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TEXTO

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DI

Biologa Molecular e Ingeniera Gentica


Concenos. Tcnicas y Aplicacion(:S en Cienci.1s de la Salud

TEXTO

ILUSTRAD O DE

Biologa Molecular e Ingeniera Gentica


Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud

Jos Luque Cabrera


Catedrti('tl de Universidad

Angel Herrez Snchez


Proflsor TiiUiar dC' UniveNidad

Ocpanamcntv tk Bic.J.qumka y Biologa Molecular Universidad de Alcal.i AlcJij de llenares. Miidl'it.l

GLSE.VIER
\ 111\lnd 8fi1\JCIVna Atlb4fnlam l~tllll Fila.leiiM I..Qml:l:" C)rl.lndO 1~ Rwm Sydne} T)).:i< Tcorun1n

ELSEVIER
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A nuestros alumnos, Inspiradores de <Hite estucrz.o.

A nuestros compaeros profesores, Montse, Cristina. Jos Carlos,


Pilar y Ana, por su confianza y apoyo continuos.
A nuestras familias y amigos, por su comprensin

y por el tJempo que han cedido.

Prlogo
En la Preseotaclon de e<ste libro. QUe tengo el honor e prO!oJar, bs au~res c1rman que prelenden reunw los~ cep!os actuales de ta Blo4ogla Molecular y las modemas metodologias de la lngenleria Gentica con \1Sta& a su apkactn
a la Pa10109la MQiecu\a.r, human<1 y li'W"al, en 514 divettOos ou;peciQI'; eti()IQg:it', fisiopa!Qiogi.-. (l!agn$lti;Q PI'Qt'f;boo, \Ora?utiea y preVGnO!On do 1~$ toltl'f'l'IO&k<Je$, y pr()IYIQCi()(l cte: ltl salVO Y pretenaen ~riQ (fe$(Se una petSpe<:ei~ pl1.1ridi$Cipli~r e inl~<Jom dif9a, tuncsatncnlalmerue. a lOS estudiatltes qve cursan las llecnOifi.IUtas de Faunacla,

Modieinl), ~OIOQII.l y Veletlnarla, y 18$ orlen1aoooes blosanll.atfas de Biologa. Bloquimtca '1 Oumca. Se Itala, sin dv(1() , dO IJt1t\ e<npresa l.at\ opon~ \' ambkx:l6a, como ~ y dHicit Peto, a la VIsta del resutUI aleanZaao, puede
ofitmt'rGO que: .. ew:ito M Sido tolat

La elaboracin 00 un texto de lascara~enS1icas m9nciol'adas 9$ oportuna '1 nece<saria. En los Uhimos deGenio&, la Blolog1a ha experimen~ado t.n pt000$0 de progresrva 'moleculanlacn' qoo ha oonauc;~do a un nuevo p.mu;ltgma blolgioo QVa trato t ontond41'r k.> qvo $0 1\3 <lonomin&oo '1.3 ~ dv WYMI~ (F J.oeob. 1970) <>IN motoMI IOQie 01 <he IIVU'IQ state (A. l. LEM!nger. "Biochemistry", 1970) ~ las bases moleculares sul1yacentes a los procesos biolgfoos El ~ee~ente de$ci1ramento c;lel gen<>m3 00 diV91$0$ OIQar.$niQ$, y mvy O$I)OQ;;t!rnon1c da! gonorn.'\ humano_constituye una ct~ tur,(larr~enw que M <le halar w oonunuldBd en el no n"'e((OSirnportante estudio de aos proteomas. Sigutel'ldO los pasos de la Slologla. la Medclna y fa Ve1erlnana estn experimentando un proceso de ''tnolecu!arlzacln creciente que ha ttecho emerger la que se ha flam&do Patologia Molecular. Hoy en dia. el rwvel molewlat no es soto un rwel de in vesttgadon biomdica. sino t8ITiblOO un nivel de acumcin diagnsuca, pronstlca y teraputiCa. Por ello. es !mptesdn dlble preparar adecuadamente a bs hJturos proJe&IOflales de la salud, ya que. slo s disponemos de profesiOnaleS oompetootes podremos ha<:er treme oon l01o a los retos deoJ futuro. 8 ejerCICIO prof~al de los anos venideros exglr oompeleflCm para abordar a niVE!I moCecular los prob'ema& de la salud. Por elo. harn falla protesiona!es que poseen lOs ooncoptos y los o~ontO$ do l(ltlgu;,Je molcc!Aar neoee~ p."'ra oompronder la& ba$$5 moleculares de la salud y la en termeclad. Protes1ona1es ~es <le a<lqu,rir con$tantemetttC ta in!Ofm&en biOQuim<;t~ necmn<.'l p0ro mat~~of'IC:r :;u com petencla, y ca~oes de aplleat diCha lr'lf.Orm3Cf(ll'l a lll $01uein de 108 problemas QUIO les <::onoeman_prolesront~!es con ~ida<::! do aviOC'IptCI'ICiiUI!* o.a.r<l ~Cior StAti1uir IO$<::OI'ICOI)IOS caducO$ >Of 10$ nuevos. hacieodo uso de todas las posi bilidades Que tas m()defflas toetlQiogfas oc ta il'lfQn'na(in ~n t1 su ale31'1e0 P<ua ktiQrmaQf'l bilseca t tale& protesiooales l!enel'l gran vatOt tos tex!Oe que: resumetl toa nuevos elemenl<lS eot~eepluale$ de tas di>lff$~ flnt3$ de la Slologia un1o a las oonesporeflleS tfCr.cas y metOOOiogas; ya que t:)efmuen que estudian1e eaquier3 ufl..'l base $(11idn a pa111r de la cual podr ampliar bs conocirTH~lOS acudtendo, luego. a las monograllas especa!ilada$, a las fevsiQr\0$ o. lf'ICiuso. a 106 a.nicutos orignWes. Por lodo eto. y pot abarcar un campo hasta ahOra insunclentemen.te cub1e11o. con S.dMIMO$ QVO la obra~ JQ:s l.oot.lo y ngel Hlvrilez tespcnOO a una neoet;ldact urgente e wnponante.

NIOta bien. como hemos indicado, ia emptesa no era naoa lli'leil. Y no 10 a po( su catactet de ()brll 1)6&.ea, dirigi da a e5tudiantes de "'anal> lioenc~aturas y. por taniO, con fotmacio dtvefsa, y por su pt~ensln oe seguir un ~rat~m.en1o do los ternas integral y moftidt~r. los autores pte<~endlan Integrar lo conceptual, lo teci'IOk>gloo y lO aPliCado, abor dando to esoocial y rechazando. en roos de la daridad. Jo complejo y no bfen es.tab\eoeiCio. Es e~o ~ 0$10S obie INOS reQI..M.Itian, PQI parte de los atllores, lanto un oonocrn!entoprotundo yaciJJa!lzado ~k>$ c;liWtt$(1$ tomM tr;.tados co m1ca y B10tog1a Motea.Mr. y un conoci"*"o do mo ~ conocirr.eo amplio y completo de tos contet>os de la e.oq..,1 lOS contenidO$ rormaliVO$ de las diversas hcenaatu1as: a la VE"Z que e>~g!an una gran capaclao Oldclica. Sin Ol.l:ftl. la prolol'lg!WiA e inten$a d&dieaort do lo.$ autQft$ oa tea dioooncia urwer&ltana ha Sido un factor dOOSI'/0 para CUif'tW'Ial con JCAo la efl'~Clre$8 BCOmectda. El ~locto oe ttt\bbjo 5e9Jid para 1a elaboracin del teXIo. e<sde la recogida de la inb macln lno.aJ a la (eviSlOf'l: l'inal de Cllda cap(!ulo, c~iMdO ftl cuonr ll'l; obt;orv<aciof'IK y sugerencias de toe ptOfesore$. especli&lista.&, dOCiorando& e a"tCiuso estudiantes de llcenclatwa que lo Nlt anRIIUIOO, tl;'l oonlriblf!OO, !amblen s.n <M~a. a 11'.1 4'm;:Gfencm ele la labol roo'il:ada, Excelencta acrecen4aa por el&::et1adO trata~to vi$ool quo se ha hecho de la in f0fm3<:in prosonlod<t

El'l re$Url'len. el "Tcucto lfuSirado d& Biologfa Molecular e lngenlerfa GeMtle:a~ de lOs ProtHOrC$ JO$!) 1.~ y n gell'ietrleZ C$ una Obr'& ai'I'Qciosa. muy bien reallza.da y Que ha de sef de gran utlrdad pata la fOt'l"naeil'llonto oe ta omplia gama eJe et!udian!e$ 3 Quifne$ va 6rigi<lt~ como de los prole6Kirulles de la salUd que oesee-n aetu31iZtlf $U$ conoe#n1en1os en li'\Ode los campos mas lrni)Or!MtO$ dt ta octvt~l biomecicina. Es por- lodo elb. que ha SI paf6 mi IM'I hOncx y una satlsfacon nx:Sacltll 0$13$ lineas oomo Prologo.
PAOF. JOSE CAAREAA$ ~
U!i!VERSIOAO OE BAf\CELOtl4
OtctEUGAE 2000

Presentacin
OBJETIVO
LOS 3v3JIICC$ y ili)IICo'(:iOI'Ie$ de 13 inves1lgac::Ic'l bloquiiTIICa y genbca ocupan hoy dia una poSicin pnvleglada en el e:u'l"fX> <:le las CienciaS de fa salud en general y en la Farmaaa y &ome6cina en parbcular. Se vi&tumbra en loo albores del SJgiO XXI una tendencia hacia el erlfoque molerulat de la enfermedad, oomo referen10 ll1mo en la in!etpre13CI6n d9
lOS pr"OCeSOspat<liOgtOOS y como non:z~e de nlH.Mls estra~ di;t,gn3tJc$$ y lcr\'tpuhc:b$ b\l$lldo:'l$ en dichO$ &v81'100$

Pota d<lr r~pue~ a t:Sta Slluacin se requiere U!\8. adecuada preparaCiOC'I uf\1\'erSitana, k) que ,._.suflca el desano-. lo de1 presente pro19CIO un libro de etO que f.a(llile .la &dqul!liCitl oe una forrnaciOn oS(Ca en et area de Sl~ogfa Mol~u tat, f.l'l. enfOQUe est1\IC1ural y lndlm.enslonal del matenal gE!(ltico y de los prod~os gniros, asi oomo en la In gen.ierla Ge-n-Uea. et1 un s:emldo amp10 18 mocifiCae)n de dicno material en beneficio dE't la 6atOO o oe la tecnoe:: P01 su glllll slgnl!lcado y su potencial futuro. esw cbclplina.& ya se (tl'l5ef\an, CQtl mavor o menor pra!undidad, en las liovnclatutaa con responsabilidad dfrea o mdi~a en la sanidad {Farmacaa, Med,ON. Odofl~ia y Vo~nnan-ca BIOiogia, ~mtca y Ou1mlca) y en detemunadas d!plomatt.ras (Enfermeria y Fi~r~J Con el fin de contribuir a esta forma~ <:i(ln, $e oropone ul'l enfOQue adaptado a la realidad, aseQUible a todo e&t alumnacb. QU8' pueda fecilnar el proc.eso de e:nseflanza y aprendtzaje de tan in"CX~rt.an1es y noveclosa.s malefas en un tea de conoctmento en wntinua elQ)aflSIn.
P LA N T EA~ li ENTO

Para oat cumpllmiento a este objell'o'O, el libro se plantea bapo una lnple verJ!ente. Conceptos

~ la Vilnrcdad y p&ft!Cularidao&s del elum~<b al eve (llrigl(j& la Obr~. ~ ~ J)~l() 1,11'1 e~ltl$i$ OSPectal Oti lO$ tundarTMJntos. COmut'lO$ ()(Ira !OCios S. ~ten con ~ill~. avnQtJe con 01 ngor CIOI'I(jliC:O eJCigidO hoy di<t. lns bolsos torlc:as irnproscil'll1b.\O$ para OC)mpr~ la matOO!I y ~a CIC$MOIIar y ~ Ocn1tllt:l o pro!C$tOf\)ltnOn!e lll toonologlt' dcriv.a(ffl <t~tc:st.os eoneeptos. se Pcu~ode un llbi'Ovalido para cooOO&f' de IOJma adecuada y SV!u::ien'e la &olog~.t.

MoiOOI.I.af e lngonieria Gon-tict~ $in toncr Q1.0 a~ a l)l'ltl. o-coSi'va, y a veQH ~nt~ewsaria, Aspectos tcnicos

~C~oci6lilaein

La metOCJOtogia deftllada O& ra BIOIOgia MOieetMr. y eo espeCia! ae 1a tngenierla Gen&-11ca (iniCialmente !itM&CJa a la tecnologfa del ONA teoomblnaote). se ha ex.lendie-Jldo con etlle~ a !lnes IT'AI)' d.\ersos (als&amienco_e1on~in, hiDhGtacion, secuenaadon, ele.}. para dar lugar a. una 8iotecn010gls ~~ . tm'l!no que eo Cierto 1'1"1000 pootia ub !Izarse como aJiemaliva a lngt/e(fa GeMtielt et1 el Ululo~ lib10. De ah1 Que, bajo un P\.IMO oe '1418 IOdnt\lwo. n00$1.10 segundo objetiVO consista en esWOiar tos principios de Jos m&lodos y ccr11ca:s mas comunes. aqullos de 1'1\a.yor ttnl)a(tO y U!!l+dad en la -'YeStt9'1-Cin bsca y en ellaboratOOo d(Nco. La de9Crlpd00 y aplicacin concrew ae las vartan~ tec-no)glcas. metodolgicas o nstrumenta!es. cada vez m-s dNerc..as y en rnodiicadon constante, debe soer relegada tos periodos oo doclorado o de especaallzac!n profesional en reas dellaboralorlo dinlco. entte ottas, prloclplOO'Ienc eM

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Aoisis C,inicos o en Bicquimica ctinica y Pa!ologia Motecula!. Aplicaciones biosnnitarias La a.ok>g;la Molecula e lngeoieoria Getkl!ciea h8 OOMribuiO a lf':SOivet prOl*!tntt$ de cout~c!ttr lnv$\IJ<:II (Ohm!naQf\ de x.enobihcos o tesldoos), agricola y ganadero (meJOC'a gentiCa y aimeniO$ lrMsgnico;). tias ~:tplic;aCfOiloQ$ en Far maoa. Modiooa y Vetennalia, que se centran en la lucha oonua ta f!fllermeded runaoo y anlmal ((l'liOIQgf:l, 1)3!QgOI'Ii&, d~;~.gn6boo, tratamranto y prevenon) y en la &lnte&t& <S& mo6oculas con l!nes terapvlloos. ya han rendlclo sus pNmeros lMOG. e~ extraordinariO avance ha d!lOO 1uga1 a una ser;e ce lfm.oos QtJe, en Qe!tCJ'81 ncluyon tf proJio tJ(Q. o el ad,otivo mofOCVIat. Como 1Presefl4al!vo e 40dos ellos se aoep4a hOy el ttm!no Blomecllclna o MeOcna MOl~' c;Oc'l>siderado de una torma amplia como una 'ViSin molecular' de \Odas tos aspeS relacionadOS eoo la enU.l!medad

CARACTERSTICAS
Trotaml(mto Integral

vmultidi&eipllnar

Se na. btJ9C8do integrar las tenieas y~~,_ con 10$ (:O(Icq>!Ot. abofdando lo esenoal y fechazat~OO, salvo excei)CtCW'IEis, lo cof'I'IJ)Iejo o no bien estabteciOo, relaCionandO cacta nuevA iNormae-n <:Qn lo d$c::vlido en ()(ros temas y con bs mbitos bioqulm.oo. genelioo. quimtoo. fslologlco. anatrtlco, e1e. Asi 10 sugiere kt insuhciente o de&pfopotaena

xu
da preparacu)n re<:lb!da el'/ ocasiones por el alufl'WIO en matet'laa bralcas preVas, la InClusin de la Blologfa ~ular e lngernetra Genetica dentro de una disciplina de Bioqulnvca Genera!. w lmpart:cln en programas vat1ado6. en cursos dis.tinto6, con un numero llmilado do crdhos doc:ren:95. eet: Se ha lnten&ado propoccionar al libro un derto carc! outnomo. ~<1ble al ri!Jno, nivel y s!tvecill de cada estudio patticolar. Ello no ob6ta. muy al oonuano, para que deba seguir ffeOmMddndoS4 lo oonstlla di) la bibiografia espttcifk:a y. sobre todo. do lO$ excelentes llbtos de texto clls~ hQy dia, oon un abaNeo y tr:Uai'IW:1o de tos tema; difetente$ n1.1ostro,
Di seo v isual

Como aspecto ms elgnlllcawo. y para facl!tat la caracterlstica aotenor, el !lbro &e apoya en un tratamiento lli8ual, original, oon proluan e esquemas y figura& Pftldoi'IW\al'ldo &Obfe un te.xto lo ms dato y sencillo po&bkt. Como con &ee~.~encta. las ilustraciones deben considerarse parte lfltegrame del lelOO por ro qU&, en contraste oon lo habl~uat. no son aladas en ste n tlen$n \oW1 pie o tiUo de$<:rip1ivo, E16eclor debe aCOG1umbrNW a. eJO'amkw la figura cuando llegue a ella, pus~ la PO:sioiOn de $Ct\ etn la P6gin~ Qf oO:Jcl1rnente .1<rJll~ qvo re OORe$pOf\<le on lo lectura (salvo contada& ex oe()CIO~ debid3$ 31 t3mat\O de la figura. Pi)r ocra pane, se hace un oso extensiw> del COIOf, no $010 p::trO! aumontat el :wacuw dO las i!u!ltraeiones. sino para tra~!r ~ inrOMCin: por eje~. el Ollf!MO <lb.llaCJo y et te,xto fel~tiYo a l companen color. Los <fibufO$ ton Otiglrude$ en su conoepcln y pretenden la lntetpreta('j()n ~ea de ~l'le'S que pore-set~to reaul!an a veces complicadas o tedoaas. o de lOs dibujos 'f esquemas de ottoe autofes. Se pef9i9ue un cataclerln:Uitlvo. que t.clllfe te comprensin y mowe al alumno al estudio detenido oe la matena. al tiempo que enriquece la exposac:ln. Serta dese&Die qt~e as.1e esfuetzo ptdefa servir para vencer la resistencia actual del alumnado a la con tk.lfta y corwaste de las fuentes tibllograflcas. peta ocwwe.ncerlo de iO anti!KWers!lsrto del uso Indiscriminado e 1os apunle$, propios o ajenos. oomo I'llca fuenle de Wormacin. Como es;imtAo adicional a esta enfoque. ta Editooal tam bln ha ttatado de lograr m precio universitario. Termtnologla
Se hanlirMado la& palabras i~ y .sus trfi~otionGl oxot$ivatnen!O ilor<'ltS, ompleandO 10$ trmlnos Ga$10113 nos wds.tentes. A. pesar de ello. la dOfOcin d ta~nos M ~ <1t 13 equrvarenOia 1ng1osa, CUIU'I($I) 6sta O$ de uso muy extendido en las fuentes bibliogr;Jflcas y, especiBnen!e, ci.IM<b petmite c:o~ndcr 10$ acrnimO$, A eS4o respecto, hemos. dooidido utiiz.ar o.x.ttu:swAmOI'IIW lo$ a.crnimos ingle$9$, .VJO $U u$10 ~tonsivO en toda labibliOgr.tlia y en el Sertguaje cientlfioo hablado; nos parooe. I)Or titmP'O. ~~ betle escasa utlllda que .. alumno conozca la RCP', cuan do en todos los. :)'lornos ~iO"** en que te pueoa movef en et tuwro se enconttar ooo la 'PCA'. Como oonse cuencaa ms llrunatrva o. G$'10 criterio. lo$ 6cldo$ nuelcieo$ 1'10 se llaman ADN y AAN, SinO ONA. y ANA.
E.nfoque a organismos eucarlotas Nuestro tratamiento de la ma1eraa uende a reooge:r et mximo de inlormacin posible, aun dispersa y t$CC'!Sil en ottas !uentee. relatfYa a mamlfel06 en~ y a humanos en particutar. S9 ~iondo . pOc' qetnplo, quo dobo p(:lntt$0 ms. OOfaSIS en el cromosoma l"oumano y sus a!l0t8Ci00et: Que en el m~mo de accin de tas ONA po~merasas de Esdlerichia <OH. Obvlam(ll'ltO, no $4 rCI'\Uf'lda a 18 QfBn riqueza oe COIM)Cimlentos aleaMada en procariotas '1 Vln..s. sobre lodo Qlando Nl.al n~m'laQIOtl os e~ndal para comf)(ender ptocesos &eocos o de inters analitlco en eucaotas. Orlentacl n El oon~enlcto se deSanola pensando en las orientacion&S bi0$31'1il6tia$ que J)OSiblement.e mas reqW!(en del conOC*'niO'IO de los concepcos y tecnlcas de la BfotogM: Molecular e logenie<~ GentiCa~. avnquo, dados au amplitud y su turufo, en el presente lillt'o 90io pueden ap.ntarse las bases mlnlma$ necC$;arias para $u OOI~'C)fcn$in. Por vn l&QO, el diCtgnstico m01ecul6.r, ya de U90 casi ru!lnano en los modemos laboratorios dinicOf par<&. pof ejemplo, la preven eir1 prenatal. 1tt idenbllcadr't de Individuos ooo fines lorenses, etc. Oobo. no ob~10, Mllal~rW que no se !tata de un libro de Pal06ogla Molecular, sino un uooo bsico sobre lO$ OOtiiT'Iitneos neoeosarlos pata abotdar prooeeos palotglcos. Por otra parte. la ter apla moltec:\IIOir. o tralmionlo cte fulufo de ta en!ermedad basado en los avances. sobre moditicac:in gene!lca de la'!l clula$ (ku~ 96ftea}. el ooox:lmlentodelgenoma humano (genmlca) y, tMu 'o1go pi~. $u relaCIOI'I oon la lunctOClalidad do tu P")4tfnas (pro~).
Desarrollo del libro

EJ mtodo de trabafo :se ha ba$ado ~ una tola! COeSi))f''88bSdad y ooottlnaan ele ambo& autotes a lo largr> ero 511 oonsm..eein (en su ms esuiero ~iOo), en varias etapas dutan~oeoloG ;ati wt~~ro tuWs det su ge$taei00. se ha pet !Ido< tOCit\ 1a lntonnacln recogida prevlameme. oon fines dootontos. etc innumerableS ruentes (telrtos. libros especial ~. teviSiooes. artfcuoe origloo\ls, notas por50nal05. o!JC.). Cada tema, t...a vez tedaccada su primera versin. en oca siof'oeos a f)."lt1!1 \10 tr~ en grupo con estuciantes. se tadai)I lnOOtJ)O(ando las figuras originales elaboradas para 13 OC3$in e Incluyendo en ellas ~ ta informacin po$bhJ a eqei'ISA$ del teklO. En una segunda dicho lr.lbt.,io IIG h{lvls.o enrtq~.Jeeido. pedaggica y caentific<lrnet\'lo. potta lt\tlOt de rev19fn, observactonee nftlciosas y criticas rig\lrO$a$ ;~ttll~s por andguos alumnos, oclMI!IdO$. ~ pt~esores. irYVe&~:igadotes y prole510fl.'llo$. Por oJo, OQtl nuesuo profundo agraoocmlonto fos n()ITI()ros do estas personas aparecen ciUKkJ6 en la otlta

pa.

Revisin y asesoramiento
Revisores
Nos es grato hacer mencion oe1 esfuerzo generoso reatlzado pot' las pec"90na9 que han remado temas concre-;os (~e-~ libro, en algt.nO de tos motnentos de su elaboracin. A pesar de eMa OO!.abcM'aelon.la responsabilidad de los P<>Sbles etrO.<l$ e$ SOlO nue91ta.
Miguel Aguil01r Urbano

Protesoc Asoaado. Opto. Sxlquimic.1 v Biologiil MQioc:~r Univtrsid:ad Cle Crctob3

fTflfflM 12 )' r$)


Franc::iseo Javlet lvar ez Pachn Doe'!Or trt Farm3Ci~, 11\Cbstr'la latr'MCtJiica AJc:)! ~~ates (TemtJ 15)

Isabel Fabtegat ROn'ICfO Pro&e$0r>a Tlt~. Opto. BtoQui mlca y &ologfa MOieO!Aat u Universtdad Comp!uoonse de Madrid (T ema.s 20 21 y 26) Mu g;,ti'll Fornbndez: do C3stro Prolesor.'l Titc.A:l r, Opto. ~mica y &Oiogt~ MOitcvltu 11 Unlvtt"Sid310 ComplvlcnM de MoCiritl
(TcMW 20. 21

y 26}

Eduardo Arma Forreiro Cate<*'tiCO, I)pto, Bioquimica y BiolOgill Molecular Universidad de Aical
(Tema 1)

M Oolon:ts FcrnndQ Moreno PtoiOSOf'<) Titvtru, Opto BiOQumica v 8iologia Moleculal UniV91$idad <14 Alc:t~l rrem 4)
Esther FfHret Cebt lln

M Oolores de Arri;J.ga G!n4tr

Protewil Tcu\ar, Opto e.o<wimic:<t y BOIOgitl MOIOO!Mt


UnivetSidad de Ltn
/T>m~JS 2.

Profesora nUJiar. Opto. &oiog~ Ceh.W y Genbett


Universidad de Aleal

3 y 16/

(Temas 17 y lB}
At acell F'o mlnaya vage ProfaSOf8 Titular, Opto &otogla Celvlar y Genel.iCa UnivetSidad de Alc:a! (Tqn!iJ$ 17 y 18} Luis Franco Vera Catedrtico. Dplo. SIOQu!rTIICS y B10logfa Molecular Univer5tdad de Vale.ncl&
(Tema t9)

Mflogros e.,nostcrot Gont-'Jet


Pro!e50'a TittAa.r. Opto. Oui~ Aflnti1ica o lngcnioria Olllmic. UniV9ftidlrd d Alea!:\
(Tetn H )

M" Cat men Boyano Adnez. Profesora TtAat fmerlna, Op!o. BJoqulmica V 8i01ogia M<l'ac:ulaf Univer&rdad de A\calli (Tftm8.5 12 y r6)

Xot6 R. 8utt91 o
Ciontifi.;.o Ti!~rltu, (Afuro do tnvest~g<tcin del CnOOf UnivetsidOO do Sflit.nmca - CSIC (T""" 30)
Fom;~ndo Cllmcnt RoJTKO Cated't<O, Op4o, CienciQ:& Fi&dgtca$ 1 Univet$1dad do Baroelona (iema r3J

X..Wicr Fuentes Ar dc:criv Strvieio CIQ; e.oq.limi~ Ctinic~ Ciudad Sanitaria y OnivCr$1l3rl8 de Bollvi Hospitalel oe U01.'1Jega1 (Temas 28 y29)

J-uan Pedro Gard a Ballesta Ptoiesor Cle Jnve61lgacin. Cen11o de ~ Moleeulat "Se...ero Qoho.aK Uni~ Autnoma de Madnd- CS!C (Tema23J

u Dolores Delgado Vinar


Profesora TiMar, Oplo. 81ologia MOfecdar UnfYemdad de Canrabria

(iemas8 y9J
Jos Cark>s Diez Ballesteros Profesor Titular, Opio. Boqu(mlca yetologia Molecular Urwer&tdad d& Alcaia
{Tema 7)

Ana 1 . Garcia Prez Pfo4esora Tltutat. OpiO. S!oqulmlea y Biologfa Mott:eut.ar Universldad de Akala (Tema31

l.&arina Garin Ferrelr a Investigadora po6doctotal. Opt Haetnatotogy, tmpqrial Co!!ege Schod of Meoctrcne
Ham~mith Hospital, l.Ondre&

(Tema 221

XIV
Lu is A.. GonzJez Guijarro Jess Mendleta Gmez In~~ QOtltrJtat'JO. CfntrO <kl Bio!OQia Molecular sevctO OChOa: y Opto Fartna~ CStC y Uf'ri.vorsidad do AIC316 (Temas 6 y J4)
Jul io Mon1oya Villa.roya Pro1e90f Tllular. Opto. B~mlca y Biologa Motecutar y CelWt Unlvett>lclad de Zaragoza (Tema t9)

Pt-oCew Tit!A31, Opto. ~miel vS!OI(lga Mofular


Univet$idad de Abl
(T.,., 5)

Jos6 M. Gonui~ de Bultrago


Cateorlluc:o. ~. BloqulmiCa y Blolog!a Molecular y JefQ de Seccin de Sloquim~ca, Hosp~,al Un!vei'SICallo UolveNcW! de Satarnat)tG (Tnas28y29)
Pilar lnielta CAno

Profesora TIIular.
Opio, BOQulmica y B1olog!a Molecular 11 Untverstdad C~ense de Madnd (Temas 20. 2t y 26)
Antonio Jlmnez Ru Profesor Tllular. Opto 8ioquim1Ca Urwer&ldad de Alcala.
(TM?a6)

.SOrge Mooknol Sanz Ldo. en Slologia y Tcnico de Cltomstria.


Opto. Medicina Univenlad de Abl
(Tl1fflil , )

y Biologl<\ MOIOQ,jar

Fel1pe Moreno Herrero Jefe de la Unidad de Gentica Molerular Ho$f)ital Aamn y Cajal, M01drid
(Tt;trlt 10)

U" c,rmen Lastra Gonz,le% ProfNOra Trlular,

Op$0 Oufrrnca Analitica e lngerrieri;; Qvifni~ lfflersidad de Alca& (Te!T/8 11)

Javlet Len Serrano QliOdrUOO. Opto. BiOIOQia MOleCular Ut'IYersidad dt C&nlabria (TOI1M$ 8 y 9)
Juan Lpez Bar ea ca!edruoo. Opto. Boqojmica y Btologfa Molecuta.r ~..~rntNetsidad de Crdoba

rr- tt

, . TClf'Ma: Muio Blanco Prole&Ofa TttiAar. Opto, Bioqu.imiea y Biologi;.1 Molac:utar y c.kllar Univor~d do za,il9Qla

Rat~l Oliva VlrgiU SotviC:iO <te Gcn61iea Hospital C11nlco, Saroelona

(Temas 17y tB)


FIMI Or1e0ft Orti!. de Apod&ea

(1emas5y6)

Jos M '" Uacarulla Greole$


Caledruoo. Opto. &oqutmica y &elogia Mdecula.r Utlivorsidad def Pal's vasco

ProfesO( TittAat, Opto. Ouimlca Anallttca e k'lgenteria OuJmica Urnversdad de AJca\ (femtl , 1)
ACI.SCIO ~rez: llblttos PtoleS(lr Tltc.N~t. OpiO 81oqu!'1mca y BioiOgfa Molecular y Ceb.Jiar UniverstOO<J ele Zta~a (Tf!ffl41$ 1, JO y t8)

(Tem.,

121

lt41fcodes M;utln t.t.'lrqufMZ

Prole$0r& nu,llar, OpiO. Blologfa Veoetal Uni\'Ot&ldad dl:t Alc:aili


( TMm21)
ttonortn;~ M~r1 rno:z Blnnco

lu1 s del Peso Ovale Investigador det ServiCIO de lnmloll"'ddg::a Hospital Univer&i\ai'IO de la Princ:est~, ~A:Idnd
(TOfiV 13)

Profesora TTiutar. OtAo Sioqvlmiea y BloiOgla Molecular lkwer&~dad O. ln fTem<~s 2, 3 y t6)

W Begoi'la Martfnez Jatrela

Profesora Trtular. labotatooo do GetlcltiC~ Forense, Opto. Aflatomla Patolgl~ . Metlldn3 l.t98l y Forense
yToxi~ U!WYerSK!ad do l;)r~t~t (Tema B)
Al~to UMtfnez serrano Prof~ TII\llat.

Pedro Pi&clril& Montilt. Investigador Conltatado de Aein(:IOfJ)Ot<1c>tl. Opto Bioquimic.. y 8ioiOQiiil MOIOC\Aft.r Universidad de Crdoba (Tems.s J2 y 15)
Manuel Pineda Prie90 Proie&Of Titular, Opto. ~mi(:(l y BiioiOOa Mok!euiAI llniYef&idad de CfdOb (TfJfflll.$ 12 y 15} MontserrtJI Pinin 84rr1 1u Proteson'l Tllular. Opto. B>qu/m1ca y Bdogia Motecular
Univets~ ~AlCal
(T~4)

Cenlro de 81ologfa MOlecular "SevetO Ocht


Uni~W,'ld AulnOtna de Madnd - CSIC

(Tems51
Miguel n~ Medl na Tortes Protesor Titular. Opto. ~ MoiOCvlar y &oqulmlea Univers.:lad de Ml<tQ(l (Temot 3())

(Tema"'

Atfredo Prieto Martin ProleSOf Asociado. Opto. Medicina Umotersldacl de Alcal

XV
UI ~n Puebla J1 mnez Ptolesom Tltu\;u tnterlna. Opto. S!OqU"l mlca y 8101ogfa Moeecutar Unwetsidad de AlCal

Bar1olom Sabater Garcia Cate<*tUico. Opto. 81ol0g!tl Vegetal Un1vc-1$idad do Alcl\!j


{T6ma21)

{Tema 16)

Carmen P\IQ:yo d" '"' Cucttlt Catodr,fl1~ . OPio. 8ioqufm~ y BiOIOOIB Molecular Uni~ad de COfC!Oba
(Tema 25)

Franc:i.s<:a Snchez J iminez Prolescxa Tl&:ular. Opto. &ologia Motecutar y Universidad de Mlaga
(Tema 30)

~lmlca

Juan A.. PulidO MOfa Doctor en CJeocias Biolgica& y Supe.rviSOt de lns.talaclones. Aadiacuvas (T(IIn;l$ 16 y 24) ngel Regleto Chilln ProleG Tilultu, ~. BIOQuimtC<I: y Siologite Uniwmidad do Len (Tqmas 2. 3 y J6) Eduardo Reye& Mar1i n Profew- ASQCiado. Opto Medicln<'l Univertidad de Ate<~l
{T4mil 11)
MOl~

Jos s.inc:hezPriet() Borj;~ Prolesor T1 tulaf, Opio. BloQulmica y 91ologt'a Molecuat rv Universidad Complutense do Mad1id
(Temas 20. 2J

y 26)

Pilar Sanc:ho lpez ProleSa Tllt.llaf, Opto. Stoqutmica y Siologt'a Motecular


Uf!IWM'Sh:Sad Cle Aleala ( Tema2)

Juan Saus M.s ltlvesf19adof Jefe del Opto. Pa!oiOgla Mote<:Uat Fvndai>On vatoneiana <ICi nvest~iotM:t$ Biomdica$. lnsllhllo de lfi'Ve~igac10nes Cifdgrcas. Valenaa
(Tema 13)

Nieve-s Rodt~ue z Henche ProleSO(S Tttular lntoona.


Opto.
BloQu!rr~C& y

Bdogia Moiecula.r

Joaquin Soler ,..ed1na


ProfeSO! Tllular, Opco. UM.ersdad de len
(T~$ 2. ~mica y BIOloga

Ut'IIV&f'$idad d& Alcaf


(TQm:t 16)

Moleculal

Jos Cario& Rodri.guez Rey


Profesor ntulaf, Op1o. Biokgia Molecular, l.lnidad ASOCiada al Centro de lnvesllgacte:nts Biolgicas UmW~Jrsidad diJ Cllnt8,bri.1 - CS~
(TQtn;J 15}

3 y 16)

a.t" Cristin.a Tejedor G martfn Prolesora Trtular, ep.o. Bicxwlmu~a y Blologa ~utar Un1Y81'$idad de Alcafa
( Temas 5

y ZZ)

l. OOIOfU Romn C:ur10 Profesora Tttular, Opio. Bioquirr.ca y Bologt'a Molecular Universidad de Alcal

MJguel ngel Trueba Conde Profe901 T'llular. O,Xo. BIOQUl m.ca y &ologt.a Moleculac
Un.verSi(l~d OCf

P3is v~sco

(Tema 3)

( T9ma 12 )

Alumnos de licenciatura y de doctorado


Varios len'la$ se .-.i~tQn como !rulo dof tr.Jb<'lio ~ gr14 ton h.1mnos. a l)altn del evrto t99719a AJgonOJ de ellos

han r\risado

I)O&IA!'~e con

especial dediCIICi(ln 1 em3s <I'ICretos.

Gema Alonso Poves LlcenCia<la Paloma calleja Lampatero


Llcon~ ~$tri~

Ctolla Garcta UOteno Lioencit't.<: ~tria l:)rm:~c-;tutic:ca C.at los David Gea Mnctez Licencl3<):) ffanel seo J avier Gondlez Cappa LicenCiado
( TemtJ:t 8 y 9)
8~011rlz Gonz.iiln Oiu Liccn01.8d:l

tnrmatuliea

Susana Cantero Blanco LicenelOOa. residente hOsp!lalana Diana de Crdoba del Campo LicenCiada. n1JW1a larmacevbca
(Tqm;~

1J)

Mon1 ea farto Pareoes Bec:ana ptedoctoral Raquel Fuen tes lrlgoyen ucenctaca. tesieloote llOSplla!arla
l nmact.~lada Fuentes

Ttre&.a GoozaJo L<izar o

Eltalumna
Marta Herrtuu 8etr6n Llcencaada

Rus

ucenCiada

Maria P;~z Jlmnez Hetnhdez


O;ivila l teendada

Raquel

Ga~ia.

bcanci&dt'l' industria tarmaoullc:a


(Tettl8 t4)

Jos AntonJo Jotdn Hernndel

Ooe1or. profesor de enseflan:za !100\M<Iatla

XVI
Cfrl'nt'n Lltano Vaquero OOCiora; industria l~11mt~o6uliCC'I
Lu is AHredo LOIOt'O r.ta.rtln

Helena Rodero Torres


UOMCiada: indl,.l$lria l{rmoo::v!ic&

cenaado; IOdUSITia farmacutica:


Luisa L~.s Panas
IOveEifl9iO'Ml posdoctorBI

fitima Rodrig!Jel: Barrios 8ccana prOOociiOrat


(TO(rl{ls H y 18)

An tonio Jos M.attf~z Osorlo


Uccnoado; ll'ldustri& fttrm:u:6u!ic.a
Paul ~

Alicia Rodrigt.N!"tBobada Jlmnez Ex-afunma

Joa A.lbOrto Rojo Lpoz Llc:onclado


(T~ma25)

l.tat.eiU NUM:t

Secaria prodoctoral
(Tema

"1

Sara <MI AO$al MonecltWo

Uoenciada
Ana Maria Snchez: de Abajo

Elena Mollino Centeno


~;,x,afumna

Ex-alumna
Berta s.'inc-he:r. d$ Juan
E JClhJrM<I

Juan CaiiOS Murciano Fcm&nctez

lnvesligador ~oral M lnmacut.a<:ta Navarro PGrot liCenciada


Gemma Olmos Centenera
Barla l)fe<IOCIOr31

Rosa Snehez Sinchez


Ucen01ada: 1'\duS!ria farmaootlca
Sitvit S3nz Mortltilla

Ooelora; farmacutica eitvlor

Stlt a Otti.z Gatrudo


l,jcneiada: !l'l(lustria ttumaoeutica

Omar Sharal Ordez Eatumno


tt1" ng.Mes Vlllar N~z Becarla predoct0011l (Temas 6. r r y J2)
IU~I Z~rdan Rocfr(gucz Ellti!Umtta

M Terua Pfte.z Mafoto


D~o; loobort~tono ~linic;o

Francisco Javi.flf RIVeto Vilches Becaoo predOCioral (Temu 6. n y 121

Otros agradecimientos
tnerl!atios.. M!lcas, sugeu.mclaa af 1emarlo y al planleamlento gkal. p0r b
gmtitvd:
~&Us vU.a de Grado (Maarlcl), Jos A. Cabeus Femindctl del Campo (Sal<ti'NIIlC3), JoM C;arreras Bar~ t~. Antonio casas Mote'.M (Madr\d), Jos A. Cebrln PWez (Zaragou), Cristina OIJ!gado MontN (Looctres),

TM;<> al lfllefo como dutante el deSM'ollodM libro, drversas per&Oflas han mostrado su apoyo V I)Olrticipado QQI'I c:oQue talrtli6n Querell\00 eK pre$lrlo$ f'IIA$lf0

Eduilrdo Grela Peregrin Gtanada), ngel GJmnez Sofves (Madrid), Niocolils Jo1.1v deo lo! 8e~rrwdt\ (Aie31 <1t HOI'IatO$), Manuel J . Lpez Prez (ZaragozaJ. Jos Manu.l L uque Pin illill {Madl'id), lg.nM:io NUI\u: de Cll.ttto (MAJa g;o), Manuel Ortega MalA (Madrid). Jacinto Pinilla Barrau {Zaragoza), Pedro Rondlt4S Rabinal (Zaragoza), VIcente Rublo Zamora (Valenaa) y Enrique Viflar !Adnml (S&tamMC$). Agradecemos lgua!rnot~te a E~r Espaa, S.A.. en la persona de su droctor.'l edl\oriJI, MariJ JOS Hom6nd~ Gme:t. so con!IMU en este proy~ y su empeo en que el libro haya salido adolan4e: con Joda; sus ~<:10$

te<:nicas.

lndice
I' REI.I<\11'1.-\ HES
PrJQgo IX

'

Pre&enlac:in XI
Revisin y
a~sorarnkmto

xm

Tem<J 1:
Introduccin y aspe~ctO$ gencrf'OS en euc:ariotat t Trans"*Sin de ta .mormacln genlica 1

Tema 8 :

El ONA como ma~erw genllco: AMecedentee 2 Caractetistical5 g9norotcs del ()etloma S


Teme 2 :

ConctensaclOn del OHA y cromosomas 83 Cof'!Ciensacln d$.1 ONA M euca.no4a& &3 Esrudio del cromosoma metarasico 88 Do1ac10o genuca en eucanot:as 93
Terna 9: C iclo c:etul a:r 97 II'IU(>(IUOCIM 97

Componentes

fundamenta~& de los

cidos

nuc:lckos 9
Componenle Cido Fosta1os 9 Componente neulto; AzUcares \ 1 COmpol'lel'lte bSieo: Bases nluogenadas 2

t.a CIOO'Ifttitla en 13 interfase 98


OIVISil'l <k OMtJI8S $(W'l'u11!leas pot mUOSI!S 99 D!YiiSin oe ce!Uias germ1na1 es primarias 1>01 meiQs;i$ 99 Unin 00 10$ g~metos ~s wmnw. ta tecundacaot~ 106 Resumen inl.eQiado 106
Tom~

Tema 3:
Nucle &ldos y n uc:letidos 19 Esttuctura ele ntldesielos 1g E$truc:turo de nuc:lelidos 2.3
To~4:

Estructura prima.ria de <1c:idos nuc::leic:O& 31 Asp&elos geoorales 31 E$11\1C~vr\l primaria 32 Formas de representacin lineal 32 Dos tiPOS de cidos noclelcos segun
SU (X)mPQSICiOn 33

10: Orgt'ni z<'ciOn del genom<J c:uc.:<triOtico 107 Complejidad del genoma eucaribco 1 01 ONA do copia Urw:.a. si"'Pie o no repetrlivo 108 ONA repeb1ivo 109 Estudio eliP8fl!Tief'Cal de la complejidad en el gef'IO!fla de eucanotas 11S

Propeda.dea #!slooqufmicas efe los odo6


nucleicos

34

Tcmll 5: Estructura secundaria del 8-0NA 37 Proporeln ae bases nitrogenadas: R<lgl_,$ <le CMrg;.'IN 38 Modelo de Wa1son y Cric;lt' forma B del ONA 39

Tcm;a6:
Variaciones en 1 01
" trwft.lr.;~

Tema 11: Pre-parac&n de mues1ras.. extracciOn y anlisis de ticidos n ucleicos 117 ObtenOOn y preparacin ptelimnar de !as muestras 119 Disociacin 00 la muestra tiSUlar 122 Separac10n de clulas 122 Carac1enzacWn ootutar y medidas de viabilla<:l 129
Lt$i$ de 1M clula& 132 Prep.voa,c:i" do l~c<:i~ l\Uboefvl<lJO$ 133
Tr'atatni~\10$ atlidOna!as o col'll)lementanos Extl'~eci6fl ~ ti,eiOO$ n.~clcicos por

del ONA 51

Vanan~es en dobfe

hebra: formas A y Z 52 Vartantes lOCales de ta esttUctura secund$rla dol 8-0NA 5& Motl\'OS o:slruc;tvfale$ resPOnst'b1 9$ 00 la urnn 001 ONA con proteina.s 60

133

solubilidad

o" faS<t511'lmi$Qble& 134

Tema 7: EstiVC'tura.s de oren ~perlor de DNA y ANA 65 ~renrollamiento del ONA 66 E-struci!Jra de loe RNA.s 69 Los f'l:lOSOmas 79

Puf'lilcadOn de cidOs nueleioos poc pfeo()l,l\dn salina dr!ereooal 1 35 Aecogoa y oonseNadn de las mues1ras 135
Procedimientos ahema:ivoe: diroc~:<n det ONA 135

extmcoon o anaJas1s

Fr;)CCionamienlo da cicbs nucleicos 1 36

XVIII

11. TRAK.S:'\IIS IN DE I.A IN"FORMACIN GEN"tTICA Y1'EC!\'0~0CAS RLAC10NADAS


Tema 12: RepUcacln del ONA 141 Caracteuslieas generaf,es d& la teQ!ieacln 141
EnllmologM. de la repfie&ein t45 Etapas en el prooe$0 de teplleaein 150 AepUcacJon m!IOOOitd'lal 160 Tema 13: t-ll bfldacln de cido& n ~telco&: fuodamenlo y

Tema t 6: Cfon<tcin celular: Tecnotog:ta del ONA


recornbln.a:nte 197

En:bf'l"'as de teslcci6f\ 197 ~ein oel.f#r <tt mot6evlas c1o DNA 203 G9notoca& 215
Tema 17

mitodo dCI ensayo t63


lntroduoeln: OesnaWr'aliz.acin y renaturaizacln

detONA 163
Anlisis moiEIC\Uf de

Gtomlca. Obtoneln de los map.;t.& gentico y fiai co del ganoma 217 ltUroducdn 217
Mapas genelloos 218

ta hibridacin de CJdos

nucleiCO$ 16'1 Metodos de ensa)'OS de hlbtldacln 169


T~m~a1 4 Prepo~r-acln

Mt'IP.,"'$ fisiO:O$ 221

y miltct~ie de sonda& pa111

hfbridad o 175
Proparaon de $01'1dt\& genticas 175

Marcaje de las soncia.s 180


Temn 15 Ck>n.aei6n acelut.ar: Reocci6 n en cadena de la. pOilimet asa ( PCR) 187 tniJO(h,tCX:Il'l 9CI(I<Itl'l1. fa eb'ISOI()rl 187 A~i~Ci6n in wro <Jel ONA: Reaeein trt c:ad&f'la

Tema 18 Sclcuem.iacin ct.f gcmoma v Proyectos Genoma 231 lnttOOJoeiOn 231 MiOOO c;uimico <fit seeliOneaOI'l del DNA 23t Mtodo enzlmlito dCJ secveroacin del ONA 235 Secuenclaan del RNA 238
Proyocto GCI'IomA Humoano (PGHt <:aractOfl&ticas

l)$tntllll0$ 239
Otros proyectos de &ec:uenooc:in del genoma humano 240 Geomlca comparauva 241

<M 13 poin'lerasa o PCA 188

Ul. E."~WRES I ~ (;t,."'ti <.:A


T~a

19:

Tema 22:

T ranscd pcl n 243

lntrOCIIJC:I>6n: COtl(ltl)40$ genetales 243 Enzimologla de !a lr.lnscPQOn Mec<ln!Smo do l:t


reaccin ANA pollmerasa 246 T~IX*Sn en euearlotas: d!lerenclas oon

El cdigo genttico 287 Atuecedentss V propiedacles geootalee del


cdigo 287 Asignacin de eo<~ones a aminoAciCioe
(;(lntrtiQ$

289

Pf0C41101U 2SO Etapas en el prOCG$0 CIO lrt'll'l&e~ln 252 transcripdn del genoma mii<XlCWc;tr,looll ?57 t~es de la lranseupclon 258
Tema 20 ~ Contro l de l.a e..:pre:si n g6nlea: precranserfpd onaJ y lt en&eripcklnal 261 tntroduccin general a la ogulacin eJe la 4txpr0$i6n

Modele)$ de ~t'&$t'lnUlt':l61'1 293 car;~~tteri~ielt$ eSJ)OC:Ificas 294


Tema 23: Sfn tesls de proternaa: Traducdn 299 Caraccerf5$1cas de M troouedn 300 Fase ptO\ila: ae!lvaeiOn de lOs aminoCidos en fOffl'IS
(Se 8/'I'W'liOaCiHRNAs 302

Fa$8 1: in~cietl 307

gnica 261
C<lr\410II)I'tlrans,c~IOnal

Faso 2: olonga.cin o ala1gamiOn!o do ea ~


263

peptdca 311

Aegd.aelon gentica de la transcripcin 264 ~ 69igenti1Ca 271


Tema 21: Mad(.ltacln del RHA o pt'oc;~samien1 o
potr an&cr lpdooal 27$ illlrodUCCIn 275

Fase 3: tem'llnacin 3 14 Enetg6e8 <tt 1a .$if')!e$is de proterna& 315 Inhibido/es de la traducaon 316 Rogulaeln de la a/MeS18 ptote:a:
Niveles de ooouot 318

Caracterl!Wcas Clfereocales de 1a maduraeion 276

Prooesamlento del FI.NA rmmsnj6to 2n


Prooesamtenlo de lo& ANA& tlbo&mlco y

dO ttansletooc:ia. 282
Mad~M4Cin <te~ ANA miiOOO~I'Ial ~cin POOtr.ln&erlpQOni"tl

Tema24: MOdilleaelonH pos.lt &ducdonales 32-1 lnllduotln 322 Tniffco o destino de \a& protenas 322 Madvracin o procesamien~ dol SJO!i9Ptido

284 y pr(tlrBCII,ICdonai de

naciente 326
Piegamlenlo de protelnas 337 Oegf'&dacin de las pro!ei.NS 340

la expresin gnlea 284

XIX

IV. t\.SPt"rHS A I'I .IC',\ 00~


Tema 25: Ba.s.e$ moleeul ares de la I' I'UJt&eln ~lONA 343

Tem;:a 28:

y l a repar&ein

Enfttmod<tdes
monogtni~OIS

moacc ut;~ r~s: enfcntJC'd:,d~

300

Conoepo de mu~acln 344 Clasl!icacon oe las mutaciones 344 npo de clula que sufre a mutacin 344 Mutaciones. a pequea escala o p~uales 346 Causas y mecanrsf'l\06 bSICOS ele

Conoopto y claSifiCata<ln 389 Enlormodt'ltiC$ exogenas 390 Enlon'l'ltd~tlc~ gonliCM 390


En!Orn'l<~dcs polign~Ca$,

mullitactMales.

mixtas o co~as 399


Tema 29: Entefmedades cromosmi ca& o cl1og4mticas 401 lntroooelon 401 Clas.Jiicacin y nomenclahn A()2 CrOmQ$0n'IOpa!i3t nvl'l\nC<I.$ 403 CromosoMopatis~ esHuclutates .t06

las !'Nl1adooes 352


FlepataCiOn del ONA 356 EnfeoneaOOs humana& a&OCt~dt~& ;:a

la repatacin 363
Tema 26:

Diver sidad del genoma: pollmotfl$mO& 365 ltttroduccen 3&5 Otversldad genica dentro de

una especre 366


Mecansmos tmpl~doS on 41 V\U'I<'II)illdatl

gentJca 366
Consec\lenC~M luncaonalos d&l $)(llimor1i$1'M 368

Tema 27:

An.llsis M genes. De:tecd n y aplicaciones de lO& polimorfi smos 379

Tema 30: Bases molecvklres del cncer 41 1 lntrodUOQn 412 El cf'lcer COt'f'IO enf.etmodad gonli<;oll 412 Etapas caractensticaG- en el <l<t&atTOIIO del cntet 413 MecaniSIOO$ dt tr.lrl$1()01"1<1CI" <lo <:(l:lvll) norM<\1 en lumoral 414 Cootrol de la Ofoliferacin 001 :14ili!IO$

lntr()(luc>eln 379
An\\li$1$ 00 901'1(!$ 3Wl Deteccin Gel pollmOffismo de secuenaa
deONA361

exlfacelolares 420 Flegulaoon del ciclo oeUar 422


ApoptOfiiS. moorte celular progr~matla O liUiCOo oclul;1r 43l
~cnci.- drctl

Aplicaciones de los pol!morlsmos de ONA 384

c.;'mcor 434

Mat<:aCJOte-9 IIJmot'ilfe.S 434

Rolert ncl:t$ hl$t rka$ ..:141


Blbliogrefia 4-47

lndice analitico 449

Tema 1

Introduccin y aspectos generales en eucariotas


1.1 1.2
Tran &mi-s.io dct ., i nform.ac~n genbtiea - -" .. - - ...................~......_ El ONA como m:ttafi~l genhtico! p.11sado, pr.sen te y futu,o ..............................- .......................................
Ca~ctcui-5ticas ~-neraJcs

1.3

del ge.netna..................................................................... ,,,,,,,,,,,, ....................... .

1 3 .1 1 3.2

~de PfocaM&a:s y eucanocss.........................

2 5 5

1.3.3

Magnllud del genoma nuclear de eucariotas, , Magnii!Jd y catacteristicas del gcnoma mitooo~l

A modo ~ inltO<Iuoei6n gener31 a1 presente le)(fQ (y. e-n defln!ttva. a nuesuo enfoque de la a.otogla MOieculaf e Gel'lellea), es ootwenlente deset1bW suanlamente tos tre<s aspecto& que mejor ponen de mcwfioslo ol papel de )OS ilcic'Jos nuc~s en la cUa y en especial del DNA como ponador de la nformaon Qllfl4tica Por un l<ldo. 1;, <le$Crlpa0n giO~ ele l&s rulOs e lt<lf"'$lfli$ic)(l ~ la inr0tm$CI(ln gentiea: en segvnoo lugar, lOS 8fl(ece<lentes e)(penment.ales que dem061raron el import.N'l:o popcl do lO$ ;kidO!I nutiOICO$~ ~le, l:tS earacterlstieas QMf!fales 001 gonoma de c~.Jet~riot4\$ . como punlo 00 pMid3 pata el eshldio posleOI' M prorundldaa de tos conceptos teorlcos. tas
lngo~ia tocnologl~ y

lt'l$ flplieil~ de esta Matea en las cienCias de ta salud.

1.1

TRANSMISIN DE LA INFORMACIN GENTICA

liffM & 'Rl"A <k"'""' & 1 .,..,.,.....,-n,..m,.,

~,.lo)n(U"-"" tfl

rn,_; ...mrnuomJo4;oo

.,. ri O"-" T IV.Ol!CC'IO N


);i.................... om""""odo". ~~!:o.l,..
~llll(""9f V~ ,o)6,!'l,:o6) ~ ri llokN""o

--

f""'Or... ....

lNTRODUCCtN Y ASPECTOS GENERAUS EH EUCA RIOTAS

Fr;)nci$ Crick. intn.xkljo "' 1rmino "Dogma oontral de Ja gen!Jea molewla,. pera desak, lnek.19o a"'es de CQO()(:OflO su import.tv~cia rNI en lo& &$$ vivos, el flujo de la Informacin gendca y la utlllza016n oeU.v de diChO' infQm'IOOn En ooncro10.1a lransmisin de ia informacin conteflida en la secuencia del ONA alas o&Jias y organismos (lesoetdie"'es tnedi&llto 1...., tepfic~cin, y s' o_xpre$in en blomolruras fvndoflales medlarue 10s proce909 de ttat~SCIIpeiOn y tradl..eOien. COI'I'IQ(endo, Pl.l"$ ti ()()l"'j..ttto ~ rel3eion05 gene...- exiS1on!M entre el ONA. el RNA y las

prolei'MS
()et)e resaltar.5e Que l.;i tf)C)(e$01\ttlei6tl ~vi;llda DNA ~ RNA - Protoln<~ no indica la baniiormae>n de una mOie&U en 0178. 1~1 oorno te indica norm~lmonte on t.$ wtM metablicas. sino que cada elemento en la &ee:uerecia aporta le~ lnf0rmaei61'1 l'leoe'lll!lrin para 13 t i nleliS ~ siguionto En este &Onlido, a importante el ooncepiO de planll'lta o

molde molecular: aunque cad8 paso est catallzado por una f!f'l21ma. los sustratos. (nuetetido$, J~mlnokidot) no .&on seleccionados pot ela. smo que ....enen especlbdos por ia lntetvenclon del rnotcle. en concreto pct su $COJetc:, de

nuclel:ldo&. El progreo en 4lf conocimiesllo de 106 prooe&Os de lr.tn&mlsin de la infotmadn genbea oblig a la afYIJ*aCI6n diJ n!e esQVema bsieo origf\811 para acomodar otfOS proce506 ~ tcwnbiM oo.::urren. al mell05 en algunO& orgarusmos l)&t1iOOI.are$, ~mo N d c::MO dt3 <'lgutiO$ virus :
SiMn" .Jo uruo ~~~t~l\'t'W.l de

Jc'A ~Mfll(l'i)t!JOC.,\_ Clllalif.u1i


po.'f" R'\ f(plo~~,;l), ~J;;o fl!

rtMt~duphc.clnd~Wl

11l;um"Jo nnll'. (l'ltK> c-1 ckt mo:&lli< dtl lallacll _.,/

Visin aclual de la tmnsmisin de la inronn.'ICln gcnCsi<:3 ("dogm:J ~1\lrnJ d.: la geotica m:olecu lar"')

replicacin

n ~n RNA
DNA

repNcacfn

de;RNA
traduccin

---lransc.n]>cin~inVrsa

..

Protena

~~,,..,_.,~ & U'-\ ; punir d~l R'-iA "'"'n" ""~' <-MahNJII

""-"'tow~nr'*- hi\ITWjl_ !H.' di tn IOudro~ru..

1.2

El DNA COMO MATERIAL GENTICO: PASADO, PRESENTE Y FUTURO


EJ conOCI"'''ieMO de bl estructura de 108 cidos ooclelcos se Qcla en el siglo XIX oon .. aislamlonto on el
n~

oeuat de una nuel.eina foonada por una pane clcla {hoy. ONA) y u~ par(e bsica (Prolofna).. Clllf <Xln'IO ~n 01e&tvdi:> parO;N. de las prope<lades da la mclalna y de sv JllltiOiOn <:On 101 ~ celul&r. Sin Ornbrargo,. la oaructura sll'liO se

OOC'IOCi a mediados 001 ligio XX, .-1 m()61rarse Qu!: ONA 81'8 el oompooente cromo$6rnloo dei)06flarlo de la inklfmedn gel'l1k:ac. C..C. deslacar.., t$t0 sentiOO. ~ anlecedentes Clave. lOs expe'nentos de Oswald T. Avery, Coln Mac:Leod y Maelyn McCt~ny. et'l 1944, y de Alfred D. Hetshey y Martha Chase. en 195:2, q.,e tor~stituyeo un hito en ol <.:OilOClmi&nlo dol m:.:tenzu genliOO lS escala molecular. Trt~~s estaS- lrC)OitaOOtlet Iniciales. el verdadero inicio de la BloiOgia MoloC\Mr tl'locter!\11 k> tos:lilvy6 aa ~~a de e&tructvra eo <kltlkt tll108 pa;r el DNA. formvl,da, en 1953, po.- Jamea D. W"tson y FntnciS- cr.ek. A p&rtil' ck!l l~ momento, casi lodo o1 cs.ivorto r~ $e Ol!fllr& en el es1udlo del ONA genmloo, desde et puntodEt wsta estructtnl y funr.lon&l, ~n procartotas y e!..leariOias. con una 811encln espedal a mamlf.etos en Qenerat y humanos en particular, Los avances togrados. U'll'lto let!OOS eomo tcfliiCOS y aplicados. han sido enormes. A ello Na contrilMJiclo ltt {)1)3riein de la ingeniarla genOC... ~mo prino!potl ~rea ~8da de la bioaogla rnolectAar. Queda pendianto para vn rvturo i)f.ICimo 13 oorw.:luSIOO del PtQyOC;to Geno~ Humaoo (gen6mlca 1\n::lorml). el an!hws de la. funciones de c9d<ll gn (OO~ica funcional) y la discoci6n de 13 t$1tvdut'a y f..n:ln de In ptotelnas (p'ocOOmica). Como expresiOn <J6 t$10$ ~os oonodniiCiflto~J.. htl su'l)idO ma gran variedad de campos de actrvldad eo las CicnciM de '" $M.I<:I (M!i<'ta, FarmaCia y Veto\rial). '"~ como anbCuerpos monoelonale&. mtodos in'"'JflOQuimiCOs, biOChipS- p~ra el dlag.\$UOO, Clonacin ~lar y elon~ibn aMnal, fafmacogenes.. ingerueria de proteina&. procelnos tt<mbinantes de tn~er!l dlagostlco y teraoullto. 90fldB!I de hbtdaoo. terapia oo:kA<w y g6nic:a, 11'8nllferencla oe genes. vecsoree. Wus. etc. Nuestro objeUYo no es Oeecriblr lo6 aspeelos conCt'9tos c1o $$10$ ~ml)(lt. $ltlO sOlo poner de manlfies1o las bases moAeculares que les sirven de soporte. como p.mo de patUda para un estudio detellklo de cada campo 9n $1J con-o~n~t; jrtA do co~nto. COI'I este lttl se presel'ltan en este primer lema las caracteris.ticas gencrale:s del gonoma de eve8~.

.a

te,...

EL ONA COMO MATERIAL GENTtCO: ~ A~ N.c TE :! C :! E '.': O :!'E~ N.c TE=:S ,___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _--". 3

F;xpt-rhnenro de Avery. MacLcod y McCar1y (1944)

f.~ICI'i I.'C'I!ll ~

de I'IIC'\UJ>IIC~> (Srrl'Jtfdt_o.r.:'t 'li\

jUh~>ll.llltJo') wdeJdM
~,...:ando)' b'ten~.o;

h<ID; > '"'\- tdcl inglb \f'RI<Qlh) A1 Ul)'l:~lM~ {lmdu.:cn n.:I.Hllc..'l!lJ >
.X'aSI(tl!ll!l llll'llu\C 1""" fi61(lt!CS.

JI"' 11110\ c.ip,.11b

de

:~'i;M'.

B,...f'tllll.fiO\'ml!cma<.mc~

_"'"""...)--1

~-

(.llrn~ C'CJ'~ dt ncu!~'<l(o. Pl'' fa\!~ \k 11111 Clt/.111U., 00 ~"n l,t d~"b) "'''f:l IOO fCMI\ al'. OOpliiO_I!.~IIob~ bI(ICruiJ ntg~oua>" "R" (n,li,~:'JJ ca in~J 5b l

Dl>ctenlll -...- ..ukn111

t\1 Wtno.~l.'l o;CJ)\b II'JI"C-<\ 1~ ~.. .t.J.;I.,lr.


Cul<~r
fokl.:O;t; li\UO."''CII )
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...--..

de-Jan. dt '><:f lflfl' !l'>ql~

Gntr.1b. 19l!(J

l.llo; CC(lO"' nn l(lfccuo)'<a R" I'Uo(l.icn tntnsftlmlllt"" !ICm'l~ll('fll<'mC'f'1C il11 m f,"O;~~ l"~" 1 l'f\f ' (>lll;loCll ~on ,r;p..s S" o .. '<!n un ('\IJ,.;I(),\,:clul do: .t-.b be c-..trt~~.:to,...: lr.lO.'cWII 1\blil ctK'<tl'l'lr un wnronmr cm b.~U\ 1o.bd mmd{ln name. el c 11ul
!V~oa 11-. OOfYII)(I;Io:il'ln ~lnt~o:..t '>~'"'*a 1;. del

ONA y f"J((pei.!Jd..~

hS.,.'\1-q.t~lfllh.~ fll~cltC~

(\~(\U~ll.., llr-J\ Cll\111~11~)1\11 (Jihl<.k'n. cl<x.:'ln'fo.)l t~... ). Adtnh. tlo) le Cl<'ldt~ lu \IW\

,.s,w

1rlf''lll>l ,, IJolliflhiCti:'l)lfl lp!'(ll~,.)u .:lit nho..nuo:k11.:. (o.fllC ~,..,el RNr\ ), l)l:fl' ~se p..tdm !,1a.:u 1111d tr.w)iOrnl!liuf:l tr.u d lr..,tam!Cfllo '-~l
dcwxtrnboatu\ku~

Jtf .tlfllk~! ll)('ll'<JI;;, dc CO\IJ'l'l~~l(ol) d~ f'!OfC'olla$ o) llpOOS.. '" \< \'i:la Jfc~wb lXI' el lr\ll~lllk:nf<}Nfl

fa reodiCMon d arim tDi' IOIOOnmi!!Joc U 0 1\A

Ci.,toelusin: El J>N:\ es el n. 'SJXIflS.<tblc de la sintcsis de ln cnltnU ftL'i.'I!S~ri t'l par'allt f(N'lnacin di." ls c.\1pst.lltl y. por tanto. <'S el portado de la infomtacin ;!CUtlca

INTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES E.N EUCARIOTAS

Expt'rimento de Rersbey )' Chue


(1952)

r~li~u6o mcdinmc pt(llifcrtw:in de I(IS 1'i M

\l i.!Nat' tfKluCh\ t' rcua dlfl:r.:l)(-iar l:Sp<."Ci(K*II<(IIt' 1.'wllt\' DNA y prlkina>. o:n 1111 mcdcon )f. o con 1 - :S

1 A

--=-.

Vin.s fl. d~; l.tpo IMn !I!.J:I) <.:s'*':.. cipwlu n cilp;io.b prutcia.

\"mkrt'll ONA1 Stl lntn1 .,_.

H 'tt\1!> ,e; m:m::~


,.,. ftl el 0' A
(\IIU\:;) ll!l)\t-l.'liJI

"'fl .-;~~i?p/

':%'~_....,. "/! ~...,-./~<E;-,:;,,::,:-~ :.::,= ,.", :---.


skl en In.:opdn
(protdna.~. Uu ~a~5

.:oo fslim}

rnol&ulA~ con a7ufh:l

~e - )
~.......JI!X!..,.,..l.~ 'uus inrn.'WI 11111~ Nc1 enas ~. . . . . . ..,,IU:t::l,..,....
(t~W'I<!W sOlo MI DNA}

(R. th"ft'iol. 19' 1)

Al lwlmosen<'fflW"" l\'li11JICh l.u umun~m~ \'tN$ )' ~riu. Po>l CCI)Ln'o~ ~ pul{dcJt $C:PIIr'.l(l(l~ ~truiUo!m:ttildatlt~) \le biSN,;terins(~lfimciUAI.. p('OC'11ldistil\'l() tumaflo

n'"'icbb \lO.. -as


rlldi~th'll.\

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U"O<ri" 0 0 n dlKOiti

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1fBI:Ob&cifl 1

la.'>lxl>:tni:IJ han Sido u'I(C"CWdltt 'IC!r ct \tru.) unt i~harbol pr~n u~a ftllC'\'1 emeraciM .k"'"'~

'----

~t}..~

Conclusin: El ONt\ intmductdo en la btte(eria contiene la ,,ronuacin tlectS>lria paro


generar nuevos virus: es decir, el UNA t.'S el pOrtiido..- d~ 1~ informacin ge:ntii(a,

CAAACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA

1.3
1.3.1

CARACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA


Genoma de procarlotas y oucariotas

Con:ptuattnen:te, el geooma (ce la ralz grieg<1 gen, Oll!;IUn) ~ $Ct oon11idenwo corno et ~patrtmooa:l gen6l.IOO' de un otgal'll8tTIO, es declf, el GOnjunlo t~ de ma1erit1l ~-tiCo I'Mffedit*riO ~nte en una cluls. tanto nuclear como e11.1ranuclear. codlficante o no. La mayoria; do orgoni$t'llOS tM.JseM ut1 get~On'ul eot~s.tlluido por ONA: excepcionalmente. algunos wvs tienen un 90norno de RNA, t.a p:wte <:od;~came <lef genoma. aunque en euc:anotas as m!noritaoa., especifica en bma de 98fl.S _, nbm&cin neeesal1a para dar lugar a prod!JGtos gnico&. t06 RNA& y las proteinas $IO$ $0n r0$pon$3ble$ ae toda t.a acsMdad ceiUtaf. de sus caracterf'stlca& morfolgica$ y 00 muctlas dt i3$ ~I;)YO't tlel oomport<'lmiet\40 de un Qtgantsmo, des6e ta embnognesrs a su crecmento. mac:luratin fl~ e inteloet1.131. 9$\Mo adulto. teP(OductiOn, y 10d~s SU$1u'le::i00eS metabOtlcas y saNidades fisiolgicas. Con respecco al es-tudio del genoma. aeben tesallarl>6 primertamonte la$ <::.trati$!iCM diletend.IIIIH; de ~l)$ y eucariotas:
ll(Ak t(lf\~

IAinmalcJ.. plunu;. k\'Wuru.lt:nt:ll'S)

l'kOt-ARIOT.\!;
1bi!t'l\' .tlll-!

DNA nuck'3r

(cromatma/
crot\'lo~)no'l~

N.ou. ~~~~~... 1"" , bthltol. ~ 11 l~lllll ....., ~ lop 11:1~ d 1 . - o dt tu dhllu NO.;mt!U,....,. ~ ~'QI. N)l!lflW ltltnpK!If'lltrl!'nlt .:1!Cill> ,o.~ lo Qlllodad 0.0 ~A <lllt b anno'I'Om.b t ...r..anc~ a - ) Wf'<tK>I" 1 l>1 ~o'IJHp>lld!nti<! >~ll'floll~ f"'>(~ot tg.oallfll.'n!t. h C11lfll0o<.'ICII!I> <k~ 'll>!l MI)'OI'e> 11;' J,r,. rtuni!IM

proa,.,...,,_

l(,n"'

'"11)"'

R~(!ldese

que los Otganlsmos procat lota.s ('o procarlontes) 501'1 olllas (ecJbacterias y

arq~lenas)

de

IM'\&1'10 pe<)Jetlo (0.2 a 5 .~m diameiTO) c.on membrat\al pla&mbca y generalmen\G oon una ~

odvWr Ogldtl. y

diversas eeuuca:uras s"I.C)Mlciales (1)6. tlagelos. etc.). pero carecen dtl membrana nodGar. d9 ~lo$ y de cua!Quirlf intern3. B g~nom.a d4l pto<:t~ota $ 01. OC>mP&r;,ll'll)tner\\C. ele ~ t.a~i"C> y relativamentil sencillo. Se n:~duoe a un nJCO CIOmQ$QI'OO formt~do por una mol&wl~ c:.'Cult\1 ~ ONA, loea!iUldQ et\ $U$ponsin en el (:ill)$0!. 01'11~ llt'mado\ zona Jk.\Cft:M<> ttUCiltOidtJ. Sin meml)tan& que la delimite. E!llree~le enoon!far. ;,c;lcm.b. una pequet\a cantidad de material gentico extra. no esenCial. en forma de pequMas molOJias dtartares de DNA, 1:3macas pfl)smidos. Los plsmldos poseen la propiedad dG replicacin autnof'l'lrlll.. ea decr. sin ooohnaclbn alguna: eon M di'hSIOn celular. JU(!9an un papel lmpottanie, al eod!!'tcal p-or.elnas que confieren res.slet'laa a tos MllbiOtieos. u otros m~uerlale11 t6Jucos. y ofrecen l.tn8 imponaMe ~ como herramlenlas en la teCt\Ofogfa del DNA reeomblt\an:le. conctetamente como vectores para la lllOOtPCit'8clOo de ONA a clulas.. t.as ot!I\Jias de eoeartot.as (o eueartontes}. &anlo mllloetulares (animales y planta&) COO'IO vnloeOJiares y multitlulares $imptos (Pto1o:oos. hongos y ~lg<'!s}. oon mil$ v~d:(l$ y ~0~1'\V~GI<'S Son do rn.ayor tt~mtlo (1().50 p.m). POse<.-n mcml;lr.Jn~ ~mlltico-'1. pueden po*r PIW'< 0/!M.'tf (platltat}, t.et~en titOe'Squei!!'lo ~nterno, y mue$tt;)n unttgr8ft ecmpMi~taein dloplasn'l'ltlea. con dlfefentes IIPO$ de otgnulos SUI>Celulare!l (mJIOCt>tldriat et1 t'lf'lm'lales y pltl1'113!1 cJofoplastos 81'1 plantas. li.SOSOtM$ IN\ a~~~ . e1e.) y ceras esti\JICb.ll'as (ret/ct4o endop(cisnuco. COfTII)I8jC de Golgf. etc.) El nctoo oone oomo caracterislica esenoal la pf'@WIC13 de una doble mamOrarm nucle<Jr En el QE11'10tna de eucancxa& debe distingurse entre ef genom<J. ~le.-r y el dt orgnulo& El ge_noma n~,~cte<~ r apareoo bajo dos formas eSfructur'*"eAte <Neu~ntes durante e1 cicto oeb.!lef te eromatina (en ~ interla$e enttt divi'$1Qne$), como m<ttonal r.aamen10so disperso p<>t la Mayor patte del nocteo, y los cromosomas (duranle la dlvi!I!On), tacilrnente <lb$ttvttble$ eomo entidades ~as o eotpUscuiOs ltldependlenles Ambas lormas estn COf'ISlitukl.as por &as misml)s moteoulas lineales muy largas de ONA de dob6e hebra. ewechamente asoclikfas a proeeln&s.. El geooma de orgnulot (doroptas.tos y mltoooodrias) est etganiz:aao en cromosomas crculares. al ,gual que eJ de pocarlolas

ovo ll'PO de oompMimuo\acin

lNTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARJOTAS

caractertstlcas dlfer.nclatH

humano

1.3.2

Magnitud del genoma nuclear de e ueari otas

El material gentiCO conwnldo en el ncleo supot1e generalmeota ms def 90% del total de ONA celular. Por 1an10, el ptlmar aspecto a des&acar es &u magnitud con re&peeto al genoma rMocondrial y el de procariotas. A ditereocla de sto&, el genoma nudear est repaltido en varios cromoeomas. en nmero variable segon la espec:i&, 9(!tlen<lltnet\1C muy grandes y oon el ONA miJY condensado al estar estrechamente asociado a hlswnas y otras proteinas. La magn!tutt det gQI'lom<ll v1eno determlr~t~Ci<l por la <:entidad 101al de ONA en el ooojun~ de cromosomas de una 06Uo E$1.<) $C I)UO(IO e.xprc${tr do vtlml$ tonn:as;
En nmero de e~OI't'l#$,

c:acsa c:tOti'IOSOf'M.

d~ig!\OI:) po..

n en org$ni$1'0$ "-~ y 2n en dlploio$, donde hay 2 ~s do

En masa de ONA (pg pleogramos). Como v aJor consiste en expresar la candcioo de ONA tolal en el genoma de una clula ooo respec10 a la PfOMtl\$ Qn l.lf\a otlul01 hclploido <kt la mtSma ot;pQo;::tO. ComQ so~. qn ol1,1las ciploldes ol v;a!Qr p~ &Gf de 2C o 4C, dependiendo tSol estadio del Qc:lo ctlul<tr lo ms habltwf O$ expre:sarlo en fongitvct pb = PMQ de b<t$(1;; on hcbr.a dotllt, o nt = nuciatio$ en hebra

Mn<:ill~. Pttro molCulas ltttgt'S $0 emplean ki100a$es (kb o kpb = 103 pi)) o mcgttbt'ISM (Mb o Mpb =- 1rt pf)),
c mn!Oicionrj . (!Uf reyzaiiJ!!! la III!W!!ilyd dt l UiSA gt:kar ~a c ut acigtall: Pn rro~io. bl ~n(dud IQt:;tl de 0).)A ('Jll.mh :dula 4ipl(lldc c~~ t:~ C'fllfC' ti)' lOO \'CIX."!! ~twpmor quoc-In d< un:.. ttlulo, p~riota. unQ'Jc la diletenci: puede lkpr h11~1:t 100.00(1 \~

por C)C'!UplO Cl,nl'!id~'fliDdn 105. ~ ~~~!k 11l~utw Qlul~ de: pbi!U$ )' 11nfitli~ IT~ 111
rnX'JI~ de m~-.~or amnl)(). el mi<pl~

En fonn:a

li~t.

la toogrlud totaJ dd D'M de: uoo "'"' ll1.1m111

110milti~ flfiplodc~ JI\

C1lll<l!iUUla...) sct ok uflo.lS l m -ttrM.

Al rtfcnt <'Mil cifrn uJ nim~C;:tO de tiluliiS del C\ICI'f" humnDI () billon .. ~ J()!! cilub$). In lutgitud loltl ''-suhante. -1 bltlottes M m l!frM (4 10u ml, cqlli\'a lc u 100,(100 \"clms 11 la 'noerrn (drwnf~rcnc:in de In TW:m~ 40.000 tm;. 7.000 viajes de ida )' vuciUI 3 la Luna (dJ'ItuKb T!~TDI..una - ) 00.1)(10 km) y 1) \'iljd dt 1J:1 y ~utlta 111 S\ld ldl'!a.ntQ .crraSol 150 millollt;'; dC' \m). l'rt C$Cribtr b St'l.'vtncia oompkta del g\~O~ lOOII de: una cifuln hum11~ $e ncccsitAom I .J!O
~OIUihCI)(:S de Ufl:l ubfl'l !cotlSidtrun00 1,(11)() Jljinllli pt'f Vt~lumt'll y 5.01)0 Jctra~ p(lt Jlflinll). que fonnarn ul'lll "'ptla.. de 2(.0 m de allliJ'll La.~ 0:1I1:~ se h3oen <:as.i JQCOChptttiSibks si !:t qQi(.te COBS!odcnu ~ l(IO-l!JI\Id U>WI dd ONA ""'

h>da l:t lnurumi&d (lll:malmet~l<' b lO" tndividloll$)

Procode, por otro pt'r1e. ~~ ta magN!u(i Del genorna de rOna eomparatflla tan!O enue il'ldivKtoos de una mismtl ~ oomo eo1te e-speCies di,etente.s..: a) Toe!,;. las clula& de 10$ ht:ividuo!l d~ una tnisma especie poseen la misma CMtldad Cotal de ONA y nUmero do r;:rom()SOf'RIS De esta geneull:z.aelon deben exoeptlJarse las olotas 09"TT!inales, dedicada& a la repoduocin del lndivdUO, que poseen la mitad. En lodo& bs cat;O&, e&Ca; cifras M fefieron a o6lul3$ en un miSmo ~t.OOO t:1t diviSin ceU9f (normalmento l;la'ltorfaM). puos, cmo ::;e vr.'l post~ntt: (terna 9). b eancided total de DNA. aunque no el nUmero de Of<Jm050mit$, varia en unill Clvl~ a ~ latgo del Ciclo oeJUiat.

INTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOTAS

~bargo, se ~llmil hoy en dil qoo ~ <:On~e IKI08 100.000. de modo que la Pf'090'CI6!i

eodir-.cantc &61o ~nz<~

a1redl!!d0f <Sel3% (~ DNA. lotl)l, Aunque l8 tunden de los ge* e~!i bl6tl M:l<)bleocl~ par~ una pequoa fraccin e4 total presente en el genonta lMnano, la ~xistencla de una correlaciOn entre cantidad ao1a1 de ONA el'l el geno~ y gr.ldo <~& compfejidad del organismo superior puso oe ma.rvflesto la necesidad di;! e~ruci:Sr OQtl ~yor pccisin 1o11 cwganiZJJcl6n esltuctural. a nivel molecular. tanto del genoma (tema 10) CQmQ de b$ gene. (tem{' t9) 1..0$ hechos ms caracterislioos eo relactn oon la complejidad del genoma nudear 900 la presen01a de gandtt regiotlcs qvc: no GOdifican Pf'Odi.IC1o gnfco allguno (DNA no COC'IIf}c8J)Ie) y fa ex..si.P,tlca de .S~Itl$ de OA ~ $8 repilen un nUmero ms o menos elevado de veces (DNA repetJ!IYo). Como se estudiar (0(1 de1enrmie'IO po~~. My QI}O unir a ello la ex1~encw de una enorme drversldacl de secueocras (polimorfismo, tema 26) M diStinll)$ r&gi~ dol ONA, tanto sencilla& como repetitlvas,

oodificantes o no.

1.3.3

Magnitud y caracteri sticas del genoma m itocondrlal

8 gero:na de o~ (mltocondrlas en animales.. mitoconctria&: y cloropla$106 en ptantas) cs., pos.jblamenee, un vestigio del cromosoma de bac:tenas .cwcaicas que oc.cedief011 al ci!Opla&ma de euc&cM; primitivos. par. dtu ~ tr..s ta evoluci6n a dichos orgnulos.- So ace Q\10 1<t millocondritt (orgnv.lo qve apott3 ei90'Yo de ltl enorgi<'l que n~Mn clulas} surgi al acumularse et OJtigono.., 18 alm6$ftlfCI terrstrc Po~o. lo milCondritt y ll mjQoo df;! lt~ c61ul<' eucariota se crearon a la Vel". ill lncorportarno por 4lfldocilo&is tlulas p~riol<ls uorObiea$ <11 interior <fo lct clula wcaribtiCOJ ~ y tusiOnar~et aneJa$. Con el 11empa. la mayot(a de tos genes procariO!icos (gene!! protomitocondri:"'lf!':!l} st1 integtan)(l en el genom11 nuclear, eon 10 ~ et eucanota primiUYo 31\af!tbiOO ya podfa vMr en Of'l:t {ttm6dera aetbic:a.. rica en oxigeno: slO ooa pequera froocin del genoma procaoni1co primigenio $)8f1Tiilneci en la mltooOfldrla. la&c:\.ia:s anlmale; po&eetl un nUfllllttO ""'Y vt~riObiO <'t milO<~. df!pen(liendO el kl;do. Ca(l{t rnllooondl1~ PQ$00 vanas copias do un (lnioo t;rC)m(ISQma, $11uad:)S en la matriZ Milloeot~dr1:tl y aont:lada$ a 1~ cnembtana iti'Orna. En con~i;). el nUmero de eopl3s de ONA rMOOOfldrial {mtONA) en una olula oscila entre 200 y 1()0.000. El ~rom0$(lllna miklOOndlial es blcatet\alb y CirCUlar. como el de j)(OC8tlota9, aunque de tamal\o muy Inferior. 16.569 pb en hc.lrru:aA~n, Q)n ua long~I.Jd de 5 ~m y una masa moleQAar de tO MOa~ e.s1o supone. unas 3.000 veces menos que la longitud del ~romosoma ooelear ms pequeno. Tenlendo en cuenl8 el nmero de OCJPas totale& (2 del genoma nucil:tat y m1,1lhple$, y muy vari3!11e$, del miiOOOfldnal}, se puede calcular que el ONA mitooorw:lnal total supone. dopendiando dol lejidO. enlt$ un 0,05 y un 20% del OHA total de la clula. Finalmente. el cromosoma de cloroplas1os O$ igv,almenlc bc&!enariO y cireulat, pero de m8)'or tamallo (JJ8 el mitooondrial. A dderencla <JetONA nUClear, de gron cOITC)kl;d.,d. oon rcgiOncn oodilicam~ y no codif.e.,nc es, ~ miDNA ts f!n su ca&t total~ ooditcanto y no rqpotllivo En C(lncreio, ~ Ct0c'M$0nl<ll milcX:ondrlal null\&t\0 c:::oouene un 101 a1 de 37 genes: 2 par" rRNA, 22 .,-t~tRNA y 13 para pt01elnas que forman parte de los oomplep:S enzimticouespiralorios 1 , 111, IV y V. $t.'s $Up(Wiet'l slo el S% de tas pro~Jnas mltocondfiMes, mlenltas q~.~e el resto Mtn codifiCadas por Ot4A nudltar.

**'

Tema 2

Componentes fundamentales de los cidos nucleicos


2. 1
C.omponen.t.e 6eido: Foslalos ................................... " ...................................................................................

2 .1.1

Monof06fatos ............................... --

9
10 10 11

2.1.2
2 1.3

Oifosfatos ..... . , .... . .


Ttifoofalo$ .. , , ....

2.2
2.3

2.1.4 Tiposdeenlaoes6osrt~w.... .. ..... - ... Componente neutro: AzU c:"*''"' '''' '"""'' ' ''- - .... .. 11
Componente b.lsk:o: Ba.' " nitrogen<ldiL$.............., .................................................................................,.... 2 3. 1 ~C$ niii'OgcnoO;)$ tnl\!$ lreeuen~ - 2 tipos.......... ....... . ...... . ..... , .. .,_ ,_ ,., ....... .......... ... 2 32 Ollt\$ blt$0$ dO itltetS biOIOgir.O y CllniOo ............. , , _ ,,, ... .... 2 33 ~3<10$ r ~~Sieoquittneas. dO~$ bases pul1r'liea$ y J)ltlmidinh:as , , 2.3.3 1 Exls!eneia de dipolOs .... _ ,_ ,,, ........................................... _ ,_ ,_ ,. _.,----.. ---........ ... 2.3 .3 .2 Hidi'OfObieleac:l... ....... . . .......... ............ ............. ..... ........ ......... .... ....... ...... .
2 .3.3.3

12 12 13

2.3.3.4 2.3.3 .5 2.3.36

14 t4 14 OsposiCIOn coplanar ae kls enlace$ de caaa an1 110 (C N y C .C) ....................................... 1 4 Tautomerla o iSOITierla <lnilmica ....................... ... ..... . . . .............. .......................... 1<1 CarCier bSIOO............................. .................. .,,__, .,,_ ,.,, .............. ....... .......... 16 Absore.Onoo lt'l lu% ullr.'lvio~tt , \7

"".a

Los actdo& nucleicos (DNA y RN A~ e&tan con&til\lldos por la unlon da numerosos nuclelldo&. de .; bpo&. Como &u estudio. se oon&ideran algunos aspe~o& de lntets !)Mil cada uno de los componemes estf1Jaurales de diChas unidades, los nuclebdos
r~troducci6n a

Fosfao(s) Nuclelido + { { Nuclcsido

Azcar + B<1se ni1 rogcnada

2.1 2.1.1

COMPONENTE CIDO: FOSFATOS Monofosfatos

El fosfato 11'\Qrgnk o (P). mezc:lil de 1 35 especies qulm&Gas result.81Mes de &a dlsoclacton oe la molct.il3 de Aeld(l fosJOiico, aparece como anin a pH c.:!o, como dlatliiOO a pH tlsOigico y como ttiani6n t~ vH alCalino En la ~. el losfa!o &e encuentra en fOIITia libte (P1) o fOt'l'Mndo pane de numerosos compuestos gniOO$ (R.P) I)C)r ejemplO. los
nucle!idos.

10

COMPONEKTES fUNDAMENTALES DE LOS CIDOS NUCLEJCOS

~i(h.'t fo;l!<ftiOJ: lliddo onof06!Jrico)

1 -K>-P-o ~

1-i,PO(

.w -"" ' .,

.9, _"'-",.\l _ uo-P-o ~ CY-P~)

,-

.\-

f, .. ruw tnut~au,.._ , 1 P 1 e- mt"l.d:. dt Lu J "'-lillleu dc:l 1.: t.-lhnM


m oltf_.tlf(opo,:lbn~ el f'm

2.1.2

Oifosfatos

El d.ifosfato o plrofosfato (PP.t &e presef'lt8 a pH re~ como trianin (una de las -1 formas inicas del cido pirofosfrico}. Es ~ble n diso!~~tiOn a pH nevlto o ole81ino; 1in ombtlrgo, dOntro dO 13 olt.lf~ es 1110$taCIIO por ~ctiOn de la& PI'Oioff;t10ws. lormttr~<~o 2 P1 Al*ece oombinaec> fund111ment811'1'1en1 e t1t1 nuei&6sicl0s-dib$1a1o (por ~jt.~mpfo.
AOP).
l....,_.<"!Uihhi.,...w~ ~ f~~t~o;.004d poli

ictdo pirofosrtiro:
llic-u .lt) dt f~fi\rx:v)

1 10--- >--<>H -.a: _..

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~ b'

-rmrMtatt f'lfl!lnlt' tRf>l')1t vrnpuc lo v1 ,:atlt pttlfr...l:.hao.kll

2.1.3

Trifosfatos

El crifosf;~to (PPP1 ) e preseda a pH I!Skllgloo oomo t-etraanin. No aparece en forma libre, M10 foonaodo parte. o&cn(::iefr'nen1e, ese nuclecldos-trifoslato (por ejemplo. ATP).

ki(lo tn(oc-l~o
JI4P~Otll

COMPONENTE N.EUTRO: AZCARES

11

2.1.4

Tipos de enlacas fosfato

Pueden distinguirse canco tipos <k enl~c:es fosfto que van a formar pttrt <10 los nucJ(IOtdO$ 0b$6(vst ta estructura y nombre de 10d06 ellos. asl oomo la diferen.:::G enlre enlace esw y anhl~ on tos nuclobdos (llfoofat~ y trif061atados.

r~-. .- P-o

fc,.f.X~h;r

( li:~follli'IIIOI.-':>1cr,

"

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R -o-r -o--R '

ftl;,l~ iS,I('{.

f,.(ul<t.monoiOsfatot un ~;,,:r f:flliM ~H.:Kin ik 1., mol(culu

un -stC'J dobk coo


do6 ~1.'ulas di!l!rtm~

ln[coslilo

2.2

COMPONENTE NEUTRO: AZCARES

El azOcar (ftclalmente llamado OSd) siempre es una pentosa {5 lomos de carbono), biM la 0-ribosa o fa 0 -desox.rribosa. La rtbos.a (nombre derivado ae osa de' Rockefelet' ln511Me of B~hemisuy 1908) interviene en ooclesldos y nuclebdos bajo su forma ms estable. PO.ribofuranosa.

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ol1;;~$ "-~CI'i3s

molo.Aa:s de

m~r$9

OtoqulmiOo:

12

COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS CJOOS HUCLEICOS

2.3

COMPONENTE BSICO: BASES NITROGENADAS

Son moleculas OO!erodcllcss, con ms deo Uf'l tomo de nitrgeno.. lormadas por un anillo llnloo (pltlmdine) o por dos atlllkle condensados (porina),. Obs.tVense en 5os ejemplos de bases qoe lfltervlenen en lOe cldos nuclekos f.a numtf8Ci0n de lOS tomos del helefocldo y la posi016fl de los wshtuyentes eltlemos.

2.3.1

Bases nitrogenadas ms frecuentes: 2 tipos


P{lm~uln:s )' nomencl:uum d~ BASES PIRIMIDiNICAS

l~
" 11
.;:itosinu
bm u

NH,

()
N

nclet) pirimuJin:e

(2-<".u-4~mkiPrimJtnt)

ll.4-.tloxt>$.mc"o lrnmJJII>
( S.metdurki.loi

Su1"''""' .N 1\\lmC~n
(UJR) 6c 1~ :iMtllltYHJd

ta:ICifO
!1.4~xopirlmodmuJ

IIAIIkl pirimidtnl
lo\m!, .,.._,_.
$<'flllllo lloqrooJ

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m'tcl~...-~

purina

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N

OOt:nmil
( {>~.11'1<nl)plif'lllfl)

guanina
U-..niD!H'>~I.Ipwortl)

"
11

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St:IIII."IIIU ~ llliltiiC'J';I~Iat l lO! di:~ -~<kl u.illa punlli:l.

(.'tailk> prnmdilu: .mkk 11111i~iq;


wollo,)nn+~..-.....hl.,.ml

'.,;' 11

A modo do: resut~)CO. la posu:jn de los


b:l> niuo~.:;~ es:
~i1U)'<'Illl.'"' ~~:..; ~.'n Olida u011 de lal

,,
,, '

'

.....
l

CH,

2 )'4

'

6
2)4

COMPONENTE BSICO: BASE'S NITR.OGEHADAS

13

2.3.2

Otras bases de inters b iolgico y clinico

Ei$t9tt QCt <a$ bt~MS pKinu;~s y piwrudtn.cas., en Q(:t"'ernl poto fr&rue!\le'i, (l~e SutQ!m por modficoOn de laS bases pnn~ A. G. C y U o de alguno de ws anlog06 (hlpoxantna. HJ. Son de origen natura1 o sntuoo. lnterv~ en procesos como la melilac6n del ONA en la olJfa y mue&tran dtsbn4as propledaf:)es (anllbiOtleas. antl\llrlca:s. anlltumorales. ele.}.

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14

COMPONENTES f UNDAMENTALES OEJ.O~_ CIOO ~ CLEJCOS

2.3.3

Propiedades fisicoqumicas de las bases purnicas y pirimid nicas

2.3.3.1

Existencia de dipol os

Toda ~s bl'ltell PQSeen lomOS: eleclronegativos de O (e~toeplo a<lerdna), en poslciOn exoclelica o ell'lranudeer, y <le N, IMI<> t.~toc.ielicS oomo ef'l el anillo, nucleares. Como consecuoocla. son aboodSftleS los enlaces po&ares, lo que ' " l)rmitt inltr.lloeionEu entte si mediante pueNes de hidrgeno, que poseea una ImportanCia capital en la estructura ~n(l~ri~ <te IQS AcidO$ nudeioos. en eSQeclal del ONA.

2.3.3.2

Hidrofobicidad

1.01 n.,,~rt'IN:.ttt arcmttue~ de ~ a~ Nlee que las bases ~~gan u.-. mateado car6ctar apolar, aean hldrolblcas y pooo $QiubiC$ en agua t~~l pH celular, cef'Cano a la neulralidad. A pH cido o alcalino edQulefen carga y se haoen ms $01 ubles en agua. Como ya se esrudiar, tas Interacciones hdrofblc:n d a.pllam1 ctnt et. qve tktneon lugar eniJe ba&O$ diSI)ue9t8:S patatelatne<nle (a mooo oe t'nOI'W!dJJs apiladas). son esenciales para e&labiiz&r la estructura tridimensional e
b$ a<:iOos ~W~Cielcos .

2.3.3.3

Disposicin coplanar de los enlaces de cada anillo (C-N y C-C)

Se debe al carctsr arom:tioo. y" pu6de Ob$01'\'ar en mOdelOS e$paclales:


(' itosirm

Adcnn,

2.3.3.4

Tautomera o isomera dinmica

Es una l$01'1'1$tla de ~ f\Jncjoo,aes, Consiste. con carkter geoer.:ll. en lt' rnigfb(ibn del $:1<lm0 de hklrogeno uniOO;) un &tomo de C, O o N hacia 0110 atomo adyaoenle. El tipo m$ ftcuet\IO" lb Un.Jiometie; oetOenllea.
f l)Uli'IIIC'It:l ~C'IO:tt(!>ho.'

41<i ltlo1!t r~-.::u-.,u)


Uo~ 1ipos. de: ~uton~as

umna.umma prml'lrt<l
Nll

raumn~r

OH

u-cjl_
tonnilt.:~I O

< .A..
fon'l\3 .:-nol

!!,.C')l__
fom1:1 i.mina

,J-..:.

Nll1

stoncru!e:;.

f>l'ma amina
prin~ria

SQn muchO$ 10$ eompue$1 0S orgtrioos que emten como mctc:li\$ de 2 o mJ de estas formas tautomttcas, lntcreon~rti'*'* y en ~ Entte 1 06 oompue&tOS he'leroclcliOO$ son do espeeial llmportanc:aa las tautomeria& en la&

basn P'Jnic8$ y pirimid[niCas, en las cuales la migracin del H llene lugar dE!$dle un 10m0 de N nuclear haaa 0110 tttomo exltanuae.at. y vleeY8t'Sa:

Tlii.IWIIli'liU Dos bpos

.,.

la.:.I:UOOIaclilll.'l

rn11 r~~-;21U1 n:t

fnu(''"lC'rW rruna.rl.a

l 3UI001 (ri ta:s

en las bases

nnrog.t:Mds

11~~
lactam3
( (('ut\11 N.'l"-

1 laeuma

Jtl!~
fonJIOl imiM
~NH~Q

Nl-1

/" rnmu cnut


Nn~k'lllt

forrna amjna primaria


CN t'IUCh.: l )

~~

Nlh

o,:H I!IIIC.btJ

4
rn o:ue~lUo>. ri 1rupv o:o:1 o f.;ttJ~~ pa~dt un cnlu!X' ...-.Jn ~i~l~. o;./.rt;ra-. Al cai~P~~r el )l(oulo) .Y J 1dNk d N nudo:;n al O li:t ll'VJ'!I t'(kl. K OIIIIV~\IC' ~ d la tU<.\ ml ' l i(w'""'' F.~'" IU"""IIll.'ti llfua C. Unte., punlli;li OW"!!Il)ltbml. ~ f;t!' J tltttutdlu..~ {", l, y '1 '

.0"1 ~c.wtldwo~.,.ur~~~ l'l!mlf.


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p!rillltdiniiPnunl)>w;shtiltdA. ('. )11 t..ll 1 j'lut!~ o\ ) (;

f:t""

COMPONENT E BSK:O : BASES NI TROGENADAS

15

En oon&eQJencaa.las tao~omerias de la& bases nitrogenadas 90n las sgu.entes;

tina OOsc (A) rrcsenta u~ sola tsulomcra:

La ltlul (lmC.ria de A es
im1ns-amina primari:l.
t~ l:tuWn~m' mrnt ~~ nnmbnm pcmeo.SC \ 111 .11~t<n~co wbn.- 111 k lr.a ~k

~NJ_N
'
aminn

J.:_)
"
o

IIN!.y~) (J_N
~
imina

A NH

llbiii'C"

"

('U3tro bascs(T,

U. G , C) p~ncada

una dos tautomcras independientes:

T y U mucs1ran tautomcris doble. lactamn-laelima

~~~:rCII T
0~1
JI

........
........
lnc.1ima doble

laetanut doble

;)
H

u
l.tlc1ima doble

loctamu doble

(j )' (." lll U(!$lr:lll 13UIOnl<:tf<'l$

imina-rumna pn mana y lac1 amalactim.a.


t w; ln~t~mcr'.)fi imiru. ~ n;)mbr..Jn IX'nrcndo un ll<"l~~ $<litre- b

II:N

I'~N G ""~~-'> NAJ.) A.JlN . . -.'= ...- H


N
JI

Jt

ktr&dr laNse.

lactama y
amin.:~

l:telim;.l e

imin:

Nll1

Jt)
N
JI

110

't'J
N

e*

NB

I)Ctamay

lac.-c i ma e
lnllll:l

amina
eS"I:Ibles.

amna. con lo que eJ equilibriO se ei\Cuenlr.'l de:5PiazMo hacia la rzquletda

Oe$de el punto Oe Vl9ta qulmlco. en las bases lib(e$ 1a11 form..'1$ lWIOmricas laCllma (enol) e .nina son mei'IOS y pOr ello son unas 10.000 veces menos abundarttes que M OQftOSQ()ndiente& ~meros lactama (OlMO) y

16

COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS CIDOS NUCLEtCOS

2.3.3.5

Carcter bsico

Todas las bases nitrogenada5 &OO ba&~n d~blle$. J)Ve$ M lrtQITIC)$ do N, tanto nuelot~~ros eotnO extraMJelerot.." pueden protonar. oon valore& de Pl<a a~mprendidos. on110 9 y 10 Como ejemplo reclort:SOI'tl8tiYO, Ob&rve$e la iOf'li~ll't de la adenina;

t~lguno-s su:sliluyentes.

Sin embargo, es1e carCier bs*::o. propio de los onillo$ p.ritli't y l)irimidiM, se ve disminuido por la presencia de En c:oocreto, el grupo -OH de b5 enoiO& ()' \;lc;lima..) e. ligeramente &Ciclo y puede disodarse:
OH
N ~C

'

Como oorn;ecuetlCia. la& b95e5 nllt008fl.;das QVC I)Q$00n grui)OS. ladama (ceto) pveden actuar como cidos. a tmtd!s de sus t.au!.meroiS lac:tima (enol), c;:()n b tv31-M 'tt (eduCido el C8f8cter bsico propio de tos anillo&. en mayor medida cuooto mayor sea el nUmero dt grupo$ ~OH . V6anse lOS ejemplos ~tes: a) A es la Onlca base que no tieno QI\ICIO cotorenol y. por 1 an1 o. no ITlUeStra ningUn can\cter icido y e& ta ms bisk;;t de todas
o) En e y G. el Unloo grupo OH apol1a"" c;~rlldor jeida nvJY d&bil, 90f lo que siguen oomportndose a~mo basfn;
NH,

(\lido 1ambi.n
para G )

{_] u~o ~~
N
1 <0 N

NIJ

(forma l~amal

"

(for,n:l Lactima)

tfonn;1lactima
ionilada)

(\lido 1.ambin
.,.... U)

2 JJ~

tfom1a laclin).'i doble)


d) Como e,emplo e.xnniQ, jt:ido f'lco (base nitrogenada con ITO$ grupo$ OH) ya muestra vn marcado carilcklr ddo
{at~nque

oo e& un cil: futtte)

((orma l;1 c1urna ttipk ioniil'.a{b)

COMPOHENTE BSICO: BASES NITROGENADAS

17

E&.la di&OGiacin. oomo cido$. de 10$ grupos enol oompensa en parte el det;equi!ibtiO tautomric.o antenonnente con&tderado, a..mentando la presenCJa de las formas lactim;~ (enof). No e<:Utltit un fllfecr.o &imi<w oon las f.otmas iJmrn;t, pot 10 que e.-~ 1a (ltilcUca es oomOn que en las bases nlltogenadas $610 se oesetlba 1a tau!Ometia laetam31aeti~. de rYU:'Iyct llascendef'ICia biolgica.

2.3.3.6

Absorcin de la luz en el ultravioleta

E& una pn:piodad car(l(;tefiRictl de laS ba$0$ punicas y pirimidini~ . debida i'l ~ carlleiat aromitiw. En bs e&pectrO& do absorcin,;) pH=7, se obSoe:Na \11'\& rutw\c al>$orci6n de la Jl.lz en el ullr.IWO(e43 (UV), ton un rrW.imo cerea de 260 nm para kM:ia& ellas.
~~ ll!llok

U>() 1111\

b nu:;eda o.k ~

14
u;knion

21ro nm rflltctl'iertt ron b medida de prod~

Q,:=>"'-r-',
7

'

\
1 1

guanma

'
longitud de ond.'l (nm)

1 1

''

,,,_

El mantcnimiemo .-esta propiedad en noclosidos. nt.ltlebdos y ados nucleico5. de los que las bases forman Pilr'W. POrmito &u vti!iJQ6n C~nalftie<t en e&tot; oompve&tos: por ejemplo. par<~~ la cuantdicacin do cidos nuclelcos (pOg 36).

Tema 3

Nuclesidos y nucletidos
3.1
E&l ruc-tura de nu<:6e&ido& _, _ , _,,_,,_, _,,_,,_ , ,_ ,,_,,_ ,,_.......- .- ............._,_,~--"-~- ..~ - 19
3.1. 1 Calacterls1lcas genera6es -- ...- - - - ... - - - "'""- -- -.. - "_..,_ ,,,_..,_ ..,_.., ,,,,_ ,,_,,_,.,. _ _ ,_ 20

3.1.2

T ipOS de nudesidos ,,_, _,,_,,,,_,,_,,_...... ........... ..,_ ... , ....... ..,_ ,,., ... __..,_ ,,, ..... 3. 12 .1 3. 1 .2..2
3. 1.2 3

Nude&Jdos que f<:ltmaon pana de ~c:icb$ nucte.oo& Otros nucle6sido& de inters biolgico y clinioo _. ..

20 20
21 23

... - .... ... - Anlogo& de nu~idos . inhib1dores de la tran&CtlpiS$CII inversa .. _,,,_ ,,,_ ... _ ,,,_ ,,,_,,_,,,

3.2

Estruetura de nuek!Udos - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 23 3.2 . 1 CaraCieri&tlcas generMes .... - ....... - ... - ...... _.................... _.... - .......... ................ - ...... - ....... - ...... ~... . 23 24 3.2 .2 Nucletidos sencillOs ... -....... -.... -...- .. -.. -- ---... -... _ ..,_, ,.,_ .,., 3.2 .2.1 NOmenclatura . .,,,_,. __,, .. .,,.,., .., ........ ,, , .... .. .... ... ... .. 25 3.2 2 2 E$1ructura de los nucle6sidC~Hnonofosfato que forman pane de los cido& nucleloos 27 3.2 3 Prop~ f~&iooquimica:s de nudesidos y nudebdos _, ............... ~ ........ ....... _ .. ,,._........ . 27 3 .2 .3.1 Propiedades iOonieas ,._ ,.,_,,.,_ ,.,_,.,_ ,.,_,,. ..., .......,.. - , ..,, .,, __,._ ..... _ 27 3 ,2 3.2 Forrn<'Cin<lccomplej()$ , .... , ..... ,, .... . . .......... - ...... - .... ~.. - ... 27 3.2.3 .3 Absorcin de la tuz en el ultravtofel a ,_, _..,_,.. _, __.. .,. __.,._.. _ ., ... ... ... ... , . 28 3.2.3.4 Noeletidos como motec:ut~$ do n~&uf\'a onergtiea ... ... ........ _..... - .......... 28 3 .2 3-5 HC:Irll&i$ _,., ...,_ '_,., ..... ,.,_.,., 28 3 .2 .4 Nucte<ltil:$ cidicos .....,,.,_, _,.. ~... 29

3.2.5

Nuo!e(idos OO<Piejos. , _.,,

29

3.1

ESTRUCTURA DE NUCLESIDOS Con-esponce at esquen'la gel'lerat: nuclesido

= base nitfogenada

+ azcar

Tatnbtn Pvoe<lefl con&i<ferarse como el producto de la hidrlisis de lOs l'luCietlctos, 001'1 liber<'Cil'l do fo st3to .-.otgntto. Equivale, por tanto . a un nuclelldo carente de 1 0$1 0'110$

20
3.1.1

NUCLESfOOS Y NUCUTIOOS

Caracteristicas generales

La \P6o oovalente (~..ce N-gJico$ldico) onV. ao bMe y ol O'llli~~~ ~tibost'l o oesoxirrbQ$8} toe ~s:lablece enlte el C-1' {carbono ancmrico) del azUcen y el N-1 del anillo pirimidinico o ~1 N-9 ~Millo purlruc::o, oot1 prdida de un~t

mol6eult'l ele~

oildwdo
llll<t ba,~

nu.;koHk'
IUIII biSo;<
pitiGlldiiiKII

purlnlo;

,.
Ofl (0~1

3.1.2

Tipos de nuclesldos

Debe disl!ngulrse entro nuelt0$1do$ oonslltuyentes de addos nuclelc:os y otros nuct.sidO$ do In~ biolgiOo y d inteo. Su descnpdn sie~ se hace en f1.11o:;;i6n do la na.turaleza QO!IWC& de la base y del azOcar.

3.1.2.1

Nuclesidos quolorman parte de cidos nuclelcos


Nudcdorii.los pu.rrrucos
N'~~eil~idoo;: pirimidiokos
ttl~h;c.\~l!li}

'
,...
e , :; ,

~
~

nl>tlllw-k\1-i<Jull (.-..; ~\IC!Mr.ll t"tl d 1" <\ ) )' (.:n RNit.l y dr;o~>m"l>o."'iil. ll:t ';.t\l""t..,. r'floueflll'illl &'11 d U 'lA lle-IITibon~KWsicli (t n. DNA)

delitlXInlbOMitlo:oddo>
lf'!IU~Al

n\o!ollt~c-~.111~

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C. 11
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II<X'Ib .n.

,,

T.u 1..
~ ------ - - - -

,_ ..,. E ------- -------------------------------2' -dCSOAiocitidi.Jlll l '~1itnidiM 2 di.'SO,iad.,..no!lina l'dcsox " -----------" ...... nllu{o;o,....... "~" - ;'c\,
~

su liJO -K1111a ............... ~ ---- ----~~iJo .!"!~ ... -- ~ - -- ----------- ....


:.d~ln.a 1 1' l!--O.tcloo.oflor:onuolli

guano$uli:l
~lfu

11 1!11!1..

tiJidltl!l

'J...4 1'-04!Htlu1n1Mil)

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lll' dC'!IIctl!I'-IHl

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"~""';_!) .........

nhc>r 111_.._l~

1-(l' -lbol.l l' ,_.,_ ni'Ciflllll-1) t unin

la Cfi$1Anclon antf9 nbonCJCieSidos y


de$0inib<>s:~ en la molwta

desoxlrrlbonllde$~

esllit'la, obviamente. en la presencia do

rl>o$<t

ESTRUCTURA DE NUCLESIOOS

21

3.1.2.2

Otros nuclesidos de interCs biolgico y clinico

Adems de los oompotle:l'\1es de 1\uCieObcfOS y ic:ICIO!I nucteleo!l. eiste' en lf'l Mtu1111ez:a 0110$ nu<:le0$1d<)$ en IOrm& libf'e o oombinM;a Algt.mo$ do ello& $0n $igr'iiri'C<'Ibvos l)(lr ~;u lo~tJCIQn o ~CCin b.ioQuin~n . o induoo por sos apllcactOfles elinicas Deben citafSe louigu!entes

s-j)

""' ' IIOCV'Y


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11

inosina ( 1)
j)..j ;~o.

(COOll)(lnetllc n1 inl)dt:tri> dd ll<l-1 A. en d hr.v.o dd .aniJcudUn. [l:i. H)

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N'~mld.lb.ltlsnu

puromicinil

.-.~!CnkllmL"lm l.)).

nn1 b inusilad e ni na ( Ar"::A)


11-( ~IMlolllluul"'"'""'t 1 :Kinmu

ara hlno~iltic u~hl a


(Am C)
1\l '..i-l).~fior.uU~I
.. 1h l'Jillll

22

NUCLESJOOS Y NUCLETIOOS

Cmfl!lll..

"'''llo._"'f''"'k.o.' A. B. C, D
\lhlllll)-'

\11: ..('U,
h!Kto.lo.>)

A ti lo:<O\;fl;
,,..,.,.,...,.hito v ltl,\'hl.omW.tl 1' ..(_JI..('II,.CO.Ntl,

'~~~o"''"""""''-'".,'

' 1'

t ,,~ua~

5' -dcsoliadenusilcoballunima (unlll (1(' las ffl rllln,( t(Jeu.dm:1d~as dt l.a 'it:tmlnu o_;, 1~ en~ """ii' R1ll Yfi:rrm.:ii6n ~

-.-c.c,

ESTRUCTURA DE NUCI.Enoos

23

3.1.2.3

Anlogos de nuclesldos, lnhlbldores de la transcrlptasa Inversa


lnrnunodellclencra tunana (V1H1 y VIK-2). causan~es da! SIDA. En tos eotwierte en lOs eoespor.tte.ntes desoxitludeOsiCIOS

Se~*' para combatir tos rettovlrus de la

retWK:S~ aeWM como l)f'Of;';rrrtaOO$ ya que ta celu!a an.flVIOtla 5' trifo~fato. que son los verdadeltos firmaoos. pues eompiti!fl

oon los de$0J~irribonuelettc>$ normales. 1mpicliendo ~

ea ttansetiCltasa lnYBtsa. ptopla del v.f\ls, sintetice el OHA COI"'lPlementanoal RNA vinco
" 1!IUtUkO\ lk.'\t 1'\

Uased: la
..uc d~n\<Jn E$trtl(tu r;

fmliru

Cit'l!\in:.

Hi(k"3ntin;l

~
NQml)~
C:<lfflpl~10

" '

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2' .3. ~ll idQhi(lr~-... 2'.J'dideSOXI
timi dina
2',).'-c.Me~.-.~i

<>

~"
N

)~,

.0 "":.X> 1.., '


1' ,J'd ldC~O.\i
mosina

'11

"

. r .;~.t;i.Jo.
timidina

1' -c.1~o"$0Xi
)'.til.Jc:ltldma

1'.3' -<JideSOM
,\/T 1 idm 11J m;a

c:nidin.:t

NQntbfl;:

oomcrdal

d-IT 1,,nudin;l

dd( l..tl~ltahin<~

l l( 1~m\ 1Mfiu.<1

ddl
1) i,J,U\1,.,. ifl;

3.2

ESTRUCTURA DE NUCLETIDOS
Corresponde al esquema genet"al:

nucletido = nuclesodo fosfato(s) = base nilrogenada azcar+ fosfato(s)


Tamfln se puede cons.toerat cOtnO:

nudetido = azcar-fosfato base nitrogenada


Nuclctido

3.2.1

Caractersticas genoralos
se e:sl.ablece entre uno o varios grupos fosfato y sel\006 grupos

La ~ . de carcter eo~te (tosromono&$ter),

OH ~~ t~ZIX:t'lt del nllde$i(lo

La ImportanCia de tos f'k.M:Ieotldos es eKoepcional, ptir'IC:ip3!mente porQvO $()fl k)s mon6meros constltvyentes de tos c\0005 nucleic;.o$ y. POr tanto. los productos normales de &u l'ltdr611sls. Al mismo tiempo, porque apateeen et~ lorm& lif>fe en disbnCas localrz8CIOOes subcelulares, forman<lo parte de molculas Cle gran l(ltetes DiOquimieo (e$C)eeatmentoo coenzmas) Para estudrar lOs nucle6tld06 se emplean diSI.irllos crfte-rlos de Clasiticaein, acendiert<JO., Carae1erlstlcas esttucl\.l"8tes, ctitetlo U1111z.aoo I'M)frrta!mente: El n(lmero y poslclbn en et azOCa de tos grupos IOSiaiO. nuctes.icto$ mol'l()fo$i310, -bi$1o$1ttto y .tn.sfot;f.ato EJ tipo de azea,.. rlbonuctelldos y 2' -dC$01(irribonuelttiOo$ El tipo <le baSe nitrogenacsa. nudeOtidO$ purin1eos y pirifTII(.!iniOO$ Ct~~r3~e line31o cictioo (dmermnado POt ' fO;Sfato).

24
Otras carac!Kr~leas . atas que slo se alude ocasiOnalmente: Proeo<Jtneia o es~ en 1<'1 o&kll8 Funcin. etc.

NUCLEOSIDOS Y HUCLEOTIOOS

....

3.2.2

Nucletidos sencillos

Se oonslderan nucletidos senc:ilocs lo$ q.e presentan tosf;.rto(s) on 1)1\CJ $da po$iocin def a;ilct'r: os1o inch.Jy~t tanto fO$ oue tienen un Unioo I0$.1810 ~onolosratos) como lOs que Uenen dos o tres fosfatos que estn unidos entra si {dtfo6fatos y lrifosfatos) Se muestr<10 como ejcmQIOS tos eoespo~lentes 8 adenlna:

Nuclesidos-Monofost:no: 1N M P)
(P n(lrmalmcntt en 3'
1)

Nu<"le$idos-Di fosfato: ( NDP 1


(P CORSUii\'0$. DOrmalmente ~ S')

5'. rarantei\Ce en 2')

N ti~

S(r)
()- -Q('H,_A.

,.,.,,
d AM P AMP

r.~tu

,,

' '

. ..._
.1
ll

o-1!~-~-o~j

Q"'

" J...,._l l:):N


1

NH,

N N<J

f 6

.1
H

dA I)I' AOI)

H
Nll1

En forma hbr~ y .;Qmo JI'ICNl(~'"ten)$ ~'<Mbt1tu)'CTitcs de los C"idoo nudcico~

Slo en fo.'lmla libre: tienen funcin

~m"rgtk,.

Nuclesidos-Trifosfuco: 1NTP 1
(P c>n...."'CuLhi)$.
nom~alm~'tltc en S')

Sl<tcn l(lt'Yl\ll libtc.

Son lo$ 101.S i mpoelnant~'S por


stl

funci-6 cncrtica yJo

o-IL-o-l!-o- ~-o

p o

" o

't~).
N

.,;QCntmd tiCll. Adnu.b. SOtl


pt\.'<:Ur:)te$ ~'1'1 la biOS.iiMcs.iS

bt b t

"' ..o. ......

dATP

t\TP

1k ddo nuclciros

, .,
s.

.1

lO$ nuciOOikiOS que torman pane de los CIOO& nucloico$ sen siempre NMPs oon un fOsfato en posicin Su es-IT\Jctura y nomenetatt.wa se estJJdlan de forma detallada a continu:tein. Lo& nudeeldos con 2 3 fosfa1os consecutivos en (dloslt'IOS o NDPs y trlosf.a1os o NTPs-, respectNamet~to). dllda su imponanta funcin bloquimica. son objeto de esrudlo en QJI'SO& de SioQui~& Generat ~afmenlil . otros nudetidos. oon m ra1os on mlliQies poslcbles del azOcar. se est\dan pc)$t.eri0fmel'lle oomo nucteo!Jdros clclicoso compleps (pg. 29)

ESTRUCTURA DE NUCLETIOOS

25

3.2.2.1

Nomenclatura

lO$ A~~Cietidos s.c nombran se-gn dOS Criterios:

a) Como steres fosfato del n1.1closido. P(l( ei~: adenosina-monofosfato, guanosina-difosfalo. unchtl~rlfosfato, etc.- (llble'Vi8CIOS.. respeC1ivamen!e, como AMP. GOP. UlP),
b) Como icldos. sustitttyendo la terminaeiOn del nombre de ta base por el sufijo -iNco. Este criterio slo se ul:litll norrnaiMMte para tos nudet5idosmonQfO$fMo. Por q .: 6Cido adef'tllco, ciOO guan!lroo, cido undilico. etc.. (respectivameole. ~1'3 AMP. GMP y UMP). En el caso de nuclebsidos.-<litosf31o y .tfifOSf310. se emp6ear'lanl0s nombres diadenilico. tritu::!eniieo, diguar\lllco. etc.. (para ADP. ATP y GDP). Si se quiere tontr en cuel'lta que IO!l restos tosfato eslirn ioniUK:IOS a pH rtslolgloo. se ut!llz.a el wfijo ~ato: adenilato. gol'nit;)to. ~dilftto, etc.
C<ltr~

.rvandeoci3 <'nu .. l ~ nomh

',s,. h:t,.e~.

IIUCicb~1.Jo~ \' I'IUd\'iidM:

llbtc-nturllc(lmU:u.

u
Ul'aCiiO

,.

e
citosn:.
citidirn~

bm:
nuclesido: nucktido:
(tlu\'1(6si<lo monofo.sf1110. NMP)

ndcnin3 adcno$ina

guanina guanosina

lim.ioo
timidin.'l

uridina

timidilato, citidilato. gu3nil;no. uridikuo. adenilato. c. adt"nlico de. guanilico 3c. undlico irc. timidlioo c. citidilio oTMP oCMP oAMP oMP oUMP

Sajo amboe critenos. pata, indic{lr de forma 11\1\s delallada la es.lruaura. &e espeCifica et nUmero y toa POSicin do lostotfatos.. Por ej.: 5' -N/IP adenosina-5'-monofoJfato ~CiOo 5'-Menillco y......,p adenosina-3'-monofosfato cido 3'-a<Senilico 8cldo 5 '-dladeni tico 5'-AOP 01Ciei'IO$il'ltl5 '-<li'IOsla10 acldo S'ltladennlco ~f-ATP aelonosinn5 lri'Osfato Cuando 110 se especifica el nmero. impflc:ilamente se asumct que., rostmo ocupa &a poSiCin!'). En este senttdo. tos dos UltiiTIO$ cjomi)IOS se IIO<tHan !limptemenlil comoAOP y ATP. Esm si:stemoas ele nomet~ctatuta se S(liean tanto a desoxlrribonucletielos como a rtxnJctetidos. L.gie<~mente. para tos prlmetos debe anteponerse el prefo d0$01 o su forma tlbreviada, la letta d . P(l( ejemplO: desoXJtlmldiM
rnotw)t'OS.fato. dTMP. de$Oxltlmldllato. ~ -c!TMP.

Una forma aun ms abre\llada ele reptesentar 106 oot~esidos monotosfato es mediante In inici.,l de su l:>i'l$0. anteponienOo '" lctr<t p si et los.fato se ul'le el'l5' o posponiendo la -p st la unin es en 3. Pat ej: pA. pG . pU, Ap. Gp . Vp. Este criterio es de intets para el e,.UCiiO 6e la nicltkls. qulmlca o enzlm3tlca de los. cidO& nuclet<:Os (pgs. 35 y 198).

US l3l;llaS siguielltes resumen todos tos nucletid06 sencillos (NMPs. NOPs y NTP$) emteo:es on la ctlul,
IIICh.r~dO SU$ clh;linll!$ d0:1'10mi'I8CiOI'Ie!l.

26

NUCLESIDOS V NUCLETIDOS

llMf'KLATURA DE NUCLE!niOOS SENCILLOS Pt.RINICOS

Ribonuclc6tidos

2' --adeni lato adcnosina2' IOsf:uo

5'-udeniLuo ndo:nosina-S'fosf<Jlo

dcsoxi-ctc.

desoxi-ctc.

(la dt:soxirribosa no ienc .OH en C2)

NOMENCLATlJRA DE NUCL

IDOS SE.'IICIU..OS PIRIMIDI NICOS

De:tO:\itribonuclelidos

RibonucloEidos

---()

<k:soxi-

"'

(In dcsoxirribosa no ticn~ .01-1 en C2)

ESTRUCT\JR.A DE NUCU 0 TIOOS

27

3.2.2.2

Estructura de los nuclesidosmonofosfat o que forman parte de los cidos nucleicos


f\udco.\~idc-mc~noti~f:,to :omponcnlt's dd

RNA ( - ribont.K:Icilcidos)
PimidinJCos

Putiniooe

oi-u-Ltf:

, 8 "8
o=l'-0(:,..

~fe,
000 000
A.

o ,.l~)
.
Utl Oll

=I~"~
1 11 "'

001-fu

o=r-<~

lllil.:nltliO,

,u.l,.. !'AMI',
,J-

gu:~rul:uo. (.\11'. ~'o(; \11'. (..

uridilato.
ll \lf>.~l'~u.

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l.

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'<thl>ll.. ~-f....fr.S il

j ' IOO-fMO

, ...no,ill o~ f't..f...,

.,,...,...s.r ,nr~t"

Nuckh~ mooof~fa1o compo1~1MCS del


PurCI.OOS

DNA ( = dcso,ilribonuclccidos)
Pirimidlnicos

1
lf:.."'

o=

"8
t-()<'11:
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ooo
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dtw~!jliJ....,.~.-~ (..,..C.~

c 1" " ~~~~"'~~" .n.

<k~i~lltd...... ~ -(.,.f.Jh)

3.2.3

Propiedades fisicoqumicas de nuclesidos y nucleti dos

3.2.3.1

Propiedades 16nlcas
fOOS

como oonseewia <le 1a disoeiaciOn en disolUCin ecuosa de tos grupos P, PP y PPP.

109 nuclewoe

(NMPs. NOP$ y NTPs) muos!nln un m;n(Ndo <;<1r&ctcr o\<:ido. con 2 , 3 y 4 valtOS de p~<. . rcspec!Namemc. En genert~l , al sor SU$ valOres e pK01 irrferiore$ 7. w encuen11an ~rg-3dos negntivnmonto (O)IJ$!etl como Mioncs) a pM fi$io10gioo Gracias a este <;areler aniniCO. los nudetidos forman salln <;on metales. son <;rist;~l iu bles y s011 ms solu bles en ag153 que los l'lutlesidos o sus bases ntCrogel'l&das.

3.2.3.2

Formacin da complej os

Los grui?O$ PP de NOPs y PPP de NTPs muestran gran afinidad (IIITP 10 \'ete& ms que NDP) por callones citvalentes. como Mg2. Mn2 y Ca2. Al estar slos presentes a alta ~noentra.x,n en la clula. los NOPs y NTPs no existen como aniones liDI'es. sino lormanclo eompte-jos q~lato 1:t. S)t!ncc:>al<ertle eon Mg2*. Sajo estas "formas activas' (MgAOP' y (\\1ATp2 ) ambos nudeotldos parocipan en reacaones enzlmllcas de 1ransferenda de foe.fa!o.

28
3.2.3.3
Absorcin de la luz en el ultravioleta

NUC LESIDOS Y N UCLETIOOS

y lO$ nvCIOOii<IO$ mvostran el earactcristioo mllimo de absorcin de la luz en el UV a 260 nm. debido a la OOM nitrogenada oorrespondierrte Por ejemplo. los va~es de absontvldad mOlar (, en M t em' ) de algunos nucle6sido9 -monolos.latoson los siguientes;
Los nuCieSicJo$

AMr>

GMP

UMP

Th9

CMP

15 400

11.700

9.900

9.200

7.!00

/ Veamos un ~j('mkl d(' SJIIiradn prirC.ir de~~~ propiedad; ~ 5in~o-'fl p;lr:'l e:.kul:n lla C(!nccn\Jtlcin. n p;u1iJ de l;a fnnul~ R..-nJcsc que c'$1()1; \'3IC1n.
A~~

t;t+ b (~ -(' '"' A ~ 1 ~~6t b)

absonhidad rnolar (an1~'S llurnada coefw:.enl~ dt ~uncin molar)

e "" coocen1,.;in

h "" p11W plico

molar

ONA k a cquitlll)l;u 0'1 1~ CWIITC) desxamlxlflutk'Lidi)s. alwlar la C(lfu,:cnrmdn m1hmQI;ar de nut:lettdtu <n 111 mcn::l:a :mah:tJad:a. Allfat&r.oc tk un:a rnl"'t.tla o:quin1ol:ar. el C(Jo.'f1C'i~ll1~ de ~.xtu)('if'l s.:ft 111 "~-dia.

Una mcl(la de nucle1idos.. ob1cnida por hidrlisis <k una mucst.ta de DNA. po$1N' una absorlxtJ)('ia ~ 260 nm <k 0.547 (mo."di\1., <n un11 cubel:;~ de 1 cm de: pillO ptico). S..poniclldo que 111 <:omposkin de ese

E ( 15.400
~ucgo:

11.700 + 9.200 + 7.500 ) / 4 10.950 M 1 ~arr

e ..{ 0.547 1 10.950) M = 0.05 mM

3.2.3.4

Nuclelidos como molculas de reserva energtica

Muchos nuOetidos {fundament.M'nente. NOPs y NTPs) actan en todo lipo de clulas y en rrdtitud de procesos metablicos oomo eompuest<>!l rleos en energla. Entre elos, los nuelesldos Wo&fato in!Mvlenen como pteanores de la sntesis de ONA y RNA. con libefacln de plrofosfato.

32.3.5

Hidrlisis

l.Ot nueleo!liclo$ y nueleOtidos J)Uedef'l sef llldtoizados en sus ~es. en medio ddo o alcalino. Esta hidu!l!isis quimiea PoS.OO eieoo interS en el esbJdic:tde lOs tcldos nucleloos.

Nuclelido
RascAzi~e3tP

ludroil~l) 111: 1da "ll.IH' N-glieosl~ __.....---\..


CflliiCC

1"(14.\lta

del

-----

--......_

hldf'hu'i ak.uln~a

rotur:'l del ..i.':II IIIICc J ------~


----..._

~ , Ba..<\1! Adtcar-P

Nuclesido ,

Bal>e-AzU.car

A7(tcar

1'

Sasc

A.Wcar

ESTRUCTURA D E NUCL E TIOOS

29

3.2.4

Nucletidos cclicos

Son nuclesidO&mono'o$f.ttlo en bs que un miStnO lostato &e une a do~ poaeclone~ del a:cVcilr (do& OH diferentes), generalmenle 3' y 5' Actcln oomo $8900(10$ men~~. ttaMI'I'Iillendo sellales desde el enlomo (POr 9J$mplo. hQnnoMs o prime>S mensajeros) 1nterior celular.

.:o~.:r

"""'k .. ,. ""'""' f...r.v...


~

lflll.~~o>:

'~'""'' "~
,~o,;h,'l))

3'.5 -fosiUto cidko de adc:n<JS.ino r


(
\\IP~o:tdil,

.s.ti)sfall) d clk l) de gu:u)t'cSina


( (o\1J>ddK\), (."(;\11')

e\\IP)

3.2.5
a~os

Nucletidos complejos

F~almente. se engloban en este apa!'Wc.lo ~ n~,~CiefidO$. no componen1 es de los a~ nuci&Jcos y con 1\Jnciones dilferstlS. Que etlruC!ura!mMte Cli1leren de tos nucleoudos senoiiOG en uno o varios de los s~o&

Va.o$ grupos fos.ftel O estetifieacJOS en poSiciOnes mttlplesde' azucar (bis y tnsfosfatos. CoA. N AOP"J. Presencia de dos nuclesidos, t.ndo6 entre si por un 'puente" de gi'\JPQS lost.Mo {FAO, NAO. ~A) , estos e<~uan cJentto de ta calegorfa de dlnucleddos.. Presencia de otras b&Ses nitrog&Mdas (FMN , FAD, NAO. NAOP') Presencia de azUcaro$ di~ini0$<'0 1 3 ribOfi.Jranos:a {FMN. FAD}. Grupos funcionales a.c::ionale& (CoA)

IJI'St iiS t .I\ICl\

Adenusma3'.5' .blst'os1 1llo

. . ,,,.. ~,

_,l'~.l

m i""'

f.:od'umonosw:r irld.:p. -ndi.:llk$

<'n J"'"'Cioncs
d:itliUtl6 &,- tlll
nlbU~

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'i:-" ~
~ coo un f~llh,'l n\irs ;d'
~rill nd...oosina

'

2' .)',5'.trhf(Kf' ei(J

30

NUCLESIOOS Y NUCLEn DOS

' OP'Cll\1 \ (i RII)O>,

Mononudeudo <k tl:mna. FM~ :

Dimtelt,,d() de ll:l\ u l:l '} udttum. FAO:

":XX"i~l ~ u. o
N
1>- -<>11

nil.roe~!Olda
(dUII<Ctl~

<ilrnb>oe

t9011k.XIICIA'l.

o na:vuuu

"

......

nbmam(onna lmol.)' m(l(li tk:ada


i!tl 1'11

lh< J!J ~ ,~XX, ,;.., lb ..... ......


' 11

or.n ba~ ndlup:nada


fdimclil uo;a.kr.ucma.
l)fla\11\il

,_
~

11- -<)11
-<>11

lf\lpa

alliebidl>cntouoll

,,.... """" --<>11

fibosll CIJ 1\lfTilil lineal > ' roochOOidll


ukkhilo 1 nofl

.....

-()11

lb

....

o=t--<f
o
1nh'Kn - t l;" in,,

~ni(.ndc

naclc(lo;idl.w
mln~

OO.

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par pn

dllillililllt
n'hlllauru
\ 'untmna R

o-r-~
OH OH

&,

'11

fl"'CIIIMta de r\1, \ F \hj

Dmudc1ido de mcounamtda y adenina.


NAO+:
lllrt buM>

Fosf ato del dmudttido .k nicotinamlda y {ldcninn..


NA OP+:

~ AlooXJtlfUid'lidiJ

l.d$-t'nilda

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~tuf'l' l~idJO !k)

ou 2'

~AOJ ,, 1

o=l>-<> b

Tema 4

Estructura primaria de cidos nucleicos


4.1

Aspecto&

gener;~.les ,,,,,,,,,,,.,, ........................................................................................ _,,, ..............,_,.,,,~......

31

4.2 4.3

4A

1 1 Niv<ele$ estt\ICt\lrales ---- --- .,.,_ .... , ......,_ ..,.,.,._,_ ,.,._,_,.,.,. .. _ ,_ ,,,.,._,_ ,_,.,, .. ,._,_ ,.,.,._ Estructu r:.. pcirnaria .......................................................................................................................................... Formas de repces.entacln lineal ~....... " .."'""'""' ''""'""''"'' '' '''' '''' '' ' '' '' '' -..- .............. 4.3.1 Ftrtwlacompleta... ... .............. , ------- ... ,,._,_ ,_ ,_,,, ................................. 4.3.2 Representaciones G<SQUemticas .,., .........,......................... .................... .................. 4.3.3 Representaciones abre-nadas .... ,., ..... ,,., ..................................................................... Dos tlpos de tic:idos nud eic:os s.gUn su c:on'lposi-cin .......................... - .................... - ......................... - .. Propiedad$& fisi c:oquimic:.:..s de los ic:.ldOS nuc:~ic:os ......................................................................... ~....... 4 S 1 Pro~ades en disoruOIOI'I............ ................ ........ ................... ... 4.5.2 Reac:llvldad .................................................... ....................... ,_, 4.5.3 Hidrlisis qulmlca de ec:idosnucleicos........................ , , 4.S.3.1 HidrliSIS Cida ,_,_,_,_, ,................. ........... .... . . . 4.S.3.2 H"ldrli$15alcalina .. , .., .........., ... ,.................... .............. .............
4 .5.4

32 32
32

32 33 33 3J 34
3<11

34 3S 3S 35

Abso..-on e-.1'1 el ultrtwiolela ............. ................................. ........... ..

36

4.1

ASPECTOS GENERALES

Tr~io~mcnte se OOiltide' & que los ~idos ~"K~Cieicos !Oti'IWl pane Cle lOs t~ueleop(Ot~ldos. el grupo mils impo~Utrte de hell:roproteidos o "pfa.elnas conjugadas~. entte lOs que tambin se nc:tJyen gllooptO(eKbs y ltpoproteeoos

y, en ocasiOnes. tan'l>itl losfopt()(eks y cromo- o meta!oproteldos. Efectivamente. bs nudeoptoteedo$ resultan de la lntetaoclon. mediante enlaces elec:lrostllliC06 fuenes. de los residuos b&ioos (cabni006) de oenas proteinas (histonas. pro~anwws) y b5 QNOOS fosf.ttto {aniniOO$) del t\CJdo nvctcioo El cs.ludio del~o de osttts 3#ocitl(:o()t'Wt$ nU(;leop,oteic:.as se htlr ut~.a vez OOI'loeida la esttuduta ele los cldos nueteioos a todos sus l'liveles.

POt su eomposJeiOI'I qulml<:a eleme-ntal (C. H, O. N y P), denvada de la pre5en<:.a excluS'va de nucleotidos en su esuuci\Ka. bs cidos nucleicos se dif8f$11Citm de las protelnas. esenoalmenle. en su m<JYOr conten.do de fsbo (10%) y en la ausencia \Otal de azufre.

en
(v<W'IO$ crcmosomct:5).

en m;Jtriz mitoconctri<ll y en estroma da

en 1<'1 zona del cilo$01 (un <:romooomt\ y

..
en
c&pslda (en ottos tipos
~W'U$)

vanos plsmiclos)
la lnfom\ttCin de50e el ONA haSta lOS prOOu<;I.O$ gniCO$

en
(temporMnente), en cilo$01. en motlrit mieocondfil'll y en estroma de

ESTRUCTURA PRIMARtA DE CIDOS NUCLEICOS Exl$1en 00$ 111)0$ O& &eido$ nut~eiC:OS, <lenor!WI8dos ribonucleko o RHA y desoxlrrtbonud elco o ONA, que difieren en 109 nuci&Qiidos COn-()Otlenlet;. Atlte$ de <IKcribir so estrucl\lra. recordemos brevemente que ambos cidos nucleiC:Os se encuenttl'll en k><JO ti>O oe oeu&s. t31'1tO procariotas como eucariotas: oomo excepcin, los virus ~lenen slO ONA o ~ RNA. En lodos los eot$0S, sus <ivor&as funciones en la transmisin y expresin de la hformacl6n gen6tietl vienon determi~ por su localizacin ~boelular y su estruaura de Otden superiot {oonformacl6n
tr~imens.onal).

4.1.1

Niveles estruct urales

Desde t.n punto de vista estnJctural. en los cidos ru::lelcos se pueden considerar vatios ni veles, $imU;aros en cieno modo a loe descril06 tradicionc*nente para protefnas: Es-tructur a ptim,;ari,;a, de&erita POf la tri6n de runerosos nuclesid06 mecian.a enlaces fosSodlst. dando lugar a un polimero lineal. El oroen de bs nuele$1!3o$ (o sus bases) en In cadena define 1(1 sc:ue~ia dol ic:iclo nudeioo. Estructuro sec:undaria, oon la Que se il'*.::ia el N!lisis t$Pt'lci31 dt 13 l'l'l()lt(ulal. comu;pondient a la c:onformac:i6n lOcal. es cJeelr, la disposiCin relalft'a de nuclelldos (lue esW! ()(6Jtlmos en 13 sec:uenc:ia P3ra" ONA este nivel estruc:l\.lrat viene dellnldo por la asociacin de dos cadel\89 ~ucteolfdlcas a tra~ de laS ba.Se:!l nilfogM&daS que &Obre&alen del e&<~ueleto azccw-losfa1o. En el RNA slo se presenta en detennnadas reglones de la f'f"dcula. Estrvc:turas de orden suP4tflor: Se engloban bajo este trmino gentloo IOdas aquellas estruauras tridimensionales que surgen a partir de bs niveles primario y sec:undario. En eucarioLas son c:ompleJ&s. variables y en ocasiones escasamente conocidas. En el caso del DNA pueden ln~e aqul las estruCilJras te!IUilantes del superenronamlento y de 1a asociac:in c:on pt"Oiefnas bsleas para totmar la cromaN. Sin embargo, y a dderenda de 10 que ocurre en protelnas. eo ganeta! la estruCil.lra adoplada a este nivel no vler\e delermit'lada por las de los niveles Inferiores. En el caso de algunos RNAs (especialmente lOs lANAs) se obse~Va un plegamiento trldlmensblal bien <!efndo. equiparable a la estru<:Wra terciaria de las potelnas. lwn en este caso. no se observa una estrucWra cuaternaria, ya que dicho pl998f"ienlo slo afecta a una rncMtwla y no a varias asociadas entre si, c:omo en las proteklas.

4.2

ESTRUCTURA PRIMARIA

la e&tructwa ~na. c:omn Pt'lf<'l ~ y RNA$. consi$1c en la J)tencit'l Cio C3<Sor\M, gonert~lmento larga$, de cattlcler 1'1'181CroMOieo.Aar, kitmedas por la tr.iOrl de nuctebsldos mediante enlaces cova..ntes 3'5'fosfodlster. Por tatiSO. la uniOM ~a es el nudetldo, o nuele661dc>11'10f'10fosfato (generalmente c:ontemplado como 5'-NMP). Los ~idO$ nudeioos son. por tanto, pottmeros de nuc:letldos o potlnuc:letldos, con t.Wl esqueleto ll.neal 1~ oor u~ allemas de foslato y pentosa (parte oons&ante de la secuencia), del c:ual sobtesalen lateralmente las bt'lses (pat1e varia!*!>, que define la secuenc:U), unidas al azcar respectlYO por enlaces n.glc:osktic:os.
Por convenio, ta secuencia siempre se Indica en direccin 5' ... 3', es dec:lr, con el extremos terminal (5'P) a la Izquierda y el exlremo 3' terminal {3' OH) a la derecha.

j
5".. -P-ok

-P-oJa-P-oJ..-P-ola-... 3

Dentro de oste ni~ o&truct\.1111 110 esWdior6n a c:on~uadM tas 6istintas formas de repteSentaeiOft. fas ditel'~las on c:omposiei6n quimlea de los dos tipos de ddos nuc:telooe y~& propiedades 1\~lmicas ms represenlativas.

4.3

FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL

P\ledon emplttaf'&O M~ 6 niveles. de SiMJ)IitleaeiOr'l creciente. En general. se haoe uso de la letra Inicial de las bases, en may~, JNirtl representat a Sias o a sus nuc:tesldos. El c:ldo nudeioo propuesto oomo ejemplo es~ RNA (~Cic<'ir: rib0$:1 y baSes: A. G. U y C). pero las representaciones son Igualmente valdas para un ONA (azcar: dosoxirrib0$3 y bases: A. G. T y C).

4.3.1

Frmula completa

P<lt r<U:one$ do O$~io y fundamentalmente dldccas. es aoottSejabie comenzar con una representac:ln vertical del esqueleto del cido nuelco (notac:ln 1 en la f9,wa). que permite apreciar c:on de1alle tos .-cos fosfodit,.er ftllre nucteOsldos oonsewclvo6 (uniones azc:ar-lo$fa1o) y 1o'l situllc:IOo perpeodirc::Ww 1111 esqueleto de lOs enlaces ~sklicos (uniones azOCW~&e). ~n'l mM!Mier 13 orlenb'ICIOn S' .... 3', se slllla el extremo S' P ~la parte superior y el exnmo 3'.QH en la infeot.

DOS TIPOS DE ACIDOS N UCUICOS SEGN SU COMPOSICtON

33

6~-

,.

~
G

,.

l...L)

:\\
\ \
...r;;;;;
l...L)
,~ucle~n CO\IIII'n!c

1 ~

("
V

<Q

l ,.NNo

f'o' ~ ~ f s s
~ ~

Q)AGUC

liftefll de fllld~

tsq11cleso
!p.>ll(

-~"

"'''*'!

h
4

pA,CjlUpC

oAGUC

.~

t\GU<"

4.3.2

Representaciones esquemticas

V$rti~l. cuyo

Como peculiaridad ese ~111 representaocl6n. el arillO furanbsico del az~r IIC $1mplillelll tnediante un SOlO 1razo exttemo superior corresponde al C-t' y el infiof al e-s (notacin 2 en la figura) . En una lorma aun mas SlmP'e se omiten lo$ tosfalos intermediC y la mo~meraeiOt\ de 1os a.We&re$ {notacin 3).

4.3.3

Representaciones abreviadas

La $impli~in n ovede aumentar il'ldlcando cada nucle6sido mediante la tslra niciall de su base nitrogenodl'l {11) nioo variable en la &e<:IJO;nti~) El polinudetido queda~~ reducido a una SuCle$in de letras mayso.ia& fllercaladas con )elras p minU$Culas (notacion 4 ). El ext111mo 5 'P (a la IZquierda) vieone represcnlado por un3 IC!nl p ~.udil por lb ~ra del pmor nucte6Si. El U tl'iltnO 3'.01-i. a la derecha. v.ene dado DOt l<l le!ro del Ultimo nucle$ido Los ~IGOsidos intermediOs tevan lapa Izquierda y derecha, correspondientes a las poSiciOnes s y 3', re$P&Ctfvl'lmtn~ . En la oesctipcin ooddiana de 5eeuencia$ de <icidos nucleicos se supritnen las leltils p intetme<Ras, OOI'liO que 1& reptesentaan se reduoe a una $CQJetlCi3 de letras preoedlda por una letra p para el fosfato en el eJCtretno 5' tnolacln 5), o so il$umo &tJ pre$enc:ia del tosr-ato en 5' y se omlte incluso esa pf'lrners p {notacin 6).

4.4

DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN

'.''1"0 u,.: -'cdo oocloow


Monmefl)!;;

ddo rlbonudeico (Rt " 'A) Ribonuehlidos

cido d l'SOx:irritffln ud(('O (l)NA) Otso ~ 1rrlbonu det idos

F'osf~to

enl,nm.:lu los mon6mero~ (C'tl!:.cc ftJ:IfoxliO:stcrl

l!

Azcar

Hibosa

l'uri.llll$

r .l)es,odrrfbos:a 1 Adenina, A (6-aminopurin.1) Guuin:a. G (2amioo(H>xopurina)


'l'imina, T (Sm<tlurudlo)

Citosina. C (2-uxo-4--aminop~rimidin.,)
IJradlo. U (1.4dioxopnimidjna)

f'irhuld l:u

34

ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS

Segn la fl04aeion de fi'ITI.lla completa. la tepttscnl<tcin dlt ambos cidO& nucleiC06 es la slguieole:

RNA
n

ONA
A
n

=._,~'")
u

H,, ..,~ji' " '


o= 1

~ f
u

~np

e
T

11: l

'

"T~~
Pxtn:mo)'

o~'} h.
4.5
los cidO& nue681cos presentan propiedades imi)Of1arrtes en transmisin (replicacin) y ellp9SI6n (transcripcin y trOOUccin) tweYemente algunas de ellas. relacionadas con la estruct\n, y ~ aplicacin al propo e6Wdlo de estas molCUlas (pcw efemplo, la analizar como fundamento de la hibridacin).

b1>'oJ ~

PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS


relacin con &uS funciones de atmacenamlento, de la infonnacl6n gentica. Se comentan aqu resto se irn estudiando a medida que surja $u renaturallzacin de un DNA ctesnatura!lzado te

4.5.1

Propiedades en disolucin

Las ~dena& polinucleotkticas de ONA y RNA son hldroflltca&. debido a la PQ6iblida<l de lormaeiOn de enlaces de hidrgono con el agua por parte de los numero5o& 0~'\~~Xl$ lo$f<Uo y OH libres del azcar a lo largo del esqueleto. P<:w otro lado, a pH fisiOI6Qieo lOS grupos IOsfato f1>K. ptli'I'IO a 6) e iOrntal"' eesi por completo, haciendo que las molculas de OHA y RNA se comporten como icldo& y tengan rwmerosa& cargas negativas. Debido a este carctet polianinieo. tos c::idos nuc::ktiooa: se oncuenlr8n casi siei'I'IJ)f"C floOVtrali;a<So$ por interacci6n i6nica oon las cargas pos.~ivas de OtrM rnotoeutas.. C<lnore4~mente. el DNA del genoma nuc~CM euc:~rilioo so ~vont'<' unido 01 histons, protelnas ricas en Alg y Lys. carg&!la'S posltwamente a pH tislolgleo, dando lugat a nueieoprOt.eidO$; la importancia de esta asociacin se considerar posteriotmente (pg. S.). En klos espermatozokles, el papel de las hiS1onas es desempel\ado por pe!JJE!tlas pmtelnas ricas en Arg, llamadas protamlnas y tambin con ruerte carga positiva. En otras ocasiones. eJ DNA se u~ a poBamil'\aS (pt!neip8Jr'rle!nte espe~ y espermlctina, asi llan'4Cias I)Of Nlrler s1cto detectadas otlglna!mente en el semen). distribuidas ampliamente pero de forma especial en algunos virus y baderlas en estado de rpida prollferaciOn.. As.1, por eje~. en el fa9o T. las poliamlna& neutralizan un 40% de la carga negaUva total del ONA. estabilizando su conf<:ln'Mcin. Por Ultimo. oomo resultado e)q)8nental de esta propiedad. la Qn$t<IIJ:tacin de t\cidos nveleioos te facilito si su ca.ga negati'ltl $0 <Mpensa por ltt unin de iones mcltllioos. Debido <' 1<'1 tetatNa rigidez de la molcula (en doble htioe) y a su lnmetl$& IOngilvd en telaeiOn a1 dlmetfO, las de ONA son Mtl'f viScos.a:s.. Esta propiedad llene inter-s en relacin oon el estudio del proceso de desoaturaiiZaeiOn (pag. 165}.
~iones

4.5.2

Reactivldad

En general, los cidos nucleicos son quirrjcamente muy estables. especia!ment& en el caso del ONA. Ello se debe

a que la desoxWrllosa careoe de grupo$ reactivos; ol 4'-0H ost c;on'Clf'Of'l'ltido on el ciorre del anillo, y lo& 3'-0H y 5'
OH ft'ln f()fTn;lnOO en1aoes fOSfodiStef". EJ RNA es algo mas reactivo, gracias a 1os grupos 2' OH, 10 que te re-fleja en $ \15 ()n)Oied~deS.. por e,empiO, su ntdrllsls en medio alCalino, como se ver a c:ontlnuaciOn.

PROPIEDADES FISICOQUiMIC AS D E LOS CIDOS HUCLEICOS

35

4.5.3 4.5.3.1

Hidrlisis qumica de cidos nucleicos Hidrlisis cida

Los k idos fuertes escinden tanto lo& enla085 fosfodi&ter entre nueseoSidos como tos f!I'Wioes Ni!!loosldlocos de cada nuetetldo. P tanto. sirven P<ll'et ana!iU~r t;:a co~iein de cases de un aCldo nueleloo, pero no para determinar

su secuencia. Enlaces Entaoes Enl(tteS ErUce& tos!odis.ter N-g!icosldioos fosfodi6stef N gtiCOSidiCoS (entre nuetesklos) (en cada nuc6esido) (entre ooc!obsidos) (en c&ea nucteSidO) si $i S

se hdrollzan7
Medio cido tuene .. HCi lM

.,

Medio ~iCIO dbil

no

sJ
(todO& o purmas)

no

s<
(IOdOS O purii'II)S)

LO& ;'ic.ido& dGb i'-.& rc$Pellltn tos ~s toslodl&stet. pero tienden a tQI'T'IP8' la unin N glieo6idlt;a. E$tc entaoe es

ms lbil con PJMO$ Que (01'1 pirimldlnas. por lo que se puede conseguir {J)Or ejemplo, <'1 pH zJ) ts.(:il'l(lil seleCtiVamente
I<'IS bNcs purif'llCM, dai'ICIO lugar a kl6 denominadO& ilcidos <Jt:1(Jrini(:os Es-ta hidr(llisis es e <:ietto inlet'l!s psra estudiar ~rel3lk'l'lente la secuencia del ONA. Con el mismo fm. 1<\ml:lin se Ml'l preparado Oidos nu~s spJrim1dlnicos. po1 dil'l'liraacion selectiva de tas pirirr.dJnas bajo OQrldiciooe$ quimiCllt$ diferentes.

e:

e:

0:

...P-dRi bP-d Rib-P-dkib-P-(JR1b--P-d Rib 1"-dkib--PdR ib ...

... PdRib-P-dRJb-P-dRib-P-<3ktb-P-dkib-PdRib41dl~ib-...

...

...

4.5.3.2
ONA;

Hidrlisis alcalina
r.lt'Oii~o

El medio bsico afecta de distinta manem a te enliiOO$ fos-fodi6ster. tos enlaoes H-gkosktico& son resistente5.

lOS del RNA pero t10 lOS del

DNA
Enl;tCO$
EI'IISOCS

se hidrohzan?

Ef'ltac:es N-gtieosldlcos IOSSOOistet N~sidicos (enve nt.JCieOSidost (en cada nudeS*lo) (entre nucle6slos) (en cada nuctesldo)
(0$1od i6~er

.,.....
"

RNA

no

no

no

El RHA se '*Wellz.a rllpidamente. liberando sus nudetldos. en d"~oluciones <tiuldas de NaOH (pH 11), Sin afectar a los enlaces N 1J1ICO&.Jdico5 l <'l tudrli$1$ de tos .-...ces azcar.rosroto se debe oto omplic&cif'l directa de los grupos 2'-0H de hl ribost1 en la c<~taisis quimi~ Se torm<'n a-si NMPs 2'.3'Cidioos oorno l')l'(lduetos k\!ermediOs. que son hldrollzados rilpldamente en el medio ak;alino, al azar a uno u oliO lado det cnlalcc 2',3'f0$fexli~lr. parra dar una mezda de lo&. 2'-NMP& y 3'NMP$

36

ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS N UCL EICOS

....

f'Jro nplo hidro)t;t~j sleliln ck

ao RNA lnll(lrC riQO ~do) por


( llMIO _.rcOu.:ktl

(un to:trwribunudc6ti<k>)

-'
l
110

o
-()11

\-<''o(2'.. '011')

m..:~:! 'lllonofoSt.f.>

""

,.

011

+
l.loast ......:~; ...101~~
(l '. NMI')

lf IIIOl~ 'OIIM(OOII dl,;tlfii.U haola.) dt

nuo:!mnl(>-1' J mo~t'Jto d d .:o


(l',J'...:NM I")
011

110
El DNA , al conlrario que el RNA. es re-siste-nte a la hi d rlisis en medio alCalino. EIO se debe a

te. ausencia <10

grupos Z'-OH en las unidades de desoxlrrilosa, k> que Impide ef ~mo expuesto anteriormente.

4.5.4

Absorcin en el ultravioleta

la wnlllll.ld en el vsJot maxlmo de absol'banda de las dlstimas bases (pg.. 17) puede utiliZarse no s:6b para detectar y cuantlftcar aas bases. lOs nueleskl06 y lOs nudelidoe, Sil'\0 e64)E!Cialrnente para determir'lar la coooer\llradn de lOs acldos nudeioos. De hecho, es et ptocedlmlento eomCinmente tAilluldo, a pe581 de M ser el ms exado. Basla con medir el valor de A:.o e.n una dlsolocln diluida, &ufldentemenle transparente. de ONA o A.NA para poder calcular su con~in . Sin embargo. es con~te la realizaciOn de algunos contm~H. leniendo en cuellla especialment~ la poSible contamlnaeiOn con protelna&. cuya ptesencia contribuye a ta eb&OI'dn y, por tanto, lnterl'.ete en eeta determnac:in. EMctivamente. aunque bs mlOO'Ios de absorci6n son caracteristicos de cad<l uno de e5105 oompuestos (260 nm partt c\cidos nucleicos y 2ao nm para protein;~~S) , ambos absoft>en en ciorW modi<l& a las do& longitudos de onda. Por ejemplo, 13 ab5ofb<lncia de tlt'O'einas a 260 nm e.. par3 igual C(!t'~Cen!l'l.'l(:i:!ln. unas 20 30 vttees inferior 3 lt1 de lOS
cidO$ nucleiOO$. En la l)(tletlea. ler'liet~do e;~ cuen~a esta slruacit\, se deben emplear ambOs valores abSorbaneia (A260 y Aao) ~ra podel c:orregir la lnt.enererw::la murua y asl de~ OOf1'eCtamet~te las oor.eenttaclofleS de Cido nueleloo yoe l)rotetna.

oe

Tema 5

Estructura secundaria del B-DNA


.5. 1
511
Prop<:~rcin de b.:lsea nitsogn adas : R~Uis de Ch8tgaff ....................................................................... -.... 38 Algu!\M te~aeiot'oes en1 re bases son Iguales en todas las especies 38

5 .1.1.1 S.1 1.2 5 1 .1.3

Retaclbn emrebases..........,.,_..... RelaciOn entre punnas y Pft'l'lidiNJ:S .... ... .... RetaeiOn eoue a!TllnObases y oxobases.........

38 38 39

S 1.2
S..2

o~r.~s (eladooes SM dtferemes segn la especie .....

. . .... .

39

Modelo de watson y Cr lek: forma 8 del ONA ................,_...........- ..................................~...........~...........,_ 39 5.2 l Complemenlaried~d de l<'l$ b3$(l$ nilt()genadll$ ... .... . .. - . .. ......... ....... 39 5 2 1. 1 COI\Secueoeias de la complementar\edad . . .... .. .. . . .... . . . .. . . . . . a 1

5 2:.1.2

Efeetode.l pH sobte el apareamemo de bases .........


.... .... ...... -- ......"...

42

5.2.2
5.2.3 5.2 4

Geometrla ae 10s pares de bases.... ... ........ ...


Anbpera!elismo de tas dos hebqas . 0 1ferenci<as. en la 5ecuenci<a de ;mblls hebrol'i
tioicid~

43
44 .u

5.2 5
5.2 6 5.2 1

v ct~rtlc!Or dotr6glto

.... ... . .

.... .......... ..... ..... .... - .......... _...

S 47

Perftmctros cuant1 t:JtivO$ <le la <.IOble Mlioe....... - .................... -- .......... - .......... _ .. -- .a& C3nictcr l)miplcl!oo y t:t:~bilidad de la doble ht:hce . . . ...... ... ........ ... ........... ...... . ..... .s1

5 2 7, t
S 2..8 52 9

Sit1)31C~t)n ele 10$ (0$1 StQS y cart\clet hi<.lrotmco........................

5 2.7 2 Co~l)!,S, :r~amief\10 de &as bases y catilcter hdrott!co ..... .......-...... .... 48 Superf l (ie de 13 molca.l la SIA'lXIS ~ e-1 ONA ................................................... ............ ............... - 48 SignitlcMo blok'.lgk::O. JCb'leldad para la re~n ........ . .. ....... ........ .... .... .. . . . .... . .... 4 9

El

Ql\3li$h~ t)()f 4ll18et;l6n

di)

r~yO$

h:~ ~t~nwcSo r'IO!t~blemenl.e

' sus IniCios se observaron, lncllso en muestras Impuras de ONA d!auetlo, sel\arJes que oorre:spol'ldlan a un espaciado regular de 0.34 nm a lo targo de las fibras ele ONA. En los aos 50 se obtvvleron datos mis preci&OS, con muestras de ONA mM P'KQ y h<tolondo uso do lo:;. mtcx.Jos dO difr<~cdbn de ruyos X, qu~ ytt S(! habian desam>llitOO para el estudio vstrudor<~l de prOleinas, A I)Mir de los oorrespo~cll p!l:tc.>n<l$ dcJ difr;:tC;Qn. QQncle l~s m3neh;,s -~ f!>~trl'llc:s en tQtma ~ aspa indican ur\3 ~lttretura e;~ hellr.e y laS; band:lt in1en$tt~ en la parte superior e lnfetlor indican la repetian peridica de eslttrCiuras. &e condu)'O que: la molcUa de ONA eslaba formada por dos cadena. <:on una disposlCiOn tlelieot<lal y oon una doble periodiCidad a lo iaf9o del ete de la nllce, Cilda 0.3-C nm y e<~d;: 3A nm Por otra parte, la qulmlca de nucle61idos perm1tla conocer la exrslef\Cia de Interacciones hldtofbiC86 por ap4amlenlo. as$ como la SSOClaCIn mediante pvenles de nidrgeno rapareamien!O~). Todos estoG daiOS eJrperimenta\es, tOnto con ef ana!iSd de k1 PlPPfQQ6n de las bMc:s GOn&ll11.l~ntcs de la moiCCUiil <:uyas c:onclvsiono:s. so elq)Q(Icn 01 conbnUao.n, y la c:.ooslroccin de model~ moleculares. sirvieron de base para la prop!.IG$ta por Watso'l y Cnc:k de ta efJtructura de doble M liOO. cuy;:~ de$CripQ(Jn ~ t:t objelo jlnnp<ll dt C\UO tl)mtt.

sobtt el C()(H)Cimien!O de \3 S.ruUf<'l $0CUnd<lri3 del ONA DeSde

-u

--

....

38

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEl. 8 -0NA

5.1
~e

PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

A pesar de que la COf'lllOSicin de bases puede perecer un aspecto ligado a la eslructura primaria, su estudio se en este temtt por eMar diroctamonte relacioflada oon la esttucwra secundarla del ONA. En un ptlndplo se ~&yO Q~ et ONA ost<~b;t formado por C<'nti<l<~dos iguales de 106 cuatro nuclecidos A, G. C y T, y que la unidad f\lndament&l ..a el (ftr~IIK!Iido, MS!tt Qvt El\00 CNrg3tl. et'ICre otros, obset'o'6 dirintas propcwciones de los 4 nuclecldos en <ivorsos or~nismos. Ccncrclametlte. lO$ ONA$ aislados a partis de clulas o tejidos dlferontes de distlntoe indMduos. dentro de ooa misma espeCie, presentan idntica composicin de bases. que adems no cambia con la edad, estado 001rici011al o variaC*:ltles del et'ICOmo l..cll oompoS:in del ONA e&. pot anto. caracterl&tice de e:ada especie. A partir de e$0& dorios se formultuon un<t& rogtu o goner;~~lizaciones cu.-ntit~tiV<~$ $ObrO 101 ~mpO&Icln de baM$ del ONA,
que rueron 1:1 tl l'l~ para deduCir su estrud:ura en dOble ~

Anima~

.._
"""'
Galine

""""' ....
T011uga

-A

Composicin de bases f% moles1

Relacin entre bases

nrnna
29,4

G
1 0~

Guanina ~r'l 19.8 21,0

Purinasl Pirwniclr'ltls

Rclat:IOn de

aslmcrlrla

A
T

.li.

.t.!ll.
TC

.6:1.
GC

30
29,3

1,06

u .

ErilO ele mar E&CI'Iel'ietlia COl

23,8 29, 7 29, 7 32,8


2<4.7

28.3 23,<4 20,2 27,9 29,1 32.1 29,2 :>0,3

2 1.4 2M
20~

20.4
21,5 21,3

22,0 2<),8 17.7

o...
1,06

1 "" 1,01 02
1,0 2
1.0 $ 1,0 5 .02 1.00 10&

1.01 1,02
1,00 0,96 1,03

1,03
1l l> M2
0~7

U>
1.36 1,30 1,33
1,<43 1.8.

Sacton..s

Staphylc:ICCocus aurei.IS Ctll~l#l\ porlnn99nc

safdne 1u~~ea VM

"""""'Fago ~ 114 (monol\lllf) Faooo174 lonna tEI()IIcltllli.l (l)lliar

,., .
30.8
21.0 13.4 24.3 ...3

23.6

...o
21,0 1<4,0 29.0 37,1
24,1 22.3

,...
11.3
19,0 t2,t 37.1

'""
2U
18.$

.02
1.02

m 1,0 2
1,0 3 1.07 1,. . 1,0 0

1.05

~
1~

> 1

21.1

....
1,11

1.0 2

0 ...

12.<1

1,00 1.0 0

0.73
0.35

2.73

t.02

}~1

,...
32.7

014
1,00

.30
1,00

22.>

o.

.oo

1,34

1,1$

5.1.1

A lgunas relaciones entro bases son iguales en todas las especies

A pesar de~ la COfTClOSicin varia eniJe e$()ft(:ie:s, en todas ell&$ se c:ump~et~ ciertas relaCiones entre 13$ ba$4'$, kwmutai:SM oomo las tres l)tWneras rog!M do Cl'\;lrga1f, que $C CJq)c)t'letl a OOI'Itinuadbl\.

5.1.1.1

Relacin entre basas


y e1 cntonido de G a1 de e :
A$

En pracbcamente toda$ las espocios,., QQI'Iteni!;So ese A se aproxima a1 de T

"
~

Razn Aff

TI A

Razn GIC " CIG "

Esta observC~Cin fue Her<;i;'lll ~rtl oue W&tSOtl y Crlct: postJJiaaert los pares AT y GC. que detlnen la oomplementariedad de bases en el ONA de doble hebra. Hay que destacar~ es.la regla no se cumple para las poca& e$Peeles cvyo maUJJr, ~ieo esta IOn'roaclo pot RNA o DNA de hebra sencilla (oomprense en la tabla 106 ejemplos del virus 174, en 51.15 rormas de hebta sendlla y de doble t.ebra).

5.1.1.2

Relacin entre purinas y pirimidlnas

Como consecuencia de lo anc.riot'. el oon!enido ~ Cl'I'MS putinicat {A G) se aproxima al de bases plrlmklnlcas (T + C}, es decir, hay un 50% do I)Jrint'l$ y un 50% de piM'Ik1J\&.s:

A+C

T +C

Razn (A+G) 1 (T+C) "' 1 Razn purlna.s / plrimidlnas ~ 1

MOOEL.O DE WATSON Y CR.CK! FORMA B DEL DNA

39

5.1.1.3

Relacin entre ami nobases y oxobases

N observarse QI.Nt A/T-= CtG-= 1 ltlmbib'l se h.tl d~e c:un~ir (por razones ~ltlclaf'IWite matem&~lcas) QUe lA~Cl t (T+G) = ' Por tanto. puede conduir$&. c::omo tttaOIOn ~ICional ($1rt un signdkado especial). que:

8--aminoplnl(l$ (Al+ .!.;;ffiinopnimitlinas(C) 6-oxopurlnas fG) ~ 4-oxopwmid!nas {T)

5.1.2

Otras relaciones son diferentes segn fa especie

r~On de .:tslmehla.

A- T
Ci +- C'
que. adems de tener oo vator d-'orente paro eaa ospocit, no -10 t~proKitn.'l a la unidad como !.MI mmoes anlerlorea (..-er labia). Por ejemplo, "" ;:~nimo:~lc:$ la ro~OO de: as.melri& !!':S s.etnpte supet~or a uoo; lo rr;-smo oourre en planeas superiore$ y hongos Por contrsto. en baClerlas y virus 10!1 valores son mucho mas variados &Uperiores o nf9:1'\10te$ a l<l unid<Jd Ltt r<~zQn ~ ~$imc:tfin p.tode ~ambUm caleufarse directamente a pttt~t OOt conton.!o 9n G~c p<trbmcl! h<~bitual en otros t.IIX'$ de! C$1\1<110 como la desnai!Jrallzaan de1 ONA:

Oe acuetdo con ello, los .,,,mates. p1an1as sopenores y nangO$ muestran un exceso de Al (50-65,.) soDTe G+C (so.3S%}, tmi,WI.Ir;as <l\IC: en bt'ldl)rias y vrus se apreda la gran variablldad en. G-..C (ts-25%)
U.!~

" =-~-==--==--==--==~~~~ ~

ou

"'

.,

ZH

A+T ,_

Virus
B11.<:1<:rla.i

'"

'"

"'

~ '\. G+C

G+C

Protw:oos

1loogos

En ~umen, con e!IIOs estudios se ha obServado que los ONA9 de especes 8\folub.vamente r~as llenen ~ou\3 r~On de as.n'let"'- s,m,lar mien1ft'IS que tas especies l'l1lfY ~as tleoden a tener \~~'la raz:On d!ff!fente. A pesar de sw ~3 1~ mel'll)$ (:OI'IQCI(Ia <".e laS- r~ ~ Ch:trgaff, el hecho de que pennl~a dstlngulr entre espeCieS haoe que pueda ut-.t:~rst como Ctitefl() en las relar.ones evolullvas y las clasificaciones laxonrr.:as de los organiSmos.

5.2

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA

B modelo tridiroonsion011, como ostructvra de refet"Cnoo par<~ \ls pn:~piedad9& detONA., rue posl.\llado iXlf James Wau;oo y Ftaoci& Cnck $n 1953 Com:l$ponde a&.., ~ente donomWI.ilda form; 8 dof ONA. lit mils tomUn en las ofiulas la mas establo de ~odas lCII5 que puedo adoptar vn ONA balo <:OII(f~<:iones li&lolgie<~s !:$te modelo se bas taPio en tns obseN<'tCi(lnt$ por ;wos X <::omo (lfl las r~s do Chl:lrgt'il! y, I)Of tanto, os!J: de <tc!.*W c:on oJios, O'lsi como o:::.n Otro!; estudios reabzado!l medi:ll'l~ un gr-an n(lmero y variedad de 1~ Simlllt.neament~ !Sb ptopuso 1:. adecuacin del f1'IOCtek) a la fooc10oalldad de la molcUla de ONA para lB conservacton y transmls16o de la inletmaein genebCa (pttg 49). ~a las s.guentes caraete<lsticas bSIC8s

5.2.1

Complementariedad de las bases nitrogenadas

Ut e~rudura quimica de tas bases peonlte la formaeiOn de enlate!~' por )Uetl~ de l'litlr!)e'no (dQ$ <'J!Qmo::;_ electrooegatlvos, oomo N yo. comparten un 1omo de r.:frgeno). En concreto, dos nuclelldos pueden lnteraeO()f'W de forma esped rlca rned!ante dichos enlaoes y se habta de "base-s COI'IIplettW!nUlria:s~ ..paru de bas~s .. o " ~p;Jr~.;~mie nto do b;J$1!-.S''

40

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BDHA

P.,.& un;) mop comprensi6n de 1<t c:omplemontariedad, es conveniente establecer unos Ctlterios prevbs en cuat\10 a 13 ewiMa de lO$ nt.ICietkiOS on <:ada pareja e basM.. Se trata con elo. &impemente. de faa.tar la esct'CX:In de unas estructura$ relattvamenco oomplejn

f'rmui~HOn

la bii'C in.dll I!W'

3-lrnkdor okl enbl:o: N-shcG~id:""'i' cut~ ellll'l ..._ , dt!!it:J~IIf el cankk-1 OOnador o IIC('fllor para 1& fonnllt'Jil <k p,M'I'llcj de ludr6gcoo:

f (lnnula.sprnilltt lllO sobre ... lll~I!U$:

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bu d~:>fllhi~i~"fl. t~.'llla base lejii,J, 111:1 ~- ..e ~mona .:o)Cit;:.rmn.:ill 111ml

SIJUC si~n~
<o.ll ft~lll ~1#1

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA 8 DEL ONA

41

(:7\ Al re'lre,cow uo par debo~ )C tu'lpk--J la f.1n'lula de upo : parot<l M~Cictidol ''nundo ._ 1~ i;(qui~nla. y b de IJP<J J \.2) p.r:l el ~ltuado.l a la o.kfet:ha (ambas cooronn. wM)n .rntl)
Ado:n.:ina )" Tmilll (0 U~llo) ~n IOI'n'IM' 2 cnbo:o,; por pucnk dt bidrgo:n..r. 0 del crupo <"-Ocn ('-t dcT 001.1 H def ~ XllzmC-6dc A llcnNJdo:T ~l N l ckA

H, _.11
(11

' N:x~,
"'' N

TfU
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Gwain:. y Ci~~:Hinll puNto iurmaf 3 C~~lattj por bo~ ll dclppoNUz cnC-'IdtC oon 0o).i~C- cnC-6dcG :-..; de(' CJOD llo:n ~\.J do: G O do:l srupo ('..0 C1l Cldt C oon H del s.ruJ10 omina en C 2 ole G

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11.._ _.11

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tx
N

la& interacciones ptimas &e forman errtre G y C (lrC$ ei1MCCS dt hidt~) y e-Mre A y T. O biM A y U (dos eriaces de t1idr6geno). El par G C 9$1ableoe asi una inter;ac.ci(ln 11\bs fueoe (tue ef par A T (en et ONA) o el par AU (M el RNA} OOOrve&e e siempre se fonnil un c~o do hidtgeno el'ltte tos oos atomos de N nucleares. mientras qve lO S rMtar'ltes se torman entre un grupo amlno exoc:lcAico y un grupo carbonio. Son taMDin 1)0611lole1i otros apatOOmlenlos entre bases. denominado& de tPO Hoo9st99ft". Que <aparoocon mono& frecuentemente y no forman parte del 8-0NA. Por eje!T!Qio. B;n el RNA (Wg 73) , en i<'l$ ln(liiJ$ hliCC$ de ONA o RNA (_pag.. 60) y en la interaccin cod6n-anticodn (pt\g, 296).

5.2.1.1

Consecuencias de la complementariedad

Gradas a 1<'1 comp;enw~larieOad descrita. dos cadenas polinudeotldicas &e pueden asocaar siempre y cuando todas sus bases sean oornplementarlas. Este apareamiento oompleto de las dos cadenas da lugar a un cido nucleioo de doble he-bra o doble cadena. e'SiflJctura habual dal ONA. Esto quiere decir que siempre que en oo. ONA eJOSta A. G. CoTen una cadena. se encontrarn T. C. G y A. respec:6tamente, en la otra, Es l.,..,ortaf\.le destacar QUB; la oomplementariedad entre las dos hebr<ls del ONA. El$ fund<wnental ptr~ su P3J)I)t romQ portador de la informacin gcn6ti~ Por- un ttldo. POI'QuO se reduce 1~ posil)iliQtld de~ t~s ~ses se rnOdif iQUef'\ qvin.e&mentct Por otro, porQu& ~ 1-aOiila ta eorreeciOn de mutaCiones y de errores prOduciO()g ~rante la replicacin del ONA. Fil'l8k'rlente. porque la lntorrnaCIOn est en cierto modo duplicada, aooQUe las secuencias de ambas hebras san <iferentes enve si (p;ig, 44), Adems. la exiSiencla de la complementane<lad elq)llca las r~ de Cl\arQ8ff (pg 38), y jusbflca dos carac:terls1icas estructurales 1mportantes.la helicidad y el antiparale!ismo. que se es.~ucian ms adelante.

42

ESTRUCTURA SECUNDARlA DEL B.ONA

lluscrdOO. mediante ut1 ejt1npt.o lup(llil.co bl"~ ~ 1 :1 ~s:ic)(Jn del ONA humano. de cc'lrl1o0 1:. dobk hcl:m del DNA pcnni1e c::(plicnr las reglas de Oargaff:
C:ornp<t~iicoill'l de~

......
A

% motes en

,.... "'" ""'"""" 1


32

%~sen

hqbra

% tnOies en

la<klblehet:lr.t
COCIEII'II&S

COCiel'ltes

...
30 30

Regla oe Ch8fgel1
cooespond~et~te

T
G

23
2S

"'
32 25
43

15

15

20 20
50 50

RelaciOn entre ba$e$ !ndi'o'ldualt$ A:T,C--G


Retac!On enve pumas

AG =punnas
C+ T :pi!Wiidin'"'

.,
51
1,33

puriNI$ 1pmmdin&ll
A+C

57 0,15
53

1,0
50 50

y pitlmlcJirlas A G/C+T 1
amnobases
yO><OOa&es

= amintlba&e$

47
1,08

Relaci6tl enb'c

GT oxocases amino / OXOC:IIKM

"'

47
0,92

1.0

El llpl'n!llmjciJio iqllica que el conacniclo de 001.1 b.,llC en una hcbrn lv de liCr igual al \k su baso: complerncntan:. en 111 otra btbr.t.. POt" o!'llb. 111.~ reg.J11s de Cb:lfi11ff 111e cumplen n :mdo tiC ounsidtrn In composklfl lo4111 dtl ON1 \ d~ dobk brbNI. pero no pata ead11 beb.-. pM" separado. ya quo: c.- cMc Ca$0, .'\ s T y C ~ (i. T:Unp(K'O $e Cumpll 'll ~ relll$ en kJtl ~ llUCkiOOtl de cnh.."NI K DCillU (p.~ j.. RM y ONA v/rico), doode A wt U. A T y C -. G.

5.2.1.2

Efecto del pH sobre el apareamiento de bases

Los cambios de pH, al afectar a la Ionizacin de b9 grupos funcionales de las bases nlttogenadas y al equilit:>tlo de &autmeros. modifican las posibiliclades de forman de enlaces de hidrgeno y, por tanto, eA apareamiento de bases.

T-A

u-A

. . ./o,-i n o" )
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N

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c-e

q_;;;~?J-1, l' - -~.

'\

---~'2, _::::K-1, ~ -e_,._')-, t ...


H _ )-N
1

'\,

\o

Como oon$0CI.Ieneia .., valOreS de pH in~s o superiores al fiSioiOgiOO el menOI' nmero de enlaces de hidrgeno posibiC$ I)I'()Yoca la tepat~~Cin de las hebras componentes del ONA, fenmeno denominado dO$na1uralizeCI6tl (p&g. 164). No debe conl\lndlrse es1e efe con la hidrlisis cida o alcalina, ba;o condiciones m.ils extremas. de las caclen<~& 00 <.\<:ido ~loico (pAg. 35).

MODELO DE WATSON V CRICK : FORMA 8 DEL ONA

43

5.2.2

Geometr1a de los pares de bases

A pesar de la dlfM:ullad de vi&ualizar !al geometdn <Je un ~"l r de bases el'l 8ttSer'ICia de un CfiOOeo)() cercano a la rNOOad (modelO trJdlmenslonal, sea material o informiltico), M OO$crlbe a COtttii'W.JaCiOn de 1a forMa mas l'tel posible. La fort'r.aclbn de un enlaoe de hidrgeno roqvie:re q~,~c 10$ lrC$ $tomos implicados (dos electronegallvos y U'l H) se siten sobre ooa linea recta E&1a condicin $61o So9 p~,~eoo evmplir Ol.lal'ldO lOs <lO& el'llac:es Ni;IICOsidicos de lOS nuclesldos co,.,.emenlarios forman ~,~n ;ingviO, it~ftnor a oon 13 linea i~aria que une los C-1 de ambas pe.n1osas. E$1a geomelria del par de base$ detetmin3 13 <li$PO$iCi(l(l espacial relallv'a de las dos hebras en el ClNA (hellcidad) y es la causa a nivel molecular de 13 l)re$e(~Ci3 de SUI'CO$ menor y mayor en su estruci!Jra lfldlmenstJnal. ambos a&Q:tos so...-.ali:z:tn en detalle ms adelante {pgs. 45 y48).

oct.

rcprcscntac:in bidnnc.'1lsional del par de ba~s

modelos tridimcn!:laQnales del par de nuc:kudos


1no ~e m11n.1liltll...: 11)

J~x111"1bo!t:t ca~

x.-..pcc.Jicular a la base (d O anuJar queda btlcis atrs y el PS' h3cia dcl.amc reSJ)C(IO al plano del papel)

dcsoxittibosa Caloi ptrpendic~,~lar a la base (el O anular queda haci11 delante y el PS h11cia 111rs.. rcspce1o al pl11no del papcl)

II J-<;.,.~ -~
\ & +

e,

,-_.,. .--!'\; ... -. e, 1 ...... ___


~

\,

n :t.. ~~ 11 -~ ..... ~ ?\G


, ,.. "1\ -

N - t-1 O

'ifi~...l} ,-

r" "

.....
...

Gn conclusin: Todos los p:Lrcs de bases prescn1an una g.comctria s1mlar, definida por. longitud de lo.,c; enlaces de hidrgeno s.c..-p.:m~i n entre las pcn1osas de mnbs n U(: ICti~ ngulo entre los cnlnccs glicosdicos )'la line.n C t '-CI
Una ~z ostable<:idos lo5 enlaces Oe hidrgeno mttiple:s, &as di,...ncias entre m tomos q~,~e los kwman son pr(lcticamenle iguales p."lra ~Odos los CII$OS lg~,~t'!mcntc, ill ~l'$<1fW & iompro ......., PIJrina con una pirimid1rta, la separacl6.n en11e las pentosas de ambas hebras taf'I'Cifn se manuene constante Solo de e~a Mal\era (dlsta1 '1Cia oonstante entre las hebras. hdependlentemente de su secuencia) es posible ta a sociacin tol'lbl'lua de tas dOS cacJenM para formar una molcula de OHA doble.

44

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BDHA

5.2.3

Antlparalellsmo de las dos hebras

Ya se ha ncicado que el apareamiento oompleto eotre &es dos hebras exiQe que sus secuonCJN sot\n compklmentaas. Debe al'ladir&e ah01'8 que estructuralrnen1e e!Uo slo se puede conseguit Si ambas l'lcbms $0 di$900Cn en senticlos ()JNfliO$; a una avanza de 5' a 3', la otra debe t\acerlo de 3 a S'. Se dloe que las hebnls llenen p;~rilleias, El concep(O de an~lellsmo va, pues, esuec::hamente lig3d0 t~l c:se polarictad opue!Aa, o que son anti complementariedad

' o 'e"!
n

~l')(qutla ~.k la~ !lo.


~(,w.:mpu

j .;o ~ '!.
<.li:ninUt. ._ , IC'!Ido <ll
d ml5nll) ,mi., L'<mlo)
cewn~or~:

S'!TCCC't'CAC,.J. 1n !~'I TACTGACCGA IJ')


yt(,lo)~

~nto:n~-M

ko;on.,.,.inlo>

>llo.:lltlldC'J' a~'(tn
Co)mn. tkl :.C)Ih'C'M)
C$hMt~OO p~~r, d WO:UC'J>n.l dC'-

JOellboW un:. dl! ~ 11 ) '

.:lll&:oa)

5.2.4
Diferencias en la secuencia de ambas hebras
Yf:t

Debe desta<:arM que lns dos hebras de un DNA. complementarias y antJperalelas.. poseen secuenaas t.o&almente
<:trererrtos. oomo &e J)Ue(le
~rcntement.e

en el i.CI:Imo eje~ mostrado. Es d~. son hebr as no ldntk-.as. Este nacho.

si""C))e pero que a menudo pasa lraacM!rtldo, es de gran trasoendencla; en concreto. en el proceso de lr<\nscripein, lt~ molcula de RNA que se sintetiza es completamente diferente segn cuAl de las dos hebras del ONA se transcriba. En ocaSIOnes &e utaza el ttmino MINaS eo~NNO((td&$ refirindose a aquellas reglones del ONA en l9S q.se una< las llebfae contiene 9Jat proporCin <fe purinas y pirimldlnas. Como consecuencia, la hetlra oompiemeoteria es tambin
~ada:

- C- A-A- G-G- A- T-Gtle"bra 2


tm.J,.. -C-T-A-C -G-A-~-c-

__.A

- G-T- T- C-c- T- A-chctwus ''no cquilibrndas":


% ( A (j~ctnl > %(1'--C"-'""''

r.wt ,-"-

hcbr3S "t!quilibrndas-:

o/II(A {j\...t.n.l .. % (T (_')hfbml ..


%( '\+{j ~""'-2

so-;.

= o/o(T ~ (')ht11t111 = 50' ~

%(A G).,.tul o!%( r C\.,.,,..,z


corno consecuencia:
%(A~{i ~""'' > %(A+G~ctrct.!

como otmsecue:nc:i<l:
%(A(i ~tnl =,-..(A+G ~

o/ o('r C)t~ 1

.. %(T

<'>...:tnl

%( 1-.-l').,tnl < %( f ( ~,r,]

MODELO OE WATSONY CRtCK : FORMA 8 DEL ONA

45

En prinQpio, la existenCia do hebrt'S equilibradas o no w refiere a rogiOn$5 lot<~!iz.:Ja$ de una rnOiC\Aal de ONA, Existe. sn e.margo. un ejemplo singular en el ONA mitooondrial humano: considerado en su conjunto {16,5 kb). sus dos hebras son de~ibt'adas. ~'" ul\ill " m;is nctt en wrina& qua ltl Qllrt\ (56 y 44%, rG;speelivamenle) A 1<' primet<J se la lama habitualmente 'hebra pesada (o hebra W. del~nglslleavy: rowrde&e el mayot tamao del 3nill0 pUrinico} y a la otra, 'hebra ligera <o N L dt tigh()..

5.2.5

Hellcidad y caracter dextrgiro

las~"eSITiociones esticas irnC)I.Ioslas POr 13 geome4ria CStl<l$ ~res <le Mses (Que indu~ loS en13oes ~re bar:se, pent0$3 y tosltuo, P$9 43) ~cen que et apareamento comp1e1 ooe las doS nebtas s6fo se pooo.a. est&l:lle<ier S lOS pares oo bil$0$ suOHivos wn gir;)nOO unos con respectO a o 1 ros (OOtlete-tal'flente. 34.SO et\ e1 S.DNA). Como oonsewem:ia <le 13 liCI.In'lu!t\OC)r'l de eSioS giros. tas hebras de DNA adoptar\ una disposicin helieoicJal (es OeOt CBC!a hebra aescriDe utta helice) y 18 caCie1'13 Cle 0001e hef)f1l es I.Wia "doble hl ice.

Georntricamenle, l.l"'a hliCe (genrica. no de ONA), sea sencilta o doble. puede ser de d06 IJPOS:

h('Jiccs 0.:.\"lt&ifti.
dcM~s..

b:l~tt:>
~~~)$1r.l.~,

a dcn:cha:..
(1 ~'1'1 ~"'l'llido

:. i:T.quic~. 0<'11 ~mido

h4-mrio:

llntibornRO:

,..,-ncmu

hHic.:

hlice
dublc

~cnerlla

h 'ti~

En el caso de ta fOrl"n& B del DNA <tl'l'lf>al hebras se Cl'lrOial'l alre<l(!(lor de oo t,e <:otnUn, longrtudinnt, format~do uM dob le hel ice dextrgifa. La <setva(:IOtl de mCMSeiOS MOleculares tri(fitnension&le$ perMite un mejOr (;Ompron$i(ln de este car&cteoJ hellcoldal.
Modo tw.l:mu:llunJI do: b
:.,..,..;oa~~~ckd!l> ~~dpo(.k#')dt
.,..,... " ' ' ,jt ..~~ t>;'OI

dRito-- T
p

,. ,.

d ll!...:kh00.,.((orrrlo;lt'o(11htt().. T(' )' GA (dt.l:c prndC' ~ u~io:oJ;etn 1~ ~~oet'ICU!I

"f!CCO> .. Ql!lttl(lf

~"'

...~

,.

c.llht-C
011
(.,..r T ' A o;!i el plll'l(l rt'lfo;llo)f, pr C 'fG ~" cl pl ~no ~

,.

5'

,
,.
.~.

46

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B OHA.

5.2.6

Parmet ros cuantitatjvos de la doble hlice

..

liiAmetro de la hliceo 2.)1 tiM (23.7 }

..

Dobl-e: pc:riodicidad a k> largo del e-je longiludinal:

..2.~ nm
(22 J

,...,.,. ""'"

de" h i~otk bpm'sdc ~)

t j C dt

b hlice (.-conttc' l.:e pucnlb

Ejrn;.do: A pan ir dd dllto de $C:'p.1nu.:. 16n enll't c:ub <ls p:ucs de ba..":"s (0.34 run). se puede cakulnt el mlmcro lotal de p.m.-:s dt: bnso:s de UOil molcula de ADNA dc cualquier longitud (por ejemplo. un otelro): 1 m 0.34 nmlpb -= 109 nm i 0.34 nm.pb .. 2,94 109 pb ., 3.000 millones de pb (Mb)
Vke\ersa.. 3 panit dd nmero de pres de b~ de un I)NA (p.ej., $.880 Mb), ft~."(:tu:-ntciCiliC llal\300 su " longi1 ud en~ de ~sc.::s-, .!iC Micdc c:alcul3r la lon;:itud (di n)(:tiSOI'I:'!i) de la mol~cJia:

S.880 Mb S.Slill 10" pb l.88 10' pb 5.88 IO " pb O .J4 nmlpb .. l IO" nm 2 l~ .un = 2 Jo-\ n1m ~ 2 m
l ooa: 106 pb .. 1 milln dc pb = 1 Mpb. pero se suele usnt Mb y no Mpb)

MODELO DE WATSON 'f CRIC K: FORMA 8 DEl ONA

47

Lu ~":SCakrn Fnmdsco 1del c.-.sullo d<.


Chanlhm.J (\ aJk del Luua., haJM:m),

tuyo dJ~io ~ utrl00)'<' 11 LeonurOO da


Vmci. ba sido con!>idcradn como u.OOdv tk lalubk hlicr dd 1>1\A, <;tm la :ml\cd:~:l d.; que~~.~ g.rv es
lc~giro.

Se l l':!.l:t de un.t C'ii!ah.To:~ h.;h('Oid.11 (de 1'fl'-, <;:lr<~<:nll, Cl)n 111 C:r.J'l)\'tcnS1ic.a
adpic:~

de ,,,,.,..rer dos ram:Al$

mdC'!)l'tldJ<."IllCS. l<ldU UOU ~"On S"IJ

..:1\lllli:b (t"tl
deu-:1~

la fmo, un:~ ul fr~cuc- y ou-a Pm \;)nlo, !> p('rsomts p~.KdcQ utd i1.:.rla al m1S1ll0 ncrnpl) sin

En c:l C<l50 dciiJOI\A. d NIIICiclo de 1;.~ d..!ll he~.. cnnesromleri:l o b~ banut<hll;ts t:\tl-rn; ~ de 1~" c.Jo;.. nmtxa~.

5.2.7
5.2 .7 .1

Car~cter

antiptico y estabilidad de la doble hlice

Situaci n de los fosfatos y c ar3eter hldroffllco

Debido :'1 la lnlaracci6n e-mu~ fas ba:$0~ de 1~$ do$ hcbr;)tO, 10$ ~qvclclos a...Ucar-fo$1al0 do ambas d&bon dlspooerse hacia el eJ(tenor de la doble hlice po1 lo que Ef ONA duple.K tnl)(l:$tt.\ un m;'.lrc;ado ~r(tCVJI hidrofilico La &Uperllcie de la molo.Aa establece as! 1nlefacc10nes lattOrables oon e1 mediO ar.uose> etlcvnctanle. At tni$MO !iCn!pl> l(t dl&eribucin relatiVa de ios fosfatos es !al que .mlnlmiu la repulsin ~!tca entre P.IOs

en CSt(: IMdCI<l -.( ~~Jlf'l'CU biL"ff la u~ehn:u:nn de 1~ txbc...

n.-sr~"1.'1"\J al CJe

\ k

1!

Ullln.ll
(ji);U\1!1.1

Cllll'I-IR;I

48

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B..ONA

5.2.7.2

Coplanariedad, apilamient o de las bases y carcter hidrofbico


Las f)ages ~inlcas y piM'IIdlniC89 de ambas cadenas se encuentran dirigidas hacia el interior de la doble hlioe. superpues&as.
de

bmanOO un apilamiento similar it un ITI()I'ltn monedas Como consoooenci;t de !al


y paralelismo de los < millO$

proldmidad

aromflcos. se origint~tn entre euos IVel'lt'IS oe


01tracciI'l, de lipa van ~ WAals, 1131'nad3S

klteracclooea 011 s,olfamfMto (fuerzas hidrofbicas). De esta ~ el interior de 13


r~-~~e"" y~l(llbl't"< ~~de 11 w....,

wtllkll me ..:"

""'~

doble h61iee. &ltamente nidtolbloo, quedB aiSlado del medio acuoso (hldroflllco). contribuyendo a la establ!lzaciOn de 1a molcula
y a te (liOteCCiOr\ de la lnkw'tnacln genlica (pues sta la constituye 'a secuencia de bases).

Estas in!eracclones son mayoritariamente


'lespeclfiC8s (es decir, son r.dependientes del tipo de base implicada). a dit.fencia de tos

enlaces de hidrgeno entre bases complementarias. muy especffiOO$, Aui"'Q~ loa atracci6n ontre @ ~res oe bases
i'ldiWcJualmeole no earNJy tuene. al axhodr t0,4 ba5eS por vveltCII de ~. la ~ribucin ~<:~~al <al;, o51<tbil~ do,., molcula~ Muy ekNada.

Resumen de ftlcrtas que

fl"'"'"tllt<\ iNK'<I

'"!"'"'

e>tabilizan la
doble hlice del !)NA:
I~IQI'I('\

/L~ ':~ ::.:: '~ " :::: "':......J

~
5.2.8
Superficie de la molcula:

__
"""

1\tdn)f~

<k arilowrooenw de

surcos en el DNA

COMO $e M observaoo. la geometrla de lo& )i'lrcs de bases (pg. <$2} y el antlparalelismo de la$ hebras (p~. 43). Mee&atios para la formacin de lOs puentes de hidrgeno, hacen que los C-1' de tos a.roeares de los dOS nudetiOO:s compementariOs no se di&pengan simtrieetl'lente oon re&pee~o a las bases y, pOr oliO, que lOS esqueletos de$0lllrribo9a--losfalo de las dO$ ~s no se siten en pu'\10& diametralmenle OWMI*S de la OOble hlice. Como consecuencia, a todo lo largo de la estructura en doble tllioe se fofman OOS sureot, ~ may (o hendidura profunda) y otro menor (o hendidur3 pequ&fl&), que van girando de fol'nlOI Nllieoidal, al igual que loe dos esqueleto&. Los svreo6. especialmente el mayor, dejan espacio suficienle para Que moleculas externas puedan oootactar con las 03$$$; ste es el rundamet'lk> de la lnteracan del ONA con nuMerosas protefna:s eepace& de r.conOQ&f socueneias de base& (pito. 60), con fur.clones tan importantes <:omo 13 tegulac:IOn de la e.xpresin gnica (1'(:1' ejemplo, factDteS de ~n~nscrlpon}. En cierto modo, es como si IM ptOielnas "leyetan la secuencia a traii'Q do lO$ grupos funCionales de laa bases que "asoman doniJ'O del S\.WCO mayor del ONA.

MODELO DE WATSON Y CRJCK: FORMA B DEL DNA

49

,\~ddo

c~uhu.!IICi:l tk l.lu~unclrl3 de 11,..,. (lllt<'i M 11ll~ lcl,d!'>S,

Sll!lph ftdlit) JXII".I :q~l:lf b l(MTI\III;;()n 4 1.: los SlPt'O'S. Co11l11)

'

.........,...._ .... ............. ..,...


---~

'"=~ \~" .... ...... .... ..,.-.... .......... .....,,.._


~

.......

._

5.2.9

Significado biolgico: idoneidad para la replicacin

El mooeJo de doble hliCe de WM$0n y Oick oonnilc olqlic;v que se mant&PQ& una eslt\lclura ~ular a ~~ de 1<'1 vi)riaci()n oo secuef'lda y que se produzea tn&C:Iiante un meeanismo muy $imple lo duplicacion del matenal gentooo. En resumen la wpllcaciOn PlotcdO de una rnmern II)Qica. con dos procesos ~ (a) la separaci6n de las dQ$ hebm$, y (b) ro sin~is. a l)arbr do ollas como mOlde. de ottas dos C8det\a9 complementa."" (tQ$ de~ <:fe e$te PIOGe$0 5C esaudlarn OOSteilormetlle, lema 12) Tambin l)effl'll!e la repatae& de mulaciones y daos en una hebra, al disponerse de la otra 'COITM) reroronoo do ta sec:uencQ c::otT'Eicta

'

' ,,

Tema 6

Variaciones en la estructura del DNA


6.1
Varlant~s

en dob&e hebra: fonna s A y Z ........................................,_,,, .. ,... _,,,,........................... _................. 52

6.1 1
6.2

forma A del ONA. en compc~racin ron la forma 8 .. ,

.. , , . , . . . , , , . .

52

6. 1.2 F()tma z del ONA. en comparaciOn 001'1 las formas By A.. - . . ...... . . . ... . . . . .... . . . . --- . SS Variantes toeales de la esti'Uetu ta s&eundarta del BONA ............................- .............................. 56

6.2 1

6.2.2

Cl.IVatl.lra de la doble hlice.................................... ,.... _ ,_ ,,, .......... ,,_ ,,,.............. ............. .... . . ...... 57 Palfndrornos .... -,_ ........ -....... .,_, ........... _ ,_ ........ _ ,_ .... _ ,.,_ .....,_ ...... _ ,.,_ ...... _ ,.,_ ..... --- ..... _ ,_ ...... ,,_ ,_ ,,... 57
6.2.2.1 6.2.2 .2 Conceptoycartteterlslleas , , , ... , , , - . ,, , ........ ,_ , ........ 57

Jtpeticionesde~i<t

,.,.,_,.,..,,_,_

--- -------- -----..

58

6 2.2 .3

6 2 2.4

6.3

Z2 $ 6.2-3 K.DNA.. trfple hiee ...... ,_,_, ........... ....... ,_,_,_.,,._,_,_,_., ....,_, __,_,_,, ..... Motivos e-sttuccu.ra!es responsables de la unJn del DNA co n protei nas ............................~..................... 6.3. t Oescnpa6n de los motrvos estruelurales ms frecuentes ... . ...... .. .. .. . ...... . ... .... .... .... . . .. . . . . . . . . . 6.3.1.1 Motivo hke~iro-hlioe o hlice-vuefla-hllce .... - .........................................,_,_ ---- 6.3.1.2 t.totivo hice-bucleMioe .............. ..................................................................
6 3 13
6 .3 .1.4 6 .3 1.5

, , , , , , , ........... , . . .. . . . .... . . . . . 59 Co!t$eC~JenC~C~s e$1Mlur31e$ de 10$ palfndtOI'IlO$ ...,.,_, ....... ---- . ,,._,_, ...... -59 ti) En iJCidos rM:IeicoS de hebra MfiCilla.. ,. , , ... , . , , .. . . . . . . . . . .. .... . . . .... 59 b} En ONA.de doble h9bra ,_,_,.,.,.,_,_,_,_, . 59 Fvncion.-1~ ele los l)<'llindrcmo5 . 59

Pttlfndromos ef'l moleu181$ 00 h0br81 sen<:illa,

61
63 64

60

f.'04ivo horn~ir.o .
Moociii'O<IedO<'O llt!C. MociVO cremancrt' de tevci~ .

,_,_,_,. ,., .... _ ,_,.,._,_ ----

----

61 62 ,,_,_ ,_,.,.,,_ ,_ ,_,. .... 62

,.,_,_, ...... . . ........ .... . . . . . . . ...... . .... . .

la molcula de ONA no es una estrucl\lra estttce, sino fleJUble y dinamica. Gracia!! a la eapaciclad ese: r~in ;JIIre<Je<:l()r de los enlt~~ces de 10$ nvclelidos. el ONA puede ad~r m \01vo diversas fonnas, dlsbrolas de la lorma S de Watson y Click. Se e$ll.ldian en este l$'n:t: Aqullas que, manteniendo la estructura hei!OOidal de doble flebrtl presentom una oonJormaOOn diferenoo formas A

yZ.
las vanacooes oonformaCIOf\ales de carcter lOCal en lomo a la eSiruetvta B La itl(er~ oe regione:s e:spocffic.a.s del ONA con estrueluras ceractetlstlcas de algunas proleif\a$. En g.et~ert'll, e$105 tros tiiX)$ 00 variaOOfles es1ruaurale:s tienen relaCin con funCIOc'les Importantes en et <MI ONA. interw'liendo, por ejemplo. en el inicio y la regulacin de 10s ptOOeSOS de ~~in, teeomblnaein. ttanseripdr'l ele. De ani el intet6$ de $u .,ludio conjunto, como tema rldependlente, para a!l'l(llia{ l8 estructura secundarla y sertt{tr las b3!Ses de dieflas funcio!'IG$, que s.ern ot,elo de estudio en temas postetiores
mett~b01i$m0

52

VARiACIONES EH LA ESTRUCTURA DEL ONA

6.1

VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z

El ant\li$1$ POt ditraccin de rayos X a reSOiuciOn aiiOmiea revel la emteneia de dos nuevas lormas esttucrurates o QQrr!ormaciones diferentes a la BONA ttacJicional. en 199 que se mantienen las caracteRsucas bsicas de ste (compemenlarledad, amlpara~mo. helic:idad, etc.), JM.If'O ll"'Will<m Qtr<ll$ dife:r~nci~$.

Comparacin entre los t res tipos estructurales bsi~os del ONA en doble hebra:

TIPO OE HWCE
A (deshidratada)
Sentado o. giro do _, h6tiee Fma y tt~mt'o DeX1r6giro

B (Watson.C<ICI<)
DeX1rgiro ll'ltermedia

Z (Ric,..Oicke<son)
Levgiro

La n'I&S ancha y

coo
11

la ms e&tred'la y larga

OliJme1ro de '" fllioe 1 Otstanc:ict en~ bases (d)


Pare& de ba&eS )(Ir vventt (n)

2,55 nm (25,5 A)

0,23 nm (2.3A)
1

2.37 nm (23,7 Al 0,34 nm (3.4 A)

1,84 nm ( 18.4 A) 0.38 nm (3.8 A)


12

Ro'l<'lcin pot cada base (360" in) Longit\ld vvelta de hliCe (Mi)' lncliMcin del plano de lOS pares de bases " Suroo mayor o gtande Suroo met~Ot o pequet.o Enl<'lot N-glioosklloo
Nor..

3.2:,7
2.53 nm (2S,3 A)
19' <gran inelinaein)
Esuecho, ~u~ Amplio, no profvndo

10.4 .. 3-4.6" 3.54 nm (35.4 A)


1,2 (casi perpend'ICular al eje de la hlice)
Estrecho. profundidad

- 30'

4.56 nm (45,6 A)

9'
(ligera inctnacin) Estrectlo, proiundo

AtlehO. cwo'urdiclad media Plano. sin profoodidad

Ant;

...... ..,.

Sin {C. T) y Anti (G)

Os.~- o'*" ~tde beMt. MtCHt ak:l llrgoc:leldl:l h6a. : Rouc.on por cada pat de beSes. o giro re&P$CIO .111 Jlill' _,1-not ( delllrgro. - II!'Y(Iif'O). 3 L.Onglluoda M vueb IW!Iice, medMia e lo l&f'(IOclel eje. eoloQoJI&Ime'*' )IMO doa rosea* o po~sode htlioe'.

" lne~CIOn ~ iM ~~~no pe!J)endioJI81 al ee de la hlee

6.1.1

Forma A dol DNA, en comparacin con la forma B

Lill re<luc:ein de la hUrTied80 relativa por Oeb<lto del 75% (por ejern(llo. eon Clieoludones t1'U)' conoenlrada&. es deor. deShidratadas) hace que el 8--DNA tienda a translotmatse, QQmo ejemplo de la llexibiittad do la m016ClJia.. a otra conformacin. denominOO. A.oONA. Aunque esta forma no se ha encontrado bajo COndiCiones 6$iOIOgk:as, su esl\Jdlo es de tnter& por ser la que adOc>t3 e1 RNA cuando posee regiones de doble hetx"a. MI como lt' <le tos hfbrldos ONARNA.
Estruct~.r<*nente, el A--DNA es similar a la forma 8 : es 9v<'lmonte una Clotlle htliee deXttOglra. oon hebra& oomplctnent<'lrias y an~ralelas untda& por e~o& de hi!Wigeno. Sin embargo, dltlere en sus dmen&lones: ltt hiico A es mtts anchll (mayor dimetro), mi s cort~ ~m un triSmo ntJmero de nucletidos {menor diSianc:ia enlrO pares de cases} y llene mayOf nmer o do bU I!S p01 vuetta. Como QQn&eOJencia. son monorell 1<" rotac:i6n POt cada base y el paso de hlice. A.demas. la& MSM 110 se disponen casi perpendicularmente a1 eje de la hlloe, sino daramente h:llnadas. y se Jit(mn mbs separadas del eje de la hlice La suporfi<:ie de la MOlcula es tambin d1feren1e e' suroo mayor es mas estrechO que ., la forma B y muy profu~. mien11'3$ que el su-co menor casi no se aprecia por ser ancho y poco profunOO Mien1~S Que la forma B puede aCXlfi'IOd)r en sv surco menor IJl8 columna de molcula& de agua, el 5urco ~lcit'l de la IOtm& A no olrece e&paOO wficionte. ~ta dlfetenc:ia expliCa, al meno& en par1o, POI' Qu6 li!l desh4<11t'cin laveoe la lorma A.

VARIANTES EN DOBL~ RA: FORMAS A Y Z

53

Pra tn{hlnr- ln,'> diferenci:t!i c....,ln~elurn lc!. .!>C put.'<l!! emplear un modelo de .. ci nta,s'~. donde d I."Squtlcto se rcpr~u:t por 1ma cinta, de la cu:1l se dcSl~c;;)n los ~ullfo s JH'n l :~~gon: l es de dt~><irrih~:. qN :'llc:unos dt oxigE":no (c.:rc~q >lll:-t gru iHh fos fal o
h:tnlla~ que o;obrc."$tlk"11}. Cada nucleOtido c.,o;t:i representado

Lll.!>c."CU!!Ill"iil t'.n ambrn. Cibl"'- .sla 1 msmn:

15', GGGTATACGC ( n

en un CQIM dil' crcme

{3) CCCATATGCG (S'l

E~1c mismo nw<k:lo vi.!>lOdesde su plltc :.uperior) 1 )cnn1h: tluslrot que f:t hChcc .\ c<> m.1s :thu:na. <;Qn lll::t)'(lr di;'Lmcuo y un diliJ)I)l!liC ill lk' lits bases ms :lc.:J:uLa dcl l.'jc de la hi'ilce;

2.55 nm

..

!.~ \7 nm

...

54

VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DMA

Un:l '*j , complcmcnwria !1 la anterior. all.l: \'Cl que ms Cit"n::ana n la r.,'"'lidad,

es la dd modelo espaciaJ compacto.


la-: t~sc~~ C'ltn colorc:ldM en roo;a y el C$qudcto de pcni0'\3'> y fosfatos etl \'Cfdc.

los Mll'l!OS

en i111Ch~P:t:
hf~fl)

ptu

<;QnrtW

u .to,.

put>d4'
~

1S3nnt 11 pb-.

...

o.:J nrn

Las dtferonCia$, roCI6n eomentacJas, en la esttuetura de las dobles Nl'ioe& A y 8 vlen(tf'l ~~ on Ulbm<t ins.tancle por la diferonlo dispoSICiOn dO lOS pares de bases. debida ooncretarnen1e a ooa distinta ((lnform.-c:in do la dft-&Ol(irribos~ En ot A~DNA, el C3 <Sobresale del plano formado por los otro& CIViltro C'oatbOI\0$ de la tllQCuranosa (oonformaciOn Cl'tfldO), mienlnls que en eiBONA es el el que no es c:oplanar (coflfmmacin C2'ettdO).

cr

p
, , . , . . . , . . , . _

\
~~~-

~ L./
,.

'o
H

11

"

r
cl)nfonm lC:tn Cl'cffl'h lADNM

_..o

11

.'

11

-N ~ =

(T,(.T t: )'()~,

confonnann CZ"('m4l
(BDl'A)

Esta d1s!lnta con~in del anillo de t\boe.a hace que en el A..ONA tos dos gruiJ IO$f310 oonseCU'IIvos esten ms prXftlos enlrn si. 10 que explica que los pares de bases suoosiVOI so acerqven. aool'lando la cadena..

Smilarmenie, o1 c:nmbiO en ~ geometrla c:onoooe a tos difer'"'~ par~elrO$ geo~t(i(!QS ya comenl.ados.

VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z

SS

6.1.2

Forma Z dol ONA, en comparacin con las formas By A

La oxiswn<;ia de 18 ~* Z surge por jlrimera vez cM la ObsetVBCIOn, me<liante dlkaociOn oe rayos X . Cle una doble

hlice del hexanudetido CGCGCG. oon c;u-.c:toristieas diit!ntu a lM f<:wm<t$ B y A. entre ellas, oomo ~Y sQmficativa, so giro .. iZQUien:las o levgir'O P<l$!erlormen,e. $e M ~ncon~rodo esa* e$11\JC!ura en Otros oligonucleU<IO$ sintticos oon S9Cuen3s de pun;t:S y pirimidiM$ 311en'l<1$. hinque in vivO predOMiM el BONA, se ha pooiOQ Ql)Set\tar 1a presel'leia Cle algUnas reglones Z en el genome de clulas eucaritJCes. ompieando anticuetPQ6 oontra esta ltJme oonformadon. Su f\JnciOn. an pot conflm'ler, parece estar relaaonada a~n et control de la expresin goruca y oon la reoombineetn

En c~nto a $liS Cll'nllYI$iO~, Ob~aocJ&$ af'lora eomparativamel'lte con las ollas oonJormadOnes, se ob!lei'VB que ltt hofice es 1& mb estrecr"l.a (1,84 r'tm de dlametro), la m's larsra (mayor <IIStar'tcla entre beses: 0,38 nm) y la que tier\e mayor nUmero de pares de bases por v~~elta {t2). 1o cual supone une menor rotacin por base 30~) y un mayor ~so o longitW de un$ vuena de helee (4,56 nm). Es, en resumen, una hlice rooy esbl'ada. En su superfioe forma un solo SuJCO. profundo (oorrespondienle a la poSICin dol surco menot en A y ~NA)

Modelos t spaciai('S compactos:

1 fl.ONA 1

,,..~~.~k,

Wlin \~

4,Unm

""'""' f l-

., pt..

fl, )l; '""

ttu""'~ cu ~oklf ro'a o:~dtt" 1\CIII<o)f.lll\l\C..., 1:11 ~~~ \Cfde)

de es~ estn.ICti,II'O t1 niV(II mQiec~ muoslra Que su& diferencie*& respecto a las klrmas A y 8 se cfisti nt:l eonfonnac.in, en este C<'l$0 <tlrededor del enlaoce N-gliC06idioo En la& fonnes A y B t<XIM laS bases f'litr~aCias se Orief'ltan alejadas del anao de pel'llos.~~. en l<t ll;,m<tdl) confcwm9tin Ofnti , mlentr<l* Q\16 en el Z-ONA s61o lo hacen las plrirmcinas: las purlnas denden a s!Warse sobre la pen60$a (OOfi'On'naciM .sin), Por ello. en las secuencias de purlnM y plrln*inas a!ten'lal'lt&S (pot eje~. CGCGCGCG} tipicas del ZDNA, $C f<rvorece la &ueesln de ambas eonformaoclones, .s;n (G) y anrl (C), obligando al esqueleto azUcar-fosfato a plegMS<t en zigz~g part~ I)O(Ier t$1t'tblecer lOs ~<le$ de IU:;Ifgtno
La oonsiCiett'Cin
Ul'l(l

deben tamOi(ttl a

56

VARiACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA

cooformucin ~in
(punru:c en 7-D\lA}

cvufum~ tmti

C:tdn t"u
po:Oh.'ISll

Ouaoos.ina et1 confOI'I'Ilac_,n ~In:


~e wrha SlOb
laprn~

bas<' llkja.b de b

modelo
LridtmcnsionnJ del par de

nuclc(ilidos CEG

en un Z-ONA
rcll.lh\'113 muy <hfercntc~ la..-, del n. I)NA

ee eo
lo" f(l(. fAtO!I quedn eo J'I&.'eiotws

e N
p

Ln drspo:ucin en nta"' del esquel-eto de la fom\a Z del ONA ~ aprecia de fom.a plitru~ en este rnoddo de varillas. doode 1~ @.nlp(IS fos-iitl se hall mido con una linea \'CtdC' hipocttica. Se mucsrra, a cf':t(ll$ oomparutwO$. cmo el 8-0NA no prcscnt~ esta orderl3cin, sino quC' $U esquct~o describe; uoo hlice continuu. Obsnesc que el Z.OhA es el oH.: oon Mlict <n sentido levt'iro.

li.l!} ;rupo;.e; Rost'.aoo


..:n tllt'-.(fl' (de hi d numbn:
Z.O'i\)

"'lfUC" ~~n&lhwa

l'IICII<IOIII trW1 pr0.\.m!l(l8, (111 h' M (tu~ M A y (I.,,J )!.,A, poli"


ti:Q~ . . . dt\<..J.'I

1.o:1 sru.- r~~~~t~ ~

kl e~ in n'rP&e

M nCC!IIIIn.cJn !Ollina pan l'fduci1 lai


tq~ulsi~ C!l'CirOiol:iliC'M ttl!fi'

ellos y a fll)lkr
~C'Itel'~

co.lllf~arinZ

6.2

VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA

Los estt41C4 de difttteeiOr\ de rayos X lambln rGYelaton 18 eldstanC~Ct de v<lriclociorw 0t1 la c:Qf'llormO'IeiOO el\ detemWtadas s.cucnc:ia$ del B-ONA. Aunque dentro de es1e apartado lantin podria incluirse ti ~rolla"*"'to del ONA, so M preteridO describir es!il aspecto como una eMructrsa de orden~ ese 10$ ~ nucleloos, dada su Implicacin en la org~I'Klaeitl oet c:t()tl'I()SOma.

VAR IANTES LOCALES DE LA ESTRU CTURA SECU NDA RIA DEL BDNA

57

6.2.1

Curvatura do la doblo hlice

A pesar de ta regularidad del mooeto ele Wa1$on y Cnck. e.1usten P$QI.Ie!'IM diferenOO$ IOcilh~s en la ~!1\IChJr.t de tos ONAs depe.ncllendo de 106 nuclelido& integrantes. Por ejemplo, on detQrmn(l(!'a$ $OC\IenciM: los p;)rt$ <st bi'I$C:S no

son e)(aCiamente coplanares. to Qve puede OC<IISionar una Oc:sviaciOn Clel eje <te l:t OOblt Mliot En otros Cli$OS. frecuenle&. '" cvrvt~tur<t no se origiM por uM secuenda parteutar ese I'MJCteOtioos. Sino que es forzada por la union de u!\31 prot&i!\31 a 13 cadent' de ONA (como. por ejernpiO,ta mos.trada en pg. 61)

6.2.2
6.2.2.1

Pallndromos
Concept o y caractersticas

Se denomina &e<:vencia& ~!inctr6mic., o $imptcmerttt palinOtOf'I"'IS, a aqueuas regietles de un ONA cuya seeu&ncit' os 1;) mismt' en ambt"'$ hel:lta$. Son f)3$1ante comunes, y llenen un stgnltlcado especial por varia& razones: ($)ser IIJ93re:t-di&M ele las etUimas de re&trlccl6n (herramientas elq)Eirimentales para escindir cido& nucte.cos en la tccnolog.ia del DNA rec:otnbir\Mte): (b) actuar oomo centros reguladorer. de la expresin ~: (e} ditr lugar a estruc:tul'as secundarlas pect.*ales en ONA y RNA, ele. Orama(!carmente. un pallndromo (del goego p.:~Nn = de nuevo. dlomos = urrera) C$ tod<t patarbra o frase QVO $0 dele-trea Igual de Izquierda a derecha y de deorecha a izquierda, Por ejemplo: RAOAR, ANILINA OABALE ARROZ A I.A ZORRA EL ABAD. En los palindromos hay un centro de $imotri<l (a 1(11 vez e,e y piMO ele sillWHfil}. que es ltl letr<'l central o la posion $~\'~te las dos leb(ls Ql:ltltrUIC$. Sin embargo, la eldensin ~este t6rmino a1 ea~moo de 13 Siologil'l Molecular no es directa. se diCe que u!\8 regln de ONA O$ p;JIIindrmicn eo3n00 ll' secue~i* de un3 hebr a, lei08 Ge iZJ::Iulercsa a derec:lla. es igual que la de la o tra hebra, leida de cere(fla a iz-quierda Por tanto, tos pallndromos se observan en lar. dos cadena& conjuntamente. y no en on., $018. P04' ejemplo, 1a secuer~eia liAGCACCACGAn set'la un pal1ndtomo gramatJCal. peto no es una secuencia pa!incsr6mica. Tenetldo en cuenta que, segn el convenio de escritura de lOs ONA&. ambas hebras se deben leer de 5' a 3', se concluye que las dos hebtu de un >al fndromo denen la misma secuencia; sl8 puede eon&!derar&$ una definicin de p;dhlromo.

Hebr.1 1. le\!b de izquierda a deroclldll (S' ~3 ): lkbra 2. ldda de d~'fe\"'ha t1 iUJuicrda (5'-n:

TTAGCACGTGCTAA TAGCAr.:GTGCTM

1 :

~ ~ ~ ~ ~ ~ ! ~ ~ ! ~
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

A 1 T

1 '
5'

Como una extensin del conceplo de pallndromo. se llaman pal fndr omos Interrumpidos aqulos en tos cualeS una pequeha secuencia separa las dos mitades del pallndromo y actOa, por tanto, oomo centto de simetti<'l no puntual (en lugar del espaoo enlte dos nucletido& de un pallndromo esl1icto). En cualquier caso. lOOO pallf'ltll'o;no est3 IOrmado por dos n.~ade&. de seOJencia idntica. separadas por un centro de s.nelria, puntual o no ~ual .
.,.l!(!nm(l intc:rrumrud(l
unll-110)!~1~~~

'\'!"'""'~"""'""..... '""\''"",.

~: 1

T T A 1 A 1

~ ~
1

e
1 G

ar~ liTa e

G
1

~ ~
1

1 T 1 T 1;:

Al CUmplits!) lar\10 la $iwne~ Pf'OQit'l <SOIPl'lindromo QQmO la oomplltmenlariedad de las do& hebras resulta que les secueneia!l oe ul\8 misma nebra que <\'ledM a ambos l:ldos del centra <:le simetrlt' son oomp!Gomentanas en!Te s!: se dice por ello que las secuencia& pabndrmicas son aulocomplementat ias.

58

VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA OEL ONA

~ q t lf JIJG le 1 J c c;: 1 f Id JC 1 t Ji 11 p- hctnl q x 11 1t 1e 1e 1f 1exe 1x 1e 1a t x 1t 1+)f hcbD 2 ( 'I T!TiliCICP.Jel ~ ~-- " x 11 1t 1e 1a 1t 1G 1
~h

. ......

( - ~ ITITiliGICii i CI '< J i lll lf i C IG !f IG 1

1,

t " l lll"' nmrkm-:ontiiOI

6.2.2.2
de

Repeticiones de secuencia

En OCIIIIonH H ubl~ZJ como Sinnimo CllifnclrOI'IO ti ~ ~

~. ~que en~ opMtol . . do. ftllllade6 Mnen la


~

leen

..,....... """*"'o no)


()lro temwlo ~ 95 .. dt ~IOirc:lnN dnc:tn, ~ M emplea Cl.lai'IO .,. "" ONA M)' repeCICibn O. una ~~
~ llumtllll j()G l~t$ ~ ~ 1 m!Ud ( );
lo('

.mbol lados del

c.ervo

'*'-

ca.

kt'll C1t lotfltiI. ~O.;


, 'T1AGtAC l '
~TCGT~

~umnll tn.1tad ~~ ~:

(\DCIId t rapet.cln), "ida $itmpre en ti mismo tonbdo No son I)CIIIindr011'10$ J)Otqut no cumple el criteriO de igu<'lldad de ttc:utnCial leidas ttllef'lticlo ~esto, ni !\ay ctntto de tlmocrla. por 10 que no se habla de ~mlt6c*" EttM l'fll)e.::lones llenen ..,_.. potQUt tpereoefl con enonne freoJenoe en

' ' nAGCAC 3 '

AA1CG1C

con.-

fi> 109). taniO en ~ o adyacentes (repefiC:IcW* ..,


&19 MI;;Js pot un
~

.....,.., OOJI'O

~ de

, '*" e
do

bneS ~

- ~~ La.~"*",...~ w lea ncianmo-.dbdo

................

cr.

se tlaflla de tepeflaofNN ~~ cuando la seouenc1a ae ft!PIII,


F.,...tllffllf

\a....,.. l,.uc ( t !>- r..ttOCAO:: 3'


MT..G!G

~- :- ~ 1

t:

'M'A

Mfe';TC

A.C 1'

tortn. lnvenlda, dentro de la ,..,. hiCira De nuevo no son pallndromol pun

no l\ly centro de simetria rotaCIOtlel. tino pq,no d& tlmottli! .specular.

ltlat

Ultimas

poslblldadet,
11'-t<k "'- l l l lllllj[W'IIIoolll
......

.urqut apateoen con frecuencia en k>l ONAI. ocupando W\8 parte impoa~nle dt w

141C:!UeftCia
cuanto

no

a ti

tienen ~ tn M!N(11Jtl seaJI'ICiaria de lol

k)l'l

ili(~"""

6ddot ~ por 10 que Plfbt de ..,.


i'ft01rIIOI6to M

r""*" tos~

~ll

11 RpttiC'IOn f- t

' TfAQ.;AC 3' ut .a

"ia.Mua l ~ - l. Ml'eCTG .!' T'T>.GCAO


Suloo 1~ V
. . ~ W' ~CII

~ WMr.t...t. ckras

5 ' TTAOCS..C 3'

1'

MTCGTG

!TAGCAC M":'CGTG

VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BONA

59

6.2.2.3

Palindromos en molculas do hebra sencilla

el C3$0 de bCdO$ MJCieieos de hebra ser.cma, la deJinieln de pal~omo no se puede aplle:al esttiCial'l'lef'lte. Sin embargo, dada ta relacin de oomplementane<lad enb'e la secueno-a de un ANA y ta de una de la$ hebras del ONA que So codifica, tas secuencaas de RNA de heb101 ~ codifi~o PQf vn ONA Pttlindrmico $Qn t<smbin autooomplementanas y se oonsii:Se:tan oocno pa!ihdromos Bajo este crilerio, C&de'l vna de 13!$ oos heM:I$ de un ONA paltfOmico larnbln es una secuencaa pi!ilinc)'mica de hebra sen~

p.,,_,

6.2.2.4

Consecuencias estructurales de los palndromos

a) En cidos nucleicos de hebra sencilla


La e:d9tencia de pallndromos.. por ser 9E!cuenclas au\OCOmplemenUirias, puede afectar de forma wnponante a la estrocl\Jra secuOOana. A&l, tas nebtas sene1llas de ONA o RNA PA!den plegarse OCCI$io~lmente SOI:lre si mitomt1to pw-01 formor un~ estrueb.lr'l!l 4IVt notquiU8. SI el cen110 de 9imetrla no es punllJal (paUndromoe ln~etrumpidos), su &eevencia forma un bucle en et extremo de ta hotqi.!a. La formacin de hOrquillas posee gran rele'vancaa en la estructura tridunen&ional de algunos RNAs El ejef'flllo mas significa1ivo to constitiJyen los btazos de tos tR.NAs, regiones. con c:litrucl\Q de lfIO y bt.IC1e {pilg. 74), torm3!00S por secuencias patitldl'6tnic3s Pat otto lado, este tipo de pleglamie.nto en el RNA (:()(lttibttye, en algunos casos, a la termlnaein de la transcnpcl6n: ooncretamen:e, en el mecarnsmo de termif\Sdn lndependletlte de p de procariotas y los mecai"'ISmos equwatentes de eucanocas
p.ol io~:o,~mfll(l a\<.1(1;

~ ole ;,emcnlll j\lll'!lul l

,. ..'lWl"'.'i'IWi'l'~" ,.
~~ta.cin

J
'.

de """ llcbn ~e

,.

'

H<~rq<.nl!.l ~on budc

En el caso de hebras sencillas de ONA tambin PJeden enconlr.lrw horqvillas. POt ejemplo en e ONA de$natur'81i~. Qve CMtot de Ul\8 estructwa secul'ldatia ~flnida. TaM~ se propone su formacin E!f'l sMuaclones particulares, por ejemplo durante la slntesls en el labotatono del cONA (ONA oomplementafiO) a pattlr de un mRNA, donde el extremo 3' del ONA de hebra $91'1Cilla se repl~ &Obn:l si mi$mo y sirve <l$i ~ ocbOOQf para la polimerasa (p&g. 2(}f)).

b) En ONA de doble hebra


En el caso de vn ONA doble, las hebras dol ~lindromo P\IOdon .OP<Wew&e y '"sociarse de otta IOtf'l"'&, generanoo estructtMas de <fOOie hOrqua& o CtiJCilormes (en &orma de c:ruz). Similarmen:e al caso antefiat, tos pelinci'omos intcrru~T~CJ~dO$ form<111 crucifQrmes oon do& buefe$.

ln11: !ou ,;
n bu~
~,

''

tru..:ofonnt wn b~Kk

o e

6.2.2.5
~01'9s,

Funcionalidad de los palndromos

Los pallndromos en ONA dt'Jplex aetUan 00tr10 seflales Ot feoot'I()Cimiento a las qve se unen nvmeroGaS protenas que poseen estruccuras d!mrlcas que 1es permiten Uf'lil'$0 <~>e bm<'i simtrica <t ambas n.~ades del pat!ndromo (pi)g. 61).

60

VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DHA

6.2.3

H-ONA: triple hlice

Se trata de IA'WI estructvr3 poco h<lbit\,.1;11, k:nnada por 3 hebras: una triple hlice. tambin llamada trfplex o trlpb Se de5Cubri0 por "rimera Y8l. <en \lO RNA, aunque O$ en ol ONA donde &e encuentra con m:s frecuencia Se fQfTMn en fogioncs riCil$ en J)'nnas (secuencio {CT., t en unt' l'lebr;ll y rica5 on p,rini's (M<:vencia (AG)n ) on la hobr<' eoml)lement3tia, En condiCiones normales. diChas secuencias se encuet~tran IO!almoet~~ a!X'readas $irt el~iOn atgvna en 18 dOble hliCe. Sin e~Jargo. puede OCUYir que parte oe aa doble hlice se 8bta y la hebra riCa en e y T se ropliegt~t y se a~rtte con 13 ocra nebra <AG). m&<Jiante urta nueva <:Jase de~* oe hldr(lgeno (COnocidos ()()mO
enlaCQ de Hoogsteen), er'l una Zot\8 cf()(lde Sta aun Jotma doble 1\liee. Apateoe asl ~ triple hlice (CT}n 1 (AG)n 1 (C T)n en dihO segmento del DNA. La ocra hebta sendlta {riCa en A y G), desapareada, fOtma una especie de bUCle.

Org;.lnit:;ICin de las cadenas en el pl.anB:


hdo.:c

bqutrIMI:bI)Ml~. 111) l .n~ d(K he~ e1 y 21 ro~ 111\l do'blr hhee' 111) Una .;k llll hcbr.u g \'lllvttndo h;l.;..a alr.h ~ 1

y se aperea oon los doe: betlr.s 8Mcriorn, fomum..to tl.lemcnw de tnplc hhoe. 3"~ L11 otra hdm(:!:) qultda dc~arc-ada. basca qw 'iC R\.WIC' de nue~o con la bcbrn 1 para {Qm~nr "" SCI\Indc.l tumo de doble h8 ier.

()rsanizaciOn cllpadal de las tadcnas:

" .-6 ....} ..... ...,.a.


f'(ll"~ ktn 1

EJ.:::mpk) de #p3re:tmlcn!C) tSc 3 bases que da' lugar a la lriple hlice en el H-ONA (TAT). El <Jtro ap.<treamientCt ~$ cntrt dtosina, u;nrn:~ y citosina protonada: c<;e+. l5n el caso de !{~M . l:tmttt:~~In 1'A1' '-.. vcDdriu S\IStit\litb por UAU.

~11111(011 ~r-kP

'

/
1

'
Ol

1.

"

'

tunllik nrrux un.adu' .k 1~ heho ...:: '


H

'

\ \

enlKC'S de 1

'

dioi<o (de W.won..Crid:.)

E$t4.t tipo de eslt'IJclura ha despertado gran ner& POr &~.~ t~Pii(:(l(;i6n en tcrapiM de inhibicin de la expresin gnlca. meclante la unin de un oligonucleOtido U\t&liOO a 13 cSoble hlice del ONA en la regln promotora de un gen. IQt'mando una triple nlioe que lm~e la expresin Cktl gen.

6.3

MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL ONA CON PROTEINAS

Son numerosos los procesos biolgicos on 10& que la funcin del DNA depende de su interaocln especifica 000 pn>eeinas: de!Ueca entre ellos el oontrol dCJ la expr.si(ln gnlea, e;etcldo pot protelnas denomi'ladas genricamen~ /tJctores de t!Mscripcln (cuyo papel $0 ~bJdia mas 8delan!e. pg. 264). El estudio de e&4a& proteina' tiune in!c r6s dentro del contsm de la5 variclntet estruet\nles del ONA, preclsaments por su capacidad de roconocer e Interaccionar ~n secuencias concretas del DNA. Este reconocimiento lient lug3r gr~C.$ la posibilidad de variaciones tocoles en aa estru~ura ttidlnensional del ONA, asi como a lil intoreoei6n directa de 1 8 protelna oon las ba$0S.. nin neoe-sidiKI de qu& se separen ~ hebra& do In doble ""'liee. En la mayor parti! de los CtJSOS, 106 runerosos contactos eMablecldos (de bllO i6nioo. hid~ y enlaces de flidtgeno), aunque Individualmente dbiles, se oombinan para 0.... un ineetaif'' especlnc:a y muy 1\Jerte enlte ONA y protefna.

MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTEINAS

61

El ft<:Ont>Cii'I'Mie(lto se etetce a ltavs de regiones o elementos 9$tt\IChJr<lles, que $01'1 SOlO una parle de t.a torcuula co~a de la protei na, y QUe se pueden enoontr3f. con vna es.~rucn..a espacial muy simiar. en pt()telnas dl~ln18s, r.lervinlendo en una mistna funcin en !Odas ellas SI se cumplen es1os rOQIJISito$, rocibon f.o~ <foec'lominaclon generica de motivos estructurtllet. l)l'l)leiOOS (ett ing~ . mob/s), en esli! caso moiJ'Yos de unin a ONA~
esiTUCiurt~

La Interaccin tiene lugar oon el e11.1eri0r de 18 ~ htlce, espeC*almenle sobre el suroo mayor, Como caraeteristlca Imponente, un nw:smo moiJvO MK!e oon.taeaar simultneamente con lf8rios puntos diferentes del ONA., torzat\do asJ en ste una modifie<~Ot'l conf<:wYrlaeional que ttaoe que seasenc.as lejanas puedan aproJ~imarw Oict10 camoio confmacional puede inducir ii'ICiuSO 18 ~raeiOtll)ardat de las hebras tdHnaturaliz:aCJn 1~1). oon lo Qv& se verla faii'OteOOo el aceeso de <Wt'$ ptOlefnas. Tal es el caso. por ejemplo. de la RNA-pallrnotr<l$8 et1 el l)rooeso de trnnKripein

6.3.1

Descripcin de los motivos estructurales ms frecuentes


IW ~t\1' C1l foljl)
h.lflflliHI ~....
~

1 ... ..,, pi,_

t:~~IC!f'lo.,. a tll

6.3.1.1
Se n.-

Motivo hlice-giro, hlice o hticevuelta hlice

Se abrevia oomo HTH. del ingtt:s ~K..Jum..t>eNx. Fue el primer molivo ptOieco de unin al ONA bien esludiado.
enQ~:;~~Mr;)(SO en l)tOieir'laS regt.RaOOtas de \a expreSIOn gntea, tan.a en viru tomo en l)f~t\S y eucariolat. Est tormndo pot oos tegmeniOS pepUdloos en f.thlioe, de e&trvctura rigidl. ~rt'dO$ por una secuel'leia de aminokidos. nexll)te, que permite QUe las dos hlices se t~proximco entre si. una. <1~ las aheliOH (llamada hlice de reoonocimtento) se encaja en el surco map del ONA, de f()l'l"na que los residuos aminocidos de un lado de la hlice lnteratQOflan mediante puenles de hidi'9"f''O con laS Dases tlilrogenadas e~eslas en ese suroo. El dl&metro de la uhllce liene la dimensin aderuada (1.2 nm) por<' Mtnlt en el SUlCO. Algunos aminocidos. situados en la cara opuesla de la miSma hlioe, e;tatl&e08f'l inlettiOCiones 001'1 otros oe la segunda hHoe, fijando la posldn relallva de ambas en un ngulo Ciltii pcfl)Cfl(liQJtar {ver esquema ir'liCial). La segunda n-hlloe queda asl cruzada &Otwe la de rec.onocin-.et~.o y ~uada er'l el &llterior 001 ONA.

[)o:.; tn.>~kllll> tok-cula.rei dttn..k se Ji~r~Xia la intCf'aC'(in del DNA con un 10011\'0 it(liccgm>hCiicc <bm(..-,c(J. En c:;l.:: c:t-so, 111 protdnu ootnl)lrtil cuui~-.u: 2 tnoli\'OS BTII. Se n\UC$11"J[l slo 6tos }' nl,g\tMS hCiic~ n:an;t:S.. np.:n.l~> ;,J roouvo; el fe'l!l<t de 1:. noul&ula 1 ..0 so: tnueslta. pues oo se rdadon:l ~on la uniUI) al DNA.

ronfoOffiliiC':I()IIIII en el [))I.A, en ~k' <!liJO una all'~r&. re~nsubk dt la Nnci6n dt b prou:i~

1.11 urrilln fk " do.l!l mothm HTH pucc furr.~r ,_ niOd:!lk' .tCtn

(p_q .. &t.:n;:r l.tlrtll&op:lim).

62

VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DHA

Es frocuente que uNt protelna p-eserne dos moUYos HTH o bien q~,~e $C <JSOC!en do& molculas de protelna q.atet: (es dOcir. un <llmetQ), ~una oon un moll\10 HTH. en ambos cesoe, las dos h611oes de roc;:anocimienlo (f.l'l<l de cada moclvo) se s111.i~n ;) vna di~i<' mutua o unos 3,4 nm, b cpt coincide con el paso de neuce <1:et B-ONA (3,54
nm) y, P lamo, OQI'I dos posiCiones consewliVil$ de &u &Uroo ma)'OI' Es cledr, ambos motivos inlemociOMn .simultr;ean'lente con el ONA. conttli>UyendO l:l est<Jbili~ lt' unin <lo tct prolefna.

Los ejernpl06 rnejof conocidos de protelnas oon l'nOiiv<l$ HTH 3C1V<ln rC9Jiando la transa1lci0n en baClerlas y virus respect;vamenu~. El primero, la protefna receptora de AMP cJcNoo (CRP. t<Jmbin llamada CAP) es un dfmero, por tanto, coo 2 motNos HTH que cuando une cAMP aumenla su a-nnidad pOr $~ias especificas. del ONA. de&Oncadenando la expres1n de los genes del opetOn lacsosa {esle fue ell)rimor ojetnplo oonocido de control de la trans~iOn) . El segundo e,empio {en la figura) es Sa 9f01elna Cfo dei lago l8mbdl'l, CQdifie3da por un gen del Wus y 01($)f8$ada en toa bacteria anfll1!0na, que lnterncclona por su moi1YO HTH 001'\ et gen de lo) PI"QQeln., vinca llarNMSa tepffJW delltlg<) 4, ~~ndo eotno COI'I&ec:uet~cia su expresin (transcripcin del gen y slntesi$ de 1~ pro4elna)

6.3.1.2

Motivo hlice-bucle-hlioe

Se abtEMa como HLH. det Ingls heJIXfoop-h6Nx. No aeDe OOf'llundltSe con tll anlorior Cc>n$ta tMnbit'n de dos UMiioe. pero en e&;e caso el ppbdo que los une es ms largo,> que 10 dola de mayor nex'tilftd~d y,.., c:<wl.socUonoa. Nty m.tl$ pooibliado$ de orleraacin mnua de las dos hlices Gener<*nente. 86 igual qve en HTH, dO$
~nonios on

motivos HlH se asocian, rormlln<l~ poteinas dimlric::ts, aunquo no lj,iompro 1nto~ en posiciones con&oeCUtwae

del surco mayor. Un ejemplo de molivo HlH bien oonocido es el de la proteina Ahx 41: rt:tln (tn la fgura),
MOIWO hfhce--bude-Mbc.: t.lun6K. 'H y ~~~ mlcrn<."CK>-1 1:(10 d ONI\
(fl ~$1() \le b1 proto:irJII oo $C mu~r;a)

motho 2

lllll hficc:t de
fl'l:lmoc'11ni~

doftl;,.,,-do$

m~,..1'108<t6tl

doln111i~ lflfl ~tll.'f!Jatl Cll 1 11

dcf O~A. ~o"' al dnble~Ji~

ckl SurtO IN\'01'

6.3.1.3

Motivo homeodo minio

Se puede OO(tSiderar como IN\a ampliacin del molwo hice'9iro-hlioe (HTH), pero adqUlell'e errlldad propa por aparecer repetidamente, con icMnbca estructura. <tn distkl\tls protGinas Ade""*s de la dispoWcin de d06 hlioe:s
~wda$ tipicli del HTH, cKIS!e un tu':.:r tramO en uMIIee, del que s.<tle un:t rogi6n sin et~truchn socundari;, definid:. tuYQ$ aminOOck:fOs inleraoeiOnoJn Clirect3m&nte ((ln ef ONA. e:t1 e motiVo (en InglS, h~} $$ lmPOrt41nte POr' apn-.cer n las ptot&lnas que reg!Jan el des.aon'OIIO embtlonano, estudiadas especialmente en Drosophlt8.

MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTEfNAS

63

M(liWO bc~t~t.:odo:mln)l) d 11n61CO )' S.U


in1\~in ooo c:l O~A

~ qu< ,,_...,..~'ffllu

r.'JOI<>

tooo:oJd .......,-....
' 11'

. >1\1.; ...1\1111

..

ZI\C'II(>J
_..,;.,..,,o (,a, ~ lw!K..,. ( , _ ,. . e;.~-.. III>IUt ti dtrninlo;l ll1 11

h(lw."

6.3.1 .4

Motivo dedo de zinc

Se ha onoontra<SO eSle tipO de motii.'O estructural (en .-.gres. zmc fngef) en mol!itvd ele prot.einM eo~ritie<IS cve se unen ;)1 ONA.. et~tte el!as el tae1or oe IJanecripOO'I TFUIA y el reoeolor de e5tr~ Al igut'll Qve ert tas eflructullltS anteriotes, es ttecuenta que una misma proteintt DO$Cll mM de un motrvo; en este easo. se observan n~ente
mt:a11ples dedos de zinc oonseeutiV06 t.sle es un elemento es.tructiM'al 6otmado por unos 30 aminocidos. de loe cuales 2 astefnas y 2 histidinas tt!);)recen (lfl POsiCiOnes conSAantes. coordinando tetraQdncamente un Ion Zn ' 2. Esu. l.nn obliga a un pleg.amiMio de la carsena J)t()Cidi~. de t.orma que el motivo se caraCieriza por una OOfllormaon tridimen&tOnal alargada. en forma de 'dc"cr, Qllt 1e da f'l()r'r'lbfe. La vaname ms frecuente muestra dos hojas ~ antiP<J(alelas. C<ldt'l una oon un re$idVO Cys, seguidas ae un 9ifO y oe una estrucl\lra a-heliOOidal. <;en las do,; HtS Este motivo $C <klnQtnir\8 C 2H2 ($brevi:Uuras de uM letra pera los aminoCidos qua unen el Zn.. 2) y $U $$CU9nCJ<J oonsen50

...

~irn

1(' !CC (),

donde lOs sublncliees reprosentM e1 n(lmetQ de residUO$ (amlno&cldos variable\ X} que separa kliS aminocidos consenso <cons~nte$). e~3:$ U>eueneias ~ieten es;pontl'll!l8f'l'lente graoas al Zn la confonnaclon apropl8da para cue el segmento Miicoid<'l int~ocione OOt\ tre$ b3:ses expuestas en el surco mayor del ONA. tos res.tos vanabtes permiten que se teo::onozean distintas secuenCI'as del DNA.
b 1ruo:tura d(.,"+:~ ok "n okdo ~(' l:IIW" C)'S;Ht$:. '') ]' II()JM fl, 1 htlt~ -e o. ) l l( ln 7,n:
lnlt... \!1(01

t'nd (,.~I.,..Oc:t~Wk~"' 1H I I A.~l mCIIV.f>~' 6: 1W l'OAI'.:tlli:J\'m (J.: muennon ll "lgll\'ft t"l -.:o 1111)'(11 dd ONA

....

~tnfl
~.,

--

..._,....,

Clhf:lkl:

lll' .WS heb!b<kl O NI\..: lflll~1rnn OOITI<Htrlll ' 11rol~ Los motios m dt o;in.: de !01 (lffll~Ctna1 1 111A.a:~ f(lj,ll~i OIW't.IC6. c. nllltllt.J'I lw; h~ !}.ca~ el ft'I!J6: b o,;lidcna ''" ~ur.t 'o~;>;..,.._
L~.!!>IIJn.:,/#'

;:n.:nJr

En ocros ca909 se ObServa una variante de oedo de zinc llamada c., donde el ion m&~lico se OO()(dina con cuatto

Cys en la secue.I"'Cia consenso

CysX,.C'f'X1,-C'f'X,.C'f'
que no forma hojas ~. sino dos segmentos en hlioe E.s\01 ostJoctora hofmonas 41$\eroides
~reoe. pot

ejemplo, en lo$ receptores de

64

VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL OHA

6.3.1.5

Motivo cremallera de leuclna

t.., confQrm;Jcin u.-beiiooiCSal &e ooooentran en un lado k>9 aml1'108cido, hldrOIObioos, d& tal tnlln(!rn que leu 110 repne en
la msma cata cada <IQ$ vvettas dt h6'1eo (2 vueltas de 3 4 resdUO$ 7 amlnoac:idos) Dos cade-nas peptld1C8s de este tipo pueden asoclatSe hidro(aicamenfe, lnl~do SU$ ros!Os CIO le1.1 oomo $1 se tratara de los dlen~ de Ul\8 cremallera (en Ingls, leucine z~l). En el o1ro extl'emo dol mottvo 10'1$ dos <Ah6iicos encajan en el Sl.ltco mayor del ONA y presen1.an en fa cata ~:xU!rior ab~,~l'ld(Wes ;:ami~CJdll)$ Wsico5 Ql.lo inunaccionan favoral*menle con tos k>sfalos. De algOOa manera, este modelO ~ asetne~ a un..1 "Y' en lt'l q~,~., ot talb <:Orresponderia a la cremallera ele feuclna y los brazos a 106 tramos de In hliCes que 001\laetan con el ONA. E.stru.:hJms. de e$te opo AP<'f"C~Cen, POr ojc~o. en las proteinas regjdorasde la transcnpci6n llamadas OZIP.

So trata ele una regn de la ptolelna CIJYS secvene~a llene un te-9;10uo d& ~eir'lil ~ 7 aminobcidotl N ~

1'-~),1-,

las lb ll'hilii.:C'II
~ldu::;~ IIIICJ">otllh"'

brlicW<k. ~ :q
d 000 CIICajllll al el mrco _.)'Uf ddO~A.

filfi!III'IW

~~~

...

'"a.:talldo l la
~hrli~

Tema 7

Estructuras de orden superior de DNAy RNA


7.1 SupcHtH'Ironamlento del ONA ................,.,_, ........~........................................... _,,,.......................................... 7.1 1 Superenrollamiento del ONA en procariol.a$ (y mi'looon<lrit\$ y cloroplasiOS de eucat!Oias) ........... . . 7. 1.1.1 Conforrnaan relajada ............ , .... ,,,,,, -- ........................ ........ ....... - 71.1..2 Conformaooneswperenrollaclit$,.,.,_,_, . . . .... . . . 7 .1.1.3 Demostracin e)Cpelimental del superQfVOII3~to - .,,,_ ,_ ,_ ,_ ,,, .... _ ,_ ,_ ,,,......... 7.1 .2 Aspecto& tencos del supercnrQII(Inwer'IIIO .,. .,_, _ ,_ ,_ ,,,,_ , . ...... . . ...... . .... ........ . ...... . . ........ .. . .... . . Estruetura de los RNAs .........................................- ......... -....... -................................................." " '"""'''"' " 7 2 1 CompoS!CiM ae Mses y estrucl1.1'as primaria y secundaria del RNA . , , , , . , 7 2 2 E.slnlctura triOitnenslonal ae los RNAs en 9M8fal -- ---. ............ 7.2.3 Tipos de RNA: propiectaOes y e&eruct\.W"as partJcu~r8$ ........ ............ 1.2.3.1 RNA mensajero (mRNA) .... ............ ....... .. . .... . . . .. . . ...... . . ....... . .... . 1.2.3.2 RNA de tran$1ereo<;il' (tRNA) .......................... .................................................................... a) E.specifici(S;I(I de IO$lRNA$ por lOS 3Mii'IOeidOS ...... .... .. ...... . ........ ............ .......... b) PrHCnei<t de l'luleOsiOos il'llrecuel'ltes ........................... -............................................. e} A4>01re~miei'IIO oe bases il'lttae&-lenarlo .... . ............... .. ~... ........ ............ ........ . . ..... d) E.$1t\1Ciur3 se<;ut'ldaria en ttOol................................................................................. e) Estti.Jctura ~etCiarla en ' L ....... ........ . ........ . ........ . . .... . . .... ... .. . ... .... .. 7.2.3.3 RNA rlbosmico (rRNAJ........ . ......... .,.,_,_,_, .,_, 7..2.4 Rlbozlmas: funan catali1ica de algui""IO$ RNAs 7.2.4.1 Accl6n ~t;tHtica on lt'l ~cio de RNA ................ . . . . . . . ..... ---"".... 7.2.4.2 Aca6n au1oca!illi6~ &n 101 elimi~iOn <le inlrol'les. ... - -- .. ,.,....... 7.2.4.3 Acc:l6n UIUIIi liect y vloe.talitiw en virOide$ ribOZitn$$ <f.e I>O$ibiC tiPiiC::t'lcin ten~peut.ea . 7 2 4 4 Acci6n c<~taliliea lffll'lspepticlasa el'l \a sin1eSis de procelnas................. ........... ................. 66 66 66 67 67
68

7.2

69 69 70 70 11 1t 11

12
73 7 4 75 76 76
17

11

78 78

7 .3 Los ribosom.'ls.................................................................................................................................................. 79
7 .3.1 7 3.2

7 33

Loe:tlizaea6tl telular ................... ..................... .................................................................................... 79 Caraaerlsllc:as dlfe.-eneiales de los ribosomas procaritiCOs y eucaritiC06 .. . . . ........ . .......... . . . 80 7.3.2.1 Origen ..................................................... .,.,_, .. .,.,_.,,_,_,_,_,_,_, _,_.,_,_ ,_,_,_.,_,_,_,_, .................... 80 1.3.2.2 Cornpo6icln ... ,,, .. ,,,, , , , , .. , , , , , , , , ... . . . . . 80 7.3 2 3 EstrvctiJ,., ................. ....................... ....... . ................. .............. .,......... ..... . ............... 81 ~r.aciOn de los ribQ5omas. St.ibutlidades ytol'r(>Otlentes ......... -- --- ---- .............. --- 81

I.Os llcil.'o$ nudeiOOS no ~ etlouet~lran en tas ~las el'l las Jonnas e:xtel'ldidas OOtrespor\C!ietl.es a su estruerura prnar'ia y seeul'ldarta, sino r'nOieculatr'nenle ms oompactadro$, k> que hemos oenominado (p. 32) nivel esttucrural '"de orden superior". En el caso del ONA. parte O. esta oompact<~cin o COtldons-<!c.-n viene representada por el enomnado sup~~renrolkmwmto, o nteorcinwmo de la caden<J sobro si n-.sma micnb'n qvc !)<Ira el RNA M plalsma en eslructuras tridimen&IOI'lales variadil<&. En ambos casos. la oondenS<tein se completa por Ja asociacin 8$\JGcl'l<l con proteinas (J.Io8 tnducen el plegamiento de la doble hlioe del ONA o de IV tadentt lineal de <~lgunos RNA$ (p,ej . el RNA ribosn.co, pg 79). La ton~in de esta aSOCiacin con prot.ct-inas POSOO un<t re\c'YMcia .spcK;ial on ol CMO del ONA nuc:tear eucanbtico (lcm;a 8).

66

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA

7.1

SUPERENROLLAMIENTO DEL ONA

El supere.nr~lento. como parte de la eondensac:iOr'l ae1 DNA et~ goner'CII, PQ$08 esoecial significado para enlender ta organlzaclOn del cr01T10601Tla. En concreto. conttb.lye a e~icar como un DNA do !.<In grt'n magnitvd puede ~en el imerior de la olula (~)o del ndeo (eucariotas), de dtr'leMio~ muy inferiore$ longitvd IOiiC8 del ONA en doble ll6ice. PQr ejemplo:

a,.,

ONA

E. co1i
Gada cromosoma humano Genome humano dplolde

tamano ! longiWd en k:ln'na de S.ONA dWnonsione& en la& Que &e oompacc.a 10 ~ pb 1,6nvn=1.600~ 2.rn (Clula) 50 - 250 1O" pb 17 85nvn 4-6 ~{nCleo) 6 ,6 10 2.2rn

4.7

Se entiende pot superenroll smlento {enrollar algo que ya e&t enrolacb} del ONA el retorcmlenlo o giro sobre al misma de la doble hlice (Que ya lleva impltcito el. enrol lamiento mullJo de dos~$), de fQrma Qvc el do 'a doble hlice no &q.~e una 1~ rocta. sino otr.- h6!lce (...,.., sue>Ortl66cen. Su ceuw. oomo s.t ~ 3 <:ontinut'Cin. t$ 1~ intr~ <1t una tensin eltruaur31 en '" ~ moi6<:\A:I Ap..,rooe do algl)o modo en 10<)0$ 10$ DNAs eelu181ret {y3 enrolt'ldO$) y $t et~eventra es.1reenamente regulado in vfvo POr la ~(iOn de tM 10p0i$0t/lo&fflS8$ (Pag. 151 ). En MSur'nM, tas dos Metas del ONA surren un enrollatnienlo, rnientrtts que ,., doblo hlico sufre un superenrolamiento.

Un ejemplo inl\litivo del concepto de superefVOIIamiento es el oordn del telfooo, Que de poc si presenta un enrollamiento heliOI:lltSal y. oon el uso <:Olidiano, termina por adoptar un enrollamienlo adicional (oordn retorcido). Esta simil &e utiliz para elllllicar mUChas propiedades del ONA vioo {circular y peQuel\o). Un modelo m& prximo a le e&tructl.M'<t del ONA es una cuerda fo~da por do$ cabo$ OOQIIados entre si. Aunque la cuen:la Dende a mafltener e&e t\nOI'-mionto. puode w ~ manualmente a un m3"y'Or o mcncw nUmero de vueltas en~ svs C<lbo$ (IQf'sin), c:on lo que se genera ul'la 1ensi61'1 que se liDera ~e ta tormaciM de supe~et~rollamien!OS.

7.1 .1

Superenrollamlento del ONA en proc.arlotas (y mltocondrlas y ctoroplastos de cucariotas)

Aunque a!ecta tanto a procarlotas como a eucarlotas. el superenrollamlento es M5 conocido y de oomprensln mas sencilla en tos pnmeros, por Jo que asl &e abordar a contnuaCIOn. Estas consideraciones son Igualmente vllcias para el ONA de pl&mid06 procaritioo& y el de cromosomas milooondriales y doropl&ticos de eucariotas. En todos esto$ c:OIIO&, a;. mol6c:u1., do DNA mutsln'l una eStructura ~irtular o oerrada (una doble Mliee 00t1 sus extreiTIO$ un~ entre si). et~ la que es fbeit aptec:iar tos tel'lbmenos de superenrorramlento.

7.1.1.1

Conformacin relajada

1.<' confONn~n ~esa por el DNA M su rotma B (aprox. 10,5 pblvuelta eotre!I)Ot'ldC a l.WI e$1aCSO estable, de mi!Wna enorgia, QVC 10 oonsicsera no supereonrollado o rehl}tuJo, cuando el eje de la doble hlloe 1e puede dlsooner ~monte 500r'o ~ prano.

ES'I AOO RlI.AJAOO o NO SUPERFf\kOI LADO


(eonfom1:1dn de cnfnima cBCrgia., mh.im:~ estabili dad)

1 '1>1' "'Jo;mp\0, 011 una r.:p'ln dt 6) pb h~~y t. ~-.,.:!u.. dt Wl..:o: ron 10.5 pb v~tciUr: .:loCI:\I.:IWll D.f>NA. pur- luCUIIO rn.,ad3

SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA

67

7.1.1.2

Conformae1ones superenrolladas

En tas cluiM el ONA generalmenle no se onQ1911tr<a en k! QOI\torm:)OIOn relajada sino en un ~lado no relajado. su~tenrollado y mas COfT9<1CIO. Este es produado por lopQISOmcrttm (1\le ~nte el c.one ttansltono de una o ~lb$!1 hebras, introducen un aumeneo o una dtsminuCI6n en el n:Umei'O de vutfl<lS de hlice {P89 151 ). En a:mtx:>S-ca!los. :se produce IJna tensin estructura'. debid;, a un plcg<'lmien10 IOC(Il ~ la!l IW!tlfas y a una pos,ei6n re!awa de loe nucle6tJdos ~eref'!les de &u goom11.1tria ener~~menle mlt$ ct;~~. la del S..DNA Esta tenSin se contrarres.ta en la moleculcl mediante la ~i6n de un supcrcnrQII3miento ta C<ldena O(llera del ONA g.ta SOOte si misma de forma que lss base& puedan cfl&ponorliC cw. nu~No del modo mas proxlmo a 1.a COf'l'otmaot! S..ONA En pnnt~~,~t I!Jg~t ~;i ~ "'duce el numero de vuel1.8s de hlice. la tensin se libera formando un<t $UPCf~icc it ltl que s.e le ~$~ un vlk:lt negativo de superemollamionto

1S TAOO NO ~~LNM>O o TENSQ (&: <n<rgia superior) origmudu por dc:&enrolllnuk l\w de 13 dobk l~hct (pnJllb de ' 'uclw)

COnformaCJ6n :: mtnhn3 L"fltq;.m. obcmtdn medi.Aolc un

SUPFRENROLV\MIENTO NEC:J\1'1VO

1 , ,, '" \ 1 lo 1cnfhil oJ, 1111 1 1cromu... >ma & 1 10 f!~ ~ luni)('IW ~IIIUM 1~ \ ..MI<lt hth.-t. con 11. 1 pt..\'OC'lta
1 lftl'lljop "

1Pll' j 1' "'


t

.. ,,,-.
~hdt<:

W'I'IIIIO..Vi.:ro.'a ~ 1.1 tnok\:uhllk-O"'tA ~i~~:ubt


l"v ' " ' fooiM-n;lll\o ll.u-.tftl!l

'

"'

llf l::tfi
l l\:to>tl\lo<oilol ...,"'o'I'I!O OII..!ot.Ho~

':if ~ co:n!itdem 'f'l< In !l('rd!ob de una vuclllf( htiiiX kl U.:urtlllocnlu ''S'"'* <k 1--1 flto, /:<.111 llo'fl<lr~' '~ dt hbh> (l(tfl ll,fl pb vud1a: 11),5 ph wciM. t111~'"' - nua
St,

!l \ ut11:u m loS rb l WII.I


.,,..,,,)f,$t~jl 'o!\ no1 '~"u

por el oonlrario.

super~ de

&e aomen1111 el nUmero ~ V\l!lt3$ de hke, senbdo opuesl(). oon un ~;&.~p(ltOnrQII;mionco ~iti vo.

ESTADO NO RELAJADO .o TENSO (de cnlorgil'


SU'ICf'iot') \)rigmado pot liUpueorollumknto eh: 1:.~ dtlt)1e l)lt(;e tatu~tlltl de vuchas)
1'

Conform:actQn di: mlrunJ: tnt.'ftti~


~blcnida medJante un

SUPERENROLlAMlENTO POSI'rl\' 0

'

"''

111..

..........

U ~l!fl'A .lo: ~ lO rb lll-lfl.:n..: .OOm l l '~ 11;; lotll., ._..

10.rh-\\dla

!4o.Jroill o.lc UD

!1

' ,_ '
1

> ,

11

n t,j >l'>!lllfloOIIIII.I llf"':l llflf.ollu11i1 u.'lk' ~1) l l'(_. . . (\'111 '11,_; '~t~:hJ
t-o)IIflrtlwt.o(nf . ,. I HI\li

'i ""C '"'''-1Ckr.l rcu.: t:l lllllr""'' '"" -.o~wlu\k !WI...., h.t .x11rnd;, r.n la rtp6n de nl pt.. nu. ~ 1 'udt...< de bHkc,.,,. ~JI pll \\fdlll ~ 111.~ pt\ ~~~l;ltb . (1111 hmlo) lcii,S

'*'

7.1.1.3

Demostracin experimental del superenrollamiento De e$I8S dos po!l!bl!ldades, ~ ONA se encoonre normalmente en las clula& oo un e&UKto de upe~enrollamlento negativo. la primera evodeflcia experimenta~~ que a.r--6 e Pf'OPOI"IOf ta twptMI5 del

superenrollamiento de la& otadenM se obuvo gracias a la aplicaciOo de lit !tnica do IJ!jraOIN'ftflfugacin i.scpicnica (basada en el equlli'btbde &4:1dimt'n1 3Cin en un gr;'Jdlcntc <'&defcSidOO do ;lon.oro dC ~io. pbg, 1'37) Se obsetv que ol DNA dtt potiontJJ, un p~~,~quco vinn <ue ( <.'IU'$il cn(ltf ~ rn!One$, se l:if.'P<Jft\bi:'t en 1 111$ bandits en o:1 grad"~t(J. 1.3!1 tr~ fmociof'lt!t, sio emb31l)O, tetlian ta misma masa tl\Oieo!Aar. por 10 que la dtlereoea debia estllr en su forma o es-t1uC1ura. Se pudo co~obar que las molctllas menos densas etan lineales, mientras que las dems eran el~. S6b ttas la h1pleStS del supereorolamiento se pudo explic-ar la difwenaa enlre eses dos fraooones mas densas

68

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA

b&n.U. 111. l-IS


tmeno;w \'ekK:i\l.o\1 oJe dnM:I'*Innr.

ONA de &lbk bcbn linul


\'-''"-'t'llfil. melll)l; C(IIJllpiOC!Ia

1\'C:IoK:i~ de -""'unern~ rnc .:nnedia)'


DNA. do: dobk b.:bnl (lrrcular, rcobjad!l
banda l. 20S
{ trll)'ilt w~idad o): kdlllllent~o:i6n): DNA de doble he,. C'lro.ot. jUI)C(~:nrotla:ko tiiltuth.lf:i mM CO!tlpltlll

bond;r 11. lt.S

7.1.2

Aspectos tericos del superenrol lamiento

El ~de la Topologia (rama de las Matemticas que e:srudia las propiedades de posicin r&latlva de tas partes de \.1'\ objeto, propiedades que no cambian al ser somecldo a delormadn} ha permitido aClarar la eS4ructura def ONA 5\4)Etrenrollado. El signo y rnagnil\ld del &upetenrolfamiento se asignan oon base en dicho estudio topolgico. del e~ llo &e comenl.<ln i'Qvl iQ$ i1$PQC,:IO$ ~ element<~le&
I'Q>iiblt.i du(lflf1ici.,.,..,. trona... & do.lcc htllnll t(l<lt t"jcmpio, do$ (llbQs de cum,l) ron drfe~ pdo.l dt eto~llaoi)ICilll) cnlto.: ~ (o.blho:ntc 1.ui.IT"no ik 1'JJI.teli\ L - nimwrv do.t ('111~ n de '<1.'<X'l'tuo: la ho:brlu t< cner-. (1=1 mookloo do:lll llcl'~lla, oon L lO, .:~pondffi;l al (),~\ tt!aj~M~i) ,Je '!lO tlb((llu;ldt~ _,,erklnno;!llel

e ) e )

Se define el ;ndice o nUmero de enlace topolgico (L o Uc., de linkinp numbef) como el nUmero de veces que las dos hebras se QUz;an entre &S: mils especiflcamente, ol nUmero de \'OOOS que....,.,. hebra cruza el plano domido pot la olra (como anillO o corva cerradet). Se 1t t~sigrla valor I)C)$i!ivo Q.IMOO las h6br~$ $0 c:n.a.an n.-.~ 1~ dort<:NI
se Jlabta de enlace topoiOgoo potque cuando t.$(1 las dos hebfas estn l lslc&mente ligadas (es deot', no se pueden separar). a pesar de que no hay enlaces 00\'alentes enb'e ellca&, Slo se POdrfan separar (L =O) rompiendo alg(ln enlace CO'Ialente {es decir, cortando una hebra). lo mismo es aplicable para cua~cJ~ier cambio del valor L. Por &a misma razn. la dofofmac::in. llle9amiemo. eec., dt ta1 hebras. sin cortarlas. no al&er<~n el nmero de onlaoe ni el nmero de superenrollamiento

de hliCe, sil!l\"'pre (X)Sitivo puesto que la doble hlice del ONA es deXb'glra. Como ya se ha estudiado. las situaciones de superentOIIamlefl(o surgen de cambios en el nmero de vueltas de hi<:e, es declr, en el nmero de enlace L Para discernir y c:uandflear 106 estados superenrolados se refiere su valor de L al del estado relajado, defriendo un I'IUeYO valor numrioo de superenroNamiMto como la difetencia (U ) entre el nmero de enlace de una confonnacin concreta del ONA y el nUmero de enlace de w foona relajada, Este valor <le supereooamien1o p.ede. lgicamente, &ef posi:ivo o negativo
P'.W.1ue I)NA 400k~1a!I Br do: ZIO pbde IOfllitud,la t:SUUO:natll 1 tiene 2lll pb / l(),j pl)\ u(lu " 2() \'Ud~. Por lllne(l, b 001tfo>t'1~n ro:l;tp4a de C\1: O,NA ~ 1 ~ Oc I,.,.ZO P'..lr C'1K'ni'Ja y P')r debaj~de L ..20ll( hab!n dt un liilll)('f<rlroiW:Jii(MO oostti\'O o ~i\'(l, respet'IJ\'afll('n~

Parn ot etl!IO del DNA. a. oonfOttr'lac:itl relaj&<la posee, por lanto, un nUrnetO de etllaoe ~al al nUMf:f'O de vuellas

;;;;~'~"Q;m.O
~---...
~oo

oo oco
............ ......... .,
l. 'll
~~.

