentracin de urea (mmoles dm-3)
30
-1
-1
V inicial (mmoles urea consumidos min mg enzima ) 3,37

60
5,53

100
7,42

150
8,94

250
10,70

400
12,04

Cules son los valores de Km y Vmx para esta reaccin?

SOLUCIN
Los datos se ordenan en la forma adecuada para una grfica lineal (por ejemplo, 1/V inicial
frente a 1/[S], aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro
estudio). La grfica de la doble inversa se indica en la Figura. De la grfica se puede calcular
que Km es 105 mmoles dm-3 y la Vmx es 15,2 mmoles urea consumidos mg-1 min-1. Observar
la distribucin de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la
concentracin de sustrato al planificar un experimento.

-1

1/Vinicial (mg min mmoles )

0.30

0.24

0.18

0.12

0.06

0.00
0.00

0.01

0.02
3

0.03

0.04

-1

1/[urea] (dm mmoles )

Ejemplo resuelto de acuerdo con el mtodo de doble inversa o de Lineweaver-Burk.

Problema 5:
4

Se investig el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reaccin catalizada

enzimticamente sobre un solo sustrato, obtenindose los siguientes resultados
Concentracin de sustrato
(mmol L -1)

Concentracin del inhibidor

(mmol L -1)
0
0.5
1.0
Velocidad de reaccin 0 (mol L -1 min-1)

0.05
0.10
0.20
0.40
0.50

0.33
0.50
0.67
0.80
0.83

0.20
0.33
0.50
0.67
0.71

0.14
0.25
0.40
0.57
0.63

A) De que manera acta el inhibidor? B) Obtngase los valores para Vmx, y Km.
SOLUCIN
A) La manera ms sencilla de deducir cmo acta un inhibidor es graficar 1/0 en funcin de
1/[S]0 para cada concentracin del inhibidor.
8

1/ 0 ( mol L -1 min-1 )

7
6

0.5

[I ] 0 (mmol L-1)
[I ] 0,5 (mmol L-1)

1/Vmx

[I ] 1,0 (mmol L-1)

2
1
0
-15

-10

-1/Km

-5

10

15

20

25

-1 -1

1/[S] 0 [(mmol L ) ]

Grfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor

A partir de la grfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los
cambios en la concentracin del inhibidor pero no la interseccin en el eje 1/0 (1/Vmax). Por
ello los datos anteriores indican que el inhibidor I est actuando como un inhibidor
competitivo.
B) De la interseccin en el eje 1/0 se puede estimar Vmax= 1(mol L -1 min-1) y de la
interseccin con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0,1 (mmol L -1) sin ihnhibidor, Km=0,2(mmol
L -1) con 0.5(mmol L -1) de inhibidor y Km=0,3 (mmol L -1) con 1(mmol L-1)
5

Problema 6:

A partir de los siguientes datos de una reaccin enzimtica, determinar de que manera est
actuando el inhibidor. Determinar la Km y la velocidad mxima.
[S] mM g producto/h
g producto/h
(sin inhibidor)
(6 mM inhibidor)
2
139
88
3
179
121
4
213
149
10
313
257
15
370
313
SOLUCIN
Se calculan los inversos de [S] y de v, producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se
representa. Sin inhibidor: Vmax = 0,5x103 g/h y Km = 5 mM. Con inhibidor: Vmax es la
misma y Km=9 mM.
PROBLEMAS PARA RESOLVER
Problema 7:
Calcular qu velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la velocidad mxima es igual a 100 y
la concentracin de sustrato es a) 10 Km b) Km/3.
Sol.: a) 91 %; b) 25%
Problema 8:
Una enzima cuya Km es 2,4 10 -4 M se ensaya con una concentracin de sustrato de 210 -7 M. Si la
velocidad media para esta reaccin con una concentracin de sustrato de 510 -2 M fue 0.128
mmoles/min, calcular la velocidad inicial en el caso anterior.
Sol.: 0.107 mol/min
Problema 9:
Se detect actividad de una determinada enzima en extractos de hgado y cerebro. Para dilucidar si la
actividad detectada era atribuible a la misma enzima presente en ambos rganos, o a especies distintas
de la enzima propias de cada rgano, se llevaron a cabo estudios cinticos con distintos sustratos. Uno
de los sustratos, ensayado siempre bajo idnticas condiciones en 1 ml de volumen total incluyendo 0,1
ml de extractos de cada rgano, result ser transformado a las siguientes velocidades iniciales:
Concentracin de sustrato
Velocidad (moles/min)
(moles/ml)
Hgado
Cerebro
1
0,14
0,085
2
0,23
0,14
5
0,39
0,23
10
0,50
0,30
Den las caractersticas de la enzima que puedan ser determinadas a partir de estos datos, y mustrese
cules de ellas son de inters en relacin con la cuestin de la identidad de las dos enzimas.
Sol.: los valores de Km son los mismos
Problema 10:
La fructosa difosfatasa (que cataliza la hidrlisis de la fructosa difosfato a fructosa-6-fosfato y fosfato)
es inhibida por AMP. Los siguientes datos se obtuvieron a partir de un estudio de la enzima del hgado
de rata:
FDP (moles ml-1)
4
6
10
20
40

AMP (moles ml-1)

Velocidad inicial (moles ml-1 min-1)

0
0,059
0,076
0,101
0,125
0,150
8
0,034
0,043
0,056
0,071
0,083
Comentar estos resultados en relacin a las constantes cinticas en cada caso.
Sol.: Km 8 moles ml-1; Vmx sin inhibidor 0.185 moles ml-1 min-1; Vmx con inhibidor 0.102
moles ml-1 min-1

0,010
0,008

Km (M)

