CLNICA

MORFOLOGA CITOQUMICA

DIAGNSTICO

CITOMETRA DE FLUJO

CITOGENTICA + FISH BIOLOGA MOLECULAR

CLASIFICACIONES Y SU EVOLUCION
INMUNOFENOTIPO
MORFOLOGIA CELULAR 1986 BIOLOGIA MOLECULAR 2001

+
CITOQUIMICA

FAB
1976

MIC

REAL
1999

OMS OMS
2008

GENETICA

Definicin ICD Epidemiologa Etiologa Compromiso Clnica Morfologa Variantes morfolgicas Cito/histoqumica Inmunofenotipo Gentica y Biologa molecular Factores pronsticos y predictivos Terapia

COMPARTIMENTOS CELULARES

MEMBRANA CELULAR :
>CDs

CITOPLASMA : MPO,
CD79a, Ig, CD22, CD3

NCLEO : TdT

CARACTERIZACIN INMUNOFENOTPICA DE LAS CLULAS

QU

CARACTERIZA A LAS CLULAS NORMALES ?

Expresin del linaje celular y estado de maduracin.

EN QU DIFIEREN LAS ANORMALES ?

Reflejan desarreglos de expresin proteica con fenotipos aberrantes con o sin anomalas genticas asociadas

Intensidad fluorescente anormal por Ac Ausencia o sobreexpresin de Ac Expresin asincrnica madurativa Maduracin/compartimento biolgico Curva de maduracin anormal Expresin antignica de varios linajes

-LMA M0 -LMA M7 -LA bifenotpicas, LA bilineales

-Clulas dendrticas. Mastocitos.

Mdula sea Sangre perifrica Lquidos corporales (cavidades,lavados) Tejidos slidos (piel, ganglios linfticos, otros)

Recepcin: datos clnicos y dx. presuntivo Lisado glbulos rojos no nucleados (muestras hematolgicas) Lavado y filtrado (muestras no hematolgicas) Aplicacin de Ac : paneles (fases) Adquisicin y almacenamiento de data Anlisis e interpretacin Impresin e informe

MDULA SEA NORMAL

Eosinfilos

Neutrfilos
Monocitos CD34+ HPC Rojos nucleados Linfocitos

DISTRIBUCIN DE POBLACIONES EN MDULA SEA NORMAL

SUBPOBLACIONES MO % NORMAL MO % CD34+ 1.1 0.6 (0.3-2.6) % CD34+ y/o CD117+ 2.2 1.4 (0.6-6) % Eritroide 4.7 2.1 (2-9) % Neutrfilos 67 6.1 (57-80) % Monocitos 4.3 1.4 (2-6.5) % Eosinfilos 2.5 1.3 (0.8-5) % Basfilos 0.4 0.7 (<0.1-2.4) % Mastocitos 0.02 0.01 (<0.03) % Plasmticas 0.2 0.2 (0.01-0.5) % Linfocitos B maduros 2.9 1.5 (1.6-6.3) % Linfocitos B precursores 0.9 1.5 (0.1-3.9) % Linfocitos T 9.2 4.5 (2.6-18) % Linfocitos NK 2.8 1.4 (0.7-5)

HEMATOPOYESIS
T-lymphocytes B-lymphocytes NK-cells Plasmacytoid DC Lymphoid precursor

Stem cell

Myeloid precursor

Erythroid cells Megakaryocytic cells Neutrophils Monocytes Monocytic DC Eosinophils Basophils Mast cells Myeloid DC

INMUNOFENOTIPO DE PRECURSORAS B NORMALES - MDULA SEA

CD38
CD34 TdT CD45 CD10

SmIgM

CyIg M

CD22
I

CD19
II

CD20
III IV

ORIGEN Y MADURACION : LINFOCITOS B

HLA-DR

Td T

34

Stem Cell

HLA-DR

19

79a

Td T

Pro B
MEDULA OSEA : PRECURSOR

34 HLA-DR 79a
Td T

19 10

B Com n
19
Td T

B Madura
HLA-DR 79a 19 SmIg

34

20 HLA-DR 79a

CyIgM

Pre B

20

10

20

Linf B Na ve circulante

SANGRE GANGLIO L. BAZO, OTROS: PERIFERICO

ORIGEN Y MADURACION : LINFOCITOS T

34

Stem Cell
3 TdT

BONE MARROW

34

Pro T

7 2

LINEAGE
2

3 7

TdT

LINEAGE
CORTEZA

Doble Negative 5%

3 7 2 3 7 2 1 7 TdT

TdT

Early Cortica Thymocyte

Early Thymoc Common yteThymocyte 2

5 1 5 4 3 8 7 2 8 5 3 7 8 7 2 2 5 3 7 3 TdT 4 8 7 2

Doble Positive 80%

l Thimoc yte
(10% )
2 7 2 7

Mature Mature Thymocyte

3 4 5 3 4

Thymoc yte

HELPER

CITO/SUPPRESSOR

CITOTOXIC

MEDULA

(5% )

T H Y M U S

- P.B.
- LYMPH NODE - SPLEEN

MADURACIN GRANULOCTICA

MIELOBLASTO

PROMIELOCITO

MIELOCITO

METAMIELOCITO SEGMENTADO

CD13

103
CD117

102

CD33 CD15
CD11b CD16 CD65

101

CD34

HLA-DR

CD10

(Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

MADURACIN MONOCTICA

MONOBLASTO

PROMONOCITO

MONOCITO

103 HLA-DR CD33 102

CD13
CD15 CD36 CD11b

101 CD117 CD34 CD11c CD14

(Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

MADURACIN ERITROIDE

PROERITROBLASTO

ERITROBLASTO

HEMATE

103 CD71

Glicoforina A
CD34 102 CD117 HLA-DR 101 CD45

(Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

MADURACIN MEGACARIOCTICA

INMADURO

MADURO

103

102 CD34 HLA-DR

CD36 CD41 CD42 CD61 CD117

101

(Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

P Lucio, G Gaipa et al., Leukemia, 2001, 15: 1185-1192

P Lucio, G Gaipa et al., Leukemia, 2001, 15: 1185-1192

P Lucio, G Gaipa et al., Leukemia, 2001, 15: 1185-1192

P Lucio, G Gaipa et al., Leukemia, 2001, 15: 1185-1192

COMBINACIONES X 4 FL
FITC
cCont. nTdt cCD3 CD19 CD20 sCont. HLADR HLADR CD11b CD15 CD36 CD33 CD71 CD2

PE
cCont. cMPO CD7 cCD79a CD10 sCont. CD117 CD123 CD13 CD16 CD64 CD61 GphA CD56

PerCP/Cy5.5
CD45 CD45 CD45 CD45 CD19 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45

APC
CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD10 CD14 CD34 CD34 CD34

PANEL INICIAL

FITC

PE

PerCP

APC

Control
CD4 CD16 CD20 CD34

Control
CD8 CD19 CD10 CD33

Control
CD3 CD3 CD19 HLA-DR CD45 CD34 CD45

CD2
CD36 CD15 CD61

CD5
CD13 CD117 CD34

CD7
CD45 CD34 CD45 CD34 CD45

LINAJE T Y NK TCR / CD3 (Sm,Cy)

LINAJE B

MIELOIDE

INMADUREZ

CD79a , MPO CD33, TdT, CD34, Ig M, CD22 CD13 CD117, Ig D, Ig A, Lisozima Ig G, k, l

CD1a, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8,

CD10, CD19 CD14, CD15, CD38 CD20, CD11c CD16, HLA-DR CD25, FMC7 CD64,CD11b CD103 CD56, CD57 Gly-A, CD71, CD16 CD41a ,CD61

EXPRESIN ANTGENICA

-Lnea granuloctica: CD11b, CD13, CD15, CD16, CD33, CD65, CD117, MPOc.

-Lnea monoctica: CD11b, CD11c, CD14, CD36, LISOZIMAc.

-Lnea eritroide: glicoforina A, CD71. -Lnea megacarioctica: CD41, CD42, CD61. -Lnea B: CD10, CD19, CD22, CD79ac. -Lnea T: CD2, CD3c, CD4, CD7.

-Lnea NK: CD16, CD56.

-Antgenos no especficos de lnea: 7.1, CD34, CD45, HLA-DR.