~-.-.. ...m..

'"

-l

ESTRUCTURA DE LOS RNAS

69

7.2

ESTRUCTURA DE LOS RNAs

Como y<~ $C M iO(Iict'ICio (p&g. 33}. JOS RNAs soo polirtiDOnucleOtldor. {POIInuctetiOOs con rlboe.a, y U en tugat ae T) fom'laOot; por ~ linet\les de hebra serteila, ae varias decenas o milates de unidades, pero de longltud muy lnlenot a las de ONA No lKt pre:senl(ln como <:ttdenM <klOies de nebras complemtlf\larias.

7.2.1

Composicin de bases y estructuras primaria y secundarla del RNA

L& estrueh.lta ptlmar&a de ios RNA& ha sido e&tudlilda ant9n0m'lento (temt~ 4J En <:ut~nto ., ltt M(:un(fl!nl! es <:ar&eleti$1iea la ausencia de ~ esiTUctlJra repetitiva y blen definida, a 6fenmcia del ONA; r$()1mante $010 OIIJS\e es1 ructura secundarla en parte de ta molcula de lRNAs y rRNAs. Al no extSlY un apareamento sisto~tico ~ dos netwn, la oomPOsic:o6t\ 6e bases en lOS RNAs es mucno ms que el el ONA y no se cufll)len las reglas de Ct\argatf (pg. 38). Por otro ~. en .-~ RNA$ h<Jy <:ictt.;~ atlundsnCia oe nuc:Je(ido9 dlstJnlo& de lo& cuatro prinooales (A, G, C y U}. aunauc en ~ bajl) <:on respe.clo ~fa
vt'lri~

ae estos.
Com~it:i n d~ b:ast~ de O n.::a i~ mo

, uric'IS RI"A" (~j_

R:J:. <hlg:.do)

1'1po dt RN A t1ude:u

u
24.6 20.9
20.~

nlitoooodriaJ nbosm"-"1> de lrlln~i4:-n.-nc-i:


mcn:.aicro

20.2 17.8

25.7
J 1.8
~0.$

29.5
28.4

zo.o

~\,,dum

nOOsmx:o
~ tran~r..-r~'flc-ia

mcns:.icro
E colr
rtxll>I~OUM de u:.nsr..-r~'1lt:ia
mcnS~JK'ro

20.1',1 23.8 !4.Q 18.5 17.5 .. 25 19.) 24.1

)o.9
2~ .J

31.6 28.5
17.4
19.4

10.4

20.5
26.? 20,0
27. 1 21 16.0 2:!.5

27.7 29.2
~5 .1

JI

18 4 20) .. 22
:!~

)1.0
27.7

2~.7

ObsCncse cmo. a diferencia de lo qu~ Ql.:\111'1: con~~ ONA. la composicin de bases \'aria dt:11tro de u11a 1nisma espec-ie (scgiln el RNA cots.idc-mdo
n(lul$!C una cqui~slcncia

entro: bases tA-U, G-.C. purinas.-pitimidinas)

Algunos RNAs aooptan estruefi.Wa secunana en pequeflas r~s de su molcula, graoas al p~e9<Jfniento de s.u nica hebra sobre si misma. s;empre que sta permita el apareamiento intraGatfH!ano de dos zonas a.tyas secuencias sean complemen\arias, a pesar de e"ar separadas en la estructura primar.;~: se 6orma asi W'!a doble hlice klc.al. de carcter antlparaleb. De manera similar se forman tambin dobles hlices entre una moloola de RNA y una hebra senclla de ONA (hbridos RNAClNA) En estos casos. si el grupo 2'-0H de la ribo&a adopta la 00t1lormaon C2"6ffll'o presenta mpe<Miento& esteriC06 con otros !OmOS de la <:adMa de RNA. Jo ave mpide que se forme la doble hlice (que seria de tipo 9). En concreto. el 2'-0H 9$taJi<t mil)' <:orca de los fltom()$ del grupO k)$f3IO eoMiguo y del C8 ~ 1!1 ba$C ady(l(.onte En cambio, en 13 confOrmaClI'I C3'~ et 91'\4X> 7 .OH se proye<:la nacla ruara, te{os ae ottos tomos Clel eSQueletO y no ll()al'eoe impedlmet~to e$trlco alguno. potiO que es POSible la fotmacln de la dotlie nelloe. en este caso oe tiPO A. En te$umen la Unlc.a doble nlce en la que puede panacipar un RNA es fa de tipo A (el ONA. al careoet del OH en 2', puede adoptar lanto la A como la 8 , oomo ya se ha estodlldo en el lema 6).

1111

'o

CQI'Ifonnacin CJ' <'ndo (10rma A. nica pos.ibk


p:ir:lel RNA)

'

<"

e _( ,o......._..

,.

conf(lnn:.on C2'Nidu
(cst:. c.mfomucM'ln es ,~ltds p:1r.1l:a fomu R

endONA. ('11:1'(1 es

mJ!Q~ibk p:r.l ~1

RNAI

70

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR OE ONA Y RHA

7.2.2

Estructura tridimensional de los RNAs en general

Existe una gran diversidad en la esttuc:rura trtdmenslonal de las t'l'l()j(!oCulas oe RNA. ~tia es oompteja. \mica pera cada tipo de RNA, y resulta de la 00fl"'bit'I&CI6n de eSirueturat se(:l.lt'ldariM l~!es, estabilizadas por erce& de hidrO!)enO y por lntetaoclones l*!roleicas oe apil8mlento oe b*Ses. Sv e:sb.ldiO ooncrolO &e har mas adelante. para cada tipo de RNA.

tallo

A pcs:ar oo && tne.~~iMenci3 CIC una e~rucbKcl secvndarii'l propiamente diel\3 PN'<'I IOda ta moi6Cu13, 1<'1 eactona senCilla oe cualquier RNA ~ IOC:almenle vartadas estructuras: hOrqiAas, Ct\.lclmes.. buCleS, lazos. e4e. Algunas de .-as se <JeC)er'l a1 8C)att.'lmienlo de b.-ses ~tetMrlO formando cortos tramos de doCte hlioe de upo A. c:otnO $e acaD& de Indicar. La proporcin de z.onas nellcoldales varia ampliamente entre di9bni:Os RNAs. pero puede alcaf\Zar hasta un 50% de la estructl.l'8 total.

7.2.3

Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares

Tamo en proc.anola& oomo en eucariotM existen ll'Gs tipos princiP&IOs do RNA m,.n$<18f0 (mRNA), de trans.forei'ICia (lANA) y ri)o:$0mic:o (rRNA) , Adom~s oe eiO$, en evcaotas exl$1 en RNA nue~r l'leler~neo {fwi!RNA}. I'IIICIOtlt ~ ($nRNA) y ti!Qc)lsmie:o I)&QI.ICI\0 {seRNA), y RNAs de Otg&OOIO$ {MiiOOOI'Id&$ y ~8$10$). TodO$ elll>$ tienen en oomun ooa fl.lndn relacionada. dlrecu o Indirectamente, con la eJ:presln grica (madllacln postranecrlpciOnal y tradvcci6n). AGiclonalmente. en a9Jn06 virus el RNA iV09<1 el papel de P011t~dor de 1t1 inform;Jocln genelca, qve en el resto de atgani&mO& corresponde al DNA. La& <frferoncias ~meotale:s tt~cre lO$ CJiStiniOS lipes eJe RNA se te$1Jtnen en la labia.
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o<RNA 1t1lR.NA

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4.100

r~.......,nporwde la"'\N!IIWIP1fldo'<k' ..,_..,

1.900 r,..."' ,.,. "' OIJh.... tod pc:11..,.. ...., . , , _


160 } roo.u.n f'l'"t 4c'la -..,.w lj:IWldc otd

~.~.~

120

100-30.000 -~~ ~vn6:1 "'""""' IOO.JOO fUnn.l ,..,_. clt11~ . . . - . ~N.o<-~,Nf't)

oectoee- ok Md!noen~ao:~o::. (u~ll~cu S\'td~ pis. 1211

ESTRUCTURA DE LOS RHAS

71

7.2.3.1

RNA mensajero (mRNA)

La propuesl8 de la eJCi&)ncia de ~ molOI.Il<l QVO transllere: el mensaje gM&tioo des<Se el n.Jcleo al Citoplasma se debe a Frant;:oi& Jacob y Jaocqves Mono<~ (premios NObel et1 1965).. DiCha tnOiocula es el RNA mensajero que. al ser una ooora de ta infom'3(:i(ln contenida en la secuencia del ONA. acca po61eriormente en el ribosoma oomo molde o p~lla pnral3 sinleSis proteica. w cat'tiCiertsucas principales del mA.NA son las siguientes:

Se en~tta en e1 ciiOplas.ma de todas las cUas. en baja propo:i6n t$Specto "' RNA totaol y <:.on vt~o vido medio
COI'ta dt\08 su rpida slntesls y degradacin. Aparece a$0(.iado transitoriam811te al ribosomtt Sus mo~tM:ulas son de tamano muy diverso (en relaan (.(In el tai'J'I<IIIO <:le 13$ prOieinns QVO OO<Iifl(:;)n} Es el tcx> de RNA de estructtKa ms sencilla, con uf\3 cadena lineal, IC)tl"'\$d8 exCJUs!vamenle poc tos rit>OnuciOOSidos A. U, C y G '-"' <.:omPQ$1Cin de b&Se$ S un reflejO de ta del ONA r'l'oO((Ie oet que proceoen. La mola.l.a careoe de u!\<1 oootorm;)cin oeflnida: la eadena se mantleo.ne elltentida. sin adop4ar e&lruefuras secundarias ni terciarias signifi(:ftivM:, graciM a la participaCin oe pro1efnas que se asocian a ella.

7.2.3.2

RNA de transferencia (tRNA)

Fue Frands Crict; QUIE!n sUQR) que lo& aminocidos se unj$n a una mOiO!h inlem'18<18. o "accaptBOO(' aMes de rnteracaonar con el mRNA Efoctiv~mtlfl(l}, los IRNAs actUan como l'l'deulas aaaptadoras en la slntesrs de ptOielnas. Esta funOOn doQende <:le una dOble interaccin: Por un eltren'IO de la mole!Cula une.n el amlno&cldo para dar aminoacil-tRNA (P<ig 302). fa forma acbva ne<:esaria r:wt~ta reacdl'l <'e fonnocln del enlace peptidiCO. Por ~ otro extremo se aparean oon el mR.NA. en presencra del rbxioma, IJansfirienOo el &mino<'erdo (ljl ppbdO <:.rocient.e ~ etlit manera. los amlnocklos se ordenan correctamente en la prolaina, de acuerdo con la secuencia letoa por el tRNA 90b'e el mRNA (pg. 311).

EIIR>lA es d mcdt.lldur cntrt el ll\CINJC rkl mR.NA y la llct'UC:ntia de arnu-oocidos dd polipptido quc se cstil smtet11.1111do:

rm~

.. nrnn~K'l ur ;o !lii!<O;~o.;l\l<t

1111<'. II;Uo>!1 ,-,,.,.,

, tul(\\

A pesar de ser tos RNA.s de menot tama!\o, lOs tRNA& pteiSenlan ooa gran oomp~d escruct!Xat Se han a1stado y e:Sl\Kiiado mUChos. de dlstinlos organismos. mostrando una estructura comn a pes.lr de S41S dlslintas secuenclas. que

tettejan 1a r.eeesidad de BC&J)Iaern a su especitlcldad.

a) Especiftcidad de los tRNAs por los aminocidos Los IRNAs oonstotuyen ooa fraCCiOn imponante del RNA total. y se encuentran dlsuel1os en eJ cl\O&ol. Una olula
puede contener hasta 60 IRNAs dlferentes. es decir, en OOme~o supetior al de amlno&cldos (20), puesto que cada tRNA irlleracclona e&peclflcamenle (.(In un solo aminocido, pero algunos amrnoci<:idos son reconoe<os pot ms de un tRNA (se habla en este caso de tRNAs ~sinnimos~. pg 296).
La especifiCICSad se indica <.:on el nombro del 3minoCido on supe.rindice {001' ej . tRNAAia); los tRNAs sin6nmo& llevan subinditfl numCrieos (por ej . tRNATrp1 y tRNA Trp2), Cu<'tndo vt~t.RNA es~ un~~: oon ot aminocido se dice QW &Stil "activ&<)C)~ o <:.arQ3<10~. se aenomina aminoe~tRNA y se lnCiica con et amino9CiCJo c::o10 prelijo (por ejemplo, AJI'l.4RNAAI$, TrpIRNA l rpl. TrpIRNATrp2, etc.).

_c 7!; 2 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _- E "S e: T e: R ,UC> CcT..,UR. A S DE ORDEN SUPERIOR DE ONA Y RNA

b) Presencia de nuclesidos infrecuentes


Una de tas caracteristtcas de 106 IRNAs es que en su composicin presentan, adems de tos eua!ro princ:ic>i'IIO$,
otros nucle6sidos no comentes o infrecuentes, que pueden suponer hasta un 10% del total. Generatmert!e $t tr313 do derivttdo$ do 101$ <;uetro princip<'!l~. A. G. C. U. it$1 oomo de la hipoXM~,in;t, a meMo con grupos metilO en la base o la de$0llitrirl0!1a. AOerl'l!l. es ~Niderisliea ~ PI'Csoncitt <Jo ribotimidin,,,, LJ l)f\l$0nc;ia de todos estos nuctesidos est relacionada con 18 estructura tetclalfa y tiene por e1o una dara influettela sobre la tuneiOn.

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ESTRUCTURAOELOSRNA~ S ------------------------------------------------~ 7~ 3

e) Apareamiento de bases intracatsnario


A pesar de la abundancia de nuctetidos no usuales. los IRN.As muc&tr3n 1..1'1 Ciet\0 9fac:JO <le oomplemontariedad. es decir, de re~lones con es-tructu101 socundri , on doble ht.l ice bas&<la en ~tl)llre.emienlos (Se b3$C$

ln ttacatenarios. Con freooencia M observan ;Jp;JH );;,amie:ntos (5:s6ntos CIC !()$ OC W<"Jt$On y Crick. nmMos genricamente de HoOfSt/ien: PQf ejemplo. G puOCSO ap,ttre3r$e oon V mediaonte un ~13CO fflCI'IO$ fvet'le Qvt el enlt'tot G..C En otros etl$0$.. eo el cnlt"tce de l'lidtgel'lo participa el 20H oe ta l'lllOSa. Tanon pueaen e.otlstir baSes tl'l!rentaaas pero 1'10 cof1l)leme.ntarias, asl como una o mas bases a lo largo de la e:adena separadas mediante I.WI bucle ).{~~ laeililal el aooptamlento de ottas bases.

1 \:wcunierno \ - l , pero en pastont~~lllip.:aJ";

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74

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE ONA Y RNA

d) Estrvct(Jra secundari8 en trbol


Al coml)3rar l;t estJ\lchJrtt dt distiniO$ tRNAs M obMN.- oot~ notable Mmejarlu. El Ple9amiento rns probable e& 1:1 cstruetvt"a M<:unOW denomin&03 f'n ttfbol {POI' su M310gia con tres h0j3S y un ._110, o ~m OITO$ con cuatro hojM).

dOf'lde t1 aparebtnlento ef\tre Dases es mttxmo. En ella se dls.iingt.lel\: Tres brazos o asas princi pales: una central, 11. y dos perifricas, 1y t11 (cada una con tallo y bucle) Un brt~zo o tl$01 menor (IV), de dimensin variable entre 10$ difefGnte& tRNAs Un brazo abierto o brazo ~tceptor

Est ru('tur M'tund aria g:trM' ral ( ..hoja d(' t~bol"') dt lo!ltR.. 'IA.s
- ! J id<:l lu..,ntt l"'rl blot)

Brazo T. T!V(; 9 asa 1 conlo:rw ell!


~n(ill oon d~ n'bonuel~ido!;
l!lf rt<:Ul'!l!l.'' (ribo.lli~t~idiiQ. )' ~~~~~~11111). IUIII,YC>MWh'aOOJ.

Brug n. P lll' o

an 111:

Uofllbcbl lllllllll<lo> bulo

dihXJ ru.rid il.. IJO)C'qllllt \}OnllfCIIC


l:o ~ tnftC'I.'UI'fi!C' lliilti.!rour'IIC'IIO

(UII,t f'"rtx''P' M 1 ~ UJ6n 11.-1 ~mf ~IJ.41U~,, al n~

niNmoo r .. ,c.... lupr<kl ... ,,.,...,m p(l

l'l'll.!lilt('(I~C~d

Ejemplo:
Detalles. !le ls cstruc~ura

primaria y sceundarin
del tRNA f>< de kvadu!'ll
1.11$ p unliu U.: Occh1 sd lal n
b lll.ll:k$JdOS mrUI:!IkS

O dllll.aoun.hnll (wnbt&l DIIU <1 Ull1)


(}" ll'llC'~UIII()Wia UM'I'IWII m G1

o,tA

l mni.b~usa S mo:bldoo~n:~

(tlltll\Wn m AJ

(&am~II'ISC')

'1' .. pM~ridl&l

O
O'I'_ A

T
~.. d

nbo'JtJMoJmll
001 110 In I<Kin:~~

l:tl vtro!~ IRNiu a~IX'tl ~


r~utlusodot.

UlliC<lda.

ESTRUCTURA DE LOS RNAS

75

e) Estructura tsrciada en LMediante anii!IStS por difraocin de rW)'OS X <le cris~ Cle lRNAs se pueoe obse1V8r una estructura teroana oompecta, en forma <le L E:sla se ongin<t 1)01 '-"" retc)(Cimier'ltO et\ et espacio de ta estruc:t\Ka secundarla en trebol. Impuesto por las dobles hfiCc& IOC<IIC$ y 1)01 l)uenle$ de hiargef'lo que aoetcan los brazos O y T Es10s puentes son de tipos infrecuentes, incluyendo en alQUilO$ ~S()S tr'(lletes de bases (pag. 73). La esttuaura en trbol es. por tanto, slo una representaan b..-nensionat $imptillcttda oe ta verdadera esb'uctura tridmensronat
Pl~~amient<t d..-1 esqu~ll!'lt.l en b cstnctura ltl"\:liUU , Se nan.nenc pns~ Ap:u\"J.mi~"fltO <k base~ ~'<lrlljlkn'lentarias; se dcUIIIan ls 7.JIM~ o,:n doble h.hc t

11 rucu~~ de htdn'~gen.:. ~'flll'~ blls.:".$ de

bruz.:...; di~t intO\'i,

nuclc!i,\!1.:1.
~rcnn..,.l:

""" . "

~IH11

El oonoetmieniO delallado de esta es1nJC1urs perm~e comprender una pecutiartctad de lOS tRNAs. u:xsos $0n dis.tinto6 (pof' tener discinta seruencll e interaocionar oon un codn de mRNA y un amlno&Cido especil'\cos), pero <ti I.J8mpO son do atg.Un modo simil<trcs (pOr ~~ ooa estruauret leroana oomn. unirse a I'IXlSOmas y ser reconOCIOOS por 10$ f~I.Or$$ qua .,tervienen en &a tr3dvcci6n).

76

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE ONA Y RNA

7.2.3.3

RNA ribosmlco (rRNA)

Es Ef soporte estructural y componente principal de los rfbosomas. Eld:s:ten dislintOS tipOS de rRNA en cada otula pto:arlota y eucarlota. oon masas moleculares dlvet$8$, constituyendO la mayor patte del RNA 10181 {7$%). Al Igual que el tAHA. preseo~an un altO 0001enldo de nuclesldos Infrecuentes ('t'. T y aqullos con bases me~as, furlclafi"'E!!Olllmente).

tos RNAs mosmlcos adop4an ooa oonformacl6n compleja. Estn formados por una SOla hebra con regiones heUcolda1e& oorta& resultantes del apareamiento incraca:tenario de base&. Son molet.a oon mucflos repliegues sotlfe $i mi&m;ll5. muy 1'\eJcible& y~Orm3blc&. QuO so toi1'C)()r1an hidr<xfinilmic<~mente oomo espir<lle& al az-ar, especialmente a baj;a
~ ioic;) o <111<'1 IOI'I'I()el1lb.lr<~ Parece Que w c~rvel\lr'n con$1itV)'o un armatn o l'nl)kte SOOro ol Que so cn$<tmt)WI v<'!ri<'l$ prote{nf$ Pi'!NI <Jar IUI)al 311 tlboSOr'l\a.

Pr.:ditXio)JI de: Mnm ;cnt pnrn los rRNh

SS )' lf!S de

fi:('()/J. bljo una

c r.mt(lrrnocim ooo el mi~1mo nUmero do.'


apo~ ...micmos de baSC$:

\to.Jdos tndui'ICII.'li(luakll \Id rRNA SS. olm:nidQ .,k-1 ooeiJ de 111 nana J:cnqpu,) btU. Ob!ICn~ ~u >im1htud co. e:\ de t.. ('t)/1

En eoearlotas. l.a mayor parte de6 RNA p~nlc en ot nUc:leo son lOS rranSCiifot prlmai1os, molculas oblenldas dir&Ctamenre de la transoipan del ONA y <P.Je s. CIOfW<irn en RNA ~ tras sutrlr el proceso de maduraciOn postran&OIIpcloMI. Et tam~ai\Q dtl mayor IT'anscrito prirnano ptltQ.M'Sor cJel rRNA vatia entre 6 y 14 kb. segn la especie (c:Qn un ~(llet'lte oe sedimentacin de 3S a 475). Poco despus de $911' sint.eti.tado. eM pr rRNA e$C:Iin(lid0 para dar tres rRNAs maduros. de 28S, 18$ y 5.8S: stos, junto al IRNA 5S (l)roduC*> de un gen il'ldepencliente y. por ello. de un pre.-RNA dfeteNe) son los RHM que constituyen 13 m;J')'Of P<'rt.lt de lOS riboSOf'I"'8S euea~leos (p&g. 80).

En procar lotas. un Unioo pre-rRNA da lupa~. l8ml>i6n IXW' prooesamlento postranscr\XIonal, a rRNAs maduros de 16S, 28S y 55, que fonnan el riborsoma procantico (Pag 80). El misrn() precur$01' produce adamas algunos tRNAs.

7.2.4

Ribozimas: funcin cataltica de algunos RNAs

~as molculas de RNA $0n <:<IP<'OH 00 acruar OOfTIO biocataiZE.tCJOres, <le ani que el concepto clsloo de enzfma haya sido ampliado ms all de las ptQC9inls A os60s RNAs con actividad catalltlea, es decW. con capacidad de disminuir la anergia Oe activacin de cJe!ern*ladas reaoclones bkxufmlcas, se les llama ribozimas, para distinguil10s de tas enzimas proteioa:s. U c;apati!Sad catalitiea esll'lla Igualmente en la gran oomplejiclad y dW.I'$itlad de ostrue1urt\ tridimen5ional QvC l)ueden aCIO)tar lOs ANAs, lo que les pemwte edaplarse a& sustrato. <~~&i COme) en su r~lividaCI gr.'lcias a los grupO$ tunciOnaleS e bases y esquelelo. De hecho. se han pociOO realizar est\do$ cinticos ten ~$ tlbOzimas. verlt~eanoo ~ cumplen ta cintica de MichaeisMentoo. tlpictl de enzima$ proteiCas. se piet\S8 que &as tlboZiM3S ~ los primeros Dkleat811z.adores que apai'EIQEifOI'l on a;. o'IOivciOn. sienCIO <Je:splal:ados po$1eri0tmente por 1a4 ~imos )rott~Cas, mas vetSMiles. l06 RNAs serian asi las molcU3:s ~ de la \lida, antes de que t'YOitJCionasen 10s ONA.s oorno portadores do inbmacin gentJea y l&sprotefnas como catallzadotes.

Se c:Qnooen nbozimas que actU3n en divet'SOS !!pos de reacciones de inters en Biologla Molecular e lngenierla

Gencica

ESTRUCTURA DE LO S RNAS

77

7.2.4.1

Accin catalitJca en la maduracin de RNA

El pnmet ejemplo conocido de molcula de RNA con acbvl(j(Jd calaH1ica fue la RNasa P (se ha e&Cudrado en Proeiln04l.t$ pero pa~ existir vn(l t~elivi~ $imii<"Jr en eVC<~ riot<t.s) . Est3 enzim~ .,-1 (1 (Ofm;'l(f.) PO' molcvlt~$ do prot~tintt y de RNA, J)8I'O s. h3 comptObodo qve la actividad C<"~t.<llitioca roside on ol OOO'lll(lnen(O R.NA. Reconoce oc:mo wstn~o ~~ e~reOUtSor rnociO oe rRNA.s y lRNAs en pri)C:.;l'lrioi.M y cat*lilt' utl:l de 1M re~ociones ~ s-,1 m_,<:Jvracin posuanscripciOf\81 (para dar 109 rRNAs y IRNAs h.wtcionaleo9), en ooncre10 .a generecln de lOS e"ltemO!I S' Cle lOS tRNAs

(pag.2&3).

sustrato:
RNA rn.'(:~ miMO de rftt\As

enzrma:
~ RNasaP

prOdu<:IO:
p;tn:N.Imcnlc pwcc,..fu,c (e.;ln:mo S' (ldmni'"'
y~ . lllf'll(ldllt\'1)

plt"-I.RNA:>

y tlt\A!t

~'

..

pn:~UDI!f de

fRNA>

7.2.4.2

Accin autocataltica en la eliminacin de i ntrones


4

<Jet prec u rsor de r'RNA en el protozoo Torr<lhymGna (evcariot.J unic.lvltu) A dlferencii'l det ~o anicrior, este ribolimtl i'lciV<t ~forma 3Vk>Ct'llalibea, es decir. el su1Sirato es
sv prop~ molel).ll:l ~e un me<;Mi$ti'IO $a'l'lil3t ac:tUM oomo rlbOZWI'I3!$ otros pre-RNA$ prOQirlota:s y eoc;ancx.s. aqv6110$ Qvc 1)(1~ i ntrono$ de tipo 1 y 11 1.0$ in!rones (~ 245} $()(1 s.c~ del RNA precursor QIJ$ no se

l.3 $iguien!e 3'et1vid('t(t fCx)zim&!iea- ei'IOOI'lii&O& f~ 13

lraduoen 3 ptOtei n:'l o 110 fOrMM parte del RNA rnadutO pve:s $e elimiMn dur:'ltl-1e I:J m{l(lul(lcQn; el prcRNA compret~C~e. pues, el RNA madvro y 1 os it\uor.es. LOS bpc)S de intron y lOS f)rOOitSOS de madur<lQif'l <.lel RNA preC\11'$01' por OOtte y ~lme se estudian en el ptooosamleniO postr8fi6CtlpCiOtlal <M' RNA (p&g.

zso,.

En este c;a,o no se puede esltiC'Iamente hablar de cal&!lsls. pues uno de les requiSitos es que Cl ealaliudor 1\0 $e ~nsuma en el proceso. Sin embargo, el produclo final de una sene de r8aCCIOftes de autOhidrliSJS del 1nttn de Tetlah}"f1)6mm es una molcula (derivada del propio Wltrn y denominada l19 IVS que es capaz de ccuatlzar r&ac:dones <Se l.:;ln)b$i& y "tcrif-'C~cin do ollg~clotidos extornos il el!it Por Wn40. &1 bien no lo son el preRNA o el intrn or'igwlales, l I91VS si es vn V(lfdadero biocat<lllilodor.

rRNA nudum

.. ut .., , ."
~rnrlrn~

! .t~I\S

~
~

..
CpCpCpC" +

mtrn hhcmdO".
~ kll!C'ft!kl lo:ll\ odJdnl~IIIIQIIO.' <drf~ ,J f1h..,.,...)'"'ltm: ~ fi'I;A

- !.-. .-

------~ -~--~ ~~
CpCpCpC><
'1" '

78

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERK>R DE DNA Y RNA

7.2.4.3

Accin catalitlca y autocatalltlca en viroides: ribozimas de posible aplicacin teraputica

Los vkoides son molculas droulatee de RNA monohebra oon capacidad pera Infectar plantas. en at(p..W'Ios de ellos &e han encontrac tambin ribozimas capaces de actuar. de f<:lnn3 i'~a al caso antenot, &Obre su propia rnoikul~ o sobf"e socvencit'$ de RNA de molculas diferentes. Estas 11boz:ir'l'las oontienetl dos c:ornponentes esenci~IM.' CIOf un toldo. 1M S&Cuenei:ls de rl!ltonoeimiento Clet RNA sustrato (por apereanje;)IO <'e b$Ses co~emenlarias) y. por otro, w centto catatft!co. que adopta t.na estruccura tridrmensional peculial, denomlnacla cabe%a de martillo (hammerllead). y produce la esci&~n del RNA &ustr.lto, inaCCivndolo.

(l')

Wl Elbi:;~~
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!a_,....,.,,._,W"_I....,CIId
IIK\)liO) .jc. (uilo.,.

Modtlo tr"tdlM~:~tOn:al de 111 nb<lt.ltllll UIUdll ''00 d $USitdt(l,


~o'ni~ la; ..:gioou de ;aplltClllllil'llUI de hl$t:l, (011 dcoblt belio:o: $u(al. do: la hrlora

Q411hti>COI Cl()!lSigo mi$ma y oun b hebr.o ~U."!n110 fl3 trayC(:IOrill 6tl CtlQU clclo) So: ha d~ uni<'tlikllo~ QI'nos

de t oon una barra 11'\'C'SIIl

Se 1\an ensayado anlogos sin~icot de atguoo de estos ti:!OZimas (obtooldos por l~la gentica) para la destruccin &elediva de molculas <SeRNA con secuenc&as caractetlsclca&. Este es un planleamlento de terapia gnica. dentro de ta estrategia de ... ~ dirlg!Ga de la expresin genlca". Se trata de preparar riboZimas artific:iafft eon secuencias de rooonocimiento que tes perml!&n trrse "anttsentido' a un mANA. de forma que el centro ctrl3!ilieo lo oscincla, suprimiendo la sltttes!s de la pro~lna <:Orr9&pondiertte (El concepto do cadona mt.i5ftf!tido se inii'Od'ueira flt'l el tem;t de transc:ri()(:i6n, pr.g. 2:43.) Otro tipo de plantearrento de larapia, denl:ro delll estr.-tegi<' de eotrec:ciOf\ dirigida de mutaciones. conSISte en el corte meciante ribozimas de vn lr<~n5<:riiQ prteut'f.Or de: RNA cuya ~ estuViese mu&ada (poc proceder de oo gen mui.CidO}, de fOI'I"n& que ta esciSin ocurra alrooeoot de la mutaciOn y reS\.IIe un transcrito corregido.

7.2.4.4

Accin catalit ica transpeptidasa en la sntesis de prote1nas

El cuano e,emplo to oonsliluyo lO\ riboZima que ejerce la accividad tran&f)e9Cidasa o peptldi ttr.ansf orasa, responsable de lt\ fO<'\CCIeiOn 001 ~~~ee peptldlco en la tlioe.lntesls proteca. entre los 1'9$id00$ amino(:I()Ot & ituadOf M los sitios A y P del fibOSoma (Pg. 313). En este caso. la *accin riboantic;~ G~die<t en el t RNA 235, uno de los (lOtl"'ponerues de la subunidad mayor {50S) del ribosoma procari61ioo. y t)OSif>lemense taiYIOin en el tRNA hOmlogo da eucatiotas (rANA 28S de la wbunld90 60S).

LOS RIBOSOMAS

79

tKNA llS

--..!-. . co-.
UlNA
( >!

IR"-\

' 11 !U

:!ti.,

"ill ( 11

aa,.

" JI

A nivel fi$10k)g1oo. la RN.asa P y la peptdltransff!fU& nbosomlca son posiblemente 109 que me1 or r(:flejan P.l paree-do de las ribolimas con las erqima$ Orot~J~~Ca&., a 5aber: actan sobre un sustrato esl)e()Rc:o.. aceleran ta reaceln v~rba r~ de mttgnitud 00 ~1) dt$~ durtlnto C;t c~ttilisis y at PilfiJOOf se comportan de ac:uetdo con la ontiCS
m~Ch<teliaf\3

7.3

LOS RIBOSOMAS

los nbo&om<~s son partietkos ~elulares, u orgnulos. de llflportanoa eruc.al pata ta transmiSin a. 111 ln!M'nati(ln gen&lica, ~~ ooosbtulr ol fugar fi$1C0 donde $0 rvahza la .sfnteSI& de protelnas Se pueOetl c:on&~detar oomo eslnJ~uras qulm.oo-meenocas f!Uo!!S, 1)0( un la<fo. $& de$p~,an $Obcc el mRNA Otdon~nc:to la Interaccin de sus oodones oon 105 oon-esponcl!entes antlcodones del t~NA y, pot olfO., Pf'OP<UOOO(tn 4JI ontorno nCJCC$nrio pai(J que los anwnoodos formen los entace6 pepbdlcos del pollpeptldo en c:recimiel\10.
EsiTUctura!mente. los ribosomas son conluntos plurimoleculares de prot~nu y rRJtAs (35 y 55" crn poso. resoectivClfl1ante}. oon un 1amano de 20 a 23 nm. Es deot, son nucJeoop(Oledos. E.l e$1udi0 d(l otros nutltoprol~os c:cwa<:test~eos.los WU$. Y<l $El aborOO Qene~ente en una ma!ena propia, ia VltoiOgla.

7.3.1

Localizacin celular

En cada eMula existen varios miles de nboSOtnaS (por e;.. mtt!l de 15.000 ~.,un 1: coA). que IIC!]<'n ili>llPOner un cuarto del P8$0 seeo de la etllula Se encuentran en el cltosol 8!11 como en la m.:.tsiz. mtiOOOndnal v en et estroma de cfQtoplas.los Puoden estar en forma libre, como panlculas discretas, Pfl'I'O a menudo se Ob$<trvan en f.orm<~ de lWera. at;rv~ $Obro vn mRNA; en e$1e caso se les llama poUsomas o potlrtibosonlu $u gmc,lo do 3grvp..cin o pollmerlzaciOn depencse de la acllvldad flletabllca oelult11 los nt!O&oma& del cltosol de eucanotas son ms complejOs en eompo$iQf1 y ~ho mayores en tamal'oO que tos ul$0~$ WcttJn~nos. Los tixlt$omas de mi!Ooondnas y ctotopla!ltos eueariObc$ S on som<:~ntos <' tos l:><K;tet~anos (C1tot.lico$), EvohJIIV;)Ifu":n!e Pi'l'il l<ldos. los. bpos se ha consetVado una misma e. stfvetura ~und<llia. pero no la seOJeOOia que la crea.
I'UC ARillTA~
l ~num1lcs.

pbuta).. k ' adura:>. huu~


PltoC"AR(OTA'
-----ll 'IJI.:1t:fl.

80

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE DNA Y RNA

7 .3.2

Caractersticas diferenciales de los ribosomas procarltlcos y eucaritlcos

7 .3.2.1

Origen

Los ptee~~Sores del rRNA muestran una gran 4rver&idad en su secvenci<t, <W9 se rn;tMiosta en la ac:>al'fci6n (durante el proceso de maduracin postranscripaonal) dt di$1intos til$ <te iRNAs, carae~eri%ados e~ente por su d.terenle coefic~enle de &edimentac:in. .s.

7.3.2.2

Composici n

LO!I (ibOSOmas es.u~n lormado:s por dos subvnfd;tdtn dt tam;to diferen1o y forma fte9,113r, cada ur'l8 oonstitu!Oa J)Of uno o mas rRNAs y varia& proteinas de divoru mIJ$;) mo&ocul'r (entre 6 y 75 kDa). Tanto el ribo6oma compteco como sus subunldades y los rANA& oompanon1C$ M don~ segUn su ooef.cienle de sedimentacin. Las proteJnas. por su parte. se de&q~an por nUmeres consecutlm precedidos por l (Aav'gre) o S (sma.ll), s.egOO penene.zcan a la subunldad grande o pequea, respectivamonto,

Otfcn'nClll:l t:n ongen, c<wnput~M:in y estructura de los bosoma.~ ptocari61kos y cucari6ticos

ribosoma procarilico
JWur'Of ok rRJ\A .;k p-l)l:ariulll r-onA.NA t1ltl>o AIIJOSJ

ribosoma eucaritico

"'IIM~dM~,nsm~~
rftNA 1 ~ f'kN4 US

'\':tl 1 ~ 11 1 1 "' 1 1 (mao.1u"'d'*\ltii!IW:tt~ ' ' \h


lithAiliS

-\

1'\fl\'tin\:S \IC IR~A Oc ~&rtl)llll>

e""~" Jllli~ <"Js,

rRNA 55

rill\" .S..IIS

rRNA 1SS

r!t-'II A }S

'"
IRSA.
(6~ .......1

e=:;

.3,
-.:lrolich.

" "'

,_,. '"'....

S,

..

--"""""~ /
70S

.. , / \ 20 6
prul<i. ar u

_,

~ "'"

= ... .........

...,

""'""'

' '- 1 600000

M, 1.-100.000

M, ., l .SOO.OOO

/ ~iactcill ..... A~

80S

M, .. 4.100.000

~una de li:Js Y'3lores S de aiTIW~

n."i:urdC5C que la

subunidades oo es

ivuaJ al valor S del ribos<wna nnph. '1o

lOS 1\IBOSOMAS

81

7.3.2.3
L:t

Estructura
de 10$ iibo!ll)l'l\3$, igual en KldM las 06fllla$, es muy earaae,istlea se 1'1& <fllJeiCS&(Sc)
em)t(:~

~truccum

dlfraceibn de rayo!l X, dttracan de neutronet. miCroscopia electfnlca en oombnac!on con mtodoslnmmolg009 el<: Debido a su enorme lamal'!o (MOa) y 1;~ oomplajid<ld 00 6U .a~i6n inl(lma. al es1udio da la estructura dinmica y funcin oe los nbosomas COflS"Iltll)'o un lmponanle te1o lrwest~or las dQs s~ades n ~&O;i<Jn po1 ~n'cr'CQQI'(l$ no C:OVt'leniO$, ele utl~ lo1m~ ~ QmO s l<1 su!.>unK:fild pequoa ~~~ el t'lvoco do 13 gr<"1n6e. <f.eWn<IO Vf\il htntlidura o 1 \lnel .wre .amba$ PQI' l;t QOO :)~W Cl mRNA 41 motdldJ qve et rlb0$()(M se desplaza duran~e el proceso de traducc.on y ti!! la que emerge la (:lldena ~ldlc,a
( ~INCCIIrB 1:11 do~ 1>\lbullidJ\ks ~C k)s n~f&<; )'

$1tllb(i6tirr~inWI.
(0'1111)111..

'"" l.'efl'""' s.ai,,~

Ot:{lrflh-, If!; ~!M: .:1 t!IIO<tclll'lll del m k N \ y 4k lu o.:11!.1o:n.1 M)lir .oermh~.. n.)\!i~ 'Gic

,. ,..Uv~tiiN~

,............... . .

"""" --M!i:Yilo.l~l ~lfl\11.


m.tlllll (1 h~'n11'

lplnNJII
l~~~~~~ill;

7.3.3

Separacin de los ribosomas, subuni dades y componentes

tanto tos tbosomas .OOI'Iktales oomo sus subunidades y sus COfll'X'll"'enle$ ( RNAs y direrl!lni.C$ protoinas) so pueden separar med!ame cet~trtlugacln en gmdiemes de sacatOSa o de doruro de ~iO. en Pfe$Cncitt do ooncenlraciotleS defndas: de Mg ' 1 las subunldsdes aiSladas no sao activas. Por ouo 1800, a. se mezclan lOS componentes {rRNI\5 y protenas) a pH y tuena trica correaos. se Mooan espontrMJatnen1e en undade9 funcionales

1
Se\;l rllllll

d.: I\IIS
f.I)\J'I)IlCilh.-.. d~
1~ rlx,somas

. _ . g :-::
..

_...,

procnnlkos

_, .....
,...............r
n.:o:lt.-.,~~.

....

'

1:.k.'" ..,.... PI'E ]

~=

'"'

fi'"''=l "
~l:u~

Tema 8

Condensacin del DNA y cromos omas


8.1 Condensaci n del DNA en eu<:aflotas -.......................................................................... 83

8. 1 1

Proteinas ~mponen!es de la aomatlna... . .. . .......... ......... . . ....... . . . . . .. .... . . ......... . . .. .. . 81. 1. 1 Hi~.... ,_,_,_,. ----.................................... ..................................... .................
8 1 12
~inl's no hi$tc:lf'l3$ ,,,,, . , ...... , ...... . ...

84 84
84

.... . . ..

. . . . . .. . . . . .

8.2

NivelO$ de condenSC~ciOn del ONA nuc:l8ar eucaritioo.. --- ------........................................... 8 1 2 t Oi190$'Cin en nt,~cl00$0ml's y fibras de 10 nm , , . . . . , , . . . ...... . . . ...... . . . ... .. . . . . 8 1.2 2 Formaon do !al fitlt<l de 30 nm,_,_,._,_,_ ,._,_,_,_,_ ---- _ ,_ ,_ ,_ ,.,._,_ ,_ , .....,.,_ ,,,., ... _ ,_ ,_,.,.,,_ ,.,,,,_ , 8 1.2 ~ Crom.,t:.'l.t' o Q'OI'I"W;l$0m<t if"1crf(ISICO . . .. .. . . . .. . . . . . 8.1.2.4 Cromosoma metat&Sioo ........................,.. ,_ ,,, ............. ----- Estud.lo del cromosoma m.etal .steo ...................... -................................................................... -..... ~... ..... .. 8.2. 1 Aspecl06 Cllogenticos........ ............ -............... ............ ........ ................. . . .... . . . . .... . . ... 8.2.1 1 Morfologia de lo$ cromosomas ,_.,,._ ,_ ,,.,,._ ,_.,,_ ,.,,_ ,_ ,_ ,.,.,_,.,_ .,,._ ,_,.,,... _ ,_.,,_ ,,,._ ,_ ,_ ,,. ---- 8.2. 1 .2 Cariotipo y &u anttisis ...... ............... ......... ........... ................ ......... ........ ....... ........ 8.2. 1 ~ Bandeado ,.,_, .,.,_ ,_,_.,.,,._ ,_ ,_ ,_ , --------- .... _ ,.,._ ,_,,,,_ ,_ ,_ ,_ ,.,.,_,_ ,.,,. .. 81 2
Rcgl()nf:$ oon signi~ rvnCIQf1t~l . . . . ... .. . . . . . .. .. . . . ...... . ... .. . .. . . . . & 2.2 . 1 Ccnlrmer-o. _,_, _, .... ., _ , _--- ------- --- --- &222 TeiOmCrO$ ,,,,,, . ......... .... .... ........ ...... ......... .................. ........ D<1t11eJ6n gen6tiea en eucatiota'$ .......................................... ~........................................................ ~..... ~....... 8 .3 1 NW'tlero de eroi'I'IOS()tl'laS (n) c;)r~tOt h3J)IOido y diploidtt .... . . ... . 8.3.2 Con!enldo de ONA. V'illor C ........ ........................ ............. -- ., 8.3 3 LOQJs y alelo -- _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,,,..,_ ,_ ,,,. .. _ ,_ ,.,,._ ,,.,._ ,_ ,_ ,,..,_,_ ,,.,..,_ ,_ ,_ ,_ ,, _ , ----- - 8.3 4 GenoliPO, rcnobCX>ydOtflinancia ...... ........................... ............ - .......... ...... . . . .... . . . . . . 82 2

85 85 87 87 68 88 88

88
89

90
92 92

92

8.3

93 93

94 94
9~

8.1

CONDENSACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS

Para eotn:lle181 13 descripeQ-1 do l<t osll'\llct\lltl dol ONA oomo mater&al genuco y como requt.siiO f)fCVIC) al cs.tu<::lio del ciClo eeii.Mt (tema 9), es C()(l~nte analizar el complejo problema de la condensaCIn del DNA nucte3t. que ocune a 10 largo ~ &a .-.tetfase <se <iChO cielo este &&PeCio. un~ al prooeso enaT~&tioo de la repllcaclon cse1DNA (Iom<~~ 12) durante M fase S. es oe la mayor ifl')c)r\$nti<' dewe el pyntodlt VtSta basico y de sus apticaoones. Como ya se ha Indicado. la co,tdensaci6n del DNA oornpref'()e dos .-speaos lencamente noepEtnd1entes pero funcaonalmente relaaonados y &ubotdlnaoos entre sJ:
Su~f\."l!rull,uow;nh P"'~n:unc:ne r: dicho de l a molcul a de [1..0'\!A ldobk hC hCI.' ,k;,.trgm). b an logo 21 su1>tn::nmll :arm~'fl10 nt#.ll\0 ~ dcscnto l)ilta ptoC:ItiQt::~ (p:'g.. 66); SI.' ~OflO' poot en cu.:ariolti pot w m3)'0r <,;Qmpkjidlld, d~'bida co panca la g.rntllll\\gnitud dl.'l g-cno ) lllo.ll.

(-!Tln<\QIII.'t.amt.:nt<. rle$:unu :nto o <:ompa(Utcin de l 11 mokcul a de ONA debi do u l:a a)oC.)Cwc-in wn pi'O(c-inu.s. parn dar l ugar 11 niM'koprotdn:~ .._

Se ctudw en <:stt terna.


E~te a~pce1o apc:n:ts
1)0 h :.y

do;mdc

t)l:is1e e n pro,-atious y org;inulos do: cuc:m t.:L" hiS*CRill> y la oondcnsacn'!t) se ltSII ;.4'1 IU en d s~,~pcn:nl\'lllamicnto de la doble h~hcl!'.

84

C OND ENSACIN D EL ONA Y CROMOSOMAS

La condensacin del DNA desde cromatina a cromosoma owrre de forma gr.~dual durante la tase G. del ciclo cerular (le(na 9 ). mienttas que el proceso Inverso. la descondensac:ln del ONA, oomienz:a despus de la divisin oetular ( !ase M) y contina duran!& la fase G 1 hasta alcanzar de nuevo la oondiciOn 6fusa, que pemwte la fel)licacin (lase S). No se conocen con prec1&1n 106 aspectos moleculttre5 00 <lfl1bc Pf'QC~tt$0$ , ~o se (1$1,1'110 una gmn anaiOgla y se oonsidera. pot tanto. que .,.,bo$ tr(ln$().11Tcn PQI' 10~ mismos mee~nismos. en sentido irwerso..

8.1 .1
8.1.1.1

Protel nas componentes de la cromatina


Histonas

Son las poeipale$ PI'Oielna$ CQI"l''pooenteS del ma!eriaf gentioo de eucariota& (~alenlas en masa al ONA). Su 1\lneiOn fvndt~mtl'ltal ~ eslabi!Uar la estructura del ONA. contrbJyenOO a oompactarta. ~ra fatilit<w su
emCW)quetatniento. EstrucbJralmente, las ~onas ron~ituyen ooa familia de prolei!\31$ wnojanros. de I<'IMai'IO retallvamente pequetlo y con elevado oontenido (casi 113 del ""al) do t~minr:)Aeic:Jo$ WsiCOs (PI de 9 a 10). Gracias a euo, 1Y11Jes1ran naturaleza policaiJ6nica a pH li5iol6gioo {nuiTief(l$3$ e3rgas I)O$itivt'S en cada molCJJia) y se asocian 1\lertemente. met\ante lnteraociones eleclt0$t<'~&. oon lOs 9'WO$ kl$fa.o del esQueleto I)OIIaniOnkO del DNA.

% L1sinn % Argimna

o/ (I(.Ll~+Ar)

111
H2A 1128 113

24.829.5 10.9 16.0 9.6 10.8

1.32.6 9,3
6,4

27,430.8 20.2
22.4
22,9
24,5

N" de aminocido.~ 215-244 129 125

l\ laSil molecular

11<

13.3 13.7

I3S 102

21.1-23.0k0a 1 4.0 kDa 13,8 kDa 15.3 kDa 11.2 kDa

E.lci&ten c:inc:o tipos l)tineipales de J'listonas bien caractenzadas, que $9 <frfer.x:ian en su ((l~ieion y. como se veto\ des!lVh, en su papel e-9ttucb.ltal e.n ta organizacin del ntldeo&Om<l y c:rom0$01'1'\a. La Mlona H1 se pteSenta oon

tn3)'0r vMiabiliOae de secuencia y u.mat\o en distinta$ especies o lojiS, ~eras que las otros cuatro estn al\amente OOI'SCMidO'IS. En algunos casos, H 1 es &ufitituida por un<' V<trittnte. denominada HS, con especial afinidad por le cron'lalina, lo que refuerza el errc>aQuetamienlo y 1a inaditAclad ttanscrlpclonal.
El grado de condenS<'IeiOo <f.el ONA se regula en parte mediante 1a acetilacin y fo:sfotilaCI6n de ~;: hislon<'IS (pg. 326). afectarw:to Mi a la $Coe$ibllclad del ONA para la transetipci6n~ de es&e modo le~s li$tonas intei'Vietoen en et control de 13 el({ltt$iOn genlca

8.1.1.2

Protenas no histonas
rnenQ$ abundantes,

En Sil c:romatinn se pueden encontrar ottas protei na&. eo general peor caractetlzacJas:

mAs variables enlte tejidos y especies y

8) Con functn esuu.ctural


F'w'Q4eln<t$ bS.:::l!IS Prc>t:aml nas: Oesempefian la funci6n EtQVivt~lonte a las hislonas en tipos celUlares conete~. PttrticVItmnente el e-spermatozoide. Son ~in<ts pequcr'las ( 50 anww:lcldos, en alg(in caso} oon elevad<~ propOtCi6n ~ Arg, AJa y Sel. y eslruellJra pedoi1Wiantemenle (lhellcoidal. Su menor tamaiio pennlle la eotn~>&et&CI6n del ONA en el espaao minimo di&ponbloe en et espennatOzdde. Protemc.& ilc:IO<tlv HMG; HMk:l ur'l S% de las prolelna& nucleare:s Ql)rrC$()Qt\den al grupo lamado HMG (high mobiNfy group), protei nas oet grupo de alta moWidad ete<;tn)l(wetiea. I)Or su catcler cido, relativamenle pequcflas Algvnl11$ se asocian al nudeosoma {al menos in Vllro).. m~e<Mras que ottas interaccionan oon el ONA espaciador (pbg, 86). E.ste grupo lnduye algunos faelores de 1n1nseripc:i61'1 Protelnas del esqueleto o matriz nuc:ter. ESla estructl.n. que sirve de &OPOrt o gvit' en el empaquetamlen!O de la crom;'Wiin(l (pg. 87), esta formada por diversas proteif!i1$, inci.lyei'IOO algunas HMG y otra& proteinas de
~ler&eidO.

b) Con otras funciorles


Asociadas ata aomatlna, au~ en minima ~idacS, se pueden encontrar numerows ~intts. rnuy difetentes. que inleMenen en la fl:!Oiic:<tc;:i(ln y ltMtcrll)c:iOn (lema& 12 y 19} y en la propi<'J ~i6n del gtado de oonclensacin ~la cromatina: ONA y RNA-polimetaMii, sus Pf()4einc:~s avldlares, factores de replicacin, factores do trAnscripcin, receptotes hOrmonale&, t<lPOisomemos. ~t .

COHOENSACIN DEL ONA EN EUCARIOTAS

85

8.1.2

Niveles de condensacin del ONA nuclear eucaritico

Se puecle resallar el graoo <Je oonaen&8cl0n alC&ru:ado recor<Jai'IOO (lue 18 IOJ'I9ilud del ONA e$ variOs tdeMs de magnitud supenor a las dimenSiones de las estrucllJrM celulares que 10 a\bet9M (pg. 66). Se denonW\8 gtsdo eh condensacin o de empaquetamiento al cociente entre 1a lOngitud del SDNA en doble hebta y el 1amano del mismo una vez oondeo.nsado: este parmelro se ucl!lzara para comparar lOS dlsllniOS nlvetes de oompaet3Ci0n

La condenseciOn del ONA puede estUOiar&e en cuatro t\iY&IeS, aunque esta divisiOI\ es tel81ivt'l, ya que IOdavia l'lo se ;emotende ;en detalle oOmo aoon1ece este fenmeno a n1ve1moleci.Aaf. Es i~nte ncficar que la condensaciOn y de$CQrldcns,ci()o a trtrffls de CSO$ ,.,.ele$ cstb, cslrec:hilmerrte 50(;1Jd<l a la pcogre&l6n por las distinlas fases del aclo ee1u1:u {Pllgs. 100.101)

=
~

e c.
c.
o
~

= " = ,.
2
~

~ ~ /) Bucles de eromacma \ 1
Helcroctomatin41

UU
/

,.

(I~)(OMU

/
I:.U~.:ronuuma

"
\


~,, '11~11

\ \
\

Cromosoma mt~-rl':s.ioo , /

IJr""..S.Jl.'( ''"'l:'l"''"'n

.~

.. =
E

2 " +

c.

.u' <nbrn .lO nm1-+ c~.~m~ ..r - t


ljlf~)

)
'\m:l 2
(e~

:;;
e " = c. "' = " o:
~

Fibf:l de JO nm

(soknotdc),"'
di:
"!11

., n!kn"a:"on

< z Q
Fi bra de 10 nm

''
(nudcosomns)

''

''

' '

.., "
v

= o

'"""t~; nn.l*c!

......... "'" ,.._.,.,.,.

~ - I,.. 'X0U\5)_
Cadena de ONA ldoble fllice)

8.1.2.1

Disposicin en nucleosomas y fibras do 10 nm

EJ nuct~ es la unidad bilsica o elemental de la eromaUI\& y 10$ cn)m()$Omas, Conl;CibJye un pa1r0n tegular de il'ltet3eeifl tntt ONA e hi&'Ona.s, responsable de la organlz&eiOI'I e$1n.-:;bJ~I del material gentico en tooos los organiStn(:IS euCilrlotas (en cv<*luier tipo celular y etapa del ciclo). TMIO fll ni'CIOOIOmil como sus componentes y las fb'as en las que se blegra. 1'13n SidO Ob1oni0os y analizados por dlgest!Otl COI'I DNtl~$, t6a'!re3S de entrecruzamlen10 (CtOSsNtl*.ng). hl>tldadn, dift&eer'l de cyyos X, microscop(a electrnica. dlflaecitl de noe\ltrOrJO$, dieroi&mo clf'tulat, u!l~c:entril\rgacie.l anaH bca. eic.. la PfopueS1a de ta t.xiSienei~ del nueleosoma surg1 del estudiO oe 1a aoeiOn de 0Na&a5: &Obte un ONA naU'YO, el tamau\o de lOs frorgn-.ntos producrd06 es siempre mU!titliO de 200 pb, l'fll<:ntra que sr

86

CONOENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS

ac:KIM sobre Ul'l ONA pre-viamente lberado de historias, los fragment06 son de cualquier tamao. Esto sugiri que la t.n0n de lar. histonas protege regiol"'8$ de ONA de unos 200 pb.
Cada n ueJeosoma e~ klnnado POt 9 molculas de histonas y un cr...-no de ONA, Bajo CllfUI& <:Onclic;ionet experimentale<s ouede libet4ll'$e lit hi&ton<t H1, k>ealizada vtem<'m(lfl't, 10 QUO 1\fCe ~otesibte ~ 18 ON8S3 una parte <MJicionl del ONA. El nucleOSOI'I'Ia 4Ueda 8$1 r&ducldo a la llamada partieuta ncleo {col'&), formada pot un octmero de

h1$t<lnaS fO(Ieado por ONA. El arronamleniO le'f'6glro del ONA sobre las hls10nar. StJpone un wperenrollamiento negativo de la cadena de ONA (en procariola& el superenrotlatniento se consigue por simple relorQmiento del ()NA dn::vi<N'. sin iml)!ieaciOn de protelnas., y no existen nueleosomas).

ON,\ de l.klbk htli.:.: ("<200 pbj

Nuckl\\Wnlil comrtc;o:

200 pb ONA fii'!A.JI:m.H~.H.a)1


111

ONA na1ivo
CCI\lln31m.a)

p. ~

111U

u4

~- MO...r\
ll(lb~el

L11 ort'*"""

'lAmen) .le

hi)tom lo

"'ihb: plllll
..,.._uon.w""lll (lll'd~ pt\llCIIIas

fTI8f\06 in !litro. con e&da

Finalmente, <>lri\$ protein.M no hls!ona& tambin pou1icipan oen la estruetu<a. HMG14 'f HM(;.17 se a.soclan, ill nudeosoma. mtetas we HMG-1 y HMG-2 h !eraoclonan con el ONA e~iaOOJ,

UM misma motecuta de ONA envvetvt tuceSivamente a distirrtos nucleosomas y los oooec~a entte si. La porcin preHf'!to entre do9 nudeosomas suonivos se denOITW\8 espaciador, ligador o ONA incemucleo~ (Ntl{Wi); &u longil\ld P'*'t variar entre 20 y ms de 100 pb, <tependiendo del cwg.anlsmo o incluso del tejido dentro de un mismo org<1nismo. Esaa estrucwra de nucSeo$()tnas espaCia<I08 a lo largo de la molcula <10 ONA se denO<ina fibta b'slca de eromadna o fibra de 10 nm, pues su grosor corresponde al dit\nwwo dCI I'IucleOSOma. El grado de empaquetarniEIO\O aleat\Zado es unas 6 \'ecef supe!tof al de la doble hlioe ~ ONA ex!endlda. la fibra de 10 nm tambin se lam3 eetructura en cuen~ de rosano. por su aspecto tc~r.'lcterlslloo al miCtOScopio electrnico. generalmcole SOlo
006e~do cuMdO se prepera In vifJO a baja fucna i6tliea (Pot ejemplo. 1 mM), mientr<t<& Q~ote d&ntro ~ la clula la cromatina se et~euentra mayor1tariamente en formas ms condensadas. y &u disposicin en t$te est:8do te~atlvamente e:xt.et~dldo se limita. en todo c;a$0, a pequellas zonas.

CONOENSACtON DEL ONA EN EUCARJOTAS

87

8.1.2.2

Formaci n do la fibra de 30 nm

En &as preparaciones de cromatina obtenidas in wrro a may fuerza inca (por ejemplo, Msta 100 mM), la fibra de tO nm se arrolla en sentido levgiro para dar lugar a una iorma ms oondens.ada. denoi'IWiada &cNenolde o flbla de 30 nm. que supone un grado de empaquet<tmiento 40 veces $UDCiriot al de ltt doble hiice original E$1<1 fllt<'l oontiene algo ms de 6 rucleo&omas por ~da vuelta de solenode. Av~ se de&(l()I'I(IC$ &u e&(rvc:tUtil ex01cca n vNo. &e cree que 13 hi$eotl3 H1 queda situacta en el .,_teriOr del solerw:lkle. aoetcanoo los nuc1eoSOt'l\aS entre si ~ heCfiO. expet'lme-l'ltalmente la formacin de la fibra oe 30 nm. a dlfeten(G de la de tO nm, requiere ra preS~Cia de H1. E-sta es probablemente ra forma fl&iOI:glca ms descondensada de la cromatina, adopt.acia por la mayorla del ONA durante la lnteriase.

8.1.2.3

Cromatina o cromosoma interfsi co

Este niVel de condensaciOn supone 1a presencia oe 1azos y supetenronanventos oe 18 estructura anU;lrlor t.os bucles o as.as radiales. formados por tn:lS 50 100 kb de fibra de 30 nm. emer9f!'l\ de un armazM oe pt(l(einas no h!Sk>nas denominado ncleo o andamiaje central, matriz nudear o proen, o esqueleto nuclear. ESolo& buCleS sufren superenronamlento. regulado pot topOisomerasa& asociadas al esquete4o. Parece que, adems de contribuir al empaqueta!TIM!flto del ONA.Ios budes oonstitt.ryen unidades tran&eripcionales, al haben;e observado la presencia dentro de un $0lo buctt de un 9'" oomplcto o b<qn do ~,.~~n grupo do genes rogul<'dos do form~ ~ Es tipi~ Ita ob&ervou;in do i'll$<1$ mdi3Tos on 13 interftl$0 <Je c:tQtn0$0~$ I)OiteniCO$ gigMtet <S& ~N~$ de ins~ y en CTQm0$0fl'\(ll$ I*Jt'n0$0$ meit.cos dt ooei~s <Je anncios.
A P<Ntir do e$(;) ~lniCh.lf(l se t<wman cnroll;tmiontos $U{ltriorcs, <;ve h<leon QUO 1<'1 crom<'J til\3 en la nterfas.e presente en el nUcteo un grado <le condensaCin variable: se calcula que se mtmlpiiCa el gracJO de coMeMaein del ONA por 1.000 O 2.000. Este diversidad local en la denSKiad de oondensaclon se obsetVa en forma de ta presencia slml.llnea de &ucromatlna y heteroeromatlna en una clula en werfa~.

EoCJ'Om3tifl3 (cromabna verdaOerra)


Aspeao al miCroscopio bajo

Se bl'le .mensamen:e oon el oolorante


M3yGrtinwt~ld Gicm$il

Se ur.e debl!mente y con


aspecto cifu&O
F()n'l'\3 met'IO$

tincin (c:feliniein Qrigin<'l)


Otado de condensacin del ONA Conltlbuein at 104811 de &a cromatina

M&xlma condensaciOn de la erornatil\8 (prOxima <runque menos, a la del cromosoma me-tafsiCO) Mli"'Itilaria, SlO algunas porciones del m(ltCODI gentiCO se encuentran en eSia aorma. HetorOomatina con&titutiva: reg.ones del genoma qua se encuentran permanentemente en formta de heterocromt~tina (durante toda ta l'llerl&&e l y en !oda& las clulas Se d8$c.ondensa el t~empo mnimo neoesario para replicar-se durante la ras-e S det <:ic:to cetul<n inCluye et DNA ~st6Nte (lema 10), concentrado e6.pE!Cialmente en regio~ 1e10rnt:rieas y centromrlca de los cromosomas (p&g, 92) Heter ocromatlna facuttaUva: se et'l~ra corno hetCf'OC)"'matina t;lo en alguna& clulas de un mi$mo Otg~ni$mo o on t~lguno& ndivd.los de una especie; puede P3$l'' a euerom;)tin.,, en reSilUEI&Ia a determn&Cias sel\ales Uno de tos ejemplOs es la ii\8Ciiv&ci6n de IIAQ eSe lo$ 2 cromosomas X en la m~, puesto que se puede in;tetivnr \anlo el X ITI<Ileri"'I como el paterno. Uno perm~noco condens<ado oomo heteroc:romatma, mientras el otro est en forma oe euetOm&tina Al final <S& 1<) lt'$<: G2. previa a l;t diVISin pot ITdOSI& o meiosis, toda la aQII"'&IiM de 1<11 OOiu!a adW 1& forma de hetef'OC:toma!ina (ante:s de condon&ilt&e an ms para dar ef cromosoma)

condensada
Mttyont;;nia durante la

interfase

Aeoeslbilidad oo la mo~&eultl de ONA para su inleraeciOn OQt\ pt'O(elnas (DNA polimerasas, RNA pokne(asas. tact01es de transor,.x:ln...: pg. 250)

No es 9oce&ible. debido a su elevada condensacin. Es ~iblo cromatina Se h&b!a de cromatina lranscnpclonalmente ff&n$~l9 mxtiv;J SG rplica allinal de la fase S. Los genes 8Clivfl Se t))ica ttl <1ue <:Ontiene no st expnl&an principio de 13 fMO S Sus genes se CKJ)rC$CH'I

88 8.1.2.4 Cromosoma metafsico

CONDENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS

Avnove "' fiMI de la protase ead8 (tOI'n()$(!11\8 ya esta OOr'ldel'lsado corno heterOCI'Ot'Mt!na, dur&f'lte 1a I'IW!'Iatase se COndon$0 an mA$, aoq~o el aspecto tipieo Cle lOS cromosOMas metaflisieos, corpseul09 observaflleS al miCtOSCOplo (lptlco que muesiTan. en general. aspecto de baslonclllos oon dos cromtidas ms o men06 separadas entre si.

la$ f1bras de heterocromatlna se arrollan en una primera espWaiz.acin para formar una espiral menOf de paso
muy pequeno. que se arrola a su vez &Obre si rrama (en unas 1().30 'Neltas} ~radar la espirill somiltk 01 Con GQ doble espralizacin se acorta la c:romtida a \A'\il v~im~ P<tr1G, sin <M.ImOI'YI&r $1..1 dimetro E$10 f3 Mo. m6l5 vi$ibl0 31 mlcro&copio Ot:>tico A~s te(,)iones de la crom'lida &e arrollan slo en .spir.-1 menot, como. POr ojemplo. las ~

eenb'meto

8.2 8.2.1

ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFSICO Aspectos citogenticos

8.2.1.1

a la regiOn ml$ estrecha del etOf'I"'Isom&. por la que permanecen tnefas las d06 ero~ herm~n.-s El oentrmoro ~ita 10$ brazos eromosm.leos (cuatro antes de la mitosis, dos tras ella). Los btazos cortos &e de&ignan oon la letra p {de p etif) y k>$ latgos 00t1 q (de QUE'Ue). Cada btllzo se nombta.. poes, por el nUmero del cromosoma al que perteneot. S&Qt.1i00 ele 18 letra p o Q. Por ejemplo, 6p es el Otazo COf10 del cromosoma 6, 8q el brazo larvt> del cromosom~ 8, ele;, l O$ CtQtnOSOmas se elasltlcan atendiendo a la posicin del eenttmero y. POf lan. $09Un el tam3flo relatwo de lOS bralOS:

Morfologla de los cromosomas Se llama centrmero, ~nstriccin primilriil o contr;~t

CroI'IUiiOna,
lllt'l:actrkOJ: br.:(o>s de 1nmni\o

100 blll,.ladoltko~
h n!WII de llliJA.fil) dl f etei'IIC:

eroo\05011'4S

Crom~lfll:lti 11Cfl)('ffl lric9S"

un br.la'l muy
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la IUI~IS dnblc, O.S;\ ,lu,,, -..:, .'(: ! .:romibda...." ~
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en 10$ ttazos 00t1os de los crom060ma& acroc6nlri00$ {exoe~o el Y) existen, adems, otros estrecnarr.emos do la eromtitJa, denominados eonstrtecioon sec;t.~ndaas, :OI"'M en las que la espiral 901T1lica presenta un <iiwnG1ro ms ...clu(;i(:k) Oelimlan ooa seccin temwt.al en ., cromo$011\&, a modo de una pequella esfera, a la que &e llama s;~tCiito cromosmi co.

ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAfAStCO

89

(~if teaein clo.:

kxo; C.:IQm~ll' hunmnQJ.. ~CJI.IIl' lrpoll\lo:'i iKi'nm~'(> \ut...no:~ln "n \~ft'o;~"f'>tnu! III!TilU;..,I(.;r.of)lk, \kdiWI(o, ruq\IICilv)

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8.2.1.2

Cariotipo y su anlisis

C1riotipu
WC~S~ilv.;Wel <mllo.'lii !Jml:l o:o n 'MlitVI.\'llio 1.~

~fUI!Io)(li4'1T!IIOO dt \1(1 111oln iiiiCI Uo\ o MJI <~ltrkl>o;B .,k ~ .lilA

~unlu-ok~'OJ,

o;C'(lCIO: ~ 1~ (I'J;,ono~ dt UIU

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C'lllb.lqtu-. <:JP''<11:' tnll)' Nll'lil:nn .<den

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f~p1C1-.:IIIiltil!n ~IIW\"11'>1 dcl ~.lma hn ;.1~ lf '(IOJ"" w;a rn~fiiiJU ooonl) $1fl(lllun,'l)

Son valioe tos motodos dessrrolaaos para et sn.tolisis <Sel eafiotipo. Nomalmet~te, esto es-tudio 5e rc<lliz-<t 11obro cromosomas en el estado de prometafase o meta~ase. Las preparaciones de cromosomas tnelatMieos $0 omi)I(!M aaemas para anatizat anoMali;as er010$0I'I'Iie&s. Cle~.ermi~r 13 pro&encial o ausencia de cromo50n'las extra. A este fin, e-J MiOOO ~naJ y mas seneilo de obler'ICi(ln ae CtomoSOI'I"oo)$ p~trto de ICtuoocitos, como OOkias nuele>adas del organismo mas aseqt.Dies.

90 f'repuucin de el ul:~s pam csruditsr el c.-vi<Jiipo

CONDEHSAC.oH DEl. ONA Y CROMOSOMAS

Anlisis del ca.rio1ipo

de"" '-'.-.:00 ... ~ ,_._ ....


~n-..lllio:a.

l. St Ji,;od(' lllllllhaboolx
p.c,...oo~on.t~lpotn ~d(fl.'(ml

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~urp.:.;ulo:< ~~ -rl.lllfl(tiXnl~

Aetualml!:l'lte. se parte ya no slo de cuttivos de leuoocito6. con la 00$'1801aja de su vida~ oorta. de 3 a 4 d.i~$. $ino dt t uliNO$ a largo plazo de ot!Uas de dfversos tipos de tejidos (fibroblastos. m60ul3 $0.31, ll~idO amniOiico, biOPsias, etc:.). Las ms usadas 901\ las de ma)'Ot pot.enclal de divisin o mav folc::ifid.OO de cultivo A$imismo. exisAe una variOd*Ct de lratar'l"'lenlos de desnaturalizacan yto degradacin enzimMiCCI de &a cromalina. y <le lineiones con COlorantes espec1 ftcos para el ONA. Por ltimo. " hM 40:$arron~ sistemas de carlobCJiflcaciOn que pueden ser Informatizados de forma que seteocionen aueom~ment.e las clulas a analizar, el tillO de trleln y el anlisis de los cromolS(lf1lCIIS,

8.2.1 .3

Bandeado

Aplicando distintas tcnicas de tinOOn. u~ de l<lt'm3 ru!lnarla en labor31orlos de c!togenelca, se puede 06 cromosomas ~$ l)bllictas y oscuras atlemativtlmet'lte. que defll*'t gtandes reglones crofTI066mlcas observar en 1 llamadas i&--ros E~e bandeo o bandeado de et0n"10901Tlas no es consecuencia de agrupamientos foftuilo&. sino qve et;t;i r~ion.-~ con ta Qtganlz.acl6n eslruCIIJral del genoma, reflejando variaciones mtos como _, CQti'IC)OSiCI(In de basct. ~o <~e condensacin cromosm1ca, conformacin de la cromatil'l;ll, soo.~encias ropotiCi~s y no trt'lnsaltas, etc. lOS pattones de bandas de cada cromosoma &On prc;ticamenie idl'ltieOS en clulas d ltetet'IU!S.. y en casi tOCios lOs tejidos, pero pueden diferir entre individuos; I)Of' ejemplo, al menos 12 cromosomas muestran variaciones en la longil\ld de cienos segmen!OIS en discintas pet$0l'llill$. Se we<~en llegar a apreciar 11asta 500 bandas en un cromosoma; en tuncl6n de 18 resducln microscpica alcanzada, las bandn :::.Meipales se subdi'ofden sucesivamente en subbandas y subsubbartdas. A todas ellas se tes asigna un noml)ro, Q~ incluye el cromosoma, el brazo y t.W\ nCimero OO!'felatlvo desde el oentrmero hacia los extremos

ESTUDIO DEl CROMOSOMA METAfAStCO

91

RESOLUCION CRECIENTE
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nucnroropil l M'~n ~
-~1-) ~okwrn&

Qda~..r:r&'...tt

PNa el bandea<lo de c:tomosomas se emplean diversos metodos de tlncln oet ONA con colOrantes especflioos;

a) Bandeo G
Es la l&cnitt'l mils. vmi~ se b~'"" th una deStlabJ1'3tit.&CiOn OOtltfOiaCJ8 <1t las proteinas ct0n10$0mieas (generntmente tJOt Oige!Shr'l con tr;psil\8). segLCSa de lltleiO!I con Qiemsa (Cie donde ~e et nombre Cle bandeo G) y obsef"acin al miCrOs.eopio (el rettc:tlvo <le Giemsa es uM mezeta oornpte,a de (:()lortu'ltes;). Cada p{tt de Ct(lr'l'IOSOMM rTKJeSifil ast pa~rones c:aracterisucos de tlnclon. con bandas oscuras {0-posahras o bandas O) y bandas aras (Gnegt'IIN<'$).

~~ Bandeo O
LOS etOm0$0f'l'I3S se Utlen con t.r1 oompuesiO tltiOl'eseente. como mostaza de g uinacrlna {N<IrOCIOt\lro de quinaet'la). 4',6-dia"**ino-2fenll-lndol (OAPI) o Hoechr.t 33258, que se lntetcalan en el ON A. doble Se r equiere. por tanto, un examen mediante mlcrosoopfa de nuore&eencla. Aparece un patrn especilico de bandas bnllanter. (bandas O o 0-poGibvas), que &e corrcsoonclen CCII$i ex,ctamerrte con la$ ba~ G (G-posibvas, ~curas).

Las bandas G y O cont!Mefl ONA que, en gener<tl. es algo ms rico en pares Al {~60%) . pues la q~cnna se in&ef1a preferentemente enlte e:stos P<WEI$. Corrosi)Onden a (7Qf'I'\(W(ina altamente condensada, oon ONA de replicacin tiVdiil dentro do lt~ f<'&e S del CiClo cct~. telt'ltlvt'mente in;)CIJYO trilntencx:iol\illmcnte

e) 8andooR
Se bas8 en oo tratamier'lto de kloS crom0$0ma$ 00t1 ea1or (para dtsl\&1uu)!i!~r ti ONA rico en Al). antes de la tii'M:In con Glemsa. Re-sutl8n ssl o.anda& oscuras (bandas A ) que ooW::Iden 00t1 m t:landa!l G o O clor;)S (el nombre deriva de patron rever!IO). Tambi&n se oonsigue el mismo paltn de Daildas emp!eaf'ICJO Olivomic:ina, un COlOrante con atndad pos lOs Plf'8$ GC.
L.3$ b;lnd".:l$ R contienen ONA rloo et1 GC (50-60%), Cle b<JP condcnst'on cromatinica, que se replica en etapas tempranas ce la rase S y es retat?Yamente activo transetlpciO'Ia!Mente.

d) Bandeo T
ldcnlifctt un $u~n10 de band\1$ R C$C10CialmCntc conoentrOO<at; en los telmeros. las de tnclon ms .nlensa. y se "i$~4'1'1 eml)leando un tr3'ta~nto ln'niCO 1)3rbeularmonte severo antes de teir los cromosomas oon Giemsa o una oomoinacin de !in()()r'les y ~OtOCI'OrnOS.

e} Mtodos especiales
Otros m4odos de oullivo cromosmlco y de unclon se utilizan para Slluaeiones paniculares: bandeo e p;ara l i ncin NOR, Pt'lr;) lt' ~ ~ZiJdoriJ dfN ni)Cieo(o, que oonUene los genes de rRNA 18S y 28S: ba ...O~o de ptofase y prome-tt~fasc . o de alta resolucin sobrel)"()fn0$0I1\il$ detenidO$ en una e~pa tempral\8 de la mitosis. oon un estado relativamente descondensado ( Su mayor tong\tucJ permite apreciar ms Cle~lleJ.Iogndose aO bseNar ha~ 850 bandas en un solO cromosoma). ete. F".-..lmeme. 18 ci togen6tic01 molecular emplea &ondas de DNA ciOnaoo (preparaaas por U;Cnicas oe ONA rc.eombinttnbl:t. p\g. t76) wa ext~min;)r crol'l1060mt~s. de forma similar a los en&ayos de hibridaCin moleCular pero sobre ~rnCiOr'les <le CI'Qm0$0mas completos. sta es la tcnica denomnada h[bt1dacln In sltu CM ftufesc~nci:l (FISH, /fUMtscence Jn slru llyMt:Nzauon, pag. 172), se dispone oe $0n<Ul$ e$()oe(!ifieN para cromosomas ndividua6es y para reglones cromosmieas, que petmilen OQr' ejomi)IO, idenlif~Cnr rocwc:ktn<amiento$ cromosfTtloos particulares u ob(enet un diagnstico r&pjck) ese la el(i!ltet~eia de ~ nUmero anormal de cromQ$0mtts
reg~ MtJei"'Cromalieas.

92

CONOENSACION DEL ONA Y CROMOSOMAS

8.2.2

Regiones con significado funcional

Los CIQfi'IO&omas eucarilioos muestran tres elemoniO$ f:t$G;ntialos para uM funcin OOfi'9Cia del ciclo celular y la divisin. imllt9$cindibles ~~ l;a 9XP'e$in, dvpUct~cin, y sogrog<'Cin 00 Q QOmO&Of'I'CI&' el ~ntrmero (lugar de
uniOI'l del Cf01"1'10$0Ma a les flbrBs del fluso acrom.tlco). los t~.ln'letos (reglones SII!Jadas en lOS extrtm~os los cromosomas) y k:lS o"9el'les de replleaeln {puntos numetosos en cada cromoec::wna donde se Inicia la oopt.a de la!i dos

oe

neoras de ONA). Se tratan a Cl0t'dlnuacl6n lOs aspeciOS mool6gicos reladooados con los dos primeros; el anlisis de los ogenes de !PPicacin M po$00ne haS1a que se ntudie el proceso 00 repl~can {pig 1 50).

8.2.2.1

Centrmero

Se puede conslderar el centro emtico del aomosoma. poes sobfe l se Sitan las estrud uras llamadas ei netoeoros. a las cuales se uoo.n las fibras que constituyen el ~ acromatloo o huso mlttlco. Es18s fb'as, filamentos oonttcclles o mlcrotbulos, de nawrsleza proteica. eferoen la traccin neOKariel para &eparar las do& cromWtida& durante la dimin ceUiN' Ce e$t<ll f(lfmJ M prcxkJce; 1 0' sogroga.cin orden~ do los tn)(n()$()mi'IS y C3d<" t6!ul3 hijn recibo unil crom(l~ de~ (:t()tnOSI)ma, es decir, ldntiea dotaclon gentk8. La ausenCia de oenttrnero (cromosoma ac::tntrico) in"C)ide ~ el orotnosoma se una al huso mlttlco y. por tant.o, que se lnt:*lya en~ neleo de las clulas nias. La:S secuencias esenciales para la Nnci6n de los oentrmeros son muy ricas en pares AT. tienen unos 170 pb en humanos y se repiten entre 2.000 y 30.000 veces en cada centrmero. Fonnan, p.es. parte dellilm..OO ONA repelilivo (pg. 113) y ademils suponen una parte mportante de la fr.-ceiOn de netetocromatin3 constiluti'v~ . <'lqu&113 quo sOlOlleg3 a desconden&af'&e un tiempo min im o en el cido celular, el Ploei$0 1)3r* so roplieaciOn.

8.2.2.2

Telmeros

Tolmo O$ una pal8bta de etiMOioga gtlega: l&los, extremo, y meros. parte o regln, que Mee referenc:sa e t99iono$ $itultd.'lS en los e)(lrei'!10S de k:lo9 cromoecrnas eucatlolioos, oonstkuid8s por secuencia& especlaizada& de ONA asociado a ptOielnas y con caracteristicas estruct\lrales y fvncion31'" PtWins <auc 1 <'1$ dif..-etlcian <te ouas reglones cromo&mlcas. Los tclmeros de la m~y()(ia de eucariOtas estn fonnadoe por doe tipos de secuencias de ONA. Una de alas, denomini!d<'l secuenci a telom6riea. l'ei)etleln te60m6t1e8 o repeticin tennl nal. constibJye el extremo de la cadena de DNA del cromosoma. mediante la repclk:iOn en ~ndcm de un Oligonudetkb oorto (vat'iatlle segUr'~ especies. en huMatiOS es nAGGG).. Generalmente esta Meuencia telom6tica .s m(lsl"iC3 en Gen uno de las neoras., la que forma el extremo 3 ', que sobresale 000$ 1216 nucletks S<ll:lte tal 1lebt1l que aporta el exsremo 5'. Ese extremo salente es reconocido por proteln<~.s lig;~ntes del tctlmero (TBP. leiOmef'e birldir1g prot&IM). que acblan a modo de "caperuza protectota de <icho ONA terminal E.xisten taml:li6n unM secuencias mas compleJas adyacentes a las an1eriores (er. dec*. mr. lntema& en el ~rom()$o()tn;ll), que se denomll'\8n as.ocl adas a tetm~ros o secuencias eubteiOmrtcn.
tlb llllCII('Jt('taJ. y \' tfnsJ ~"JJ(lnoJel'l a hiiC'IlA111. ' 4) te"-ncr(l tdomtf\1
'>t'~-ucnoll~ ~k>rntna-.

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11-lt tiC)

Se han asooado .., los tciOmeros distintas 1\Jnc::iof\es: Participar en la M1<'1bil~8t:i6c'l y tnantenlrrVento de la Wttegridad estructural del crom()S()m: en ausencia de teli'JMII'Q$, .- extremo del aomosoma tiende a t~W&e a otros y aumtnan 1 <'1$ PQSibilidacs de que sufra reeomt:linaeiOn y degradan. Pot otra paM. 10$ te!Otneto$ permiten a las et1Zlmas encargedas de la repatacln 0e1 ONA <ttereooar emre el o..~etrcmo natu'81 del cromosoma y uno que resulte de la fntgmen1acn ~~ d ltt cadena do OHA: en eS'Ie <l!lmo caso se detiene el ciclo oeUar. evitando la replicacin 1\Mta que se haya reparado lales.n. La funcin mt'l$ importante oooslste en asegurar la replicacin ~" ~ tos eXIrtrnos 0e1 cromosoma. Es!e a&QCCIO $0 estudiara una vez considerado oon detalle el ptoceso dlt 1 <'1 ~~ del D NA (J)g. 15 7). se espe.c:ula tambin con ta implicacin del toliTI(JnJ en In arqui(&etutS lri<limenslonal del neleo yJo del apareamiemo ~romQS6mieo.

DOTAC+H GENTICA EH EUCARIOTAS

93

8.3

DOTACIN GENTICA EN EUCARIOTAS

<se este material pre!lef'lte en

Es conveneente oompletar el oonOOO'Iiento de la ~i6n del material gen&tieo cons."dert~ndo 01 oorneniOO \01 31 las clulas eucarl6tlcas y &u relacin oon el bpo de: otlu!<t y 01 o~io en el Qt.te se encventm Para etlo, es pteclso describir el s.gnifiCtldo de a.gunos !Orminos y ;;nooptos gcn61icos bc\&iCO$, noce$tuios lamcin para te comprensin del cielo celulaor y Oe 106 do& hPO$ de divisiQn, mi!OSi$ y rnewoshl flt:l'l\ll 9).

8.3.1
El

Nmero de cromosomas (n): earacter haploide y diploide

n6mero de cromo50mtt$ n~~" O$ cart~cterislieo de eacla esc>ecie, y varia muctto de unas a o11as. Se haCia de clulas haploide& (y de 01gani5mo5 ha~oidos. &i ._1 <\n tonn.,do!l slo 1)0( ellas} cuando cada c:tomosoma se presen1a en forma individual. de modo que ena& OiUia contiene un juego de cromosomas. lodos dlslln>s entre s. El nnero de cromosoma$ se identifica con ol nUmero n,

e..<;pcnnatllzid~: u vulo (clulas

Clula haploide huma na: sexuales o gametos).

TiC"nc 23 cromo..c;nmas (n=23); cada uno d~: cUos ~L ron:nado pOr unJ molcula lineal de ONA de doble h<..-bru.

.
1
!

3 . 1
1

.
2

lltl() de e~ do)
~n ~~~ cChl~a

hnplo'OC

1; . ; 1 ; 1

. . . . . 1 .. . ! . 1 i ' : ' ; . ; . . . 1 . ' ,, ,, ,, ,, ,, n 9 3 " " "' " ' ' 22 las O.:lub.$ indivldoo\)
!
!

1 ~ 1 1 1 ; !
1

"

--. .
!
1

1 1 1

" 1

1 :

1 0

19

OIUICXWI'I\IIs (l'Tl t<Xb~

' 1 cr<wnO!il)m21

......

Por ej conltario, ~>e <ktnomin.a clulas diploid.s (y organi$tn0$ (liploide$) .;~ ct(IV(illt'l$ en 1 <':1 ~ 110 ob$C1V<ln pareja5 o par9$ de cromosomils morfolgicamente gu81 es entJo si, tos esos miembro$ <H: 13 porej<l se oenominan cromosomas homlogos. Por lant(). c:8dCI 061ul<'l Clil)loiCie f.iiene CIO$ ici090'S <te cromo&()(nM, y es.to e3r.'tcW ~ipiQidot so idenbf~ ~n el nlimoro 2n (n l).llrojas de cromo~) En C8dl par, un O'()(I'IO!IOma se na 1\efedaciOcJel padre y otto ae
1~

mDdre

C lula diploide human : clulas somtica.<> (hcpatocito. neurona...}. <..-lula.s ge:rmmaks pnxursorus )' cigoto. Tiene 46 cromosomas (ln ): 46 moiCculas lineales de ONA de doble hebra. 1-'omum 2 conjuntos de 23 cromosomas distmtos. u 23 pan:s de erumosomas (a \COCS denominados 23 "cromosonms diploidcs'"). De ellos. 22 p.1res. que son homlogos)' adems similares en ambos sexo,., se Jlaman aotosomas: los 2 <:romOSOJnl.l; reslan!..:S dilicn.n dc~ndicndo del sexo y slo son honllogos en la muj er.

.-.. .w + X
lXY

.. Y

~ e< \ 'llrt'n.

""
01

!!

22 pares de: autosomas {en todas las cCiutas e: individuos)

,,

1'

XV un par de
.sexuaJ~

eromo~>~.,,n:~.;

94

OONOEHSACtN DEL DNA Y CROMOSOMAS

cromosomas
SCXU<tiCS
l~omol(l~in

-

JI

muj er:
t.l pUl n"' 23 l"!!li formado ptM'

var6n:

..

X X. """"""""

d% cromosomAS bornlogos.
ig-ua.l qu,:. los 11ut0s6mic<lil l.res nllll n 1:)

J; = i

X Y. muy dut1nW111 m _!Ww r(l2) esU formado 110'


dOS CIOC'IIO!OOOI'li M boolhlo~

S61 o una po:qlk'iia n!gi6n


~1 V y el X on hOI'OIOgl$ (~"CJI.NI pscuikJ.,riiOSITli.:'lJ)

Pfoduc~:

Gtum. 't""'

Se d1 ce q~ 13. mujtt u lwmt)g.MJt:tk: lodos ws 0\ulos I ~VWI un mismo tipo de :t(IIIIOJ(tll lll, X
un X lk la mlu,lre. el ocro X tlc'l pt~dre

Pr(JOC'(ktw;ia lk l 115 cromosomn11:

Tran5mmn de
loo crflm(owlf'lla.'l:

cromoroma X alas hijas y a los hijos..


mdU.in1umenec (por fenili:taein con-... CliJ)I:nl'IIIIO.coiOO X o )'. mpt-t:liVIII'llltuc J

$e dlCC qiK t J \111iJn ~ Mlcr~iU'I1&1CfT 18 mnnd de sus ~ 'lii'J\'1"thaiOl.OIkswn jl(lrtlldortJ de X . loa otrn miuul tk Y d X ~iCtllf!rt de la n~f\~. el Y Acmpre del rxdn: el X Sl6kt a la.~ tuj11S. 1."1 Y l\OJo 11 1~ tuji)S tal fendjonr ~ln.k\Jicr \11\o.
que s~-nlpl\' ser X)

Eo oi@'IJUIS esJ!CCM:t. o dfmncin de los b~J~R~oos. ooexisle cromo.soma V, .sino qut los nac~ u~-ncn 1111 -olo \'f(lmQSQt'll: ~WII X.un pnte"jn, mianr~s las bembr~s tienm dos \"fomo!<lmos X homlog<~~~.
En 8'1 <:;<\$0 de ctlu!M (1.1 orgWliSITIO$) <::On ms de 2n cromo50fi'\CI& (4n. 8n. ele.) se habla de carcter poliploide. Hay OUM que son polipiOI(fleS oe torma nahM'8t. porq~ Mtn Jottnacto eot:~i<'ls ~diCIOn:lles dt sv jvOQO Ot cromosomas itlicieJ mediante tMlo8 repleaclon sin dMsiOII eelvlar (endomltosls). Por ejemplo, las olvlas del hlgado et1 ~er<~Ci!ltl son tetteploldes (4tt). lOS megaa~riooiOs gigantes de mdula sea contienen usualmente 11),) o 32n. ttey tat'l"titt sltuamne& patolgicas caractOOzaclas po1 poiploldle: la& ms frecuentes son la ttlploldla (Jtt) y ta teltapiOIOia (4rt). Estas anomallas cromoemlcas se estudian en el lema 29.

an.

8.3.2

Contenido de ONA: valor C

Durante el ck:IO cel~. la formacin de gat001os y la fertlllulciOn lier'len ligar variaciones en el n(jmero oe cromoS()t'n&S de la clula, Indicadas mediante los l'l'l{jljlpiOs de n. En hurnanoe y animales, es&as variaciones lransOIM'I'en entre 1) (flapiOide) y 2tt (dlpiOide). No debe confundirse esa variacin con la del contenido en ONA de ceda clula, aunque s1e lambln varia durante bs l)f'OOe<SO& cltaOOs. Para Indicar e&le oon4eni00 &e emplea una nolaci6n basada en deno~r Ca la cantidad de ONA (de dob&e hebra) corre&pendierrte a un jlJ890 hapiOi!Je de cromosomas (85 decW. tt) antes de su replicacin. Se pueden enconttcw clula&, tanto haploide& como diploicle6, cuyo contendo C 85 diterente:
n,C n ,2C

gameto maduro (6\<uiO y espermatozoide)

2n.2C

Ol'!lula somtica cuando no esd en <ivisin, antes de sufrir la repr1C8dn de su ONA


Clula somiltiCa l ra!l sufrir la repllcaciOfl, a poo&o de dlvtdlrse por mitosis gametoc:ito I)JYnario. ames de dividirse por meio6i& dando 2 gametoc:itos &eeundarios

Clula diploide
2n,4C

8.3.3

Locus y alelo
locus tM:
p<I~M:IOI1 delindlL.

oc upadu por un
~cu~~nci.a de ONA 1en t~moo-.

loc k varias
poiciotliti pata
~11('$ cliftmll~

b>t'n 1o \1011

en un milimo pat
de eromO$lti.U

cromose>m.as
hornlof!OS
Jt-1 1.1
~\lerlC181 de:

I>'J.'\ '"uJ(Iu, en

un IOC\I'>

cada par de aleloo; (K:tlf)ll el mi~mo l1x:u~ (un alelo h~:rcdaKlo del padre y d ocro de la m~~drt")

OOTACIH GEN ~TICA EN EUCARJOl A$

95

En eu31Qulf!r clula de \RI mcsma espeae, ~ gen ocupe s1empre el mismo lugar en un cromo~ detlWI'IiM(fc),

'1 la posiCIOO equivatnte en su h(m(:IIOg<> (P.ot 3h<lt:il. basta eon que se enuenria por gen una secuenc1a de ONA que
OO!Jrflco un p.(lduttO tunonal. bien protelna o bien RNA.) Pata referirse de (Qnna gell6nc<t a eS<~ pcn.~i(Jn $C1 utillll:l ~~ tbnnn'IO loeus. Por tamo, genes distintos ocuparan diferenles ftXi (pyr<ll ele loW$), on &1 miStno .ac de cmmosomas o en "O!ro. E"os trminos tamben se 111ilizan P<J(a \3 posicicirn de rtl!)iOne$ dlt: ONA quo no f;ean genes.., A cooa &eOOenea concreto~ de ONA .l!!lic:a o no) s.,uiK\8 en un toeus se la llama a.ielo. Piles1o que cada cromosoma se prosenl{l OOti"'O 1,11'1 ()<V, en cada ltld!VIdtJO hay dos alelos en el mismo tocus que ~en sendnbcos o
diferonles

los oos alelos que .ptesenta un lndl..-lduo en 1,1n locus delemunado $01"1 dif~Jronte5 de los d' otro la m:sma especie (d...ersldad geneoca o pol(morfismo, p:Jg. 365) ComQ consec~i11 en el CX>n;un1o de 1:1 pobl{leiQn e~ti$101'1 mAS de dO!I alelO$ dllerentes pan~ un locus. El e&tudio de IWstornos dlf!ICOIS ht.l ponnitido lclcnt.1il;$r numerosos alelo& ~IIQ$ mnno,; fracur:ntes. en la pobl&ciOn, que SII'Yen tlO)' como mate&Ootes para .OOrMi~ dic;l'l~s pa!Ologias
gec~

En

ndi~ de

8.3.4

Genotipo. fenotipo y domi nancia


E.'>lodk) l'e~ringrOO : un soJo lot:U!>. ~'t1 CU<Jtl\l ith.li.,.idoos de la mi:vn:
csp~~c

(prCSI.'t!ICS en prvpcirdoo~

Aldos posi bk~ en la poblacin: A 1. A ~ )' A, diiCrente:s)

,,

' :o

'

S1 ;~mb;.. 1ldo' dtl pnr ~n


'!l"llk <~., el u1Jo"d"ll e~

S 11m~ ;~klo."' dt'I IW ....


diftwlllo:J, ~ ndl~ll...,.. e~

bnnlo iC'i)!, liw


UIIU C~~< dada).

twlcro lrilt'itico

Se lkline {ttn!Uipo cumo 1 11 ~conJtl1utJ6a g-eu(:ut".a de w1O ls;wl.-..mo" (CS dtl.:ir. de! un iMnkloo de
I.W.IOI'IIcJcJ (k IIXI~ }1)!1 Crumf.lmll \ dcl c nd.nJdub. San c:rntlllrgo, 11 d~ ...-..,., :riel~,: K sudc: cun~i~t el cno1tf'll qta uo llll:llll par1.cu1at. ttJII 1 1) que el ;tOOCI <k 1.111 iudiidt10 vi~e dcfmido J10f II)S do!; pf('!~ pnst:V~I6 en ew IQC:!tl~ en ~ rmll'l()!l,)mJ' hum~. de .eultt lol 'tlli.hJpks aldot.Jt1M7Jksl"',. el locu,. en l11 fX~di1n de eSA ~ic.

t i thmlou pi!Cdr 9et conSJ!krado ca sctllido ~cml 1.'01110 cl COOJUnr.o de tos nklm pmo.'tlt ,:n

fil'""''"''
(

.\ ,.'\'

oo, m,,Jd.ol~: lllll'l>luc;(ll

1'1111\'llld-

U ltlll~I'U n socidr (

lllltIJu>II II(!!IIOC:itl:/11.ot('&

.-.po-*c. ""

Oil " '

,..,. un l lldllltl ~1111hpu. el


11~ 4otllfll1t((.... CIWC lclt,.

l.tlllltlpo M! ""'fii\:!.lo) p:ll d

96

CONOEHSACIOH DEL DNA Y CROMOSOMAS

Rtllleiil nure d ni m~ dt ltt~K ni~Tftn t la pobtacW. par llitlll.I IOCIIS ~ 1~ J:l'IIOti~ diflltlllllltt 1 le $ 1("1'- (ltltdt11 dtr lg.tt
Rdkitldc

~,.de v.'llilhiiOi
lk:~~m~t.l~ttiCO!I

rri'CIM'IICiO

liii.OOMJ<itv!IO,)II$ <k a~ll,l)(lt'\'>1 b"l."f!X~

l; o\, A

' '""':"A.
S: A,. A:, A)oA,A.

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1 "" 1 1; AA.,AJA
l: AA,. A,.A~A,A,

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C'll Ut~ m,;mo~ ~IIOOpo> bt!(IVC'I.. 'IK'IH'HI n>'ulldo dt 00, nunbiiUI.~ df' cadulu~ 11Mm. {p CJI'Illpk. AtAJ "'!\~ 1 b .:'*'mn;, .h Como .:<lll~ {~~lumna .!). la troNI:qlld:id de cxi!o1m:..a de ad;, 1100 de 1M gcn"'il"l" k~o:mcg&iMt .,.!1 l.! p.>bii'C'tlm t."S lloblt (111$" l l \k ctd.ip;lo(ipO liuuli:i~IW

En la& ~uaclonet> en las que 8XI&ten dos o mh alabs en Ja poblacin se dice que hay poUmorllsmo. otwlamente refcncJo al loeu& oonsidert1do los polimorfismos del 98floma huiT!ano son objeto de alenao especial en el teros 26.

Tema 9

Ciclo celular
9. 1

9.2

La ctom.;~ ti n.tl en
92 1

lntfod ...ce~n ................... , ,.......... ,............ ., - ................................................................. 91


1~ V~cioncs et1 Divisin~ clulas

interflls.t..................................... -.....................................................~ ..........,................... 98 tonde-Maei:)n y contenido en ONA de la aomatll'lill , , , , - . ...... 98

9.3
9.4

somatleas por mitosis ............. -.............................................................. .,.,.,,.............. 99


99

Divisin dt cilul.-s genninales pl'imarfas por m.elosls ......................~~- ........................ .. ........................ 99


9.4.1 GametogneS4 . .. ...,.,_,_,_,,,............................................. .. ...........,., _ ,.,_.,, _ -- 9.4 1 1 Espennatognesi9 ..................... . . ....... ........... . . . .. 9.4 1.2 Oognesls ...........,.,_,_ ,_ ,,,..................... ....... ----... .... 9.4.2 Reparto del ma1ena1 gentiooen la meio&i$ ........... _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,,.,,_ ,_ ,_ , ,_ .,.,., ....................., _.,.,,_,_,_., 9.4.2 .-1 Car<icwr reduelor de l3100i0$i& .......... , ---- . . . . .. ...................... -... . 9.4 2 2 CQnlp;:aracin entte meioSiS y mdoSis ......................................................... ------- 9.4.2 .3 Segr~iOn de croM0$0m~$ y 6YetSidad geneliCa ............................................... 94 2.4 Reeon'ICinaeionmeiOtlca......................................... _ ,_ ,_ ,_ , ............ _,.,_, _ , _,.,_ ... Unin d~ los ga.n'l~tos h & plo lde's d urante la feeundacln ......................................................................~ R esuMenlntegr aoo .......................................................................................................................................

t02
t03 t04

104 104
105 106

9 .5 9.6

106 106

9.1

INTRODUCCIN

E.s importante resaltar que lOs aspectos estructurales hasta ahora oonsiderado6 p;.ra la moloola de ON A dobon estudiarse bato la s!bJacln fisiolgica en la que r~nte se encU91\'Ira el material gen8tioo en el nUcleo e\IIC&ritico. e$ decit. durante tas etapa'S de teposo y drvi&ln que se altnan en la Y10a de 1<' c41ult~ Con frocuoncia. 0$1<'1$ dQs cuestiones se relacionan pooo entre si. o se analizan bajo planteamientos &in unn sur!Cieme M~ mOle~
~ctuter ~ getlen'ln 1an10 tos getroetos {diviSin meiO!ica) como, a psttlr del cigoto. todas laS para QUC ~o~n Ot!)&fli$mo cr~ca y $e de$8ti'Oile <Jutante los petlodos embrionario, fetal y de crecil1lMitl\O ht1111t<t el fllt~do adulto, y p~ra la teflOV&eiOn oontlnua de tas OOA!Ias que IYI.lefen <1\Jfante dlCIIOS perlooos (divisin miltiea). Medit~nto 1:.

divi$itl

oUa<s

neoHar~

()ivi$il'l por !WIIoSis llene lugar notmalmente <U'aflte toda la existencia del organismo. desde la divisin IniCial del cigoto ha$1tl ta muerte ae1 rnaMduo. Se calcula que duran:e la vida tunen& se producen unas 10" diviSIOftes. la uansidOn entre oos diVISiones &uoeslvas oo.nstttuye. junto a la prop~a di'J'5in. el c:ld o de d ivi sin cel ~o~lar o smplemen1e elc:lo c:eh.ll4!r, Su <lvtl'ftin v.vl01 01mplit~mente de ~euordo COI'I ol bpo od.ll:ar ~, o:~mo en fui'ICin ele determinados e~i muiO$ AlgunO'$ ctlv!M evoru~n POf una $uoesi6n continu3 de (:i(:IO$ (le div.si6n (pot CJel'ri)IO, oetutas epiteliales oe1 ilrltesbno y procursores hematopOyllcos en la mdula 66ea), otras poseen cielos ms espaciados (una vez al mes en clulas hepucas. una vez cada 3 al'los en ol!lulas endotetca\es de vasos saf'9Jineos. etc.) y. como caso exb'emo. algunas c:l~ detienen $V progf'OIIin en ol c:ielo, rc.;JnudndOIO !ttl$ un pcrio<to pr<*ltlgado (quie&Genaa) o inclu100 no divd.indO&e m.fl$ (nouronM) AJg\.lna$ clulas se espeeializan en ta produccin de oametos o Qitutas $0XU~IO~~ q~Mt l)9l'tl'litir<in la formaCIn de un nuevo individoo Tales celulas gttrmin~ lcs (ti diferencit~ del re~. ~luh'l$ somiti~as) so dividen mediante un mecanismo dlferen\$. denominado moiosi s. Qut lt1rnt:>i6o V<\ precedidO de un cic;Jo c;.el~ 11imil8f lll de !;)$: Mh $0mlicn11 u na viSin glObal del ciClo oeiiAat permlte ObServar oomo la clula ltanscurre de maneta Of<ler'lada y $ar'l dlsconlftlliaad por dos grande$ etaPes bl$n diferenciadas: la d ivi$i n c:olu l; u propiamen\G dictla lpot mrtosl9 paro oluta& somllticas y pot meio6i& para clula& germinales) la i nterfase (oomUn a ani:J.as). Durante e&tl1 idlim<~ la c9fula s.e !)repara para ta siguienle diviSin duplicando su msterial ~tico { ON A) y tociO $u contenidO (OfQt.ein;:t$ RNA. Of'gnulos. membranas). oe modO Que se duplietJi $U 1 arnarno 3tlte$ oe dMCiirw en 0<>$ clulas tllpiS Cl$1C3t11onto . el

u.

98

CICLO CELULAR

ciclo &e plantea en torno el proceso de replicacin, o 4UC!Iie$Cin del ONA nvelei'll. oon lo que se definen dentro de ia interfase tres elapes: ta fase S (durante la cual tie~ lug~r la repliCC~oeiOn). la fase G. (previa) y la fase G, (pos1erior), Mientras ~ algunas clulas entran en divisin tras COtJ1)Ie4ar caaa lntettase, otrM ~$31'1 a ~ estadio mcxilicado de
Gt .lam~ f.;:uc Go o QUIH(:$nt. en -que pennaneeen das o inc:Liso &"ca hasta cmpronder \lr1 nvevo

clcio. o del que

nunco Sillon {C61utas ~no se dividen. como es el caso de las neuronas).

Fa~ PQ$1 "inl~b d~ ON\

o..n.:u... ....,;,... ...,,.... ~ topo~


.:clubr, ok un~..,.._.~.,..,~-.. o i111.'lu110 Jm ll:$1\'IKI M~cckl.

Siigtliendo el pt8flteamiento genetal de este texto. interesa relacionar iOs aspectOS 9f:lll!tieo$ Cl$$101>$ 001 Cielo oon aquellos cxros de 11\doie ms bloqulnw:a y molecular. Para ello, se aborcsatlln en Totma oe1a11Bd3 13 interf.-se y lOS dos tlpos de dlvi&iOO celular. con un,_.,~ objetivo.

Poner de manifiesto la enorme variacin estruaural que supone, durante !a lnteffase, la condensac:aOn de: la molcula de ONA desde cromatina a cromosoma y su desoonclensacin en senlido irrverso. Re:salltlr ell)n)08$0 de la rc~n . ~ tambin liene ll.lgar durante la Interfase, pero en !Al momento diferente del 8r'lte(IOr. Su car~et l"r''IOeCCA8t y enzim:iltieo se estudiar6 oot1 Cletane en el toma. 12. EstableCer &as ar'lalogias y aireter'IOias er'ltre la disin por mitosis de las Qlulas so~icas y la divisin tXJt meiOfi$ de las oii.Aas gei'ITII'lales primaria& pata dar lugar a clulas getmif'l8le:s ITI8dl.nls o game4o&.

9.2

LA CROMATINA EN LA INTERFASE

la l r'ltetfase, o lapso Que transcurre entre dos tivisiones celulares, es nonnalmente el periodo mas prolongado del ciclo celular, con sus tres fases G~. S y <3?. Esta etapa ternWI.a cuando una oUa somtica entra en dt'Yisin por mitosis (par.- formar oi~Uas &omilticas tijas), y QRifldo una ;lu!<t germiMI l)tWn31ia $C <iviOe IXlf' moiosi$ (par<~ formar lcJ$
~utos germinoiC$ modurtt$). Se .a a estucli&t emo d!.w"~ ltt irltt:tfase vt~M el gr~ de Ol)n()etls,acin dol m11tcrinl gef'l&tioo y taml:llen oomo varia el OOfllenldo de DNA (2C en G ~. 4C en (h) sin modtlc&rse el t'M.lmero de croiTlOEIOfl'las (la clula se mantiene diPIOide. 2n).

9.2.1

Variaciones on condensacin y contenido on DNA de la cromat ina

Ot.wante 18 ma)'Ol parte de la v\da celular {bien Interfase o bien qulescencla. segUn lo& casos), la molcula de ONA no e~ presente en la torma extendida de doble hMico ni tampoco en 13 fOfma ~cla <Jtt Q'OI110$0mas. $IAO en el e;t<ldo p;a~i;:~!mente oondcn$l)(So COI'Iooicb eomo crom.:..tin:. (Pilgs. 85 y 87). Al pr0QI0$3r on el Qeie> oetu&ar. la cromatna se desc:ondensa gradualmente durante ra tase G, hasta adoptar una confOtmacin localto!atmetue eldleilaida (correspondiente a le doble 1\otlce), necesaria para le separacin de las dos hObr3$ <1\.11'11rl'O la roplieaeiOf\ (fase S). Para eiG, ta euetoma1!na ha de pasar pteviarmente por los esUidos de fibra de 30 y 10r'lm(p&g. 101). OU'oote la tase o,. las clula&. tanto &OmticaG oomo germinales. son diploldes (2n) y &u contenido en ONA e& 2C. En 1a fa:H S o de &intetl$ se pt'(lduc;le ~ r~On CIOI OHA de I()S :ltt cromosomas IMMC1ua1es. cacta nebra ae este ONA sifve de ITICllc)e p<~;rtt 1<~; sinttl'$i$ CIO otra nueova, quo permanece asoc:iacl8 por apa.reamiento de baSfl:S. Las dos motecuas de ONA resu!tar'ltes permanecen u"''Os IXlf' el centtmero, dando asllugar a crom060f'l'la& oon ~ hebras de ONA: ceda doble hebra constituye una c.romatJCia. O. este modo. el nmero de cromo&Omas permaneoe oon&tanle (~a. 2tt). I*O Mt Cluplic<t., oontenir;to de ONA. dotde 2C <t 4C. Un3 ve: flMii~:8CI<' 18 191)1ict~~Cin . la ctula entra en

OfVISIH DE CL ULAS SOMTICAS POR MITOSIS

99

ta tase G2 dQncfe se ir'liela ta condensaclon gradual de la cromabnl <Pag 100. M seeue~a 11\\'(!IS& a i8 descondenseci6n ocurnd'.a du;r3nlO l<t f.t~s.e G ,, pg. 101). que se completa en las primerss. oi&P9&- ele IQ mllo&i$ dandO lugar a Cl'Ofl'lO$Omas viSibleS al mierosOOJ*). con su aspecto t!pico do 2 cromiltda$ y 4 ~zos. La clula s~e siendo

2n. 4C
A~..Jnque se puede conSiderar q.e cada molcula d1t OHA C$ ~,~n cromoSQma en cualqUiet momento del octo. et termino ctomosom.a oottespoi'ICJe e$trlctamenli! e esta forma oonc.5ens~ i!ll mllximo. A \>eoes se usM lOS trminos CJOm0$0tl)ft ~afa$.ICO y c.romosom<t intfHf.sioo par<~ l<tS f()fmas condensada y desoondeonsada (cromatl'ta ). resoeclivamente.

9.3

DIVISIN DE CLULAS SOMTICAS POR MITOSIS

La mitosis o fue M , es el periodo ms corto 001 CiClO celular. d1.1rante et que t~&.ne lugar ta civisin de la ck.'a, que ya ha duplicado su material gentico y Ci~m~tiCO, en dOS clulas hijas ldenticas.. Clasicamente se eonsidera divicfid.a en Cinco etapas: (1) Profas. lcl cromatina se~~ nas.1a formar tos etomosomas, dejan de ob54.1N<W'Se b$ nucaeoAOS y apatece el huso m!bco. (2) Prorml:lfue comienza a romperse la ~na nuclear. se \>en por primern vez las 2 cromiltldas de cada cromosoma y lOS 2n erOtnOSomas migran haaa el plano ecua10rial de la clula. (3) Metafase: tos 2n CtOmOSomas, ~a!mente oorw)eosados al)3tCQet'l atine&dOs en e p&ano ecual0r181, independtentes unos ele OliO$. (4 ) Analau: los cromosomas se rviden POf ~$ <:enttmet<>$, separndose en dos cromtldas, que son desplaZadas haw polos opuestOG de la ollla Ct~Cit'l cn:>m3'1ida es ya un cromosoma hilO Independiente. (5} Teklfan comienzan a desoonden&ar5G tos crom0'$0(1'13$ y se t(ltr'n80 membranas nucleares para delimrtar dos nUc:leo$ Patalelam9MG. ta membf"lln;:t celul.-.r seport~ et eiiOf)laStl'la en oos partes, cada une con un n(l(;loo y 1~ mitad clq tos cwg.;'lnutos, formando las dOS clulas hija9 , en el proceso lamado citoclne$i S (O citoQvine5i$)
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Como consecuenCia de la mitosis. cada clula hijt' rocibo lllf\81 cromittida <le eada Ct()t'l'IOSOI'n3 de ta Clula madte, es decu. la mitad de DHA. pero constilvyerdo un conjun!O Ct()l'nOSOI'I'kO completo (23 pares de cromoeomas} con toda la infOtmaein gon61ica dota oi!Aa tn~. Po eno, se dice que la mitosis es un proceso de dMsiOn no reductora (pg. 104). La Unic<l <itan~ncia es Que fa clula ~s1o an1es ese dMdlrse tiene 2n cromosomas de 4 hebfas y 2 cromtldas cada uno (4C) y Iros aa diVY$i(lon Cada ~18 hija tiene 2n Cf'Of'I'IOSOI'I\89 de 2 hebras y ooa croml.lda cada uno (2C) (pgs 100, 101)

9.4

DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS

L& divi$r6tl moitico forma ~ Clet ptOOe$O get~eral de lormaclon de gam-etos o cetulas se)(U8les hapiOides, a partir de clult'ls germint~tes prit'l"()((liales (que son ClipiOICies, atogual que tas clulas somUcas), en ef proceso conocido OOMO gametogfnHIS.

9.4.1

Gametognesis

La oogenesls y .la espennatognesls se Wclan a partir de clulas germinales ptlmordlales, olulas especializadas del 6\lulo o testiwlo, mediQ n~ una serie de divisione$ mittic<l5 que, con et consguiente proceso de crecimJIWI4o y dif9rcnci.On celul.\r, POduOCn sucesas get'letaCiOnes de clulas llaMadas oogonios '/ espe.rmatogon iO$ (Wmbien oogonia y espermatogot~~a. l)gs. 102,103). A oontinuaciOn stas. tan'()in por m!I0$1S, dan tvg<~r t'l oocitos y espermatocitos prin'latlos. TOOI\'!I estas clulas son dlplolcles. F.,almenle, a partir de cada oocl!o o esperma!OCIIO pr1 mano y medlan1e dos dlmlones suce&Nas Cliferentes (melosls 1 y metOSis 11) se produce ta reduocin del esta<tO dii)IOie)e at llaploide. Por euo, el conj~Jnto oe esa& dos CIM&iones recibe e4 norntw'e de Meiosi s o dlv1sln celular reductora.

100

CICLO CELULAR

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DIVlSIN DE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS

101

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DeseondCn$acin
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('.ftMI)aiii'UII)

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l ldtomcrot'llmJnu

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d!Mllt,!~(on

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<-"W m::orls..so.,: .:"" una Jobk


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102

CIC LO C ELULAR

9.4.1.1

Espennatognesis
t1

En et caso del vaon. el proceso, que tiene lugar tel)t!Jdamentc


prOOUIX:iCor\ de es;pennatol.Oides o gametos maseullnos

10 '"'90 de toda w Y1da.

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~:el~

Wo:CShti.

uno de

klS

es~errnatozoldes Iguales.

espermaaoci!O& primarios ha dado lugar <' un reparlo ""'6\liOO del cltol)lasma en cuatro El nmero total de divisionN <~lc<\nl(l .,lores $01'1)'endentes, vari8tlles 9eg(ln ta edad, ya que

dependen de los afio& traon&c:urridO$ <le$do to j)ubettad. El nUMet"o total de eepenna1oZOkles reatnente prodocidos es obVIamente varillble': bM:te indieer QW un varn sano puede formar unos 200 millones dao& durante toda ~ W::l<l fftil y que un ey~cvt<'ldo, (;(In unos 2 mt, eontiet'le \.W'I09 60 millOnes de espermatozoides.

DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS

103

9.4.1.2

Oognesis

Pot o:"l oorrlfafio. en 18 mutet la oogn$&1s ocurre en su mayor 1)9Me dtK<WUe la Vldil ''""" il l)<'r1ir dt la "lul gemw'!al pnrncwdial originada en el enckxfermo del saoo vitOiinQ del cmbriOn. El m.-yor nmem de oodlos primariOs se alcanza haoo el Ql.llf'lo me$ Cle vitlt'l lel31 (oomprese con la puberlad para el vatn} y es muy Inferior al de espennatocilos primarios A J)a(lir tiO C$C I'I'W)tnColo, el tUY~ero oe OO<:itos se te<luoe oonllnuamet~le hasta la t)uClertaa, se mantiene durante l3 vide frtil oe 1 rl1l..l}tt y o.saparece C<l$i IOI31menle -"' llega( 1;) mel'lopauSia

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0118 peculiaridad que diferencia espermatognea.ts y oognesls es que en las dos

dMs.tot~eS

Mei61ieas de esta

ltima el reparto del citoplasma es asimtnco: en la meiosis 1 se &orma una oft.lla pequel\a llam:ldo CJ.Jetf pofl)t y ~ oc.x:ito Mtunc.iano grande l~ diVt&in do &4G en la me~os~& 11 ongna un segt.tndo CUINPQ potar y un vv!o maduro. Ambos c:uetPOS polar-e& degeneran go&teriormoote Pc:w U.Mo. un oocilo primario slo QGMra un vulo. rTIIE!t'ltras que un
.sPOrmatocito primt~rio produco CUtltfO 9$1)0rma~oi00s

1 04

CICLO CELULAR

9.4.2
9.4.2.1

Reparto del malerial gentico en la meiosis


Carcter reductor de la meiosis

En la 1neioSiS 1, e' gamtl'!Oc:rt<) (oocilo o petmaiOcilo) pnmatio ~lll SU$ l3 P<lJ<tS dq Q'OmQ$0~$ homlogO$ (2n . .ce, ooo dos crQMI\ttdlt!l c:ad3 uno), de totTI'\I.l que pHan 23 crom0$0Mft$ dit~ontet (Uf'IO d., Qld~ l)~r. n 2C. con 2 crotl"'bd.1s) a cada gameotodto secundao (t Ley de Mendel). Se dcoe q~ .te prOdutc:~ 1:) &togtcgarcin de los cromosoma"- o que ceda Pftf ha suf.OOO di'sytmein; se teduce asl a la m!lad el nUmero de c:romosoU)$. Por ello, so dioe que &8 me.os.s os una dMsin tedl.lctGv8. debido a la meiOs:is 1. La meiOsls 11 es no ~ y et1 ~ al reparto de ma~l ge.n&11co se asemeja a !a rt~~tosis, eomo se dscute a oon.tlnuadn.

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~j~J u ~eJuJ!Jr

=" .&('~

9.4.2.2

~ (nt. De este moro. cada c61ul<t hij~ 1~b copias id-6-ntlea.s de ONA (doble!! hebras la repllcaciOn). En oontraste. en la mebsu; 1 uparn lo miernb10.t de c:.&da pa.re}a de cromosomas. oon lo que so reduoen a la vez la canbdad de ONA (4C...2C) y el nl.lrne;o de cromosomas (2n-.n). y las clulas hijas d ifO(nte material Qfl'tlco (pues cada CtOmo6QITia de un pa1 ~e<le cootetler alelo!! diferentes en C9CS& looos .... 94)

Comparacin entre melosls y mitosis u, dlf&~oncia eseoclal entre la mitosis y las dos etapas de lit ~is rad~ .-. 1<'1 distribuCOn del material gen11co entrolo'ls. o&lul~$ hijas (!IQI'llBiicas dlploldes en mnom; 9"fllOlO$ haploido$ on mei0$1$) El m~ni51T1o de la meiO!IiS 11 es e<t.~ivaiente al ese la mitosis, pueslo que "' s.eparan In dos eromb.1ida$ y se reduce la cantidad e ONA (2C-.-C) Slf'l
e~biar el

eatact

dt.~Phca<las M

*bon

DIVISIN OE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR M.E10SIS

105

9.4.2.3

Segregacin de cromosomas y diversidad gontlca

En ambas melosls. el teparto ele lo& cromosomas hofn6loOos de cada par (meio&~& 1 } y de las aomlida& de cada etomosom.a (meiosb 11) se hace el azar, de forma lOCalmente indepenciente para cada cromo:sorna (2 tev de Mendel) En delinltlva.. se a&egura ron creoes Que cOOi! g.-meto .-.c:ibc difer<Jn~ m;.Jteri<'!l genlitieo; ost<'l varittbilk:litd t t Of fundamew uo del pollmotfismo gentioo, CIJYO& detalles y con&eeuencia& se estvdian m<& adeli'lnte (tem<~ 26)

Se&rt88C in indC'(lerwlicnte dt!' los c:romO!>Omas en la mciosis


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t~I'IIIMOl~

I'O,.bf,.,

106

CtCLO CELULAR

9.4.2.4

Recombinacin meitica

Durante la profase e la melosis 1 (Profase 1) llene ligar un prooeeo de gran ITascenoeocla en cuanto a aa. ttereneio y a la generacin de la diversaclad gentka de cada lndllftduo: se trata de la reeombltutcl6n mel6tiea, o simotem&nle reeombinaeln. Los detalles de este prooeso no se tratan aqul, pero bscamente consiste en 61 ~atll'1t.levWO. o ir.tetearnbio de regiones de OHA entre cromtidas de los dos cromosomas homlogos (es decir, nunca 1\ay recombinacin entre cromA1idas de distinto par). De ahl que se llame tambin reeomblnaciOn homOloga.
~

-...

9.5

UNIN DE LOS GAMETOS HAPLOIDES DURANTE LA FECUNDACIN

Cuando los Oot; 9<"met0$ {n , C) w ~.~nen en la focu ndttc:in, el pronUeteo ~(tic) del etl)enn<'l~~ te fu~ oon efpronUdeO hembra del vulO, mbinatiCJO sus doS gef"'l'nas hapiOides pata dar un geootns 2n, 2C en ta clula hueYO o ~. lttta, M i 13 prim+en'l e611A3 ~iea l)fOI)IarTifH'te diCha. Como 1.81, ootra en la fase G1 y poS1erlores de la intOrfMe A )l)rbf <Jet Cig()IO se letman en dellr.tlve IOda9 las cUas somticas. Et mecanismo que rige la tranSiormac:::tOn de una simple CUa. el cigoto, en un h:Vvlduo coostitll)'e un tema de groo Inters biolgico. casi totalmente desoonocldo desde el punco de vista molecular. Tras mltiples divisiones oelulates, se origina~ amasijo gtlbular de d!lutas ett~bOOf\allas, 1M cuales se auiOOfglanlzan y especializan hasta tormar un fant&tioo oonjun1o de clulas (220.000 ~es). subdivididas en ca<si 250 familias dif9ren1es. ~da una oon untt h.lneiQn y di:;po$icin concnKa&. en las di&bnt; QlructvrM (081l)JO, ops, 1'\arit, razn, ele.) del orga.Mmo oompleto. la Biologf.a del Oo$011't011o os un QlmpO dO "div~ invesligac:O'I y en tos llllimos alios s.e Nn aiSlado genes <Jte oontrolan, por ejemplo. la diSQO&ieln d~tral o defed'laflzqulerda de algunos f'9CW'I06: sin etl'lbcw'go. an estarl\06 lejos de oonocer loe mecanismos moleculare3 que gooornan la Qtganognesls.

9.6

RESUMEN INTEGRADO

Para tenninar, el &~guiente esquoma re&v"'- fO$ di$1inl0$ poeosos $$1udi~. roeogionelo de una forma unilie:KI3 los cambios en la camidad de m{ltOti811 ~iO> q.e sutte le clula durante m procesos de tecundadn. divisin

meitice y mhbca y ciclo celular.

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INTFRFASI

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MitOSIS

Tema 10

Organizacin del genoma eucaritico


10.1 Complejidad d el genoma euc.-riOtic:o ........................................... ~............................................................. 10.2 ONA de copia nica, &imple o no repetitivo ................................. - ............................................................. 10.3 Ot.IA repetitivo ....................., ,, ,, ,, ,, ,,,,_,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,~.- ....................................~.. ,.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.,,.. ,,,,,,,, ...... 10.3 .1 OtilA repetivo CO(I!fic.an1c ,_,., .....,.,_,.,.,_,., ....... , ., .,.,.,_,_,_,_,., --, ... .,_,_,_,_,_,_,_, 10.3.1.1 ONAtepetltivocodificanleagrupado ..................................................... .... a) Familia& 9fuc.as clsicas ............... -------...,_,_,_ .,,_ .....,,._,_,_,_ ,_ ,_,_,_,_,_,.,.,._,_,_ , _,_, b) Familias molbgnic;as de get~91> agrupados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 10. 1 1.2 ONA ~tilivo <:Odirleat'l(e diS()et'SO: famT131$ molligrw:a;$ ~ gene <ii$PCr$0$ , 10.1.2 OHA repebliVO no eoc:lincante - ---.. ------- ........ ,..,_,_,_, ... ----.. -......... ------------------ 10.1 2.1 ONAaltamente epetl!lvoyagrupacJO. ONAsatlitt!. .......................... ------ 10. 1 1.2 ONA mooeractameMe epelltlvo y <Rsper'o ,.,_,_,_,_. ----- ... -----------.. ---a) Bloques dispersos oe repetiCIOnes et1 lndem. ONA 11*\Sa!dlite y DNA ~rosatlile. b} Re;>eelt~ones dispersas: SIN Es y UNEs ,._,_ ,_ , ,.,.,_,_,_,,........................,.,_,.,.,._,.,_ ,_ ,_ ,_,_, 10.4 Estudio ex.pe l'llental de la complejidad en el genoma de e~ riotas ...,,,__,,, ,~...................................... 107 108 109 110 110 110

1 11
112 113 113 114 114 114

115

En pr oeal"iotas. prc:Uc&IYIE!f'lte tooo el OHA eJCiSte en torma <le copla tlnica y codifica ptO(Iuetos gentCO$ (protena$ y RNAs). Sin en'Cargo. esto no se cumple en et get~oma nuclear de eu<:at iotas. pot ejemplo, se Cillcolet 01.-e slo 100 Mb del 1ota1 de 3.300 Mb del genoma humano haploide son codificantes. Adems. el genoma eucarll.lco se caracteriza por la repetian 00 secuencias. El objetivo de e&te lema es. por lento, plantear esla distincin entre DNA <1e oopta Utl.iCa y ONA repetitivo y est\ldiar con detalle es.le UltJmo en e1 genom.a humano. El carcter codifiCSnte. aunque se InCluye Wmbin aqul, se c:ompr~ mop en temas po:s\etior-es. al esl\ldiar la expresin g6r.ca (lnlnscripc~n, madl.wacln y
~<lu~Xin) . LOS aspe.ctO$ CKpem'IOnlalos que Mn permii:IOO la demostracin de la ~ncia de OHA repe1itivo et1 el genom<'l euearit<o st OOscrixtn al fin;al del capitulo, Ba$ndose en ~a esta a1JormaC16n. &e pocfnl abordar mas eelan.te so apllcaciOn. a ptO()Iem&$l:liOW!<inol()giOOs e.\ general y Clinieos en pMictA<w

10.1 COMPLEJIDAD DEL GENOMA EUCARITICO


la presen~ de ONA repebtivo da lugar al concepto de "~mptetida d" del genoma. E-ste trm~r'IO se delil'le c:orno 1& S\M'I"l& <le tMWIOS (Pb) de tOdas sus secv&nei'$ <!iierorttes (e$ decir, l<ts socuenaas repe:bdas se 001'\Jabilzan s6b una vez). Ett consecue.ncla, para un tamar.o <le ge_noma dedO, a mayor gr&CIO <le ropcticin, menor oomplejidOO".
l::!9.Jj: L8 Interpretacin de eele trmno se puede prestar a COI'IfusiOI'I, pues frocuentemc;nte so U$<1 con la acepCIn oomn de la palabra complejidad, que puede parecer <:OI'Ittarla a; la defiOI'I Mteri(n A$i, un 900oma <:On gran nUmero de seooencias repetidas es eparentemen1e ms complejO, ~o por oeftl'lic::.)fl su ~oomptej~ ~menor. P...,-a e<viler confvsione:s, se usar entreoomiltado cuando se rellera ata OO!lnldn especiftca dac:la.
Para et estUGIIo oe ta ~complejidad del ge~a; numano, 6ste PJIIKIC diOOirse en <tis004as categorias de ONA en funCiOn de su rel)f!(IIW!dao y su <:arder ooei'licante.

108

ORGANiZACIN DEl GENOMA EUCARITICO

I)NA do

Rcguladot (c:oturola la c-:<pttsin del gen)


No orxhlk<~nlc

copia nica
Hlmcin ckS<:onoctdll)

lntroocs. o 0:-..IA inlrsgtnico Hmcn:slado dentro de los gcnl':S)


I>NA imcrgCmto (~pura los geDt:lll

gr

u dol Gt:ncs rt-~ido,: en uindcm pll F1umli~s mvhtgnt.:~~ 11gru~as

Otspc.'f.so: Familius multigbu~s <hs~rw.s


Agrupado (en regiones. bct~-tocromlitKil~)~ Repctl~lODoC:S C'U lAndcm )' AJtamcmc rcp<"tilh'{) toN/\ ~lhtt~)

DNA
n:pl!lit\'t)
l;l)di(KllnlO:

'"

Rll'lqiK'!I dispi:t'l!M d'l! K f"':llttOnocll o."fl li nckm

Minisau~lncs

Oispcr.so (pof todo d tcoom=l) y \tod.-.dllmentc n:-pctiti\O


LJNI!: ~~'U~11eiils KptJ y c~nu,

Ocnoma ll~X1rar hutnano

G"'oont;a rmll'l.:tlndr"' fmmaoo


165 kb \.'tlunu molinla c;trCnlar.

JJOO.OOO kb t'f'l 2J moJCcul.as hnealcs. 2 C\lpta." por clula diploidc.


11Jlf1)'1.

100.000 gdiC'.S

milt): do: oopiJ;S pOr <.:.Mu.. J7 g-.omlt

,.,.,... lriK t>if~- rco" m"t...


y dir..,-.,. ~ '"" """"'")

A dlterencaa del nuclear. et genoma de lCl milooonda, de tatnar.o muy pequel\o ( 16.569 pb en huma,no&. 200,000
'VE!Oe!llftleru al genoma nuclear tlaploic:lt), esti 1~ pot DMA oodJ'tcanle casi en su totalidad.

10.2 DNA DE COPIA NICA, SIMPLE O NO REPETITIVO


COttsiJcuye la mayot pene oel genoma. <~t~nquo en un., prOpc>rei(ln V\lri~da depet'ldiendo del tlpo de Otganls.mo (100% en procanotas, 80% en eue&nOia$ inl'&iores, 50-70%. en animales ~rlores). Parte de esle DMA (-6%) COOS!Jtvye tas secuentla$ de gonoa. ~ O()dilicaalos A:NAs '1 protefnas celulares: o tra parte (--5%) es rc~~PQM~ dot OOfltrol de la oxprMiOn de es:!S secuenaas, mentras que eJ reslo. mayoritario (-60%), .S DNA no (;Odfleante. cuya

funcin, si existe.~$ se c:oooce.


El OHA de OOilM sencilla fue <:On$iderado 4ut'Btl"' mucho uempo oomo responsable nlco del conceptO cl5100 de 90n; hoy" $ilbct que tlllmbi6n una pequena pana del ONA tepetJI!vo fOtTI\8 algunos genes. eucanck:o6, <:Omo se-~

ONA REPElrTNO

109

a Q)n!Jnuacin EJ ootlc.GPIO dO gen avnQvt M $Ufri(S() unn grt~n OVOiuciQn en ~riotO\s, ()3la M08f'5e ms corl'lQicado y con mUI!Jt)los COI'l'lponetltos. s. ~ue definiet\do bajO un cM&rio es1ridamente funaonal. sJempre en relacin con la transmis-n de l<l tnJormtaoin dosdo ONA a RNA y ck.rsdo mRNA a pro~int's Convet:l~o. un gen~ itQ~.~ttlh: rogi6n 00 ONA <)1)8 oompron<'e. POr un &ld<l. ' - $eCI.It~f e$1r~.s. que se lr&n$Cri~:>tn eltCIU$1-V;)mente ~ RNA (rogi6n estructvraf do genes de IRNA y rRNA) o ()(en se ttM$Crlben en ~,.~n mRNA QIJC 3 $u vn d~ t~,.~gar a 1,1n<t Potoino. y I)Or el otro 1<'1$ te(:t*J)(f;')f ~gutadQ.r3.s, que actUM en aMbOS casos controlando la transetlpeiOt'l de aas regiOnes ett:r\Jetumle$ El estucio detallado de las caractetisbe89 de tos genes eucar10Ucos se <feia pera temas postertOfes, cuanoo se analiCe

su expresaOn.
Genes pnm

RNA:
RNA

Genes p..1rn protcina.