Problema 11:
Una determinada enzima cataliza la reaccin A
B. Se ha observado previamente que la Vmx de
esta reaccin no vara dentro de un rango de pH
entre 5 y 9: Vmx= 100 moles/min/g de enzima.
Por otra parte, la Km vara segn se muestra en esta
figura:
El ensayo fue realizado en presencia de 0,01 M
sustrato, y 1 g de enzima, en cada uno de los
bufferes. Qu velocidad inicial se esperara para pH
5.5 y 8? Explique.
Sol.: Para pH 5.5: 50 moles/min/g de enzima
Para pH 8: 100 moles/min/g de enzima

0,006
0,004
0,002
0,000
5

pH

Problema 12:

Habindose conseguido aislar de Salmonella typhimurium una enzima (E) que cataliza la
reaccin AP, se decidi hacer un estudio estructural y cintico de dicha enzima:
[A] mM
1,00 0,55 0,25 0,20
V(mmol P/ min)
1,00 0,71 0,50 0,41
V (nmol P/min) con J
0,66 0,41 0,25 0,20
donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar. [J] = 0,25mM.
a) Calcular la Km de la enzima estudiada para A, y Vmax para la transformacin A--P en
presencia de E.
b) Que tipo de inhibidor es J?
c) Cul sera el efecto sobre la Vmax de la enzima, un aumento de la concentracin de J?
Solucin: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4
a) Vmax = Vmax = 1.66 mmol P/min
b) KM = 0.5 mM
c) KM = 1.25 mM (con inhibidor) (Inhibicin Competitiva)
Problema 13

La cintica de una enzima viene determinada como funcin de la concentracin de sustrato en

presencia y ausencia del inhibidor I.
[S], Mx10-5
0.3
0.5
1.0
V(mol/min) sin inhibidor
10.4
14.5
22.5
V(mol/min) con inhibidor 10-4 M
2.1
2.9
4.5
a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor
b) Que tipo de inhibidor es?

3.0
33.8
6.8

9.0
40.5
8.1

Solucin: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4

a) Vmax = 50 mol/min
b) Vmax = 9.5 mol/min
c) KM = 1.1x10-5 M
7

d) Inh. No Competitiva
Problema 14

Qu relacin numrica existe entre Km y [S] cuando una reaccin enzimtica alcanza el 87
% de la Vmax?
Problema 15

100 ug de una enzima a 25 C descomponen en 10 min el 1% de un sustrato 0,1 M. La misma

cantidad de enzima descompone en 1 min el 10% de un sustrato 10 -3 M. Calular Vmax y
ctividad especfica de la enzima.
Problema 16

Una enzima se ensayo con una [S] inicial de 2.10 -5 M. en 6 min la mitad del sustrato haba
reaccionado. Si la Km para el sustrato es 5x10 -3 M, calcular la Vmax y la cantidad de
producto formado en 10 min de reaccin.
Problema 17

Una enzima cataliza una reaccin con una velocidad mxima de 5 moles por minuto, siendo
su Km para el sustrato de 0.5 mM. Si la ponemos en presencia de una concentracin 500 mM
de sustrato. Qu cantidad de sustrato se lograr transformar en 10 min?
Problema 18

La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10 -2 M. Si la

concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de 59.8 g/ml, Qu proporcin de
enzima estar libre y que proporcin estar combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol).
Problema 19

Calcular que velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la velocidad mxima es

igual a 100 y la concentracin de sustrato es igual a) 10 Km y b) Km/3.
Problema 20

Una enzima cataliza una reaccin a una velocidad de 35moles/min cuando la concentracin
de sustrato es 0.01M. La KM para el sustrato es 2x10 -5 M. Cul ser la velocidad inicial a las
concentraciones de sustrato: a) 3.5x10-3 M, b)4x10-4 M, c) 2x10-4 M, d) 2x10-6 M y e) 1.2x10-6
M?
Problema 21

Calcular Km y Vmax de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representacin de
Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1, y que la pendiente de
dicha recta es 120 min/L.
Problema 22

Una reaccin enzimtica se lleva a cabo a diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y

presencia de dos inhibidores diferentes: [Ia] = [Ib] = 1.5 mM. La siguiente tabla muestra los
datos obtenidos:
[S] (mM)
v (mol/min)
v (Ia) (mol/min)
v(Ib)
(mol/min)
0.2
0.4
0.8
1.6
3.2

1.67
2.86
4.44
6.15
7.62

0.63
1.18
2.1
3.48
5.16

0.83
1.43
2.22
3.08
3.81
8

a) determinar todos los parmetros cinticos de la enzima.

b) Qu tipo de inhibidor es Ia e Ib?
Problema 23

25 L de una preparacin de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reaccin

estndar de 1 mL y a temperatura y pH ptimos, pero con distintas concentraciones iniciales
de sustrato obtenindose las velocidades iniciales que se indican
[S] x10-3 (mM)
v (nmol/min)

303
120

149
98

128
92.6

100
83.3

80
74.6

Determine la Km y Vmax y exprese tambin la cantidad de enzima en UI/mL.

Problema 24

La descarboxilacin enzimtica de -cetocido procede con las velocidades iniciales para las
concentraciones que se citan:
[cetocido] (mM)
2.500
v (mol CO2/2 min)
0.588
Determine la Km y Vmax.

1.000
0.500

0.714
0.417

0.526
0.370

0.250
0.252

Problema 25

Qu informacin puede obtenerse a partir de una representacin grfica del mtodo de

Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida, convenientemente extrapolada, corta el eje de
las abscisas en -40 Litros/mol?
Problema 26

La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10 -2 M. Si la

concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de 59.8 g/ml, Qu proporcin de
enzima estar libre y que proporcin estar combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol)