CROMATOGRAFA

PRINCIPIOS Y APLICACIONES

Clara Prez Gonzlez Blanca Pinedo Martnez Beln San Romn Arenas M del Carmen Fernndez Palomar Elena Jimnez Daz Silvia de Juanes Seligmann

NDICE
Pgina 1. CONCEPTOS BSICOS DE CROMATOGRAFA .................................... 2. TIPOS DE CROMATOGRAFA ................................................................. 3. CROMATOGRAFA EN COLUMNA .......................................................... 4. CROMATOGRAFA PLANA ...................................................................... 4.1. Cromatografa en capa fina (TLC) .................................................... 4.2. Cromatografa en capa fina de alta resolucin (HPTLC) ................. 4.3. Cromatografa en papel .................................................................... 5. CROMATOGRFA DE ALTA RESOLUCIN ............................................ 5.1. Fundamentos y principios bsicos ................................................... 5.2. Instrumentacin ................................................................................ 5.3. Aplicaciones al anlisis de alimentos ............................................... 6. CROMATOGRAFA DE GASES ............................................................... 6.1. Fundamentos y principios bsicos ................................................... 6.2. . Componentes de un cromatgrafo de gases ................................. 6.3. Aplicaciones al anlisis de alimentos ............................................... 7. BIBLIOGRAFA ......................................................................................... 2 6 7 8 8 9 9 10 10 13 15 16 16 17 19 21

1. CONCEPTOS BSICOS DE CROMATOGRAFIA

La cromatografa es una de las tcnicas ms efectivas para separar e identificar los componentes qumicos. El mtodo fue desarrollado por el botnico ruso Mikhail Tswett, en 1906, que utiliz una columna de carbonato clcico para la separacin de pigmentos vegetales, llegando a la conclusin de que la clorofila no era un simple compuesto qumico. Las tcnicas cromatogrficas actuales tienen multitud de formas, la mayora de las cuales pueden ser automatizadas y estn adaptadas para el reparto de gran o pequea cantidad de sustancias, siendo separadas y purificadas. La separacin consiste en un proceso de competicin donde las molculas tendrn que elegir en que fase residen (estacionaria, no se mueve a lo largo del proceso de separacin, o mvil, lquida o gaseosa). stas diferencias a la hora de elegir son las que aprovechamos para su separacin. El factor de capacidad de un soluto (K) se define como el cociente del tiempo que el soluto permanece en la fase estacionaria y el que permanece en la fase mvil. En condiciones isocrticas equivale a la relacin de molculas que en un instante de tiempo se encuentran en fase mvil y en fase estacionaria. Es una medida de la retencin de los compuestos, siendo funcin de; La composicin del relleno de la columna La polaridad de la fase mvil Concentracin en fase A = Kd Concentracin en fase B Un cromatograma es la respuesta captada por un detector en funcin del tiempo de elucin o volumen. Consiste en una serie de picos que representan la elucin de los analitos individuales. El tiempo de retencin tR para cada analito tiene dos componentes. El primero es el tiempo que tarda la molcula de analito en pasar a travs de los espacios libres entre la matriz de la fase estacionaria. Este aspecto se refiere al volumen de la columna vaca, V0, y el tiempo que tarde en pasar a travs de ella, tM. El valor de tM debe ser el mismo para todos a los analitos y puede ser medido usando un soluto que no interaccione con la fase estacionaria y que simplemente gaste su tiempo de elucin en que la fase mvil recorra todo el volumen vaco. El segundo componente es el tiempo en el que el analito es retenido por la fase estacionaria, tR. Este tiempo es caracterstico de cada analito. Su valor que es el tiempo de retencin viene dado por: tR = tR - tM

El factor de capacidad, K es el parmetro ms importante en cromatografa. Es simplemente el tiempo adicional que el analito tarde en eluir de la columna respecto a un analito no retenido que no interacciona con la fase estacionaria y que por definicin tiene un valor de K igual a 0: tR - tM tM tR tM K = =

K se relaciona con el coeficiente de distribucin del analito que era definida como la relacin de concentraciones del analito en las dos fases, la cantidad y la concentracin estn relacionadas con el volumen: tR tM MS MM VS VM K = = = Kd

donde MS es la masa de analito en la fase estacionaria, MM es la masa del analito en la fase mvil, VS es el volumen de la fase estacionaria, y VM es el volumen de la fase mvil. La relacin VS/ VM es la relacin volumtrica de la fase: K = Kd El factor de capacidad es importante e independiente de las dimensiones fsicas de la columna y de la velocidad de flujo de la fase mvil que la atraviesa. Puede ser usado para comparar el comportamiento de un analito en distintos sistemas cromatogrficos. La selectividad () para dos solutos de una mezcla se define como el cociente de sus factores de capacidad. Tambin se denomina retencin relativa, y es una medida de la separacin de dos compuestos adyacentes. Es, por tanto, funcin de la composicin de la columna y de la fase mvil. 3

KA KB

KdA KdB

tRA tRB

= = =

Las columnas cromatogrficas consisten en un nmero de zonas adyacentes en cada una de las cuales hay suficiente espacio para que un analito est en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas zonas se conoce con el nombre de plato terico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El valor numrico de N y H para cada columna en particular es expresada en referencia a cada analito. La altura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de la columna, X: 2 H = X Donde es un estndar de desviacin de la banda Gaussiana. Para los picos Gaussianos simtricos la anchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin , i es igual a 2. Por lo tanto el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico. El nmero de platos tericos en la columna entera viene dado por: L H Donde L es la longitud de la columna. Si consideramos la posicin del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es , obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms pendiente del pico, es igual a 4, la ecuacin anterior se convierte en 16 L2 N = 2 Si en lugar de medir L y en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuacin quedar: N = 16 ( tR / ) 2 La nomenclatura refleja el concepto de destilacin de la cromatografa de gases; en esta tcnica una cierta longitud de la columna cromatogrfica es ocupada por un plato terico (altura equivalente del LX 2

N = =

plato terico, HEPT). Si dividimos la longitud de la columna por el valor de HEPT, obtendremos el nmero de platos en la columna. El nmero de platos de una columna (eficacia, N) es una medida del ensanchamiento de la banda cromatogrfica. Cuando inyectamos un pequeo volumen de analito en una columna forma una banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchura de pico aumenta con la raz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. La resolucin se define mediante la frmula: V2 V1 Rs = ------------------ (1 + 2) Siendo V1 y V2 los volmenes de elucin de las dos sustancias, y 1 y 2 las anchuras de los respectivos picos. La resolucin es el parmetro que define la bondad de una separacin cromatogrfica, y es funcin directa de lo selectividad (retencin de los compuestos) y del nmero de platos (eficacia). Para mejorar la resolucin de una columna se pueden tomar acciones de distinto tipo: 1. Modificar el factor de capacidad (K). Para ello suele ser habitual cambiar la composicin de la fase mvil. 2. Aumentar la selectividad (). Lo ms conveniente es cambiar la "qumica" de la fase mvil, por ejemplo de MeOH:H20 a THF:H20. 3. Aumentar el nmero de platos (N). Ello se puede conseguir buscando el flujo ptimo de trabajo, disminuyendo el tamao de partcula o aumentando la longitud de la columna

2. TIPOS DE CROMATOGRAFA
Existen diferentes criterios de clasificacin de la cromatografa, - Por la naturaleza de sus fases: Cromatografa lquido - lquido Cromatografa gas lquido Cromatografa lquido slido Cromatografa gas slido

- Atendiendo al proceso qumico fsico que va a protagonizar el proceso de separacin: siendo este el criterio ms coherente de clasificacin Cromatografa de Adsorcin (lquido - slido o cromatografa de fases normales). Cromatografa de Reparto (o lquido - lquido), se basa en las caractersticas de solubilidad relativa de los solutos entre la fase mvil y una fase estacionaria de un lquido no polar. La fase lquida se impregna a un soporte inerte de slice o, en el caso de cromatografa de fase invertida, se une qumicamente. Cromatografa de Intercambio inico. Cromatografa de Exclusin.

- En base a la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria: A. Cromatografa plana: 1. Cromatografa en papel 2. Cromatografa en capa fina (TLC) B. Cromatografa en columna 1. Cromatografa de gases (GC) 2. Cromatografa lquida (LC) a. cromatografa lquido lquido b. cromatografa slido lquido

3. CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Todas las cromatografas denominadas en columna se caracterizan por tener una fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de dimetro por la que se hace pasar una fase mvil lquida o gaseosa que estar en permanente movimiento. Segn la afinidad de las molculas por la fase mvil o la estacionaria, stas se separaran. Despus de cada cromatografa podremos sacar informacin del cromatograma tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la cantidad y composicin de las sustancias separadas). Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos (sefadex), derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, slice, etc. Existen distintos tipos de cromatografa en columna: 3.1. Cromatografa de intercambio inica: se basa en la afinidad de los iones en solucin por los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria. 3.2. Cromatografa de exclusin: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamao y forma de las molculas. 3.3. Cromatografa de afinidad: se basa en la especificidad de algunas macromolculas biolgicas. stas se unen especficamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolcula, bastar con varar el pH una vez que la columna este limpia y slo se encuentre la que nos interesa. 3.4. Cromatografa de adsorcin: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los compuestos por el slido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria ms polar que la fase mvil. 3.5. Cromatografa de alta resolucin (HPLC). (Ver punto 5) 3.6. Cromatografa de gases. (Ver punto 6)

4. CROMATOGRAFA PLANA
La mayora de los principios que se aplican para la cromatografa en columna se aplican tambin a la cromatografa en superficie plana. 4.1. Cromatografa en capa fina (TLC) Para la cromatografa en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partculas de unos milmetros de espesor, fijadas sobre un soporte slido generalmente de aluminio, plstico o vidrio. Despus de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separacin. La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultneamente la muestra y el patrn, mientras que en la cromatografa en columna las muestras se analizan individualmente. Adems, las muestras que son difciles de separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en direcciones perpendiculares. Otra ventaja es que, si los componentes no se pierden en los vapores que rodean la placa, todos estarn en algn lugar de la misma, mientras que en la cromatografa en columna algunos componentes no eluyen y se pierden. Y a sto se suma que la placa de TLC se usa una sola vez, por lo que se pueden utilizar condiciones severas de separacin. La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con relacin a la distancia recorrida por la fase mvil. El grado de retencin en cromatografa plana de superficie se expresa como el factor de retardacin, o ndice de retencin Rf. distancia de desplazamiento del soluto Rf = distancia de desplazamiento del disolvente El frente del disolvente es el lmite alcanzado por la fase mvil, en ste se mide la distancia en que se ha desplazado ste. El valor de Rf depende de las mismas condiciones experimentales que el valor de K de la cromatografa en columna: la composicin de la fase mvil, el tipo de fase estacionaria, la temperatura y el tipo de compuestos separados. Tambin podemos definir el coeficiente de distribucin, K, en trminos de la concentracin del soluto en la fase mvil, Cl, y en la fase estacionaria, Cs: K = CS / Cl

Deteccin y cuantificacin por TLC La deteccin y localizacin de las manchas en la placa de TLC se hace observando los cambios en la fluorescencia, o absorcin en el U.V., de un indicador que se incorpor a la fase estacionaria. Toda la placa fluoresce bajo luz UV cuando no hay solutos presentes. Los lugares en los que reside el soluto aparecen como manchas oscuras. Tambin podemos observar el color de los compuestos despus de reaccionar con reactivos especficos para grupos o metales, rociados sobre la placa, como la fluorescamina para aminas. Existen instrumentos para determinar directamente la fluorescencia y/o color de las manchas en la placa. Los instrumentos deben ser capaces de cuantificar la medida sobre el rea total de la mancha. 4.2.Cromatografa en capa fina de alta resolucin (HPTLC) Como las separaciones en columna y en TLC se basan en el mismo fenmeno, las mejoras incorporadas a la cromatografa lquida tambin se aplican a la TLC. Con HPTLC se puede obtener una separacin equivalente con menores distancias de migracin, lo que significa que se requiere menos tiempo para anlisis equivalentes. Una desventaja es que el tamao de la muestra para HPTLC debe ser significativamente menor (en el rango de nanogramos) que para la TLC convencional (en el rango de los microgramos). En general, el HPTLC requiere ms equipamiento y ms experiencia que el TLC convencional. Los materiales que se usan para la fase estacionaria de la cromatografa en capa fina pueden ser los mismos que los de relleno de la columna: almina, slice, alquilsilanos enlazados y celulosa. Sin embargo, aunque se use el mismo material para el relleno, el comportamiento de un determinado soluto puede no ser exactamente comparable. La principal razn de sto es que los solutos y los disolventes en TLC interaccionan con superficies secas que inicialmente no estaban en equilibrio con el disolvente, mientras que en una columna la fase estacionaria est constantemente en contacto con el disolvente (fase mvil). 4.3. Cromatografa en papel En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se utiliza es de celulosa. La celulosa es muy polar en el agua y se vuelve electronegativa. El papel tiene propiedades de intercambio inico dbiles, as como de adsorcin. La mayora de las propiedades varan de papel a papel, lo que provoca variaciones en el Rf. Actualmente existen papeles modificados con resinas cambiadores de iones, almina, etc. El aparato que se usa consta: de un soporte para el papel, un recipiente para el disolvente y una cmara hermtica para desarrollar el cromatograma. La cmara hermtica es necesaria para evitar la 9

evaporacin de los disolventes voltiles debido a la gran superficie del papel expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de elucin se aplica la muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un pequeo volumen. El papel debe estar en equilibrio con los vapores del disolvente antes de empezar el desarrollo. La cromatografa en papel se ha aplicado con buen xito a problemas de qumica orgnica e inorgnica y de bioqumica.

5. Cromatografa de alta resolucin (HPLC) 5.1 Fundamentos y principios bsicos

El proceso cromatogrfico puede ser considerado como: un conjunto de fuerzas que compiten de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte, fijarlo al relleno de la columna o fase estacionaria, o llevarlo disuelto en los lquidos que fluyen a travs de la columna o fase mvil. Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografa. TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
Proceso cromatogrfico Adsorcin - reparto Particin Inicas Fuerzas implicadas De adsorcin De particin De intercambio inico. De par inico De supresin inica De exclusin ____ Nombre alternativo Lquido-slido Lquido-lquido Denominacin Espaol CLS CLL CIE CPI CEM Genrica HPLSC HPLLC HPIEC HPIPC HPSEC

Penetrabilidad en poros

Cromatografa de geles (filtracin o permeacin)

En la cromatografa de reparto se utilizan fases estacionarias polares (slice, almina, hidroxiapatito) y fases mviles apolares (ciclohexano, isooctano, tetracloruro de carbono, etc.), aplicndose a la separacin de solutos apolares. El origen de la retencin es, por tanto, la interaccin de los grupos polares de los analitos con los grupos polares de la superficie del relleno. En la de particin la fase estacionaria es lquida, es necesario ligarla o embeberla sobre partculas inertes (generalmente de slice) para que permanezca fija en la columna. Hoy en da los grupos funcionales se fijan mediante enlace qumico a las partculas de relleno, lo que permite a la fase estacionaria resistir las altas presiones aplicadas en HPLC.

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Hay dos posibilidades en la cromatografa de particin: cromatografa en fase normal (cuando la fase estacionaria es polar, por ejemplo si contiene grupos ciano, diol, amino o dimetilamino) y cromatografa en fase inversa (cuando la fase estacionaria es apolar, por ejemplo con grupos C8 C18). La cromatografa de particin en fase inversa es la ms utilizada de todas las tcnicas HPLC, pues las fases mviles polares permiten separar una amplia variedad de compuestos de inters bioqumico, farmacolgico o qumico. En fase inversa la retencin esta basada en una atraccin primaria entre la fase estacionaria y la regin no polar del analito. El orden de elucin es de hidroflico a hidrofbico, de polar a no polar. Para aumentar la retencin de un compuesto, es necesario aumentar la polaridad de la fase mvil. La fase estacionaria ms comn es C18. Las fases mviles ms comunes son; acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano, etc. con agua como componente de la fase mvil. En cromatografa de intercambio inico la fase mvil compite con la estacionaria por los solutos mediante fuerzas inicas. La limitacin es que el soluto sea inico (un anin o un catin). Se trata de una tcnica muy til para separar iones inorgnicos, protenas, etc. Mediante supresin inica se separan compuestos inicos, suprimiendo (o reduciendo) su estado inico en solucin a travs del control del pH, de manera que quedan ms retenidos en rellenos de fase reversa. Se trata, por tanto, de adaptar la cromatografa de particin en fase reversa a la separacin de mezclas que contienen uno o varios compuestos ionizables. Funciona bien para cidos dbiles y bases dbiles. Otro tipo es la cromatografa de pares inicos que se forma al pasar una fase mvil polar que contiene un contrain de carga contraria a la de los solutos, se suele aadir a la fase mvil un catin o un anin hidrofbico, que interacciona con el analito formando el par inico. La cromatografa de exclusin molecular separa los solutos en funcin de su tamao molecular. El principal inconveniente es que se trata de un mtodo de baja resolucin. No obstante, es muy til para la separacin de protenas y otras molculas de alto peso molecular. Es importante que no haya interaccin entre la fase estacionaria y la muestra. Las reglas bsicas en HPLC son cuatro: 1. Fase mvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta. 2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase mvil (es decir, polaridad similar). 3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagacin). 4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migracin diferencial). La elucin de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase mvil a travs de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porcin de muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por s mismos entre las dos fases segn la naturaleza qumica de stos