~ lnlnSoeben 11

cxdus1~1nnC'nlc ~ li'UJtSnibt:tt ;a

mRNA y s~lrOOtn
rc!!in

ro.g.tn

regin

1\ltUI~ - -

ro.-gin
n!guladortl

"".e_"' -''"-"'-'- -

--""~ - -"'"e" -' '' --

I.II'<A~

........... lt"-'
rRN ,\

10.3 DNA REPETITIVO


Las secuencias de ONA. que aparecen en copias mOftiples, o ONA repetitrvo, cons.tlwyen entre un 20 y un 50% d&l 10ta1 del genoma humano, segn a1.110res. Esta abundancla es la e<ncterisbC8 de4eJmlnante oe la enorme oomple)lci8d"' del ONA eucanblico. Las secuencia& repebdas, llamadas u nidades de repetldn o ~ple.mente repeUeloneos, tler.en lamai'lo$ diYIJfSos y cada una se encuentra 00 torma idntica o casi dntiC8 muchas veces en el genoma. Esta di;t~in puodo Mt on form;a d:isporn POr todo .t genoma. entremezcladas Q)n las secuencias de copra Uruca, o l)if!,n en form11 3grupad:a,b:(l!i:cadtl en rOQIIOne$ QO~~tretas del eromosomt'l En ambo$ ca&O$, el nmero de c:op~as de la unicJad de repetJCIOn varia desde unos c.entos o miles (ONA moderadamente re~titivo } h:lsto e-tif'I'O$ (le rnilc:l$ (ONA :altamente repetitivo). es.~o ooineiOe en ""'-'ChO$ C<'l$0$ con un~ dislrib1.1ei6n en rormo. di:;POI1S<t y agrupada.

respecclvamente.
"umd;t.j !k l'q)C1t~ >n 'fC'J'<'h~CilYt. de <1 .. ll\ "'

l:I!Nf'l<,... pc:-j

{j

rt'

'\"''' landtlf'

"blv;.x.. dt to:p.-t.~vnt~ ~r11pu.d.b. UM.l)a~cntc-.. n'l'l:w..,); tllmaflo<kl bl(\111~' : ' f!b

una parte d(ll ONA repetitivO tiene ~tor eodifi-C<1ntt. e:s decir. contiene la ink>nnacin para e)Q)tesar un I)(OduC1o funcional (RNA o prote-ina). Para el resto <st DNA reQetiliYO no $C tonoce una funcin clara: alguno posiblemente ooncrlbuya a manteoe~la estructura de los cromoSOtnas mienlfas Que st t\3 llegado ., propontf que una parte sea DNA ctlatana o DNA basuf8, 1.1'1 ves1Jglo fWQIIJI!vo .sin tuncion iletual. Finalment . debe de<staca~Se que algvnas de las secuenCia& repetidas no eodlficentes (COt'lcretamente, 1M denonW\.adas ITWli$8161ltes y micro$0l~litc$). aun con f\.I'ICI6n desconocida, tienen gran relevancia aplicada en pruebas ot klentffit<"lan y esl\ldios f.amilitarM . debido a su variabilidad entre r~dwiduos.
La repe!itividad del DNA tiene probnblemenle: un ongen 9\'olubvo Por vn lado. las repetiCiones agrupadas :~ueden

surgw por errores en ta tepllcaclon o en la recon'laCIOn genEtuca. Po otro, ta s.e()o3r<lCin enlt9 repebcione5 dit;persas puede proceder de van&Joeaeiones o tt&r\SposiCIOfl~ CIO<ISOmieas.

110

ORGANIZACtN DEL GENOMA EUCARITICO

10.3.1 DNA repetitivo codificante


Se le llama tambif'l OHA repetitivo funcklnaJ , pues klrma genes que .se elq)f'eSan (aunque no todos, como se Su 1amano se esllma entre el 1 0 y el15% del genoma.Apweoe en forma de "familiBS de genes. CU)'OS miembros se caractenzan pcw su homologla, al haber&e origlln.ldo medfante dup(icac:ione& (pllg~ 367) y vari<tclones de un gen
ver ~

ance51ral

Tipos de DNA repttilivo codilic:mlc

y ejemplos camclcriSiicos:
lli.stt~

l. Aj;lupodo: a) F~nul ias gCnicus dsic<.as o oonsc" 'lldas. con ~l-nts n:pc:d do!i en t:indon
\4UI."'IPIII \111 $lio) jp~\11) lk ~111 di: $t'i!10dlfU, 4 dti. 'W. ~~ O:llfldll

J!lllt1,.,'11m(nk -.1&1~ ki que

$t ~,.,_ oJo . . 1\'f'l'UC'!Illll'l b) Fwrubas mulugC:niCDs ~n gencs. llgrup<~d(l<(l


~itUIIIIIIU11 loaJil!XIOIIr\U'S JIf1Cl!Sdd [i.'IIIIIIUip:nl Wl nb:II ron l;tt "tu<t~ OOIImlnm:~t~ ~ lotiomtncao) Sus "lld~IQIICS s:ro.-s.....man ll:)('ll(r -"oi!K>IO!IJI' \ 1rilfll~ p;tudo.~. s~:nt!l tl\l~f )' f,..llk'IIIO,~ dt JC'fttll

..,..a,

tRNAs:
ti{N,\lli

Ej. 1 Ej. l

1111 rdk'M't11 IIYillllll\ll ,.

Jifn(.,.~gl

snR.NAs
Globinas: IILA-1 Ej. 3

SMc. v UfllftMI al~ !le a. rep:uelunu

tY ouu rnuthlil
t\ldolast~

2.

Oispc:~:

Fom11ias muJti.!..CnkaHoo g01cs dJspt.'rtm

'-<lf1'nlll~. ~.u '111111 l. e:il f<:lnlllkla fll,ll" 11" 11111111m1 peucllo de tt(ltiK'I'IIl~:t rf'JWiida por-l(lllo el lc:'OOIIUI (indwtl) e11 ~ dl'i1~1. lJIIC (11M J..:~ 111111 t(ld.li liai<.ullle.

1\<:lina

FcrnLina CWPDfl

10.3.1.1 ONA repetitivo codificant o agrupado


a) Fam#tas

gtmicas clsicas

(;~ncs de hiSil>ns.~
1h

~~~ -C1ooo<.,C,ttp!l>l:l~ ai. WRdml (ll)..tll at. tt~.lonl l!tu wri~

ll!lldao.t 6:: Npt:ll~llio! 1 - ),lllh), '01'11\W..tltlf 5 lllllobdts& ~n. -~~odi~

rllll)f,

~lu.~:~~cotr,n~~)

........ ,, ""!."'"
1ibo:lwnl01

t ubunillt.l Jnnck

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11

lciMI'" oJt"-Afo....le

~<;'!11-JII<

1.1 1:1W111 u!"~ d.! 11l~ o\. d01 ~S. ~~"''hf~ ta P'" Mep.:l'l:llrnto: )' lotl u-anKnk 1 -pn:-,ltNA ~IHM~ i ~-.. ljuc.S. hl!lll' a Ufllllllro k.'A -~~~~~~(CJIC ......... iumu
j\ltll' de t.. oulnonldad pllllndc okl ,,~""11\.l)

;
(..,_,r._..,c,.

o.. ...

r ...,..IUIIQai ..~ """' lo~tpell~i$lb.


f.xm.- pnc dd predUilA. J1C1m IW dc:'ll KNA CIUillltlti_L

oqio)A_,~n ~tl'll'l{7.7 ~1);

Al WIIJIIOI~ tiC.w)Cd(t(IO.::H l Mb)te k rOS.\ i p!lf ...,,.. !\ rboJWcnwn

no 1m1toeri1 11.
DNA . , <difiAIIIf)

u.n.

ri)'<A " n~A ~-~

~
sl}(q{\~t l(pctiO;Jtonoo e11 1 W:m... ~

a ~rl(lo o.ornwe..,

4fllWl cos!"iw: ~ "'-'"'''' .:ou rq>urti~ ~ lw' ,.~ ll}.l-&,.l f)l,l2'1 n s.'C'II oktR.,.A ~S 1:~1cn ~~ trlll-.rlll 1, uunlllcn n'ltetldo (Q lalodt. ( IIM\..l(ilo JI '-''1'".,, q 111 llil'l'"-"' 1

\""-'*'"'..

..

ONA REPETITIVO

111

Contienen $rt!COOilCit:l$ r e pclidV$ que codirgn un mismo RNA o proloin<'. que puede asl Sllltetu:arse con rapdez y

en gran candad. Son efetnPIOs caJactlisticos los gonot> do histonas y los de RNA OOosmioo. productos ambos que la t':lula necesita en gran cantidad {feoulese cue tas hi!ltooas debtin sintetW.r~ r*ptdMtente en &a f~sc S (!el Clc:lo celular, para asooiane at nuevo ONA prooe<letlte de la replicaciOn, y~ rANA ~e ei 75% del lolnl de RNA QOi.ll.<~r}

b) Famtlfas mulltgl)/cas de genes agrupados


A (lf~naoa dct \3$ Mtcnofo$, los m1cmbto$ ~ C41<.1<1 f.lm11ia son genc:s con m<~yor dwaW<:~ad e $0CUE!n~. $$ pueden loclulf en esle grupo ~tes tipos de familias:

Aqullas 00/'1 flOmOIOgla slo en parte de la setue(ICI:l <!e ONA, que dt\ lugar a prote-il'ia!l OOf\ gntn(lc:s rogionos 6o secuencia y estructura comunes {dominios). Familias OOfl homologia escasa en &as secuenOI.'lS del ONA, lo que genera prote'lnas con peqt.Je"<>S rnot1vo.s comunes. cada uno de pooo9 amtoo.1el00s Gttll'ld(!s "superfamitlas"", COt'l muy (Sflil homQiogl.;t tn la ~io de' ONA y pQt" t.'mlo, crn li! de las protan<~~S. a pesar oe lo cual OSias mantlenoo una ~~mlldud esuuct>JNII (en parte de su molCula, doltln'IU)S O()rnu~) y utli) relac.On- funcional. los genes que fomlan cada ~amma parecen estar relaciOnados e\/Oiut!Varne-:Me W<> mfl$ diSiantes entte si que los membros 0001pof"entes de las famaas anteriores

Familia.; de gcnC$ humanO$ dc la.o; csdena!l: a y fl de td\lbirw :

- - - - -- -

f11miliu ~ka d~: lu (-glubitu~ en i:l cwm1~11llll 1(i

~ D

fnmi\ia ~1<;;1 \lt il lhtltobul:l


t.:t.ot-mu ~ p, 8 , Y\ "tr; y r. > ' ('>cudogfu th

y f'W'Udog_~:ne~ u . )' ( 1)

(1\ot;ti.-

u,.

(1 ! _)'

~.

c. el .:rotnosomll 11

1 i.Jt , ..!l...... ,.

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112

ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARITtCO

Corno consecuencia de lOs ptocesos eVOIIJ,ivos que dan lugar a familias multlgnlcas, aparooen oon frecuencia en enas miembros coo caraaerlstlcas d1feronclale6: Coplas de gene-s ( Yarlantes) con ~as diferencias de secuencia. que codifican prodt.JCtos Qrioos funcionales pero de caracteristicasligoramente distintas (pOr ojollll)lo, difefenciM en ~;...~ on.vmMie&. p,ttl"tllntlros cin6tieOS .specifiCid~d por ~Vslr..'lto, ;~f~nidnd por su ligandq, ~c.) , Es comUn que se &eliYe de forma alterna1iva la expresin

<J. un;a u otr<' v;J~anle en funo&'l <te1 estadio de desanollo, de dlfefetlclacln celular. t(!Ode tejido ... Puudogenes. se aplica es.te ttmlno (abre~Aado como 'fl) a coplas lnacdvas de un gen, es decir, que nunca se e.,Jcpresan, o que aun expresndose no son 1\lncionales. Generalmente, la lnaaivacl6n &e ha producido por
aeurnulaeiOf\ de mutaCiones durante la evolucin en b QUe

iniCialmente era un duplicado del pse!J098ne&. en fmociQn de


e'YOh.JIM>,

Existen tipos diversos (t so CJCPro~n. si suftet~ procesamiento PO$lrancripeion81, 3$1 0011"10 do su origen

oen
s.

Gonos ttunclldtJS: se ltata de oopla9 inoompielas del gen, por l)eficJa de una regln sii!Jada en LriO de tos ex.1remos (5' o 3'}. Fntgm~rrtos M ~l!'s: en este caso se conserva slo ~ porc:iOn del interiot de la secuencia del gen (&e 1\an perci:lo ambos edremos). Obviamente, slo las oopias idnticas (famJi&s dil$ieas) y la$ varlantb$ Or)tlduC*' a ptOOuCIOS gnioos flJneiOf\aleos, mlenttes que 106 pseudogenes. genes truncado& y fr<9"'I'IIO$ (le; gonn paroo.n 110r vestigiOs 9\'0iutivos

sin l'unan ectuaL l06 genes de la globin~ constillJyon \1110 de lOS cjel"r(llos Ms representallvos de familias ndlgnlcas con geoos agrupados, implicada en uno fundn lttn imi)OI'Iante corno es el transpone de oxigeno en la corriente sangulnea. Su
estvdiQ i~ oonsiclentciol'les e'YOiu!ivas, de Cle98ti'OIIo y dltereneiacln. r~in de la exprein gnice ....
[ n ~~~~~~~ t111pa del dcoa~m11.., hW~oanu n , . bf '<r~l'<
l~ '"t\'f.l~ d\: ('(WIIfl)l del
1 '~' 1..:~ ~prc-d'.'l dr uno u (llrB

-........ !O( ~~~~,._

o;:l ioo o '<XpkSIII(I<C ;,ene do: klhtN.. Adtm.io. en ~ltda ilr;anu

<ort:aM

k>cu f'a1111l us mu

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c.cta <UJU dtl dC':ioarroll.., ~ Olra>kri;o:a. po.lf t n_,, Pl'f la p l\'lio. "no.:l'l
.k d t(<n.'nl.:5
hetn~bi-.

VCfleS d1 rer(l'llcs

,..

1111 se-- dtpe'Ddiendu <k- 1 1 e111p=; de dtsamlll> y <tri * '

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HbA4ildullll)

..:;:: .

Ecar a de' dr~rrollo>

y 6fw.!nl ~ndc
~ .IUltcU TMio

las t lob.lnas
l~mbri( rn

Genes que se c~prc:sun c:n la famclia gC'tt.icocde 1 ;~ 0 $1t)bim (en el cromosooaa 16)

<nQ que se ..:xpresan en la f.amili3 g~nica de la 3-g.lobtna (en el Cf'OIOOSOO'I3 11)

l~emogk>bii!OI(S)

sintccimdll(s)

(saco \'itdioo)

" ~ t.::2 Un1 11 n ..


v - O
\b_)'(Jritlroa "t.'lhu""' ~(;.'ell)

_ JI

"" '""

~ l!Jl -M~f.,._lll'll.: :kl!ina

Ji

{J,

r.hooriuri.1: &lobina y

f eto (hgado)' OOw)

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M")'(of'fi.Orl: P:,bina M inori~ lubina

- ~ll:Jl-l
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Ac.hll10
(mdula sea )

\b)''lllna: ~hillil a

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\b)'<lnlam: ttklbi 'll~ ~"' M ill(lnlaria: ~hillil ( 2'>)

li:S!- -

&

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\Cay<~rot:otla; .;Jr.J \111Utocarl : ~l'fl

1!'

M lfiOrilarin tt:IS1

Mayuri~. ~Y!

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Jj, Zl

MliJUOII!nt:

M onQriutu.. u

1t
J

10.3.1.2 ONA repetitivo codificante disperso: familias multlgnlcas de genos dispersos


Mienlr.l$ qvet en las familias Mltlgenlcas ameriore las ro~ic:iQnO$ 110 disponen agrupadas. prxlmas en te secuencia linet~l del genorna. en otras 106 genes <PJ6 forman la f~milia ((:(l()iaS iOnbCas, variantes. pseudogenes ...) se locafll:an <fiO fQtma dispersa por el genoma. a mrtnudO incluso en cromosomas dlsllntos.. Entre e518s familia$ w el'louerl(t8n genes que oodifl~n proteinas de i'IJI'Ic::iOf'oeS divetaa&: enzi'nticas. reguladortt$. <Jc Mml."loenarnieMo. estructurales .-e PQf l)jef'nC)Io. ta lamlia de alekllasa comprend 3 gono$ fur.:ioni!MS y 2 pseooogenes. repartidO& en 5 cromo$0m;a$; los genes de ectlna fonnan otra femili<'l con 4 genes y l."ll menos 16 pseudogeneS.

ONA REPETITIVO

113

10.3.2

ONA repetitivo no codificante

Esca es la fracctn del genoma a la que el trmino DNA ropetJtivo se teflere ele lonna mas MbiMtl Su lam31\0 se esW'I'Ia entre Uf'l 20 y un 40% del DNA gMOmico total. Como ya se ha indicado, se subdavlde en dos cacegorlas: e1 rnodcrOO;:trnon!c repetitivo, que ~ ubic-.t~ en fQmlt' disper&a, y el alumente repeiJitYO, que adamas es agrupaoo Su <'islfobuCi6n gener31 en 01 genoma I)Vt(kt ropresent.<ne gr.ificamente oomo w muestra en la figura, para dos cromosomas reptesenl.atlvos.

!ln)(l\'rnohm~o:nt.: rcp."11tno

y di~f10 l)(lr uldocl i C:II(IIl'lll , .;1llfC'JIX'X'bdc<m i'l L>NA de copu Utua)

ONA n:~uno d~ptr""

1),.~ 1pnr- w.:ll

\lod('t'\loJin"' "'* ~IJ\"hhOJ

~.cn~~~m)

i5

<

Rc110:Uttl"nc.<
o.lb{lf.'"'b

10.3.2.1 DNA altamente

rep<~titivo

y agrupado: DNA satlite

Supone entre un 1 0 y un 30%~ ge:nom<"!, y se le llama tambin ONA repetitivo en 18ndem. No~ confuf'lC.htSe

con el ONA mk~satiJfite y m..cros.,-,'6.Lil~:~ (ambOs COfr(l$W'lden al ONA moderadamente repeotitiYo y disperso, ~9 114) ni
con lOs sar.Nlfes CtOmo.smiOO$, l&s peq~as mti$M do croma:bna que forman el extremo oe lOS ~zos OMO$ de ~tn CtOMOSoma acrocntrleo (Pg. 88).
Este bpo de ONA est tonnaoo por u'*"BC!es oe pequel\o 13m<'lo (250 pb} repelidas en tndem entre miles y utl milln de \'eteS. con lo qoe el bloque de repedcin abarca cientos <Je k:b o induso \'ar\3s Mb. Tambin es caracterisllca su toealiz.aein agruptd" en 1~ espocffiOO& de \'arios cromosoma!!, c::orrespo~10$ (1 lo~ regi ones heteroeromauea-s. prineiparmet~te et1 torno al oet"ltr6mcro y en los ~ros Se oonooe el papel de es1e ONA S<Jill!4 on 1 35 regiomn telomricas (pgs. 92 y 157), peto an no su f1Jt~Ci6n eaclo en el 01Mtr6mero. El ~bre de DNA f.t~t6Jil~:~ tiene oo origen metodolgico: debido a su ana tasa de repebci6n, las reglones de este tipo <fe ONA poseet~ una 00MP0$1Ci0n de ba:se& diferente ata del res1o del genoma. que es rn611 promediada. Cuando el ONA total se fragmenta (por ejcmolo. por fuerzas de ciz.ala) y se analiZa en gradiente$ ese c!Ot'lsi!Sad de CsCI (pg. 137), los fragmentos prooeet\le:$ de ..., tegiones de ONA satlite. que poseen menor cl~$1d3d debido a &u menor contenido en GC. se separan oe la b811'1d3 l)rinQCN'II de ONA li:lrmando 'bandas satlites. Ca!ta Uf'l-3 d~C: elas c:on'tls.ponde a una subfa~ de DNA $Mlitt (l<tles como 1, 2. 3. y P). con disllnta secuencia <le re!*iCin y/o nmero de repeticiones.

114

ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARtn CO

Allitilt 1
ti~; 2 y ) ~~tKiiltt u " lfu,k

2S-4X pb
171 pt.

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(hUIDIIIO.

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10.3.2.2 ONA moderadamente repetitivo y disperso


repet!done$ no muy elevi'OO (ontrc tat y 1<f). se S\Jix!Mde en doe ca1egorlas. en funcin de la forma corno &e dlstrbvyen las repeticiorm en ptfmet lugar, algunas secuencias se repiten en tndem fofmando bloQues, los cuaN$ aparecen de fofma dispe:sa por el genoma. El segundo tipo consiste en repeticiones igualmente disponlliiS por IOdo ct

Cotno su nombre indica. e54e tipo de ONA M <lisb'f)uye a lo targo de KldOS lOs cromosomas. con oo nCI'nero de

genomo, pero que t10 se agrupan en blci<Jes.

a) Bloques dispersos de repeticiones en tndem: ONA minisatlte y ONA microsatlte


Se distinguen estos dos IWbgrvpos on funcin del tamafto de la ur.clad de repeticin. Constituyen conjuntamente entte el S y el 15% det genoma Obvia~6. a pesar de la slnilllud de nombre, no deben confuncJir&e con el DNA satlite (pilg.. 113). del <PJe &e difercnci.-n POt estat lOCalizados de lorma <ispersa por et genoma. aunQUCJ se asemcj&n a l en la proM~t~cia clo fOPCtkiones et\ lndem.

t.a impoi'UW'\Cia ptetlca del ONA minisatlite y micro&al.ta8 G'ldiea en su gtan varlabildad entre h:lrviduoa. que permitO utiliZarlo como nwcador molecdaf en medicine forense. pruebas de pa1errldad y dlagostico de enferrnedade& motularet. estas ftl*9clones se describen,. il<lclontJO t'l nablar de polir'nolflsmo gentico (pg. 3M).
a/J DNA mri:mtt!/il(: E.stil formado por repeliciontl$ de 10 a 65 po, tices en G+<C, agrupadas en tnOem formMdO t)loques relativamente grandes. do cioniO$ o miles de repetiCiOfles: esos bloques &e encucnlr..'ln re(*tiOos por lodo el genoma. Algunas do 0$1tts repetiCiones, denominadas "ONA mini$;J~6Iife hip0rvttriltbr6~. se CIWa<:littlz.an por su elevado po!imoffismo (diferencias en secuenaa y nmero de; ~iones). no slo enl!e lndrviduos de una especie. sino inclu&O entre !os dO$ en:m<:J$0(1\81$ hOmiogo& de un indiW:Iuo Sus repe:lieiol"et, de 10 a 24 pb, preserrtan la &eeuen('.ia; cnSenso GGGCAGCANG {donde N represen~ e~ nuelecldo). Este ONA es impottante por !as t~pli~iOnes derivadas de su polimorfismo. principalmente la Ob!endn de nuellas de ONA, donc:le untl sonda para te secuencie oonsen&O puede hibridar P'nulli'lneamenlit oon mOl~ toci ministttCiitos difetenlbs distrb\jck)$ por IOdos ros c:romo$0t'mtll, d:mdo lugar a un esquema o patrn de: hibrid;M;in diferente para <:&ea il'ldllvlduo. a ] J DNA ml('r()Sm i-lite: Se aplica nlc "'rmino OUIII\do la unidad de repelic:in es in'-ior 7 pb. Se presentan ~das en tndem en bloques de ha~0 50 ~ticlones. tambin dist:rbJidos de fofma Oi$petS3 por el genoma. Su polimorsmo &e apliect lgUalmenle paro la obtenciQt\ de huellas genticas. para pruebas de idcntictad y esrudiOs larnlates. Aunque 18$ seclJC'nelas telomrleas se han dasif~eado .-meriOrmente oomo ONA repetitiVO ag"4>00o (ONA satli(e), por su ul)iC:.Ci(ln et1 puntos concretos del cro11'10601'na, algvnos aotores las eonslderan ONA microsatite p<Jr er heeho de rompattir con este eataeterlsticas de tsmalk>, nUmero y disPOsiCin en tOOem de &as repetJCiones.

b) Repeticiones diS(J&rsas: SINEs y UNEs


De nuevo. la klngitt.ld de la 11nidad ~ repeotiein sirve de orilerlo para subdtvidirtas;

~lene un sitio clan<'! P<Wt~ 13 &Mima de restricdn Afu.l Se tr<tiOI et1 reaidacl oe una familia de secuenc:icl$, con oo 85% de hOmologla. que supone I)Or si sola alrededor de un 5% del genoma, de modo que, en promedio, existe una secuencia AlU cada 4 o S kl) Se cree qUI8 bs elementos AJu pueden haberse originaOO ~oh.tlivaomen!e por la ln~rselbn en el de mJI!Jples eopias (f&troposot~~)$) IOmwi8:9 pof transcripci6n inVSa 001 gen de RNA 7SL. un RNA citoplsmico pequel\o (!~CANA) oomponon1o de la pMic.ul8 de recot,OC.tnll'9nto d#l soll$1 (p~. 324). A pesar de la homolog:la (~1001) de Heuencta. las secuencias AIIJ no ejeroet~ '- tuncl6n de este seRNA.

h/) &rm!Jid .as SIN/l': Las siglas proceden e Sllort lnJerspersOO NI.ICIHr E~. elementos nucie.ares di spersos oortos. St Mbl3 oomt:.nmente de unid900-s de 100 a 500 1)1). repelidas ha!lla 20 veces. Sin embargo. el ejemplO ms caraeserl stloo, el oremenco A/u, de 300 pb, aparece en el oenoma humano ~re 500.000 y un milln de \'I)C(I$. Su nol'flbre se debe a que

oenoma

ESTUDIO EXPERIMENTAl DE LA COMPLEJIDAD EN EL GENOMA DE EUCARJOTAS

115

hl) SI!CI~tmcias UNE: En es.le ~&O. se trata de elementO$ nuclear& dispersO$ la.rgos (Long ~ed NucJe8l Elet&&WS}. <:on unid~$ Ckt m3yor l<{lma/10, 9Cf'let<Jimcnte v300$ miles de pb. QVI(t se repiten ha&(a 50.000 veoes en forma dispersa. La princip."tl rn~ LINEen fu'nanos ta constill.lytm 13$ sec:ucncitl$ Kpn , t.ambin llamtldas. L 1 o U N E-1 Se encuentran en
el genoma de 50.000 a 100.000 repeticiones dispersas, oe tatnal\os oomprendi<Sos entr~ 1.4 y 6 ,1 ttb COOa un;.~, dcb.fQ ;.~
$U

divers.iclad.

10.4 ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA COMPLEJIDAD EN EL GENOMA DE EUCARIOTAS


El descubrimienlo y anliSis del ONA tel)t'tibYO Que. como se 1\011 indicado. determina la ~complejidad " del genoma tunaamenta!met~te et1 13!S tk-nicas de reetS<Iciacin del ONA desnaluralizado. np3s Esquematican'leMe. este estuOiO im(llica IJS siguientes c1

eueafltiCO, se ha basado

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Para obtef\et conduSIOI\6:$ 81 oompa:,ar la renaluUIIiU~~Ci6n de dis.tinlo$ tJPo$ de ONA es convernente que ras. molwlas que se reasocian seM de klilgitucJ tegutar Esto se oonSiguo (ei~P<'I 2) f.ragment~no el ONA genm1 oo mediante sonlcaCIOn de la diSOlUcin (ullr~onldos de a!t.a inteosldac:l) o Jta<:it!>nctola pa~r a pre$1rl ~ tr;crV\)5 o. ~ ofloo pequMo. lo <PJe ejeroe fuenas de cizalla ~ fragmentan las largas molc.-as de DNA. tguatmett~e, convienct pcvlir de la misma con08fl(racin de ONA, o en caso conlrario debe oompensarse su vaiOt h::luynCioiQ en 1<~ v<Ui&b4tt Cot, lhrmirw:> dcfini()o 0.1 contiruac;i6n. Lit fiNI$0Ci3cin w analiza (etapa 5) midiendo la f1aco6n numrica de tragmei'IIOs we se Mn rM$0Ci31):), en funcin del tie~ de templado. La proPQtein de DNA de doble hebra se de!(tfm~ espectrolotoo'lttlcamente. o pot otrt'l$ tec:nic<ts <aue <Jircrencien el OHA de hebra sencilla y doble. Como fliemplO de este tipo de esllJdio, se muestnl la escisin de !fes genom~s hiPOtticos. MOCillos (A. By C). de lamal'lodlferente (1, 2 y 4 kb), en fragmen!OS de Igual b'lgltiiCI (1 kb).
t:,:cupodcfd !Aio, p.r.l ti senllflll H;\ ": El poo.>II'KII\~Uhll <k un pa1 <k ll!l~>t'HJ ~~~ pwmf<lil dt' toi O, p!lf kl que 1 copo Ade*"nlldiQ de llb
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F.n h ~!llllur.ll r.le.. :...ca..t. f ~ lt~nc> m)l)f prub.!lbohol:l+l +le> llltcl~),""'"'

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116

ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARITICO

Pata oompensar e1 electo que ltndr14 1;) d:i$11M3 eonoenttacibn 1t11eiM de ONI\ en las llluoe$1f8!1, se IJ98 el proctuciO en lugar del oompo de r~ci6n. r. E$t l)fOdveto se ~noce noona!rnet~te (()niO ..,_.lltfttble Col. la 1epresemadn gr.fica de la clntica do reosoc:;i;Jitin $CJ h;:~co por t$nlo, con ftaoclOn o pot()Onl:.jo te.II$0Ci""do en on:lenada.& y loQaritmo d& Coten ilbsci&M. y te ~:t cotoq(Ji3tmente de las -curvas Cot"
~ xt

Ut ob$oNl)CJIf'l do un:. coneladn inversa entte la pos.cln de la curva de reesoclacin '/la mago.tud del genom<t de partida permllc et empiOO de &o:s curvas. COt para obteflef ttformaan sobre ellamal'lo de un genoma:
~f(ln'K''""~ O:~'>nuntll ck IMi~lll'\'"1>&! l~oatM.I

6; lrn.-.lml"""' ~k <:'II'(':'C) llfo!l\"nle:~~ t""limnllln......,l. All& h'.l.Jro"" ttld!\ 111....-..rC'

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'llllllll!J.:IOQ llllllll ilc I)NA, (_' "'kl <~Me"""' de p(litnl.a


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de: uli pw de ~: 11111)

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flllllccu._ _.dlit

Adems, las cuM$ C4t tiOOen espec:ial lnl!!fea porque eponan tnformac:n caoe~ del c::onlefll()o en DNA ~lvo de un genoma. Esto ts deQ!do a que, para una misma conoemracin de ONA wcal (o. en $1,1 de :feeto. corregida usando la vanable Col), 10$ fr(l!)l'l"leliOS de secuenc.as repetida& em:ten en mayor conoontrOOn OQf 10 que se teasoclan m:s rpidamente. Se .,slr.J primeto e!lta dependencia con un ejemplo simplil'irc<ao, QtMJ parle 00 los Mt~:
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... (Tiomoo)

O. torma ~~mil&r. cuando se analizan gcnoml:l$ (e.eles las curvas COl reflejan la pre&enc~et do $CCUttn~s oon distJmO nme> de tepetlciOOE!S. Por ejemplO. P~~'<' dO$ genomas l1p1C0$ de un procariota {E COi) y un ~rlota {humano) M oh$el'va, de acuecdo coo los cn;erte)S de intetJ)reL&cOO expfiCados, que en el primero pr~K:an~e tOCio et ONA O$ de copla (Mfca. mlenlras que ~ tmomO'I ttumano posee un marcado componont0 rcpe1illvo, que se agrupa baJO 10s t&rm.nos 'ONA altamenle 1'9P41lilivo~ y ~oNA nodetedamenle repeblivo..
LII>N1\ J'lllo:.:m\'IU -;r ro:u<.o'll;ill l!'tiCoS\IIX' el de I.XIfllll
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Tema 11

Preparacin de muestras, extraccin y anlisis de cidos nucleicos


11 .1 Obtenc:in y p rep.a r<K.in prel imin.<~r de l;a& mu9$.l101& .............................,.~,............................................. 119 11.1.1 Muestrasdete,dosslidos .................................................. ............... .................. ...... 119 t 1.1.2 Muestras de suspensiones celulares...................................... . . ........ . ..... ................ . . ... . . . .. . . 119

11.1..2. 1 Clulas embrionanas (diagnstico pre-implantaan),_ ,,,..... . . ................ .. . . .. .. . . . . 119


11.1.2.2 Liquldoo lluldoamni6UOO ................ ....................... .......... .................................. 120

121 122 11 .2 Di:tociacin de la mue:tlfa ti sular .......................................................................... H H"""' """""""'""" ' """' 122 11 .3 Separacin de clul as ...... -...........................................................................................................~.... 122 11 .3. 1 So!*aci6n de ~lul3s por m61 0dO$ do $Gidi~T~G;nta00n y centnf~in ... ,.,_ ,_ ,_ ,.... -- - . . 122 11.3.1.1 Centrilugacl6n diletetlcied ..............................,........... .. . .. ...,.,_,.,_,_ ... ,_ ,_ .. --- t 2'2 11.3.1.2 Centnrugaclon en gradiente de den!liclad . .......... . -- .... , , . 124 a) Mtodos de barrera. tef'lt(llugaciOn a tra~ de vo medkl de densidad oonslante ,_ ,_,. 124
H ..... . ..

11. 1 .2.3 Clulas de te,dos o sangre felales .......................... ................................ . ............ 11.1.2.4 Clulas de sangre o mdula sea adultas...... ..... . . . ... . .. ... ...... . ... ... . . . . ........ . . . . 11. 1 2 5 Muer.1ras bucales....................... . ................................................ . ................... 11. 1 2.6 Semen ................ ............................. .............. ............ .......... .......... 11.1 'l.7 Clulas en Ol.llivo , ...................... ............ . . ............ ................... ... ........... t 1.1.3 Muestra& celulares de llquidor. biol6glcor. axtravs~es . . . ... ...... ... ...... ... . . . . . ... ....... . . . . 11.1 3,1 Liquido ccfalorr,qvideo , , , , , , , , , , ...... , . , , ........ ................. ... .......... 11. 1 3 2 Licuidor. o dorr<Jmes 1S4:It'O$O$ .. , , , , ... .. .. .. .. ... ... 11. 1 3.3 Liquido Mieulttr o sinovial .......................... ------- ...... , 11.1 3.4 Mues1f8S bJOIOga:as menos 1\81lituale!l ............... --- .......... . .. .. , ---- - ..

120 120 120 120 121 121 121 121

11 3.3 Separaciones dwecta& de bpoS ~lares .... ............... . . .... n.3.3 .1 Sepa~aciones por afinidad oon partlculas magnlieas... . . ... 11.4 Caraetertueln eefu.lar y medidas de villbi.tldad ............................................ 11 4 1 Ensam de exelu96n,_,_, ,_,_, .......................................................................,.,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ . . .. . . 11 4.2 Recu~to de c61ulas viaelle$ por R:;orporacin de un marcador .................... .................................. 11.4.3 Et'lsayos por modida de 1~ ful'ltin mgl;;~blic;.;~ ------ ........................ 11 .5 L i si:S de las c.41ul ar. ........................................................................................................................................ 11.8 Prcpa101cfn de fracciones subcetl ul<lrH ..................................................................................................... 11.7 Tnttamientos adicional~ o complementarios .................. , . ~~""""' ""'"' "" '"'"""'"'''"""""'"""""' """'.. 11.8 Extraeetn de $leidos n uelcicos por sofubilidi!d en f;:a59r. i nmi seibles ..................................................... 11.8 .1 EJCIJ'30Ci0n <!el ONA ........ ,, ..........., ...... , , .... , , , ... ......................................................... .,, _ , _, . . 11 8 2 Exlti!otin del RNA , , ........ ,,,,,,,, ....... .................. .................................... ------ 11.9 PurlflcaeJn de eldos nucteleos f)Ot precipitacin salina d ifercnci01l ..................................................... 11.10 Recogida y con:&eNaeln de 1 41& muet&trs .................................................................................................. 11.11 Procedimientos alter natlv&S: ex:trac:c:IOn o anAlisis d i rtc:-tos de-l ONA ...................................................... 11.12 Fraccionamiento d& cidos nuc&eleos ...................................................................... 11.12.1 Ullraoentrl!ugaein ......... . ----, ................... ............ .. ............................. _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ , --- 11. 12.1. 1 CentrlfugaeiOt'l zonal .................... .. ,..,_ ,_ ,_,.,_,.,... . ........,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,.,.,............. 11 12.1.2 CemrifugaOOn l&oplcnlca..................... . . . . ........ . -------.................... 11. 122 Eloctrofores.s , ... ..................................................... ......... _,_, -----.............. -- 11 t2 2. 1Soporte para la electrofore&e&....... ........... . ............ -- _ ,_ ,_ ,_ ,_,., 11.12.2.2 Detcoci6n dol ONA tras su separacin ('revetado1 ............ - , --- , -- -- 11. 12 2.3 Cclltrac:in de la e&ecb'oloresi& para el clculO CleltaMat'IO de 10$ fr<tQmeniO$ de ONA ..... 11. 12 2.4 e toctroforesis de campo l)l.ftante ......... .......................... ,_ ,_ ,_,_,_,_ 11.12.3 M~ CrOm(ltogrilfiCOS ............................................................. ,_ ,_ ,_,. ---
H .................... . . . . . . . .. . .. . . . . .. . . . . .

b) Centrilugacin zor\811 o de velocidad de sedimef'lta<:iO n 124 e) Centrifugacin isoplcttiC& o de equllbtlo <le $#XIlmentaci6n ... -------........... --- 124 11.3.1.3 Elt.rlrlacin cenlrifuga ............................ -----" ---------. 12.$ 11 .3.2 CaracterlzaOOn y seP9facl6n de e&lula!l pot citolluc ,imeltit\ de flt~jo . - . ,_, . . 126

127
128 129 129
130 131

13'2
133 133 13-4
134

134
135 13$ 135 136

< n H. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

136 136
13 7 13 7

138 138
138

138 139

11 8

PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y AHU S IS DE CIDOS NUCLEICOS

Las teenlet'ls <flerivac)8$ <'e la BiOiogia Molecular e 1~ GentiCa se u!lllzan de IOrma ~e tanto oon fines b!lieos como ~. lundemeM&Imente el dlagnslklo Cllnloo, penlendo de muestra& biolgica& muy dlvei'M8. Elo requiere &a e.~W<~ocin y analisis de RNA y ONA y,.., su easo. ~lnas u otras m&eromol&evlas. TO<IO$ es10$ ..spot'O:~, oomo en tOdo pnx;:e$0 iltltllitico, M desarrollan en tres fases:
Prc.anotiti ca. deSde la obtenciOO y prepat8CIM preliminar de la muestra inlciall\asta su transporte &llabotatorio. A nlitic;a o c1e aplieae'l ese prooec:!imietlaos para la extraccin de lOs cidos nudeicos.. sobte los que se realiza

IVOOO Cl aMiiSiS t*'>qui mlc:o-geoeiiOO prO(liat'l"'ef\le dicho: 1oma y tratamienlO de datos, y recogida de resultados en
un infonne.

Postana11tica o de valld&dn tcnica del lnfotme anarrdco. Al conjunlo de esta fase y la preanalftica se le llama

"fase ecraanalltice~.
Estas fases. hoy dla ooncicionadas por los continuo& avance& lec:nolgi~. in$1rumontaltts. dtt <Mom<ltizaein e lnlormtlcos. han lle9000 a tal estado de dHarrolo que puoden a veon enmNCarnr ti ear6etor CieotiflC:O que SWyaoe a lodo el prooeoso ana!ltico. Dentro del planteamiento dlt e;te libro, corre;ponOit considor&r $01<1monlc y de fOrma l:>feve bs aspeCios esenciales de las fa&es pn:~anatitic<t y (ll'ltllilie.. Lo$ detallO$ con~. descritos en librOS especaall:aos, P*>CCIOS de laboratorio. etc.. SOf1 objeto 00 estvdio ~ico duranlc lOs pooclos de formac:in y de etjereic:io prolesional o c;ientlfiCO en di~sas tweas de labotatorlo. Aw'lque de dificil delimitacin y COI'Menldo (por e;etnplo. a Yeees 50 IMna proceSIJ<IO de 18 M116$tf8 a la pteperadn preliminar, pero otras &e inc:toye en e51e tmWio a la faM anatrtica), ~bt'S tases se nan Integrado aqul, para su descripcin, bajo un GSQIJ8fl'la unificado donde w imcnl<'l revnir todM ltts

Mues1ras tk: ~1Spei1SiOOC$


ttlulan.'S

I'('R

CCIIO'tfu;-.:in ronaJ
clc.-:ll'llftlw.iJ.. Jino$t!
C!l!it'(l~

OBTENCIN Y PREPARAC.C.N PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS

119

posibliclades, a\.I"'QUe stas puedan no darse ~ultilneamente on la realidad Se cs.lttbleec ~s.i ~,.~na, $0tic de e~s m&s o menos consecutivas, coneaedas entre si, en las o.aales &e aplican tcnicas nYJY diversas. en ocasiones sencillas y oomunes. a veoos muy complejas y especificas.

11.1 OBTENCIN Y PREPARACIN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS


celular &e obtiene y prepare~ a partir de e'ganos. w,de o fluido& blolgiCXl$. en toocin del obecivo o de ionti~n de .,dividvo$), tipo ~ cCiu!t\ (somtioc<l o 9(1tnwli!l}. tw 00 gcnoma (r-..clo,r o mitooondrial), lipo do c~udiO a re.alizar (secuenCia <!el gMOI'l\8.. genes pr~ctos gr'liOO$), ~e En cu:~tquier caso. clet>en e~rse condiCiOnes que g818flt)Cen ra C<JN<tad de la mue&tra trente a la& <liversas variables q.e ale~an a la fase pre.ooaltica (recogida, arrtiooagulante empleado -en su ca~. rnanipulaaone& para la oonservacin, ttanspof\6, 94(:..) , En ~~. t<t ptept1rttcin prdWnir.. se hbce rlll:lid.,menlc tms 1, obteocoOn (dentro de 1 hOfOI (:OITlO ~imo 24 h). o ,., moostrtl se mnnlienc oonQiel:ldn ~1:1 ~ llog<t al ~torio
La
I'I'JJie$lnl
~o (clflWCO

11.1.1
Clu!M

Muestras de tejidos slidos

NornW~I~nte

se obtienen meocsiante biops.ia (metooo inva.srvo <te teOOgk:Sa. wo condieiOf'les ~rgcas . ele o porCiones de tejiOO de vn or~ismo vivo. oon fine$ diagnOstiCO$). se libeffln oe restos oe ~AQr't. 9r3$3 o

~ji<Sos aoomp<ti\;ao1C$ ClQf lovOOQs con disotvcin $<'!!in;;~ r1$ioJe9C3 fri;J y te envi<en <'11 l<'!borttlorio. segUn los ct'IIOS. rofrigcf"'tldos o oonc:Jelodt't$. pr()(ogi(t(l$ con hielo, niev-t ~rtOniC3 o nitrgeno liQviOO ~ clectin del tejido y ~ de extraocion clepe.~ae de muelles tadores. entte o tros, oonteniao en ONA. tinalidac:t del esbJdio, o neoe-sid&CI de amplillcacl6n por PCR de pequM&s muestras. En ocaSiones se palie de tejidos fijados o de ONA ant.guo

C-aracteristicas generales de 1 3S principales muestras de tejidos y r!)anoS de 3diJitOS


Tejktos tumorales Para analizar marcadores de membrana (glicoprotenas, receptores, etc.), de citosol (receptores hormonales. etc.) y de ncleo (oncogenes)
Rico en ONA (15 ,..grrng); par;;~ cnfermedodCII mct.abliCll& Pobre en DNA (3 f.lgtmg); pata enzlmopatlas

Tctjido hopiltico Tejkjo muscuJar Tej ido i ntostin.al Extensione-s de p~l


R.3i:r: d e pelO Huesos
Tejidos tij:ldos Tejidos Incl uidos en pa.raflna
DNA antiguo (rt$tO$ humanos y onimnlcs) ONA atrap.ado

Pobre en ONA (3 1.19 /mg). Se obtietle de zonas no W!losas CsntiOad mi nma de ONA (0,5 Jl (>l'r<'ti Z); <:on fin$$ foren$CS. dificil do e~~tudia1 Pulpa de los dionl$$ o mdula de ocros hue&OS. El tejido seo &e tntura por mtcxSo$ fisicos
Se debe ellmirw la para,_,a e-mplear.oc> d!solll$'ltes, por ejeml)lo deno o tOiueno lntore& <wquoo16gico y antropolgioo. Debe eV1tarse la contamnaclon por DNA e!Wgeno e inllitliQOf(ls de Tacwo!imerMa (que altGran el anllsls por PCR)

Oesoe h&ee miiiOI'Ie$ <ft ai\Os, L3 rC$IJ'IO vegeWI pertec1o 0$10do

(~baor) m.anti9ne el ONA en

11.1.2

Muestras de suspensiones celulsres

11.1.2.1 Clulas embrionar ias (diagnstico pre-lmplantacln)


El 'I\IIO fertilizado Of%lll'ltt en el Utero l)()r $Vcesfvas mto&is estruauras de 2. y 8 clulas tollpotl!f'ltes (6
OfaSIOmetOS. que forman la mrula) y luego de 16. 32 y 64 olulas plutiPOtente&: esta (l!ima esttucwra se Jama 0/aS"locisto o blastodermo, y a partir de ella se IniCia el desarrollo. Para ObWVt'r Si el embrin es poaOOt de un

ttastomo gentico se puede obteoer DHA ex!tayendo 1 6 2 DlaSt6meros (10 Que clulas ele la mrula).
ta~ vl'Nro J)t'Nntiw)),

no af:ta al desarrollo de las ottas

El bli!$1 odermo P<l$iJ ~ formar una capa extema de c&tulas (lfO/oOfaSlO) y utla mMa oel.llar nterntJ (Of01.stocefe o A \lJ\0$ 5 dias de la fewndaetOn se produce la Wnplal'lladn, cuando e trorOOI:I$10 invade 1iJ pared del endometno (~ re-viste interMmente el Ulero), d<anOO I1.9C1' a la ma<fullllcln de las~ OOrinkas. que penetran en la placenla para permitir la c:a<culatiOn f~l.'ll. Las ~$ de un POlo del blaMocele Gngll'lan bs sacos embrionario y vitelino, rrventras que el res.lO del bla:stocete fortn<'t el embrin, Do 1(1 maS<l oelular que oonst:Jiuye este Ultimo se pueden obtener oUas madre plurlpotentM, de elevadO ttller~ POtencial pewa trasplantes. pues pueden dar lugat en cunJvo a Cf!>llaS especialiZadas O& cti~~tiniOs bpos,

120

PREPARACIH DE M UESTRAS. EXTRACCIN Y ANUSJS DE CIDOS NUCLEI COS

11.1.2.2 Liquido o fluido amni1ico


A partir de la 11 semana de gestacin, el embrin queda protegido al e~r inmerso en el liqu)do amnitico, contenido deniTO de \lna membrana llamada $C11C0 amnitioo o amnio.s. la compoSICin del liquido amn161lco, cuyo
~en llega hasta 1.100 mi a trmrlO, deponde de un equilibrio dinmico de intercambios oon el ie1o y la madre, y oontlene clulas epdeliale<s que apot1an unO& 65 rg ONAIM. la obtencin de una muestra. medlan'e punciOn abdominal a travs de la pared del tero. &e denomina cvnnioceflfe.sis t:&~a se usa a partir de las 14 semanas de ges&acin pata el diagnstico (ln)flatat de anomaliM cromosmicas.. enfemte<l8dc& meUilicas congnilas. defeelos de' desarrollo (in~re;,r: l)u!ITIOtlar oet fetO), estuclk) Clel sexo, ele. LaS muestras del Jt! lfimes1re sirven par~ vt'IIOrttr 1& grtt~tld 00 ltt eril:f'OC)I&$1 0$$ felal y C)fededr etslndrome oe dlllc.Aad resphtofla del neonato.

11.1.2.3 Clulas de tejidos o sangre fetales Como alternativa at lf<pdo amnitico &e vtilizan f1'IIJ8:Siras de ''Ctll0$idadon corin~s . tojiOO fetal procedente del conon (membrana mM o.x\er!\(11 del embrin. Quo corrlal;t<t con la J)l.t'.;;e.n1<t). ;_slils constituyon a, mojor f\Jeolo de ONA
felat

Se obtienen por biopsia a las S..12 sttl'l\!'lnas do gestacin y tlan <'t w tu!IW~ se pueden obtener <ambin muestras de sangre letal, dentto del seno materno, e~eando do9 prooedimlenlos.:

Ltt 1$to$copi8 (m&IOdo similar a la endoseopla, vlido &aMO pera expiOraeiOn como pata lOma de muestras) se utjfza entte las 16 y 21 seManas de gestaclon, pata detetmlnar ~tlas. coagulopatlas. anbsl9 de ceriotipo. etc. Una tcnica alternativa mk sencAa, la ~ocvnfO$iS o f~os4. permite oblcncr $i'lngrc fetal ~lamente del OQfdr'l umbilical a13 ltimestte de e~tazo: sus er~s {ntJcleados) y llnfoci!OS se uUizan para dlagns.lico prenMal Sin interterencias con el lelO.

11.1.2.4 Cl ulas de sangre o mdula sea adultas


las muestras da ungre perifri-ca 60fl las ms empleadas, oomUnmente do $;)ngre ~ (unos 40 J9 ONAJml) recogida sobfe antlcoa!)!Aenle. Se utiliza la fraccin celUlar total o W5 dis(in1os tiPO$, untt &epttr3(k)$ pOr alguno de los mtodos disponibles. en especial la oentrifugacin segUn W5 di'oreneiots <'t t.&m81\o o dcnsi(Uid

""l

Se utilizan tanOn manchas de sangre, QUO se obOenen de $31\gffl fiSiOlgica (l<liM. dedO ... ) secada sobre un papel o canon. o bien <le origen aoc:ien1al (prei'ICiM, 'IOhicPo$. utensilios... ) , La mancha M! raspa y extrae por twvado oon diSOlucin salla Se utilizan par.~ metaboiOP<~ti".. idcntir1C3cin., r.nes JoreMes. etc. Se pueden destacat las Utl}etag G~. P301 diagnbstiOO l'leonatal. y las l8rjelas ele papel FTA. malerial especialmente tratado en el Que se seca la ~. $e lisan .las clulas y se extraen sus componentes. quedando fijado e.xdvsivai'Tl(lnl$ el ONA, Etlllt tllrjetM poseen la ventaja de &u fcil tran;porte y con$tf\';)Ci(ln,
u.& mun1r de mdula 6s.ea rOja (&CIIva en hematopOyesls) se obtienen. bajo ane<5les.ia local. po1 aspiracin mec:i;ln4e 1>4.rndtt rne<Jtd~t. generalmente M el estemr'l o en la cadera, v&llndose para ob&ef'Vaciones citolgica& al micros.eopiO y estudiOs get'lbc:Os e hlslolglcos.

11.1.2.5 Muestras bucales


Los raspados y enjuagU4$ bucales., Obtenidos por m&odo!l no lnvas.Nos. con oepllo suave o algodn y disolucin salina, contionon c::61 ui8S epiteliales de descamaCin oon suflc:lern(e ONA genmico pata &u dMeccln. previa ampliflc:.&oeiOn por PCR La saliva es de uso creciente POI su hu::iidi!d de obWicin (lOMa directa o pre!W!f\Cia sobre la piel. sellos. colilla de clgarrilo. etc.). La& <:lula& eoiteiclles que incorpora. prooedences de descemaciOn. pueden apot1ar cantidad su6clente de ONA (89 ~51" vn<'l 'Cm~ de muescra oon hisopo) peta su anli&is oon mes kwenses o estlldo de la patemiOOd

11.1.2.6 Semen
Contiene millones de eSQerme1ozoides (S..7% del \'Obnen rotal. oon 1.3 pg DMA. POI cltJial) forrn.;u:IO$ on 10& te&ticviO&, n suS()enSiOn en t.W\8 rraoc:l6n liquida de secreciones de la& veskulas semin<~los (50"4 en wtumen), la pslllta (20% en vOlumen). las gtilndvlas bulborrectales y el epididi'no. Se recoge <'t v3M maneras, PQf ejemplo. {il) en prcsetValivo, para estudios de f\lnclonamiento del tracto genital mas~. m3~ de tcrtilidad, etc., (b) por ..spiraein directa de la vagina, para investigadn c:ninal por agresin soxu;'llt. o {e) POr lavado salino de manchas scc&:S en ropa. p.e~. pelO. etc. Las muesttss fte5C85 &e deOOn ana!iarr CIIICCS de 1 h de su recogida. mantenindOlas a te"'*"atura corporal dvranto $U tr3nSI)Ort.e Los espermatoZOiOes se pueden separar del reAO de olvl<rs {QV!tJ incatyon 1a5 <le la vielim;t. en c&sOS de asarlO sexual) me<11ante ISi& d#erencial de sta& oon SOS (doCiocilsull'ato sOdico) y proteinas<~ K

OBTENCIN Y PREPARACIN PREUMINAR OE LAS MUESTRAS

121

11.1.2.7 Clulas en cultivo


las ~lula6 al&ladas o pro08<1enlttS de ~dc.xs u rganos di~<tdO$ M I)UOden ~u!bv'r en medios ~peci:tles El oons:b~uye ver .s~ un <'r~ de o'*OOio i~diente. Ol:'lrt requerimientos espeda!il:aoos en cuanto a equiPO, procedim.etl$0$ sutttatos. niJitlenleS y tactotes <fe eteclrnlenlo, etc. Pueden CLtarse como ejemplos llneas ceUares CiOtloeas (gentica y met.aDlicamente uniformes con la clt.N Inicial) y euliWOs oe clulas de tejidos, oon un pote;lal <fe ap!lcac:iOrl como a!tematwa al ltasplan~ de rganos y tejidos o para la reparacin de lesiones 6$1Aiwes; por ejer'l'lpl'o. llbroblastos y quetatlnodl06 para pteperar par~hes ele p.el ttrtificittl (<f(ll'nlf$ y epdenni&.. I'G$POCI.Nttmente). hepatoclto6 para patoklg1as neptlticas termnales. y~ de miocardio OiltO IO$ionos cardiaca$

QJttivo lular

11,1.3 Muestras t elulares de llquldos biolgicos extravasculares

se ii"'CCuyet~ en eS2e apartado algunas muestras con lntefes dlagOOsiJCO por si mismas o complemenleriO de t.as
t'lnteriotes.

11.1.3.1 Liquido cefalorraqudeo


E$ un fluil: resu!tatlte de lt' ul!raf4tracl6n del plasma (de ahl su analogla en OOITipoS!CIOn) y que reooge bs !)I'Oduetos Cle de'SeCIIo del mel&t:>Oiismo oetebtal. Se encuentra en dos compa~Unen~os que recubren el oentbro y la mt!!OIAa espr\81, tonU\ICado9 entre si: el sistema vemnctlfar (30 mi) y el &S.Qacio sutlaraCYloio'eo. delimitado por las membranas piamadre y aracnoides (120m)_ Se produce y reabSOfbe conbnJ<Imen1C {oon un recambio de -500 mlfdia) en lOs venrriculos de los dos netnislenos 08febr.lles. Sirve oomo 50()0rte protector del sisMma nervioso ~enltal , para Que "ffote el oerebi'O evitando su apoyo direao sOOfe la superfic.t sea. Se puede oblenet una muestra por puncin lulnb<v. Aunque su aspectO normal es transparente. en condiaones pa~s aumenla su turbidln por la present~a ele cUars (esencialmente leucoa\Os, eri!J'Ocrtos, microorganismos. etc.). en funan del tipo y gravedad de la enfermedad. Se utiliza paro d&leaar enfetmedades del sistema nef\1'10150 oem~ral, asl como pera deteclar marcadores tuf'I'IOt'Sie&.

11.1.3.2 Uquidos o derramos serosos


Se ~li:M en ...., QJw:;l<idOs del cue1po <PJe rodean toos lg8tlOS, delimitadas por dos
metnbr~.

lt'l p{)rlt'IIJf

{t:xterna) y 1a visce18J (interna. supel1leie deltgano). Estas membranas estn fotmooas pot ~ ~nt!vo y una rica
te<1 de capilare-s sangulneos y llnlilbcos. a tra'lls de Cll)'8 pated se Ntra el plasma cuando se anere el batanee twdr061 ill:aco u osmtico: de ah! la analog' a de oomposlcin entre pla&ma y llq.Jdo& sero&06. En la prctica d lNca, se tis6nguon do5 tipos de ultr3filtrado tr.Jns!Jd.b<to$. de ongcn no dlamatorio, ~on S)OCaS elulas (menos de 300/ml), y fJJCI)d<K/o$. ~os a demmcs .,namatorios y con m1.1ch<Js <:etutas {mAs de 1 ()())'mi) . Lar:5 m.~~Htra s. normalmente transparentes. slo IIC ~n en sitvocioncl$ Mor~t$. pre5cn~o entonoe:s !XI grttCJo de turbidez: vanable en f1.1ncrn de su contenido en leveo<:s y eritrocitos. fl.lndarnentalmenle.

volumen no<mel Liq uido peritoneal


on~iti~o

100 m!
toraCOCMtesis o ~esis (punCIOn en la bil&e do IQs ~lmol'l$&) ele la pared tor~ o del espa pleural) Conhene cUas de muchos bpos y e& ele intets ollnlco en enfermedades innatnatoria$ inlecclosas. maf'C&dotes I\.WI'IOreleS, ele.

Liq uido pl eural

1030 m e<Mded pleural {M acunula

liquido peri~rdl~o

2050 rn1

espaciO petidrdico

~nte$1$

Se usa con met~or lreeuen~. y3 QI.IO preseM3 mM ~omp!icaaone$ que 10$ antenore&

11,1.3.3 Lquido articular o sinovial


Es uo uttrafllltado del plasma, vi!ICOSO. 00t1 un alto contenido etl pro!eb\35 y ~iOO hi<t!urOnico, locaizado en la C8\tldad articular para conJe.nr un carc&er futlncanre trente a la tfietin Qt'OI)i<' etc 13$ artJC\.Ocionos di.Jrante el movlnvento. Con un volumen normal oe t a 4 mt, su contenidO cetulat llene .n1er~ tonto on PfOC0$0$ mecn1100s oomo en P'008SO& inflamat()OO$ pa101gi006 arucutetes. Se obciene por 81'tfOCMte-sJS, es decw. O'ISflitaCiOon lt'aS puf'l(:in en ol eswcio articular.

122

PREPARACIH OE MUESTRAS, EXTRACCtN Y ANUSiS DE CIDOS NUCLEICOS

11.1.3.4 Muestras biolgicas menos habituales


Pueden contener clulas y. por tan40, ONA, tRI. serie de muestras de lntets en casos OO!'W!ret.c>S: nuMOt acuoso (cmara anterior del ojo). tunor vftreo (detrs del iris), lgrimas. endolinfa (1\Jbo espiral dej oldo interno) y perlllnfa (caoiiiEI$ del ecP!ibrio), mooo OOO'ical. liquidO$ l'oliQAcw, oviductal y vaginal. het:;e& , Meteciones nasales, utlas. etc.. Y orina, q~ nor~TW~I~e no oon!ieno ~h.Jiitt. $4t uliliu ptnt' ~ ~ metabolitos on enfermedades hereditarias relacionadas con el ~mo 00 los aminoc:idOf (~tonuri. *"plonuria, Qtt<n.ria de amnokidos
ft'mifi(;;Cidos. cistiruicl. cte.). CIClas b&Ses purinie3s (gota) y pirimi(llnieas (aO(ftJta orOt;ea), del gtl.l!XI

r,omo (po~s).

etc.

11.2 DISOCIACIN DE LA MUESTRA TISULAR


En lo&
~.

las ol\llas M oncuentriln

atr~;oas

en

un;:~ Qtgani~in

tritlmensional,

CQn

in!Cf11ociom: u; o

<'dhNiono$ lt~neo (l(ltre o!!t~S como ton la ~riz. oxltaeelullll' (1)1!11 flicltatado rom-.ac~o por 1\btas proleleas, como~. y eacset~as ~ldicas completaS). El mejor tetldlmiefl&o en c:uant.o a dlsoci9Cin de clulas vla~ se alcanza a partir de tojidot ~tilos o neonatales. Pueden SOI'I31latse: w s estrategi as:
aiTIOf't~ <'O pM, ~rl.l c>o.e~ Oi$greg~cin

Frag,men taeiOn mecini ca: Mediante corte. troceado o triturado de 13 mooS1ra origint~~l en disolucin c61ul3$ il'dlvidu31eS o ftagrt~en~os llS\JI&IeS pequei'los que tacllllef\ su OblendtL

quimie.a: La rotura de 13 m&.1tiZ. ettocelull.lt y de l&s uniOnes ln~ero&llat'es se suele te4'11i2at pof (elq)OSicln a lArasonldos.. ondas sonoras o acsticas no percibidas por el oldo humano por po&eer una frecuenCia superiOr a 20kHZ). generalmente et1 l)(esenc:ta de detetgentes (inlcos. O(W'I'IO el doecilsulfalo &dioo o SOS. o no iOonicos. ((liTIO Tween.20 y Ttilon X-tOO). La elimirlaeiOf\ de catiOneS divalentes, en e~ el C;t2' (CQt'l ~1es qudo1ntes como EDTA).. taMbin deseslabllll.a la adhesin de clulas entte si y ooo la
homogoneia~ciOon i:tOiniC:. O por &Onieac:iOtl m<~trit. CJC~tt~Celul&r.

Dlg.sti6n enzlmt tlea: Las protelnas de ta matriz se digieren CQt'l protNSa$ oorno colagonasa. protalnasa K. pepsina o trlpstla. Dependiendo del dpo de rr~JeWa , esta digesti6n Jl'lllll(le requerir largos tiempos de inOLA;:tao::in (por ejemplo, cllJias en cultivo o ralees de pelo).

11.3 SEPARACIN DE CLULAS


La obtencin de muestras celu:laru adeOJadas par.~ la a.so tr~nalitiet'l r~ v~ procedimientoS de seperaci6n. fTaoclonafTef'IIO y caracterizacin. basados ~ente en I;)S ptopi~ de cadtt tipo ceiiAaf exiMente en la muestra. Su elecc:in en 6$tint<l$ o~ do 1M foues. preanalitiea y analltJC& depende de mUChos laciOfes: mue5tta de ~*'!ida. grOOC. de: separadtl oeseBOO, conservacin de la viabilidad, operaciones y lcnicas a ap1icar post-el'iOtmente, a.c. Aclems <le b& mtod06 m$ comunos. quo so uponen a conlinuaci6n. existen otros procedlnW!n4os especlficos, pero que no han ablnl<l<lo un uso general {POI ejemplo, ~rto en sistemas blfsloos aCUO$OS, electroforem de llujo ibte, etc.).

11.3.1

Separacin de clulas por mtodos de sedimentacin y centrifugacin

la se~l6n celular puede hacer&G por sedimentacin 1 gntvedl)d ~d. bajo la f\lena de la gravedad ten"es:tre, pero 10 1\a~ual es acek!rar el Pf008$0 aumenlando muchaS veces esta tuerza mediante la centrlfugac:l6n. Al rearll.:arse sta en el seno de un medio l iquiOO. 18 separt'ldn no sb depende de la fuerza centrifuga, &no de otro& taciOffiS que modifican la sedimenCc~ocin y que d!penden de las eatactetls.t!cas de la clula (o partkula en generlll) y del medio. El conjunto define. voloeid~d de s.edimen tacln de le clula (pg. 123)

11.3.1.1

Centrifugacin diferencial

Nonl'I<Jimonlo, el planteamief'lto ms senlto es la M~PCWa<:in por ccntrifugt'cin, comenz.anoo con valotes bajos de g (pro~ugaeitt). En la pdldica. slo se pueden $0Pf311' ~" oUM que rwestren grandes diferenaas de tamallo, al menos de tO veces {por ejempo, plaqtlttt'l$.. muchO ms pequei\as que 189 restantes olias wnguinN:s). P')f ejemplo. en el caso de sangre oon an~te. a 2009 bs eriltocltos sedimentan en la zona inferior. los IGuoocitOS IIC)8teoen en la Werfase y queda como sobren<tdanle un plasma riCO en plaquEMas lf>RP'J. Se puede preparar ~sma potlfe en plaqueras (PPP'j empleando m3yor ~idao (alredecklt de 3.000g).

SEPARACIN DE CLULAS

123

Recordc~

la. -....'J'I:II'llo.'ICl ' ''C'IJlflfl.lVA ''"\ --~ fk l1 fl\,bl d'llllat f l. tkf !'tJMI do; Jlf\1 dd twbu. t rad1 -'.:1 d..ft.'l..- ""' ~ ~,;o,&.,,...t a. rn;co.IQ Ir 1 >ik 11 \ ('i,. 1~ ka~~t..-t. J"-ofll U'OU1har;a 1<'9 o\')

.. a

1t1'

r,
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124

PREPARACIH OE MUESTRAS, EXTRACCtN Y ANLISIS DE CIDOS HUClEICOS

11.3.1.2 Centrifugacin en gradiente de densidad


e) Mtodos de baf'1'9ra: cemrlfugacn a 1rovs de un m&dio de dens1dad c<.msta,te
conlegur sepat&Cione.s ms ertcaces (pof e;efll)b, la de tos tewocito6 respecto al re$10 de las elult~s sa oenltlfl98 la muesln'l sotw un lecllo de densidad llllermedta entte la de 10s ~pos celulares que se quieren separar. se emplean pat'8 ello medl05 comercl*s como F1COIIPaque, lympi'Jop(ep y otros mueflos, tctmados gcnernlmente- por me.:et.,s de FiCOII {un pob!\Saitldo slntciea) y mMrlzamida (un oom;>ue:sto Sinttico )<ndo). S. dispone de v31ios me<!los con densidades adeciJadas pata la separacin de llpos oeUate$ concre!O!I: poc eJ.. Hy~ 1.0n P.,"W'''' e:IIJIM mot~onuoeares, Hyc:cprep-1.068 p.am mooocdos., PotymorhOp(ep r.ara elultts
sa~u:inells)

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mc:\ho d..: tc:mm.1ud


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b) Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin


P~ $0fimai tipo$ celulares euyo coe&lente de sedlmen1adn Olflere poco (p.e , llnloatos y monoo&os} es proQ$Q ;~Q,Jdir 111 uso die Medios ~ forman oo gratliente de denAc~ad lo que ti'Yorece la concentracin de cada tipo oeuat en Uf'la banda o :zona estrecha por ello. a esla tawca so 1a: denomiM centrif~i,., UIOI)t El g1'8dicnt.e <lo denSidad se genera. antes de all.adlr la muestra (gradionlo prqfonmtdo),. modiatl~ v~ria.s ditoluCIIOfl(!S de dlstlnla OI)I'ICenrtacaon de un compues10 adecuado (ficoll. sacaro$8;, <c1lbUfllfl~ SYefO lelttl boW\0 .. ). le~ p-epanKiOfl pue(le h~ese de tonna !l'laflU8I (dando lugar a un g;radierne disoonlinuo) o crn()leando t.m ;))&f&IO (()rJMdot de g,..Cfiemes (gradiente conllnuo}.

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Uo pequeno ~n d9 mu~;~:~U. $e deposita soOce ee gradiente y se oenlnfuga a alttt vekx;idt'd dumnl(l un Clt!mpo corto. HabibJ;,I~C se ~ un gradiente cuya den&lditd miKirna os lnforior ~ '- de la$ Ululas. oon 10 que stas podriar~ .-lcan:tar el kJI)(b de{ tubo si se c::eftrtfugase duranl9 1iempo wr~tient~. empe:&n ~lempre dempos menores, por lo que el re~r\l'd<> e$ depe~te del iiempo de centritOQacin: dicho de otro no 84 ~nza el equilibrio de sedmeMacln. Con esta tcnica se consiguo. por ejemplO, separar todos 10s tipos celulares sangulneos. ~!Ctlr ospermllozoi(lt!$ vi.<rbles., sepatiW clulas viableS y no viat.l6n do tejidOS de'S~ados y muestras con oU8s en $U$1)en~i6n, etc.

se

mooo.

e) Cor>t.rifugacin isopicnica o de eq1.1ilibrio d& s(Kfitnetttacln

se pueden '!leparat celulas en funci6n oxch.$iv~rnente de Sll den'll1ad empJeando otra variante de cenlriftJg<~Cin. llamaaa ~b (p~labr<t ~ origen gr~o que significa de Igual oem~. Se realiza tamblf)n sobre ~n gr~te do denSidad. pero en este caSQ el liompo de cenlrifgael6n e'!l lo aufiC~er~temente largo como parn Clte w alcnc d equilibrio d9 &edimerrlaon {-"tr4 la rueall oentrlfuga, el empuJe hidrosttico de la oUa y su difusin), ~ro

SEPARACtN DE CEJ.ULAS

125

coo~. se u$81'1 gradientes continuos~ CUbren toOO etlntef\'alo de densidades ele las oilult'l$. en eJ t(ltl(lo oel tubo la densid~d del medio na de ser mayor que la de tas Olulas ms densas. De esta forma. Wldependientemente oet t;;e;npo de oentrlfugaclbn, las clulas oonC3 sediMef'olaran en el fondo. s-'\0 que ale<~nzan unt~ po$ieiOn estable int.en6dia en el gradlenle. con una variante peculiar 08 0$1l."' lheniea se OCW\Sigue purifur linfocitos 00 $U rne~lo can monocltos, aprovechando la capacidad de ~!M lllmos para fagocitar micro8$f<:r.'ls de oro eoiOiclar 00tt 10 que su den&tdad se haoo artificiatmenrc muy $U!)etior y sedi11"'1eNan milos abajo dellubo.

CcrnrifugaciOO
dil~rw~ iol

C.:nrrifugae-in J:IOO:tl <J de


q~loe-iditd deo s.edimcnt.aci6n
l~n to:ldimlt rlfd...--JI'l.
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('('ntnfug;.nm ..:!JIICnic:a &: t..'IJIUiihno di! !dim.:nUto:-i6n

......, .""''"')

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&!l!.!i ......, vc-:IA- .11<'
')~m 1'-:in prino;ip-'mnto:

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( UO.:Iin:l!ll: de joo:oliMI:o!IMO.'otl.o, q~~C" dtp.:n<Jc. <k la m- {llomailo & ..,,,ICI.ul 1~ dt b l'or!N.. (n1.:didu \'& ''ocll>rfv.t. 1~ 1uIJ ~ Apli!Ctlto : K fl.-.c..... -': ~ <.:lu1:u'c:~ fl oo....Unlknll) lolllxtluhf ~Jlltl" ~lfl4c ~ "Pt-llo~). ~u..O:ifll

.8J!1.,a " -ulanu; :isl~o.ll!; '"' "'-:w. do.!l c...Wridc: w..r''*"'~ -"<i"" <k~ dt m~ ) furm.. El pltdien~C ctal~ mt:~da pos oon\'C'o.'6cin di fusin hl!IUH bk" <q'UO'W:I1. :.C olC'Iit~ \lo
dt ai;!M;o' el f>Pilibrio. l>-idlld mlllll'l'l.l "~'
~lit < & n..oi:ld dt ko wmx.m~o.k 1 &muCiU11 ~~-..:~& lllri fu~!)n iollcS

f!.kwNm~I-

S..Wttei(n (111 ru"~'''" <k O..:ll wokll


U pad~ \'\ illo la mc't d a p;.!f _.611\UC!M ohu~bien
.q:olllkh.~

l'l hCml"' dt

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l.wyp , , _ qra...,...., .a.a"" d

kl '"f>C11:nl.m!\n~

~wlih"*" Uo:n\0.1.-.d !lli\oma&l ;r~d~ ,, lkw:-II.IIIJ <k 1~'!> c~ml':l ck b .-~Ua

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.kulo. nw.'lt~We~. ~u:.

11.3.1.3 El utriacln centrifuga


La erutri aein coMiste en la separacin de ~h;l01s (o pa.rtieui3S en gMetal) de acuerdo eon su velocidad de S!XIimentaciOn. El proceso orignal. coo&istente en la realizacin de ddos sucesiV06 de secfmentacibn y decantaei6n. tue tadl1tado por la incorporaCIn al aslem<J de U'! nuo cJel propio mettlo l ~ido de wspensin. en senlido contrario a la & grtwYed&O). ESte lue tlnatnente combinado oon el efecto de la fuetU cenlrifugl."'. dMCIO IU!)l)l' a sedimentacin (c.onlro 1 la modalidad de -.,tr~in de mt"tyor uso actual. la elutrtae&ft eenttlfuga. ~i. las olvtas se vttn 5ometid" dos fuerzas ql08SiaS: PO "'~ oa~. 1a tuerza oetttrlfuga y. por otra, la tuerza de arrastre ClOf el !lujo OOfltinuo del me<fiO en soniJdo conlt'ariO.
{ 'nda uu~~o:~OOIiuhll ~t 111111 propiNIII!It:t ck' "f'drncwlaoim ,J,f~mn 1;.,. d 'lulb mil~ I:Jlln~ ~ S<ni'IC'MI<f'l '"ii~ r.l)t(b. 1~' ~ pcqudlll' tiMan mil"

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El resultado es un mtodo versAd!. rpido. eficaz y rel&livamenle suave para sepafllr subpoblacioner. oellfares segUn su tamao a paftir de una mexcla en suspensin Admile nUmoroo 9fi'lndO$ de eh,.1l<tt; e. in<;lu$0. pennilo Qblonor

126

PREPARACIN DE MUESTRAS. EXTRACCtH Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS

una mayor ptOJIOfCI6n de clula!! vlaCies respec~o a la mUMtra origfl.al (al separarse las clulas d8118das, <fe 4ism1a densidad). Se aplico para oblonor gran diversidad de subpoblaclones efVtquedcfas, a p~rtir do PQblacione$ celulares
hepticas, clulas en proli~raciOn (sine::~ en la fa&es M, G,, S o~). clulas sarqu:ineas y otros lipos celulares.

11.3.2 Caracterizacin y separacin de clulas por citofluorimetra da fl ujo


Es hOy dla un mtodo de sop~u~n import.ai'Q en Wl...es~cin biomdica y en el labon.t!Orio d inico, espec:il*nenta por su capacidad para ed ~isis au!omlico de suspensiones oelulares. El WIS!tl.lmet\tO emple80Q N basa en el tran&p01'1e de una suspensin celular (<:61ult'l$ t(lnguifl(las. aspirado medular. 4ejl00s disociados, ele.). impul&<l<la por oo ,._., de disolucin ISOtnica, al pun10 de medi~ o tilmarn de rqc,, En su aplicacin habitual, la <:itQmotria de flujo analiza y separa clulas prfMamettle t'l'\8teac:las eon un fluorocromo,

Cic~U~s molculas ~en la propiedad dt ser !luclr'eJttnltll, t!l decir, cupncilbd de absorber CflttgI de Ul'l! radiadll dcronag..tl:a (ha v1sibl~ o ultrnviolle~). que las hace pasar a un cslado.l dccttiliCO eJ~dlaOO desde d Ct~<~J V\IC'h~n Juego aJ MaiJo fundamcnUJ. )iba'andO CtU:tgI tanw.n l.'fl forma d~ lur. Como lu cnergia de In radiacia dcctromagnC1ica emitida 1.. 'll si...,nn inf1..nor a b
nb~.

In lolljilud dC' onda & la luz entitida es suxri(lc' al& 111 de lalut- :lbwrbida:

El .:uploo de llul)rfro~ y 11 ~ ~omu IUC)Icul~ ma.n:,dof'a5 ~ dC' unn grn 1.11ilidad. la Jl(ibi l ~ d..: l.ktec:IUI dislinla molCc::ulas )' c,Ciulas ~:n muy pequdla c.antidtd )' sin lo.ls riQ);U$ IISQCilldo, ll) m.1n:IIJC oon il>IOJX>ll radinclivos. En QOOCre40, en a;ologia Molular 9C utiJiza) priO(ipo.lmemc dos lipos d\ lluorocr~ agcn1cs in.1crcalantcs que se uIC':Il al cido mclctt:o y s.il'\'tll asl pun detcct:uitl en gek!l de cltrul1lfl."::d o gr.ubcnt...'lllk dc1U1.J:kl (ules como bromuro de ctltli(l, ~rnQjt~ de ll!Cndm:t y col(lf'.a.ntes llocdtst), y Roonxmmos unidoiS de fum\11 cxwulcntc a SoOCidas do.: hibridacin y a Ndom;; de PCR (rluoresccina. rojo Tc.xas. rodaminas. etc.).
puc:~ o(m:~

L:1 dd1..'C'Cin liC p~ ~;,Ji~r Jne(linnte: C!lpecltOiluorimeltO y lcctm' de miCTOpiX.:lS: mic!...'fl 1:! !lu~nc:ia pnm~hu de b mult';Slrn dcnt~I.mt'UO de fluore,ounda: ~~~ gotk'll de C"k"<'lrofon:~i~. blt~l (1 c:rtlfn.'dogr:.fQ.; en pi:Ja mi~copio de RuortSCcncil: pcnnitc obsoer'''ar secciones de lcjido o cflullls indhiduak:s. dcfonM scm icuanti1ativa CIIm\"'~ de ll' I JO: rtmt.ite medir dlu!Jr:" individuales, de liJrrrnl C\llllllitltiva

El PfQCodimionto de citome'lritl t1o nujo oons~ de dos otopas caracl.eritacin y separacin. De hedlo. alguno& inslrumentos (t'Mii2:t~dOeS} slo ~li2;81'1 18 primeo~. mientras que oltOS (dn:sirlcaole$) $IOf\ ~~oet& OOem:& 00 llcvilr a cabO la $0gul'ld3. a) Caracterizacin de t9 I)Ob69Cin celular:- analizador, cltmtto d fluJo o cltonuorh tto El si~ma conSigue Que la suspensin celular Uegue en (:(W'Idlc:iones de ftuiO IIWI'IIn&r. formtlf'ldO un ChOtr'O muy fino que. wmo oonseeueneia de la dluoiM. con~:~et~e las ~las ~lduales M suceSin. t:t~as IX'ISM as! de una en uM a travs de un haz k.w'nlnoso lS, cuya IOngilud de onda permite la exd!adn de los martadOfE!S fluorescentes hxlrporados prevlamet"Me a la clula. En la luz emergente de cada clula se analiza la disper&ln y la kltensldad de la fluorescencia (emisin). Oisper&in frontal de lt~ lu (reftaccitll o ;se Dispersin pefpGfldiQlar Arquitocttn inlcrnt~ (gmdo de cstrvcturoci()n subcelular, de la luz (reflcxjn} o SSC <:Ontonido dO orp!nuiOs, pularidad, rugos~ ...) lntMSiclaCI de ftUorescenc::ia Cantidad de nuorocromoos marcadores prevtamenta hcorporados a ta oUa. ComOnmente se usM anticuerpos, marcadOS oon (a ooa o varia$ /.,) fluorOCtOITI06. <:Ontre antlgenoe da la superficie celular o bien colorardes o sondas que &e lijan al ONA

SEPARACIN DE CfLUI..AS

127

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b} ~ibn de Clulas Claslilcador de cehJias actwado por fluore&c.enelit (FACS) La c:omense de flquldo, tras p,ascw por el ~ do de1oc.cin, $0 t!1m$f()fl1'1(l on \.mn $UCe$16n de go~ muy pequenaa {Oooetai~T~e~Ke, oomo oonoec;ooPCitl de unt~ vibr<JQ6n apf~ IXl' \MrMOni<io$ <'1 1;'1 ~mar;;t d., ""o). 13$ cuales conDenen como rOOximo ~ $01~ ~~~...la AJ m.smo ue~. en 1\Jnoon de los resultad()g 6el anll!ils anteflor de la clula, el $sibdor aplica t~uiOm.J\~oc;;:~mcnle a (';;!Id:. gola un pul~ de vollaje (erllfe ~y .t150 v que le propon:~Of'la
yn."' e<"~rg::t efi!Cir1C." Elu$Utlo(() dellne ~lamenle el ptAso que se ha de aplicar a cada QOI8 (y, por &anto, el Signo y cuanua de la carga que adquirira), en tunciOn de criterios &Obre 106 parmetros del antos,IS en el Citmetro. El sistema infOI"l'nitioo que controla analiZador y daslficador permite ta$ decisin en el breve lnteNalo transa.mdo emre el paso de cada clUla por 8 detector y la ormaCIOn de la gota que &a O)(ltl!!fle. Al mismo bempo, todos los datos de cada clula se almaoen.an

pata su estUdiO IXI$Wfior.


A OC>Ittin~,~;;td(l(l la~ !)01:.'1$ ~das pasan porWl campo elCtrico. donde se desl/lan de acuefdo oon su carga para caer en <hSiintoS tubos dP. recolecclbn de ITJ.lesua; de esta maneta se conSigue la separac1on da .subpo0lac10oes oelulareli di> acuerdo con IQ~ O'ltetiOs definidos (combonacin de 1amano, esttucbJrac:KIA y tluoresoencla) Como meros e,emplos de las lll'lf\Umetabl1$ aplicaciot!es de esta tcnica !Se pueden Wr: aJ El estudio de la superficie celular oon antiCOOt'J)Of> monoclonales. siendo posible ~donar una c"'a con un an(lgeno especifico do superficie. de elllre 1.000 que r.o b tengan y cl<t$ifi<;.;,\1 mile& do o6ful~s J)Of $()9'JtldO b) li11 wlomdn del tonteniOO en DNA. y RNA de 1.1no ~lul<t (p ej .. en (l$11)1';1iQS del cieto celular). e) Ltt de!fl(l"I*'I3Ctbn de su fMna: y lilrmai\0, po1 ej(m'lplo,
~ n.,opl~sl~~

11 .3.3

Soparacionos diroctas de tipos celulares A~,.~n $1!ln0""' caso oortltl.llar. es de uso 1\ab(uat y oo puede df!18t de menoonas. ta PO~iblidad de ai$fo)t f.llltt10S tipo& ~aros g"<'QN _. &u WJndencaa a oonerirw floiQflomento a te $1)pernQi8 de un &OPOft& de vldno o plsdco

(adhe$in cel.ul<lr ). ~eralmentel~ propia plaCt Oc cultivo Con \a llegada de los antlcuetpos monoctonales este prin~ se pudO ampliar a prac~Jeamen~ cualquier tipo de celula. La posibilidad oe disponer de esl<lS anueuerpos M cootr'buido OO'Iablemenle a la .separaciOl de clulas. en el tabotstono ctlnlco y de nvesbgaan. Su exquisita selectl'ndad en la un.n e eptopos M(lgnicos de la wperf.cle tia pe(milido di~ar m1odos diven;os para atslar y caracteriz.at de fOOTia directa 106 tiPOS oetulares. swesenter. oo una mezcla heterognea. ES1os ~odos pueden aplicarse, por ejemplo, para definir la& olutas a trasplantar en caso <le enfermedades graw& {celulas preOJrSOtas de mcU.a sei'l e~anOO clula& T madurar. inmunocompetentes), para

128

PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCJN Y ANLl$.1$ DE CIDOS NUCLEtCOS

detecmlnar el fenotipo de tejidos pwa trasplantes, ~r lOS IIPQ$ ~$ rt$p()n$t'lbkl5 do procesos en la respue61a wnurte. euaoblk:&r~ubi)Oblac.ones oetutafes, eie..

8 uso ele ant!c:tJetpOS ha dado lugar a una gran dt>.-ersldad oe mtodo$ inmunO<Inilllilit;O$ y do separacin. QUe
considerar parte de lOs mtodos de afinklad. Por ejemplO, las clUlas de un b:J() puOden ul'lirs.. 3 trtrV5 de aua anligef'IOS, a at~tiwerpos moooclonales prevametue fijados en supetfleies d! plSlio:> {tubos. plae\\s <.Se t;~,~hiv<>, varillt'ls. micloe$fcms . ) o malnees de; cdgeno, polisacando. ecc., io que pennte w separa~ de ese dpo eeluiBr, CM'IO eje~ Slngul:u, de (lntr ,, multitud dfJ v~es <sanolladsr:s, se comentan e continuaCin 108 mtodo!~ basados en el uso de mlcroesfems magntiCas
&oe pueden

11.3.3.1 Separaciones por afinidad con particulas magnticas

1. Marcaje:

ftuo.1ih)' Mo;:r..,.~a
-1:~1111.... .-

fo.YIIll llP'lliC111.t ,,

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J!!hCIIt;I'J"' '"l'(('lfll,)<'l

l'f~l.-~<llan ,OIIIWntnmlc lol()ooc\o. loMiall

IOIIII""nliml" uq I'~<J ~~ le .,!lula 'J""' ~ ........ VJII'I" ""


~'"' ~ 101. ...~pi.! m.l.'loiliOO ("f':irw.,,

\'~11.1p1; ..._.liN)

rJ,:ulu, pliH lbk> ttq&Ut1t

Vmtld

2. SelecciOn:

lntolflW'III-

~ mort t\-o. -pcli~ ,.,., .-nmunn (*:a kloJ,. ' '"' !la:eWflio v.pu cu1-

..,.,.!ti'

~~ .-a.__,____.__~----------0.~
tnspmlluwl., _,....~ltliiCt.."" !l:h o , - .,.. d """' " <k a.-ih l 1"1' ......,..,jllo4 fll.ljjf~ ~.

uni.da;a

,,\..,.

~lallpb~~

.., .... ......

" " ...... .,, ;,,., ~ d tu,

b llpCtchiltJ~dik llllt~ l.>la~M~o:oufucK'III lit low

-..u crpcK o"''

CARACTERIZACIN CELULAR Y MEOIOAS DE VIABILIDAD

129

Esto$ proetdiiTIIIef'lto$, oe gran sencile-z y por ello en eJ~pansi6o tlet1.1811men!e ~en uso de microesferas disponilles oomercialmento en variOS tamanos (entre 0.5 y 10 pm. es decw. rt'190015 que las o6ful3$) y con <li$lint3$ posibil~ <.le tl)litaCiM. Esliln formadas por un ma1erial $U~l'Gf~Xlqlmo'lgntico (WcidO drtt l'lieno) reeubiel1o oe una capa fina de 1m t><)limero pl&stlco que permite la edsoran o la 1.1ni6n oovalente de <'if!int.M molculas. Frec:uentetnente se les une un anllooeq>o, P<-'3 IOMlar &'lll'c uetpOS magnrkos o tTNCrotl$(&r.rs inm(.II'IOmt1QI'Itlt.iC<;I$. o bien avldina o esllept8Vldina, protelnas ilrnbaS oon gran artt~idad por la blobf'la (mlcroes/6J<l$ magnlic,,s do <linld<td) Ms <'li;lel31\le se e~tponen aplicacaones Similares de estas microe:S'eras M$9netieas pata la e~ttfaca6n dlreCla de
~idO$ n~~tleh~os.

11 .4 CARACTERIZACIN CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD


Es ..,PQttM!e prooe<~er en esta fase preanalibca a ta caraetetiU~~Cin < lt$ dl1.11as po1 alguno Cle los procodimiento$ diS()Otlibles en la blologla moderna: micr0$~pia ptica, come> putttO Cle ~rtiCJ3 ms obvio; microscopia de cootraste de fase, en paralelo al anterior. para QOSetvar con ms detalle ia supe-rlloe cetular. microscopia electrnica de batrtdo (SEM. de scanninu ~t/Otl nM:;tosoopy). pata <leflnir ia superfiCie celular y la naturaleza de las lnteracoones ellA<K:61ul3. o microscopia eleettnlca de transmisin (TEM, de tmnsmis.$101? elewon rmcroscopy). P<lrtl otnervtu 0011es celulares y exaRW~ar ~ orgnu1o& o nc:k.a5iOI'I$$ Tambi6n sc:t C(raeterizan las clulas par c:itomctria de flujo o el uso de mJcro&$fetas mag.Wdc:011s. lc;niCM Y<' oomenl:.di"'S.
E$ igualmente impot1ante confirmar el estado ~al de lit$ ~Iros ceii.IIIHes duraflte ui'IS u otta e1apa de la fase preMatitiC.a. El COI'IOf!P40 oe vtabllldad ai...OO a la c:apac:iOOd do vna GthAa para realZar sus procesos fisiolgicos y biOQulmiCOs. especialmente en lo que respecta a su mol8boli$m0 y su capacidad de dhl'lslon. Sin embargo, en la prctlca et tarmino es relativo. pue:s 5e vtiil<'l COf'l diversos crilerios. por ejemplo, e CClf'OOn que se l'lable de "labilidad re~d0$9 $implcm(ln\C <J 1<1 intPd~td oe l8 061uta, o Dlen a su acuvleao melablic:a o. tlnt*nenle. a Sl.l taPi:JCidi1d de

diwsin (prolifGraCI6n) Ptr<'IIOCIOS elos eJUSten runerosos ensayos de vlabilk:lad: los ms empleados 50fl

11.4.1

Ensayos de exclusin
Corresponde al recuettto de eJL.Us Que no incorporan un oolor..mo. ,..... Slplicnble 11
<Ciul11~

cooocido es el azul do: trip:ml'l, Ul\ colorante grupos ct~rgndos ammo > ' wlfal) le impidcrl

El ~j..:mplo n:s

lndi,iduaks
(niJ(~Illl)

!oOiubk en :.~u:t CU)'~

atravesar las cCiula 1nt:teta nw:ml>r:tttti.'O celulares IIII.U(;I.ll$; ~Of 131ll), tie slo las cdulas mUI.'fWS
L.a~

clula no tci\ida

o dal\3dls . c.:llll.ll$ 'hu.s no se

titn. pero dcb~ tt'S3hnrsc que el ensayo cl31uls dMn.da s(ll(l ul(lra l.a intclt{rid:d de su .n..'1nbr:tn:l, 1)1) ls

cCi ult~ tci\ids

''o:rd;,do:r.a 'iab1hdad
~ .,clu lar.

130

PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANLISIS OE CIDOS NUCLEK:OS

11.4.2

Recuento de clulas viables por i ncorporacin de un marcador


MtoOo a!tema\A<o, bM&OO en fa entrada de~ COITII)YC$10 a

Ir.!* de la membrana de clulas ln18ctas.


aplic11bk a t:lul:u: indh:ldualol (mu:ro!IOOpa.) y a
l)(lblk:()r)N ;:c"lan"ll
(tns.t.you~n

colonont< (ej.: , . ncuuo)

cluls int3C1~

- 8

plac11 muttiponiLo)

~'\._) ~' \._ )


clula dnada

~.8

clulilleida

" -~

\._) ~'
clulll oo lttlid3

t
ctl~o~IIIS m11) 115
1:~mo la~

H<'''(Q=(~
En algunos casos. el eolorantil (geoeralmeo~e un nuorocrorro) se une a tos ileiOOS nuCieiCOS., en cspcc:;~ ol
ONA.

\"

Eilliflnulja d.: aeridina entr .l librttncnte en t()<):ls l.:~s :lul.:~s. El yoduro de propid1 0 c.'$ excluido de las clulas intactas.

erutando slo en las dal\:t<b$. Ambos se unen al ONA.

c-lula dsi\ada

.g.2

.!

~-elula oon

corno las

r: ' '- )
m~

(ll'l'Seflli:lll f\U~io
lnii.'RS.1 en
~~~