WHO 2008 - TUMORES HEMATOPOYTICOS Y LINFOIDES

MIELOIDES : - Neoplasias mieloproliferativas - Neoplasias mieloides y linfoides con eosinofilia y anormalidades de PDGFR - Neoplasias Mieloproliferativas y Mielodisplsico - SMD - Leucemias mieloides agudas y neoplasias precursoras relacionadas - Leucemias Agudas de Linaje Ambiguo

WHO 2008 - TUMORES HEMATOPOYTICOS Y LINFOIDES

LINFOIDES: - Neoplasias linfoides precursoras - Neoplasias maduras B - Neoplasias maduras T y NK - Linfoma Hodgkin - Desrdenes linfoproliferativos asociados a inmunodeficiencias - Neoplasias histiocticas y dendrticas

PAS

Fosfatase-cida

LLA Ph + t(9:22)(q34;q11.2)

LLA-B
CD19 cCD79a cCD22 CD10, CD22, CD24, TdT CD20,CD34,CD45 variable CD13,CD33 Ag asociados

LLA-T
cCD3, CD7 ,TdT, CD1a,CD2,CD3,CD4,CD5.CD8 CD10

CLASIFICACIN DE MADURACIN DE PRECURSORES LINFOIDES

Precursores B-ALL: CD79a+ CD19+ CD34+ o - B I pro-B (CD10-/IgM-/CD20-) - B II comn (CD10+/IgM-/CD20+) - B III pre-B (CD10+/CyIgM+/CD20+) - B IV madura (CD10-/SmIgM+/CD20+)
Precursor T-ALL: -TI (CD7+/CyCD3+) - T II (CD2+ y/o CD5+ y/o CD8+) - T III (CD1a+/CyCD3+) - T IV (CD1a-,SmCD3+)

LMA: CLASIFICACIN FAB

FAB M0 M1 M2

Leucemia Mieloblstica mnimamente diferenciada Mieloblstica sin maduracin Mieloblstica con maduracin

Serie Granuloctica Granuloctica Granuloctica

M3
M4 M5 M6 M7

Promieloctica
Mielomonoctica Monoblstica/monoctica Eritroide Megacarioblstica

Granuloctica
Granuloctica y monoctica Monoctica

Eritroblstica y granuloctica
Megacarioctica

LMA: CLASIFICACIN EGIL Lnea mielomonoctica: -MPO+, CD13+, CD33+, CD65+ y/o CD117+ (al menos dos marcadores positivos).

Lnea eritroide (M6): Inmaduro: inclasificable por marcadores. Maduro: Glicoforina A +.

Lnea megacarioctica (M7): CD41+ y/o CD61+ (de superficie o citoplasmticos); habitualmente CD34+, CD33+ y/o CD13+.

Mieloide (M0): Inmunofenotipo idntico a las de linaje mielomonoctico con citoqumica negativa para MPO y con antgenos especficos de lnea linfoide (CD3, CD79a, CD22) negativos.

LMA TdT+. LMA con marcadores linfoides (Ly+LMA).

LMA: CLASIFICACIN EGIL

Score 2

Linfoide B CD79ac IgMc CD22c

Linfoide T CD3 CD3c Anti-TCR CD2 CD5 CD8 CD10 TdT CD7

Mieloide MPO

CD19 CD20 CD10

CD117 CD13 CD33 CD65 CD14 CD15

0,5

TdT CD24

CD1a

CD64

Una puntuacin de 2,5 se considera suficiente para asignar linaje. CD79a puede ser tambin expresado en una subpoblacin de leucemia / linfoma linfoblstico T.

LMA: CLASIFICACIN MIC-M

Anomala cromosmica
t(8;21)(q22;q22) t(15;17)(q22;q21) inv(16)(p13;q22) / t(16;16)

Subtipo FAB Genes participantes

M2/M4 M3 M4-Eo eto / aml-1 pml / rar myh-11 / cbf

t(9;11)(p21-22;q23)
t(11;19)(q23;p13.1) t(11;19)(q23;p13.3 t(?;11)(?;q23) t(6;9)(q23;q34) t(8;16)(p11;p13) inv(3)(q21;q26) / t(3;3) t(1;3)(p36;q21) t(3;21)(q26;q22) t(9;22)(q34;q11) t(1;22)(p13;q13

M5

af-9 / hrx
mll / ell mll / enl

M4/M5 M2/M4 M5 M4

hrx dek / can moz / cbf evi-1 / evi-1 evi-1? / aml-1

M1 M7

abl /bcr

LMA: CLASIFICACIN OMS

LMA no clasificable en otra categora: - Leucemia mieloide aguda indiferenciada (M0)

- Leucemia mieloide aguda mnima maduracin (M1)

- Leucemia mieloide aguda con maduracin (M2) - Leucemia aguda mielomonoctica (M4) - Leucemia aguda monoctica (M5a y M5b) - Leucemia aguda eritroide (M6) - Leucemia aguda megacarioctica (M7) - Leucemia aguda con basofilia (M2 con basofilia)