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con respecto a las fases mvil y estacionaria. Adiciones posteriores del disolvente llevan a las molculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado (tx). La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fraccin de tiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad ser pequea para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y ser grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase mvil. El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en una grfica en funcin del tiempo denominada cromatograma. El cromatograma discurre horizontalmente paralelo a la escala de tiempos (lnea de base), zona que informa de las condiciones generales del sistema en ausencia de solutos. Luego se observa un brusco incremento sobre la lnea base, seguido de un descenso ms o menos simtrico que enlaza con la continuacin de la misma (pico cromatogrfico). Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho, casi una lnea vertical. Pero muchas veces presenta una anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de una gaussiana. Tambin se presenta una primera banda peculiar ascendente-descendente (frente del disolvente o frente de inyeccin), no siempre observable, y que suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del sistema o tiempo necesario para que un fluido sin retencin atraviese fsicamente la columna, tubos, etc. del sistema. Las molculas de un mismo soluto, pese a hallarse sometido a las mismas fuerzas, no eluyen todas al mismo tiempo, sino obedeciendo a un modelo gaussiano. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posicin en el eje) como cuantitativamente (rea bajo los picos) los componentes de la muestra. La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin de la altura o del rea del pico de un analito con el de uno o ms estndares. Ambos parmetros varan linealmente con la concentracin. La cromatografa cualitativa se basa en la comparacin de la posicin de los picos (tiempos determinados de retencin) con cromatogramas estndares.

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Ejemplo de una determinacin de la composicin de aminocidos de una protena derivatizando los aminocidos (resultantes de la hidrlisis cida de la protena) con un reactivo fluorognico.

La efectividad de la columna cromatogrfica para la separacin de solutos depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eludas. La eficiencia mxima para la cromatografa lquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamao de la partcula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase mvil o se incrementa la temperatura. En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con dimetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partculas de la fase estacionaria no superaban las 150-200 m de dimetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso as, los tiempos de separacin eran largos, podan llevar varias horas. La cromatografa lquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatography) es el mtodo ms sofisticado y moderno de la cromatografa lquida, que utiliza partculas de fase estacionaria para el interior de la columna con dimetros muy pequeos para aumentar la eficiencia, en torno a 3-10 m. As, se ha conseguido reducir el tamao de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de dimetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separacin.

5.2 Instrumentacin
Todo cromatgrafo de HPLC dispone de, al menos, cinco mdulos: bomba o sistema de bombeo, inyector (manual o automtico), columna, detector y sistema de visualizacin de resultados. Hay otros mdulos complementarios, a veces necesarios para la aplicacin: horno de columnas, un segundo detector y un colector de fracciones. Existen tambin una serie de pequeos accesorios: soportes del inyector y de columnas, reservorios o botellas especiales para la fase mvil, restrictores de presin a la salida del detector, filtros intermedios, etc.

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Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un dimetro interno de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del dimetro de las micropartculas que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 3-10m. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartculas de la columna. En muchos casos se utiliza una precolumna para eliminar contaminantes y partculas de polvo. La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos estn equipados con calentadores de columna, que controlan la temperatura desde la cercana al ambiente hasta 150 C. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores cromatogramas. Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas segn las distintas separaciones. Bsicamente, las micropartculas utilizadas estn compuestas de slice, almina o resina. Pueden ser de dos tipos: -Partculas enteramente porosas, de forma irregular y dimetro 3-10m. -Partculas esfricas de superficie porosa, con dimetros de 30-60m y un ncleo imposible de atravesar. Son necesarias bombas de presin de varios centenares de atmsferas para conseguir velocidades de flujo razonables con micropartculas de 3-10m debido a la resistencia que ofrecen. Como consecuencia, el equipo de HPLC es ms costoso y elaborado que el de otros tipos de cromatografa. Las elevadas presiones que generan las bombas no constituyen un peligro de explosin, puesto que los lquidos no son muy compresibles. Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno ms de 500 ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompaados de desgasificadores para eliminar los gases del disolvente, pues producen burbujas en la columna interfiriendo en los resultados. Para una buena eleccin de la fase mvil o disolvente, hay que tener en cuenta que la interaccin con la fase estacionaria (micropartculas) debe ser ptima y la separacin debe ser lo ms rpida posible. Los parmetros que determinan el tipo de disolvente a utilizar son: viscosidad, transparencia al UV, punto de ebullicin, ndice de refraccin, inercia frente a la muestra, resistencia a la corrosin, toxicidad, precio y mantenimiento. El sistema de inyeccin de muestra que ms se emplea se basa en "loops de muestra", que son bucles o vlvulas dosificadoras que permiten una aplicacin cuantitativa y reproducible a presin elevada. Proporcionan una seleccin del tamao de la muestra que va desde 5 a 500l. La muestra se pasa primero al bucle sin presin, para luego pasar a la columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vas o vlvulas de membrana. La muestra no debe contener slidos para que no se atasque la columna, si es necesario deber filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver la muestra en el eluyente que se

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vaya a emplear en la separacin. El volumen inyectado de muestra debe ser lo ms pequeo posible, para que los resultados aparezcan ms ntidos. Para HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la muestra. -Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en disolucin. Son los detectores ultravioleta/visible (UV/Vis), detector de fluorescencia y detector electroqumico. El ms utilizado es el UV/Vis, (tambin puede clasificarse como detector universal) sobre todo el espectrofotmetro, que registra sustancias que absorben la radiacin ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elucin en gradiente. -Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase mvil es cambiada por la presencia de un soluto. Son el detector del ndice de refraccin(RI) y el detector de conductividad. El ms utilizado es el detector RI, que registran todas aquellas sustancias que presenten un ndice de refraccin distinto al de la fase mvil pura. La seal ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia en el ndice de refraccin. Es necesario un control estricto de la temperatura y no se pueden utilizar para separaciones por elucin en gradiente.

5.3 Aplicaciones al anlisis de alimentos

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condicin, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente, al ser la fase mvil un lquido. Es especialmente adecuada para compuestos poco voltiles , termolbiles e inicos. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas, cidos nuclicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una gran variedad de sustancias inorgnicas. Ejemplos de utilizacin de HPLC: - Deteccin y cuantificacin de cafena y teobromina que son alcaloides muy importantes en el caf, t y el cacao, especialmente por su accin estimulante. El contenido de estos compuestos se utiliza para evaluar su calidad. (Deteccin UV) - Determinacin de azcares. La analtica de carbohidratos no resulta fcil pues presenta acumulacin de grupos funcionales iguales, los grupos hidroxilo, y adems posee gran nmero de esteroismeros. Tras una dilucin los azcares se separan cromatogrficamente por medio de HPLC en una fase amnica. (Deteccin RI) - Determinacin cuantitativa de polisacridos como el almidn, las dextrinas, los dextranos, de algas marinas y las gomas vegetales. 15 el glucgeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas, as como sustancias mucilaginosas

- Deteccin de ciclomato en jugos de fruta. - Separacin de steres de cidos grasos por fase inversa y con argentizacin de columnas (Silicato de Al con Ag). - Separacin de Triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de insaturacin por fase inversa y detector de dispersin luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas. - Determinacin del contenido de Vit A y sus precursores ( y caroteno) en margarina y aceites de hgado por fase inversa. - Determinacin del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.

6. CROMATOGRAFA DE GASES (GC) 6.1. Fundamentos y principios bsicos

Este tipo de cromatografa es una tcnica que proporciona informacin tanto cuantitativa como cualitativa, vlida para la separacin de casi todo tipo de compuestos, siempre que tengan diferente volatilidad. La fase mvil es un gas inerte que arrastrar los compuestos inyectados a una velocidad de migracin que depender de la naturaleza de stos, de la naturaleza y velocidad de la fase mvil, de la naturaleza de la fase estacionaria y de la temperatura, sin interaccionar con los compuestos. El resultado ser un cromatograma donde quedar reflejado el tiempo que ha tardado cada compuesto en salir (tiempo de retencin bruto). Podemos encontrar dos tipos de GC atendiendo a la naturaleza de la fase mvil:

! Cromatografa gas-lquido. La fase mvil es un gas y la fase estacionaria es un lquido con

alto punto de ebullicin (para que no se volatilice), de naturaleza inerte y que proporcione pelculas uniformes. Este lquido es inmovilizado por impregnacin o por enlace sobre un soporte inerte que puede ser simplemente la pared de la columna. La naturaleza de la fase estacionaria nos determinar el orden de salida de los compuestos: Apolar: primero saldrn los compuestos ms pequeos, en orden de volatilidad creciente. A igual n de carbonos, los compuestos con insaturaciones saldrn antes. Ej: en una serie homloga de c. grasos C12 - C14 - C16 - C18... Si hay insaturaciones C (18:3) C (18:2) C (18:1)... Polar: si hay insaturaciones, stas reaccionarn por fuerzas de Van der Waals, as pues en una serie homloga los compuestos saldrn en orden de tamao creciente, pero a igual n de carbonos los saturados saldrn antes, luego los monoinsaturados, etc. El parmetro implicado es el coeficiente de reparto K, pues la separacin de los analitos depende de las diferentes fracciones de tiempo en las que se mantienen disueltos en la fase estacionaria liquida. 16

Los componentes ms solubles se retienen durante ms tiempo, dado que pasan menos tiempo viajando con el gas portador.

! Cromatografa gas-slido. La fase estacionaria es un slido poroso (grafito o gel de slice o

almina generalmente) y la fase mvil es un gas. La retencin de los analitos se debe al equilibrio proporcionado por la adsorcin y desorcin sobre la superficie del slido. Este tipo de GC es muy efectivo para anlisis de mezclas de gases o de compuestos con bajo punto de ebullicin. El parmetro implicado es el coeficiente de adsorcin. La cromatografa de gases es el mtodo de separacin elegido para analizar tanto compuestos orgnicos como gases, pues ambos grupos poseen presiones de vapor suficientemente altas como para ser arrastrados en la fase mvil gaseosa. Lo que limita el uso de la GC es la descomposicin trmica. La GC requiere muestras voltiles, por lo que los compuestos que no lo son (azcares, cidos grasos, aminocidos...) tienen que ser derivatizados, lo que significa transformar qumicamente grupos qumicos que originan puntos de presin bajas (punto de ebullicin alto) en compuestos ms voltiles (en azcares bloqueo de OH con cloruro de slice trimetilado, en cidos grasos se producen sus steres metlicos, etc.). La derivatizacin tambin puede ser empleada cuando los componentes reaccionan para dar grupos que proporcionan una fuerte respuesta en el detector empleado (adicin de cloruros cuando se usa un detector de captura electrnica, etc.).

6.2. Componentes de un cromatgrafo de gases

Desde un punto de vista funcional, un equipo de GC est compuesto por tres mdulos especficos: un inyector, una columna, un detector y un horno. Gas portador: constituye la fase mvil. Suele ser Helio, Nitrgeno o Hidrgeno, proveniente de un cilindro bajo presin (200 250 atmsferas en el interior de la botella. Saldr a 1 3 atmsferas gracias a tres manoreductores) o de un generador. Este gas debe estar libre de trazas de hidrocarburos, vapor de agua y oxgeno, ya que pueden reducir la sensibilidad de algunos detectores y actan como impurezas. La viscosidad y velocidad de este gas tienen influencias sobre la dispersin de los compuestos en la fase estacionaria y sobre la difusin en la fase mvil. Inyector: Es la puerta de entrada de la muestra en el cromatgrafo. Adems tiene la funcin de vaporizar y arrastrar la muestra mezclada con el gas portador a la cabeza de la columna. Para volatilizar las muestras de una forma rpida y de modo que todas las partculas inicien el proceso en el mismo punto, la temperatura del inyector debe ser muy elevada, unos 100 C mayor que la de la columna. Adems para minimizar la difusin de la muestra debe ser un 17