- Panmielosis aguda con mielofibrosis

- Leucemias agudas bifenotpicas

LMA CON DIFERENCIACION MINIMA LMA MO

INMUNOFENOTIPO: Bajo SSC/FSC Marcadores mieloides positivos MPO-/+ CD13+ CD33-/+ CD117+ Marcadores linfoides negativos

Incidencia 2% - 7% MPO- por citoqumica <3%

SSC/FSC

LMA M0
CD45/SSC CD34/SSC CD117/SSC

CD13/SSC

CD33/SSC

LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA SIN MADURACION LMA M1

Incidencia 15% - 20% Blastos 90% C.N.E. MPO+ 3% por citoqumica

INMUNOFENOTIPO: No fenotipo caracterstico Bajo SSC/FSC MPO+ CD13+ CD34+ CD33+ CD15-/+ CD117+

LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA CON MADURACION LMA M2

Incidencia 10% Blastos 30% - 89% C.N.E. MPO+ >10% cel maduras linaje neutrofilico <20% cel linaje monocitico

INMUNOFENOTIPO: CD34-/+ MPO++ HLA-DR-/+ CD33+ CD117-/+ CD13+ CD15+/++ CD11b+

Dx.Dif: LMA sin Mad. AREB, LAMielomonoc.

LEUCEMIA AGUDA PROMIELOCITICA CON t(15,17)(q22;q12) LMA M3

Incidencia 5% - 15% CID Tipos: Hipergranular y Microgranular

FSC/SSC

INMUNOFENOTIPO: Alto SSC/FSC MPO++h CD13+ CD33+hom CD117+ CD34HLA-DRCD2-/+ (M3v) AUTOFLC.

LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA MIELOMONOCITICA LMA M4

Incidencia 15% - 20% Bl>20% incluye Promonocitos Neutrofilos >20% Monocitos>20%

INMUNOFENOTIPO:
Blastos: Bajo SSC/FSC CD33+ CD117+ Monocitos: CD34CD11b+ HLA-DR+ CD64+

CD13+ CD34+ CD11c+d

CD117CD11c++ CD14++

LMA M4
FSC/SSC CD45/SSC CD34/SSC

CD13/SSC

CD33/SSC

MPOc/SSC

CD11c/SSC

LEUCEMIA AGUDA MONOBLASTICA Y MONOCITICA LMA M5

Incidencia 15%

M5a

M5b

LMA M5
>80% linaje monocitico
INMUNOFENOTIPO: CD4 + CD11b CD64 CD36 + CD14 + LISOZIMAc + CD13,CD33,CD15, HLADR MPO+/- CD13/CD33 DxDif: LMA s/mad, LMAdif.min, LMMC,LPA
SSC/FSC
CD56/SSC

CD14/CD45

CD11c/CD15

CD2/CD117

LEUCEMIA ERITROIDE AGUDA LMA M6

Incidencia 4% - 5% L.E.Pura >80% L.Mieloide/Eritroide >50%prec.er. >20%mielobl.

SSC/CD45

CD71/CD45

CD34/CD45

GA/CD34

INMUNOFENOTIPO: Glicoforina A+ MPONeg CD71+ CD34+ CD36+

LEUCEMIA MEGACARIOCITICA AGUDA LMA M7

Muy infrecuente Morfologia indifer. >20% blastos c/50%megacariocitico

INMUNOFENOTIPO: FSC/SSC CD41+ CD42a+ CD42b+ CD61+ CD45- + MPO-

CD61/SSC

MPOc/SSC

CD41/SSC

CD61/SSC

Incidencia: < 3% de las LA

1.

Coexpresin de antgenos de dos ms lneas. Pob.separadas de blastos de mas de 1 linaje.

2.

LA bifenotpica (mieloide y linfoide T)

CORRELACIN CON ALTERACIONES CITOGENTICAS ESPECFICAS

Adaptado de Orfao et al. Cytometry Part A 58: 62-71 2004

LMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONSTICO

CD34 CD56 CD7

Blastos inmaduros Mal pronstico Localizacin extramedular (LPA) Mal pronstico en subgrupo de t(8;21) y t(15;17) Mal pronstico

LMA inmaduras (M0, M1 en relacin con citogentica de mal

pronstico) CD2 En LMA muy mal pronstico, excepto si hay inv(16): baja tasa de RC

CITOMETRA DE FLUJO

LNEA CELULAR ESTADIO MADURATIVO

EMR

FACTORES PRONSTICO

PERFIL INMUNOFENOTPICO

MORFOLOGA CITOQUMICA CITOGENTICA + FISH BIOLOGA MOLECULAR CLNICA

DIAGNSTICO INTEGRADO