espacio lo ms reducido posible. La muestra es introducida en el equipo con una microjeringa de la que existen numerosos modelos adaptados a los diversos inyectores y columnas. Para controlar mejor la reproducibilidad de las inyecciones suele hacerse uso de inyectores automticos. Las caractersticas de los inyectores as como la de los modos de inyeccin dependen del tipo de columna que se utilice. Encontramos: Inyectores de vaporizacin directa Inyectores con o sin divisin (splitt o splittless) Inyectores a temperatura programable Inyeccin directa en la columna Recinto termostatizado: (tambin denominado horno). Es una cmara calentada de volumen suficiente y fcil acceso para instalar la columna. Permite una subida rpida y controlada de la temperatura, y adems se mantiene muy estable. Mediante cambios de temperatura en esta cmara, se consigue alcanzar la temperatura ptima para cada compuesto o fraccin que queramos separar. Columnas: existen dos tipos de columnas, las empaquetadas y las capilares, ambas con diferente eficacia. " Empaquetadas: tienen un dimetro interno de entre 2 y 4 mm, y una longitud de entre 1 y 3 m. Se construyen utilizando como armazn un tubo de acero o de vidrio. Contienen un soporte poroso e inerte, con contorno esfrico que permiten la unin o impregnacin de la fase estacionaria. " Capilares: su dimetro interno vara entre 100 y 500 m (conocidas como micro y megabore respectivamente) y su longitud es del orden de los 100 m. Suelen estar revestidas por un polmero estable trmicamente, lo que permite enrollarlas en un soporte metlico circular. La fase estacionaria recubre la pared interna con un espesor controlado de unos 0.05 a 5 m. Las columnas capilares se clasifican en funcin del mtodo de inmovilizacin de la fase estacionaria. Actualmente las columnas capilares estn sustituyendo a las empaquetadas ya que permiten un mayor nivel de resolucin. Detectores: los hay universales (sensibles a prcticamente todos los compuestos eluidos) y especficos (sensibles a un tipo particular de molcula). Tambin hay detectores que slo conducen a valores de tiempos de retencin, y otros que proporcionan informacin tambin de la estructura de los compuestos detectados. Todos los detectores dan una respuesta en funcin de la concentracin molar o msica de la disolucin en el gas portador. Tambin es posible conectar varios detectores en serie. Algunos de los principales detectores empleados son: 18

1. Detector de conductividad trmica (TCD) 2. Detector de ionizacin de llama (FID) 3. Detector termoinico (NPD) 4. Detector de captura de electrones (ECD) 5. Detector de fotoionizacin (PID) 6. Detector de emisin atmica 7. Detector de masas 8. Detector infrarrojo o ultravioleta Los detectores del 1 al 4 no dan informacin alguna sobre la naturaleza de los compuestos eluidos, como mucho son selectivos, lo que conlleva el problema de que cuando los picos del cromatograma son cercanos, pueden confundirse compuestos. El resto de detectores aportan informacin estructural.

6.3. Aplicaciones al anlisis de alimentos

Muy importante en el anlisis de la materia grasa porque informa simultneamente de las propiedades fsicas y caractersticas nutricionales. Los cidos grasos se hacen ms voltiles por esterificacin de sus grupos carboxlicos con metanol. El orden de elucin de los cidos grasos es funcin de la naturaleza de la fase estacionaria de la columna. Si fuese apolar, saldrn primero los ms voltiles; si tiene instauraciones cuanto ms insaturado ms pequeo es el cido graso. Si la fase es polar, pueden presentarse fenmenos de interaccin si hay dobles enlaces, actan como dipolos y van a quedar retenidos. Otra de las aplicaciones ms importantes es el anlisis de glcidos digestibles. La cromatografa de gases permite identificar y cuantificar simultneamente las pentosas, 19

hexosas, los di, tri y oligosacridos. Se recomienda para la caracterizacin de las molculas glucdicas, tras su hidrlisis en monmeros y transformacin en compuestos voltiles. Los azcares se transforman en compuestos voltiles mediante un tratamiento de acetilacin o de sililacin (ste es el mtodo ms corriente) de sus hidroxilos. La sililacin consiste en transformar los monosacridos en trimetilsililos (TMS) en los que los grupos OH han sido convertidos en O-Si-(CH3)3 . El donador ms poderoso de grupos sililos es el trifluoroacetamina (BSTFA) al que se le aade un catalizador, el trimetilclorosilano (TMCS), para obtener una derivacin cuantitativa y rpida. En la identificacin y cuantificacin de los esteroles. El principio consiste en fraccionar el insaponificable (vitaminas liposolubles y esteroles que se encuentran libres) por cromatografa de capa fina (TLC) y despus analizar la fraccin de los esteroles por cromatografa de gases. Identificacin y cuantificacin de glcidos indigestibles. En la identificacin y determinacin de alcoholes. Los alcoholes presentes en disolucin acuosa se separan por cromatografa de gases utilizando Parapack (fase separativa) que es un polmero poroso adecuado para la separacin de sustancias voltiles de bajo peso molecular. Las sustancias se eluyen de acuerdo con sus puntos de ebullicin.

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7. Bibliografa
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