' "" '"''


n(Jcko

11uoresc:cnci;, roja

cluiii"OOo

umdo al ONA t.'1lltl.1SCilltl la nrde del narnnja de acridina


;\mbo!r; compuc~ Ylll ~ltillolliM:IIbtll\.>j! Sil \'l>lfi.IIM:UOI

la intensa nuorl':S(:ecnci.a roja del )'(tdli.n,, de pc-opidio

nromoitk11 plallll 1~;\'~cc In!

entre ICB P'J'."ll. ~ bllse!!

opi13(b; dd ON.A. PQSo..""Cn propiabdQ; lloo~cnt.c'$: al ,;u


~~dl:ldos oon 1 u:t UV C"mit(fl k11. ~isibk

El __,Ja dC' ncridi&.~ C"n-tite uoa lluores~ dC' di.scimo color qn IC tncutt~w uUdo 11 k idos llll(lcio(l5dC" bebrll dob1C" o sencilla: 'v:rdc C4)n I)NA de dobk hebn~ ~<~nos ifUC';fl'DCdioos(dC" amarillo n Ullojn) coo ONA pon:iai A)tiliC' deS1'18turt.1ilado ro>jll coo ONA di: bttlra SCt~Cil13 (desoawrnliudo
compkta!na'lll.'} o tUl RNA

CARACTERIZACIN CEL ULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD

131

11.4.3

Ensayos por medida de la funcin metablica

A etivld.ad n enzlmtk.a-s la llf9Mntio en los ch.ll{lls <)e actividades ei\Zimtieas gen&rlces.. 1&6es como es.1erasas. y deshldrogono~s. petmite ptartte:u e;~sayos oe vlablidad basados Eln la generacin de produelos oon grupos vomlorO$ o lluotloros. procedentes de la ruptura enzimiltic<l de &uttr;alos $in1beos l.Jtt.a anemaliva. per8 llf)O$ celulares concrecos. es la detemw~acin de ooa aclivitlad tfltim;tliea os~>eeil'ie&. en cuyo caso es especialmente 1mpot1.at~te eW!ar que las oondcionn e:q)(lf'imcrltttles afeeter"' 1t diCha ertZirna.

El diaoc.1ato de carboxiOooresocina. poco i()niladO. <ttm,test. l:. membrana por difusin: las tSitru <~:as ci10plsmica.s lo hidmlizan <t cortx>xiOuOc'CSeI.a que, :'11 tener mayor csrga dCccrica. ya no puede 3 1f3\'CS3f la membrana y qu'--da aliUp0da dentro de l., cCiula,

cCiul-n dai\udtl

/"": ' ') ~.J()

..

i '8 ~

~e

tluM~cnda \ct'd

clula coo

~,_e

lart>lt) la:tfl ui~~>'"J~ C<lfll<:l la~>


H)UCfl..t!o fii'O:'<fll:l/) f\uo~n~M
lfll(fl~

/"":'

cCtui'ii'Con fluort.'SCCf\C IIl roj01

1 El yoduro d..: pn:tpidi() SC emplea C()Jn() Cl)ntr.tl>IC, p~JCS (2ir'l<: la.s clulas dal\ndas. A<>i 1odas tienen IIUOI'('S'nda.

.., \

..

("~itl oon:s..-c;no

11 olii(C(.lll.' (k

' 111).( ~ ..~.

~. \

"

!)U(;Cin:IIO

r..nT
(una sal <k lt.'Crazoho). <k colo' amadl~

dtshldroeyna$n mitocondrial y
otras 1\:dut.lls.\S

cclul:trcs

v Mo. ~ un form: de color azul -

@--<)~-)-<"

NAJ)II

?"

@--{~"

s-'1/~u,
(lt t

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( ti

132

PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS

pre&eneia de aminocidos marcados (generMnente. oon "~-~c. 3H o ~JMel ). Sintesis de ONA: ineotpOracln de ooclesldos marcados. Reftea la IA&OIIldao en lerminos <M cal>lCidad de
ereeilrieniO o, m6s O$lrict;)monle, profrforadn celular.
BrdU \~un anil\11;(>
('$lfUCiutlll de dl'. pu..-:; d
uun~ simila:r allk-1 grupc.

Sintesls proteica: Wloorpotadn de radlactMdad a las protelfW~t aormadas dUrant ot evllivo de ~;~os oll,jas en

S1lile al'lalk'

Jc:'lobxtutudwa m3tC*Iu OOfl 't 1 (limkrma trilitrda) al m<io dc cuhnn, bll t~<
i~aiONA

'"N

'l:r J '

Jl...,,

ilomo de Or 1.cne m

melilo. Por ello K i...-otp0111 al 0NA nut:\'0

dura.-e 111 replicacin. en


lu;at de Jf. Se dttta
medi:nle amic-..c:I'Jl(l;
marcad~ CXJfl un

dunmtc 111
n,.-pl.ico;. ~in. rndi~rvild d<:

.S-broo\1).2' -lksQxjuridina 11\JOrol.'romo, ~'ti mtodos lai ttlulas.lkbtd:l (~IOifiiDim::n~ : limtdiN~) (bromodcsoxi...;dina. BrdU) dt intnutllll.li)ttiCOCa o de citomeuU de ll~o a su ONA (~1rdc~ que lia trminn a S-rndilumcilo)
2'dcwllilim idinn

S< tkh."'.':t::l:i

C$1)C'CI.Iicos.. g<"ncralrncnlt

11.5 LISIS DE LAS CLULAS


Esta et<~P<t svpone el P~Jnto de enlace entre la preparacin do la muestra cekjw y la de m\le&tras dt genoma o i c:id o nucleico ; oomionla. pOr tontQ, la faso ant!lli1i(;a. Qut ~e (11 frt!leonami!Jnto ~~. la extJacci6n dlrecaa o el fraoclonamlento de !leidos nueielioos y la fragmentacin del ONA. En general, la isis oeiUlaf se realiza con un me<fiO hlpotnloo; en algunos casos esta etapa es sln'IIAinea con .. preparacin de la muestra (p.ef .. homogeneizacin). La lisis se puEide aplicar tanto a clulas en suspensAn oorno a las 'ladas por achlosin a placa& da oAivo. En la preparacin de cillula& sangulneas e& fteouente &a aplicacin de react)w)s de lisis diferencial (&Oto de detemWISdos tipos OGUares). Asl, pera el recuento y estudio de Mucocitos se lsan los erib'ocilos con un medio cido (por ejemllb. lbliOO de T~k}o una disolucin de doruro amnico.

PREPA RACIN

DE FRACCIONES $U.~ 8,_ C, EL ,U, LA = R=: E ::. S _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _.:_ 13 ::;3 0

11.6 PREPARACIN DE FRACCIONES SUBCELULARES


El prooeocfir'niento general, empleado clsicamente, parte el $0btont~dMtc que te$ulla de 1& <I1$0Ciao6tl mee&niCa de un tf!llldO por homogeneizacin en un merfu 15otnioo y postorlOr liSi$ celular Mediante tef'ltrrlugac;n dlfetenclat se &&pa~an SU08$1VCinl$nto n.,Jc;loQ$, org~UIO$ y Olras estructuras celtAateS.

Disoci.aci6n del tejido


"~""'W<l.:Qtl 01'1
d ~n 1'"lCIn r~ ~
i,.:e.:a~U.Il

1)~ 1\ nutllo:undnal <k I!!W'I\~ o;n l'lC'd~"l;) lolft:" ~ ;~t:.c~"') JJI l)l>o A. OIU~hrill 1 fl OOI~io de ~11>> ~~ (C CP'fiiU par-~ odenulicu md.-odu.;u. oktnmllllll rn;~ohdlld ,nn mal . r ~J.tro:o tk 111 n t:....:Wn ~Y;.mana. e!~

0.25 t-h o

~.; ""~ cl rq ido>. ""J'_..~n6oK kJ,_ ~1\ol~s,. \ ~ l tuonl:l>, c<lu.b-1


m RNt\ cllvp4S.m{IIJ<: ~ 11Uiv ,1 Pllr~ ~"MII\1131

ron u llnlwotJ\10'.> fwnte'll~~"'->

1J

Fraocionamiento subcelular por

centrifugacin
diferencial

do.'to:nn.,nadll proto:- . S< oJct.c- ~ .~r de OJCIV) lfli"'dc R" \. IM('I"Jinlo;!l~ ~- 111l\~dc 11fin idad f101 b cob P"hiMfp.<-.J .. d mo;~;'IOO JNf1lf'lrcnqut !'t CO.llld1a rn!l~ alkbtnt).

O:~jllo:...Ofl ;Id JC!oO.'trO:'IiJI(\Ild!C!l\to: 11 11011

-......f'C'I"""' ,_,.....,

11 .7

TRATAMIENTOS ADICIONALES O COMPLEMENTARIOS

~ntario&

Es esenaal combinar tas operaciOnes preoeoentes y postertO<$ oon W~.a sane de tratamienl06 adicionales o Ellisado <:elult~l M pvecS!t someter ~ troU.mion\o$ Qvo PGYG~ &u dOSlTUocin o 'l:liminen molcula&

ttOn prown1es. etc:; Pt\rt' montener 1~ integrid~ de tas muestr<'S, espeoalmente de blguno$ ~ (POr ojcmplo, p6ncreM y b~o) . se 1\& ese evitar ta aoeil'l ae .-.eleasas. el'ldOget'las (ONasas y RNtt$M), oe ahi la OOII'Yel'lienci:l de

u$ar nvestta$ frescas. mantenidas congeladas o afiadlr lnhOC!Otes de nuC~eesas Para su st*blttacin se acuOe a 13 rotura celular pot homogenelz.aciOn o resuspenSIOn en pteser.cla oe detetgentes, ya menoonados.. y/o al empleo oe disoluoones de Ma luena 61'1iea. Estos ltatatniei'IIOS son espeeial~te i~a..tes pata e.dtaet el RNA. lo <ue 18mbin requiere de fonna especifica ta presencia de agen:es disoaan:es (como ellloclanato de gu.anldlna, lnhlbldor oe RN.-.sas) o rcduC1oes ~ejemplo, 2mercaploetoool}. Para la pteparecln de RNA todas las diSOluCiones empJeaoes oeoen ttatarse ptevia<ente oon dielllpirocarbon:.to (OEPC). que lnacdva oovalentemenie las RNasas; igualmente, se ndll)'en durante la proparaclon de ca muestra y Pl.lnfic-.aein del RNA (:llrQ$ inhi)ldore$ <Se RN<l$<1$. Debe ~nbin ponerse 0$1)0C!al atei'ICion a la ehmnaciOn de cuakpef resto de ONA. gener<*n0n1e <N'Iadiendo una ONasa.
lgw~lrnente, IMIO en la Ob!enein oe RNA oomo de DNA, Cl m.t'lterial de vidrio y ~boo dobe 9$1ar ;;mpleu.mente lb-e de aciaos t~ueleieos y nueteasas. y debe evic:lenten'lef'lte e<vittwse la conu.minaci6n par el at\lllisltl ~e ol uw de guantes y precauaones como el maneto separado de l&S muesttas de dsllnto Otigef'l

134

PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCt,. Y ANUSIS DE CIDOS NUCL EICOS

11.8 EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS POR SOLUBILIDAD EN FASES INMISCIBLES


En ~ill, dttda &u complejidad mc~teromolecular. lOs cidos nuctetcos son dlf tCIIe$ de &epatar de sos oomPOnonlcs de membrana. proteina tNidual o afladida ( l81es oomo la& enzi'nas de restrlcclOn) y ollas molcUlas ~tlles (por ejemQio. poli$3~) . 1.0$ ~ drstioos alteran sus estrucwras y sus caraaerlsticas. De ahl que sean muCh06 lOs mtodos suaves ecacoracl06 para eliminar la imp.reza de tas preparaciones. !Odot ciiQs tNI$<1100$ on la& propedades fisiccK!ulmicas deil cido nuelelco. Para la ellminac:::lc:ltl de prose!nas asoeilldM se uliliu.n cntift'IM

proteolf1icas, como la prole*\asa K

11 .8.1
ambos),

Extraccin del ONA

El protoooiO !>Mico oonsi&t& en el lra'tamiento del homoQenOOo oon <isol\lentas orgnicos (fenal, Clofo6ormo o

Proeodimi&ntos alternativos

aiOOilot iS.IOmilp;Q
1.\k/ffm-mo>

l:lllll'3lnl (atuoeo;J)

t!l('".l.da por agc.a.;Kin


~utrif~a.OOn

meb po1 ~i1ad6n


tl'nlnfupeiOn

'

tnla fa..: ~ (SIIj')\'fklr. lftl.'tl(IS


IIIS flr'(>l toll~
-a)q~ d~'utll~

en la

(~r.lll~ "llOS
di~~

.......,_..
D}I.A y R..'A
~llof~

f~UC

IIClUMII

dr:ooniOIUtllll/.lldM r"' ll~

DNA y tu.A

d.....,rl)l'tl'a(l

~. <OC SolaN) M la illlf~~K

'""' r,.,

a. la f.ue
o>r@llruca (inft'J'I(If.
Q~ll

l~~e~ pf'1111d~. ~r.dil'~

nW &o,;:,. \os llpldof

doror <ormo. ~e
~iui'IM III

"""'

dt mcmlnmo

inb.'IIIe

(orllAnic. (mlb'1or. miu dtn)ll) quc411n ~ IJpido.'Of


dt< mcmhana

(2)
Plrilcad6n por precipitacin
atiNe l'lltct~:bltd.. ti al~ ..lbo:>l
~ullilllll el

1 \'01, de dllnol ~luto o de lS(Iprop:u)C)I (con as,itacin sua\'C)

DNA.quCHI
q11M..tn~:n

funna <k

fibnl~

.::ue se crnoll1m
\'n la >'liriO.

m'""'""'""

al~leiONA
C'll illllltlubl('

11.8.2 Extraccin del RNA


La eXIracci6n del RNA \ambin se realiza a partir del hQmogcnaoo, en prn enci& do iOoeianaiQ de guanldlniO. por adicin de fenol. clorofOITOO y acetato sdico de pHaS, seguiOo de agitacin vigoto&a y eenlritugacln: el#tNA aparece en la rase acuO&a superiOr. A partir de ella &e otJCiene RNA POt proe"Piacan oon etanol. Existon 01ras 16cnicas mM simpleS que O() r~ dicha e.xlf80cin. como 4 empleo de solucionot. 00 t.~r-... y cloruro de litio. <JJO h.'lmC>i6n int'ctivan RNasas y solublizan el RNA.

N=C-S
guanidil\8;
liOd31l310

d..: ttuanidinio:

PURIFtCACIN DE CIDOS NUCUICOS POR PRECIPITACIN SAUNA DIFERENCIA L

135

11.9 PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS POR PRECIPITACIN SALINA DIFERENCIAL


Se 1ril!<t de ""'prOCO(Ilmoet~to al!erl'l81iv0 al al'lteriOr, baSaOO en las diferencias de SOlUbilidad de ONA y RNA en funCIn do la c::cncen!r3Ci0t\ (le $MeS: TaniO ONA como RHA !101'1 solubles en disolucin saliBa conoentrada. mientras que a baja roncentr..ci6n de $<'tle$ $010 0$ $(llOie ti RNA,

,...--,
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-..lubili,.,.

~ ~.....: -~ ~

... t""'-'1

...

Pata es18 preopcacin &aitinit &e SUG!c util~~~ ~~ . PCtO puede 1nmbin e,..,.enrse aee1ato Sdio::> sarurado. en oombinacin ron ilfooholc$ org.Anics, OOtlducieldo a resu!lados ind.Jso MejOres que COtl fenol y Clorofotmo. sobre lodo para cantidades pe.cueilas de ONA.

11.10 RECOGIDA Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS


Uno '19l 5Cp;)r000S y eJtll81d09.. k:$ &ciClos nuctetcos deben ser conaetY8009 adecuacamenle. El preopitado seco de tu;idO$ nvc:leico$ o el "&vilO de fibras de ONA obtenido oon la varilla pueden disolverse en disolUCin amortiguadora (O!II~Iif\3, en e1 caso oet ONA} y conservarse a 4 OC. o diSOlverse en agua y mantenerse oongelad06 para posteriores mlni~ioi'IO$ ~~imlttieas. El ONA geoOmlco en diSOlucin no se debe congelet, para ev!lar la rol\Jra de las molctJas pot 1as IUetZas de cizalla provocadas al solidificarse el l'llet) y al descongelarse. Por el oontrano. el RNA si puede conservarse OOflgelado a -70 OC en di&Oiucin acuosa, cuidando de atladir un ii\ID:Ior de Rl'fa<sa&

11 .11 PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS: EXTRACCIN O ANLISIS DIRECTOS DEL ONA


A voQ8':S. no M pO$lble vmiur 1os procedimiet'lk>s deserllos. Ol()) el bajO eonlet~iCIO et~ ONA oe atguno$ I'I'IVe$1111$.

pem, $il'l emW.tgo, pt.l&de ~Wdiarse el ONA de la mueslta Sin l'leCeSiCiaCI de mMipui$CiOn alguna, salvo lt'l liSis de las Clulas. Este es el caso de la amplificacin y detecCtiOn del ONA mediante la lcnlca de PCR (vet tema pos~arlot). Por ocro lado, cada vez es ms frecuef'(e y etlcaz: la exrraocln dilecta del ONA con mtoctos mas espec1rw:lOS. lclles. rpid06 de realizar y fl8bles. No se requiere la manipAa.cin previa de la muestra. oon lo que el ONA y RNA se pueden exlraer de fonna directa a panir de mt.teSITas l'letetognea& y de ~o volumen Exh;ten varios procedimlel'l!os. Para muestra& forenses se na descrito. con resoltaclo6 prometedores. el empleo de un intercamblador inico {Chelex) y una suspens<n de partfc~Aat; de slliott como m;Jteri;lle& de dsorcln adecuados para la extraoc16n <111ecta de ONA, en especial mitooondnal Tambin se utiende el IJ&O para pruebas de idel'llidad de la& t81jefas FTA. papel e:spec;ia!I'I"'IJe; tratado que PQfmite ab&o~ uno mvo&tr~ (gota d8 $ilogJG). i&ar sus clulas y diJenr sus JlfO(elna&.
quedando., ONA int.,eto fijado en et p&()el y asi se
~ conservar indellnidamCf'IW: '" 111UHir3

Tambin se e~n cada vez m&s mioesferas magl'ltieas. analogas a las de separacin eetu!81, SOI:lfe cuyo superficie se adsorben dlreCiamente lOs cidos nuclelcoe o se unen de forma oova1en1e otras mol&culas oon allrtldad pc)r f!Bos, So consiguen :tsi m6kX!os ~ de f!.Klfbedn que se pueden ttplic<w a untt ampi.;t vttr~ de mve&tras (1ejldos at*n&'e!l o vegetaleS, clulas culbVaas. suspensiones ooUIWes, etc.).

136

PREPARACtN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANUSIS DE CIDOS HUCLEJ COS

EMr:.tc.:-in
du-.:.c;Lu

I"..X1ra~;c(lll du~l~

dcmRI\A

dcONA

cuca61ioo

umn llll; mkn:o.:J" ,..,.

:qfll la ~t6t1 lk b

;;

ICJ!IPI'' 11

11.12 FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCL EICOS 11.12.1 Ultracentrlfu gacin


E.s1e mtodo se basa en ef aumento do Ji voloc:id;td de $edim~tadM COt campos centrifugos lo s.uflcaentemenl& anos (5UI*l0' a 100 ()()()g) ~Qmo per.~ supetar las ruenas de ditusiOn. Se emplea en espeaal para el ONA, tAAtc> con fine$ pu)p"r~ivos (gran CMidad de material) como analftloos (peque!\& canddad de material)

11.12.1.1 Centrifugacin zonal


Oe forma sm1l<1r il b c5tuclado para la .separaein de tipos celulares se p(lede emr:le8r e6&8 modalklt~d de contrirug.&O!On sobre grad.antes de densideo 9<lfS separar molcula$ de cido nuclciw, en fi.IN:in do su velOcidad de sedlmentaao (definida por w coeficiente de sedimonlilc:iOn. en uni<*Se$ SVOdbetg. s._ Se tons~ que las mc::tculas de atldo nuc:tetoo sedmenlen e velocidad con~nle. coo lo que M .-ut'n en Wttdit$.. eu)'tl PO$idtl depeMe dell.amaf'IO y forma de le molo.lta slil' M P~Jctdon fO<l09et separadas en !r&eelones {pot ejemplo, por ponocif'l del fondo del tubo) y cucm11brs midienOO su absorcl6n a 260 nm.

FRACCfONAMJENTO DE CIDOS NUCLEJCOS

137

11.12.1.2 Centrifugacin isopicnica


El mfOdo isopeenioo o ~ equillf\o de sediol'l'lenlaCJOO es qull& el mas ulitl:ado 1)81'8 la sepernOIOn de disbntoS aodo nueleleo, en espee181 ONA. Rec:uef'dese que en este caso. las m9Cf()(l'olG\.Gas se .separa!\ en funcJM de su densidad gE!'(IE!ftllmente usando un gradiente qua se va formando dutanoe la ultracenlnfugaci6n a la 'VQl que se sepsrnn lOs eomponentes de la muestra (gradiente autol'otm.OOO). El mediO habitual para preparar el grad1en1e es una di!IOfucibn de doruro de ceSIO que. gracicts a su alta &OIUbilidad y baja vi$0051dad. permit formar gradientes de un amptio margen de densidad. la mt.Mt51ra w men:la con d1cl-a d"t$Oiuc;in do C$CI V se prCIQICio <1 la ultrKOntrilvga.cin durante largo 11empo (tloms o diast. hasta alcanzarse el equilibrio de sodimel'!taciOn Cad~t (ipo do cido 111JCI81co se SJ!a. formando una banda. en aquela posicin del gradiente donde la de!IGidad del fl"<1o ~ a la de la mofc:ula
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Eidnplo M urlie~~dn dt la t~'(l\n(ugadiln lsop;mo;;,, Al~unus rcgi(lfl~ "S dd gC'n~lfllll es4iln (ormSIXlf l.oa repcti~i(ln <k !fuencu'" c(lf"'n .. n ..hlltl, n ciJo. s:u ~omJ'(lSI~iOO de b."i<;c,; nrlrt"go."fl~ es <hr~TCnt.;- !k lu c::l ~ti~ del tc:cnoma, <t\1<' c.: mi1s promc.:b:l(b.. C'cMI11) M'IM'tU~'fll'lll. cuanJlt....: lragmenlil d UNA l<lt al y .w :u'l:~lv-: ..:11 ~l adKtltc~< .J.:
di!'IISwbd !k t:.CI. l.!ll fnttn~,~~~ piOCt-drittc:. <kll4' ONA .ahanlctlh.: t<:j)CtitiHt se ""P:tl'*n de la batida pnncipL fomlondo ~J,.,,,~,, sar.Wrt. , : de uhi \ ino el nombre d~ /).\' 1 wtll/tr, (di.':!CfiiO en ~1 1 c-m11 <k 1\~unt:-adn dd ;cnon\11 > DNA rqo.-snhtll ;nldlr.:ll!C d~ (OIK'CI'IIt<IC Iil

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11.12.2 Electroforesis
Como es bien sabido. esta tcnica .se basa en la capacidad de las macromoleculas catgadas paca desplazarse en un campo elctrico. con V91ocltf.ad proporciona1 a su ca~ e inVGI'$iiiiTiente proporcionat a su tamal'lo Las moieulai de ONA p()$con, 011 pH ttlc.:<~llno hilbil\JIII 1.1nt~ (;;:tfg<l neg;)lwa uniformct por UNCIOO de m<JSa, ro que hace que su movlliciad

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138

PREPARACtN DE M UESTRAS, EXTRACCfN Y ANLISIS DE CIDOS N UCL EICOS

Mci3 e1 nodo () slo verva Ck!lerminada por e1 taMafiO e kl f'I"'IO&&Jia (I"Uneto de pares ele baSeS, Si es lil"'f!ffl). o.!lle destac819e que 109 CtOmOsomas eucarlo&as son demasiado grandes pera ser idet6lcados por este ~ de anlisis. por b

que cocn'lnmenre se aplica sobre ONA hgmentado oon ru::teasas.

11.12.2.1 Soporte para la electroforesis


La s.eparaoin 00 los fr<lgmeflk>J de ONA doblo M realizo ClOf elecl70b't$is on geles de aQalr0$8 (gonora!menee en horizontal) o poliacriclmitt<l (oomUnmentct en vertical). En al'!'lbo$ Ca$0$. el 9e1 te prep3t'O c:on distintas concentr.cioncs en funcin del tam"o de tos fragmertiOS de ONA que se QUieren tepatat. Los fragmentos tnlls pequeos
(npron~enlb hM!a 1.000 (lb) se pueden separar adecuadamente en gMes de pollacrilan*la. para lamal\os algo "'*YOres (li8Sh.l 20 I<.SlO) se usan geles de agarosa. Modil'btldo la oo~entrac& de acrilamlda o 898'098 se oonslgue vatiaf el intervalO de tamanos que es posible separar (rNOIIJcin),

11.12.2.2 Deteccin del ONA tras su separacin ('(revelado" )


Ul\3 voz. seoor~s.. IM mol6culas de ONA se visualizan normalmente por aa fluoresoenda de distintos oompues105 que se unen a ella'-. Aunque el mas t.dllado e6 el br'OO'U'O de elidlo, va &lencto suslituido por otros flOOt'OCI"'mm& oon mayor I)OOef de deteociOn otnenOr toddad. Bron111ro d(' f<tldJo: AgCfltc inten.:<~bote. k mtroc:l...ot ~tre l t~:~ t:K~ aJMI~Ias d~I I>.NA, .sbrt un

poco la doble ~licc. provoca un dc:s<ru'oii;J~mielllu ~1 .

dcii)NA. ei~i.slmcP!c usado ct1

oon UV): mtOOo de tu~ein o r\"\'dadct

Su ftUOC\_'SI.'dleia aumcnla mucho cuaado se une al ONA (ookw ""rnqja bl ilumin.illr


c:ltroforc:sis y en tt.nlrifug~Cin,

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mollii:JVI< ~un Pll."ffll(1(lft IJO.I'QlO.'
pe>~ Ulr~CIC'I "111111~\'ntCO

11.12.2.3 Calibracin de la electroforesis para el clculo del tamao de los fragmentos de ONA
Las molctjag liooales de ONA doble migr&n on 13 eJoctrorOfeSis a una velOcidad lnversamenle proporcional a su tamar.o (dentro del inaervalo de resoluci!ln del gol tmP*'<IO). ESIO petmlle estimar la klng!tud de los fragmentos estudiados.

Se: Af!loN ~n ..-o llc 105 pocilkK del Id una


ltlo.'u:lackt ~~ ~ O.~A \k: ~IJIIII(I
ili)IJtCCo,
dt~ ll)fl'linod>Jt~, ~~.

..rnoll:'ildon'l; ok pco.o mulctul;ar" u "eltllkta


DNA" (L)SA kMMr) .r~ ~~~ ~~~~
~ la ckxtroi~u<. se tr~o'dm )'le klf~IA j)QU. Uld.ts lo hilld.u rl kl~lm.'l dd bmll1o Ounl!"llo! tn pb) le al !opri~a~e~ d.: l;~ ..,vil idad

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(diSQno:lil. i!VllbC'tJ, Subrt~ la tC'tUI ~llllth w ifdtii'OIM!Ias .is1 ancias de a~ancc .X la$ mueoltlls p-obltma. ~~landu lui u lan~o;~il(lo at )'lb. fe "'," (IC:mplo. 105 JUCmfiCI .:rn~d010 l(Ofl f~1010 bit:t~ CClllt)(oJoo!l.. aqu~nos ~~~ 1 wtlr del ON A do:l '\'irus ). pur la accia dt tao <neklnudo:a:\ de reolrio:d.S. I:.co.>RI '1 HulldUI.

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20

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SO fO ?O 80 100

Movihtad (mrn) (etealaiOQIIWII.II'-ce)

11 .12.2.4 Eleetroforesis de campo pulsante


Las rnolc4Aas o fr<'g~os Cl6 ONA de longlt\KI superior a 20-40 lq)b no se PVO<Icn reSOlver (sepatat) etnpleaOOO 19 91ectrolorosis c;onW!nc:iot\al et1 gel de agarosa. EfiO se debe:. en prirTM~J ligar, a la dHIOJIIad de manejo de los geles preparados con las bajas ooncenb'aciones de ~ <J,Je requeririan (Inferior al 0,4%). Adems, &as molootM de ONA. que adoptan una conform3Cin mb o menos giOtlulat, poGeen un lamatlo exoesivamon1c gf<'lnde p:,ra a!n~vesar los PQfO$ del gel y no sa sepatan en funcin de su tamallo, Para $01YOnltlr este l)fOblema se NI Ideado una modificacin de 1a teeniea. eonoaa oomo e6&cttoforesis de campo pulsante (o Plft&CIO, puiSedJiefd ger ereCU'Ophol9sJ$, PFGE.).

FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS

139

Se emplean gele& de agal'()l;a al 1%. P8fO se a!teta

peridicamcot~ 1(1 orionlon del ta~ o!ctrioo aplicado. activando allernativamente dos pares de electroOOs. El frecuente cambiO de direcei6n del campo elctnco con5igue Que la5 molcula& &e de&pJieguen y avancen a travft de lo& poros en oontormt~c:-6tl CKtentida A mayor tamallo, &e rconP.fllan con rnils difiCultad lXlf lO q~ avaruan ms despaciO. ASi se conSigue !W!9&rar fragn'W!fltoS de DNA de hast:t varias nw!gabases, lo que S41pone 1M'! a"~Snoe sQntlcatlvo pero an no sirve pera e&tudlar tos cromosomas humsnos enteros (de 50 a 250 ,..Cb cada W'\0}

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1.'11 fUDCIU dtll.lll'UifiCI

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l.<l$ muestras nan de cont(lr'ler et DNA sin tr&gmeMM, por 1 0 que 1'10 sirven las de ONA purif!C&CIO. que geoeqlmerrlc ya se NI ftagtnenlado ~ debajo de 100 k:b como consecuenci;) de 1M fueq:as de oalla durrmt e lO$ m610dos Mbiluales de aislamiento. Para oate.w preparaoeioMs con lOS cromo$()m3$ itltac!OS se mezeiat\ las c61utl'ls con agarosa c:aMinte (37 11C) y se vierte en pequetlo& mOldes de tn:lS m&lmetros, <le forma ~ ai SOIId!l'icarse la ~a (.4 -t) forma blOQue& ('iniettO$) QI.Je incluyen la$ olula& int<aoctas, En s:t06 se rea!ila la i&i& celular y diOG<Sbn de 1M proleinM (p,e. oon EDTA. SOS y Pf'O~& K, que difunden tt lr~\'6$ do lO$ ()Oros <Jel ~)$in ..rtornr las gratlcles mol6<;ulns OC DNA. Tras una <'iMisi$ para elimir\af' lO$ re$tos <Je 1 <'1 <'igo$tin, sct consig..~~& un f:liOQve <5c f!gl'lrosa con el DNA intacto fl su inlerior, que se cfeS)O$ita et1 un pocillo del gel de electro~ .

campo&. est06 mtodo& slo son apropiados para separar cidos I)IJCieiC06 en algoo.as aplie<teione& Por e,emplo. en ooKwnna& relena:s de hidroXNJP<JIJlO se te(lene por ad&oran el ONA d9 doble hebra. y con menor trllnidad el de net:wa senc:ila La crom.'Nogr(I/"IJ.J d6 irlfooreambio inif;Q, utili~ clt\&icamente pat<t sep<trar protelna&. se ha convet't*:to en un m610do a!terntii1Yo pan~ preparar DNA de alta J)urcu. ~ torrnl\ rns r.\pida que la GKtr<I(.CJn orgn~ o la cenlnfugacin en gradiente de CsCI. Las columnas con resinas de w ercan'tiQ aniOt'lioo (C8f'93$ po$it1v3$) tt!ienon el DNA (cargado negativamente) de{ando pasa~ olfa& molcas (ftNA. prO!einas. ele.). Tambin M omc*itala ~itl <*1 pt'ra fraccionat o separar RNAs de distinto& amai'los. estrucrura y TunoOtl. Por ejefi'C)b, P3tal)l.rillear mRNA a partir del RNAcelular 601 81, $e utiliz;)n t;OIUITirlil$ de oligo<rf-celulo&Ol o de poiiU-Septlarosa. que rellenen el mR:NA a ltavs de la cota de poi(A} de este ;)(:ido nuc:lelco, de lorma &imiar a lo vi&to en el ejemplo oe exlfacC!n directa con rrkroesleras msgr.Mlcas.

11.1 2.3 Mtodos cromatogrficos AunQue ampf.amerrte utili:z:iiOOs en \oda$ lo&

.,rmkJ,,d

Tema 12

Replicacin del DNA


12.1 CaraetfHfsUeas generale-s de la repUcacin ................... - ............................................................- ....... - ...... 12.1.1 Can~ccet semlconservador .................................................... ,.... _,_,_,,,_,,,._..., .... _ ,_ ,_ ,_.,,, ..............,_ ,_,_ ,,,. 12.1.1 _1 Oemo61radn expe:nmental de la replicaCIn semconservadora..... . . . .......... . ....... . ... 12.1 2 SintesJ&simu!tnea . sewet~c~lybidire<:QOnal ... .,,,_,_,_,_, .,.,_,_, ,_, ---- ---- ........ _,_, -- 141 142

12.1.3 Inicio monofocal o ,._.!tifocal ,,, .. , , , ........ .......... . ......... ........

142 l44 . .......................... .,_ ,_, .. 145

12.2 Enzlmo1011Jia de la repllcaciOn .................................................................................. _......... _.,, ............... 145 12.2.1 Requennientos de la reaocin de slntesis de ONA .......................... ................................... ,.,._, ... 145 146 1222 Moc;tni$ti"'IdCI~r~On. ....... 12. 1.3 Olreocc:iOtl oe la slntesls ..........................................................----.. --. ---- 146 12. 1.4 Tipos de ONA pollmerasa~................. ................... ............ ...... . ........ ......... ............. ... . l.t7 12.1.4.1 ONA pollmerasa~ procarl6tlcas: acttvldede-9 pollmetasa y exonudeasas ......................... 147 .. .. 148 12 1.1.2 ONA polmeJasa~ eucarl6ticas: actividades pollmetasa y e~Conudeasa ...... . . . . 12.1.5 Vetoacla<l de replicacin _,..,_,_,_,_, ...................................................................................................... 149 12.3 Etapoa5 ~n ~1 pr~so d9 r~pli~;:a~;:in ..............................................................~....................... M~""""""'""" 150 12 3 1 lnicit'QI'I , , ,_, . ---- -- .. 150 12 3.1 t Q.-tgor-.s de replicacio ................... ......................... ............... 150 12 3.1 2 ~il'lt\$ inieiaCi()(l .......................... .. ........ - ..... . ...,_,_,_ ........................... 151 12 3.1.3 COnexi6n entrt la inioaeibn y lA elo~i6n : pr(Jicin~s nete$<tn(t$ .............. 151 a) Helieasas.. .... . .......... ...... . .. . . . .... . .............. . .. -- 151 b) Protelnas de unin a hebra sencilla ............................................ ----. _,_,_,_,_,_, .. , ... , 151 e) Topo~Someras&s , , , , .................................. .............. 151 d) Prirnasa,.,_,_,_,.,_,_,. --- ,_,_,_,_,_,_,_,,,_,_,_,.,,.......... ,.,_,_,_,_,., ................................ -- 152 .................................................... 152 12. 1.2 Elong&eiOn., ..........,.,_ ,., .................,................... 12 1.1. 1 A$imctri3 de IV rOCJiiect(iOn en MnbM hebras .................................................................... 152 . ,_, .. . . . ................. 153 12. 1.1.2 Meocanis(n()oe 1a elong&eion. ...... ... 12. 1.1.3 MdJNiciOn oe los rragn'le(ltOS de C*tunki.. ....... . --- --- 156 12.1.2 Tenninaci6n ............,._,, _ ,,., .............................................,., ..... -- . , .. , .. 157 12.1 2.1 FNI de la elongacin ............................. .......... ...... . . . . . .... . . . 157 12.1 2.2 Repicacln de los te10tne-Jos ............................................ - ------. 157 12. 1.2.3 Telomerasa: componentes y caracterl~t!c:as ............. -- ..... -- . , . 158 1 2. 1.2.4 Mecanismo de acciOn de la lelomerasa ...................,.,_,_, ...... --159 12 1 2.5 FI.R';ionaidad de la ae1iVId<td lelomerasa en las celulas . .... .. .... ... . . ... .. .. ... . . .. .. .. ..... . 160 12..2 Repl icacin m itocond ri.aJ ................................................................................................. ~............................. 160

oe

12.1 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN


La repliCaCin es el proceso. eoneeplu:l!rnet~le sencillO I)Cro molocularmente oomple}o. mediante el cual a pattir de

una molcula de ONA progettltOttt o P8fe(lt8i s;e sinlotiz<'l un ~a. originndose asl dos moleculas de ONA ~111$.. O& secuencia Idntica a la deJ DNA original E$$0 permite ot 1)3!$0 de la n formaCI6n get~tlce a la deSOOf'ldenc:ia (131'110 <M
una clula oomo del incivlduo).
Au~ la repl~on oonsbtuye el aspecto ese~ial oe1 metaboli~<mo dol DNA, la~ w deben con&detar oomo patre del mismo (!(ros prOQ!I$0$ directa o indirectamente re-.lacionado9. la re-eombinaciOn o r~(.'n<imiento de la lntormacot~ ~tiea . la mutacin o llllert'Cin de ~secuencia y la reparac-In de las altetaciOnes o daf'tog et\ et DNA.

142

REPUCACfOH DEL ONA

C(!HJUnlodc
n'I(IUbo.)l~

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ddDNA

La repllcac:i6n &e produoe de fonna ~da con la diwsl6n oelular (tcwn;~ 9), ooncrolclmentc en la f<"SO S. dlsante las inteases preVICI$ t<tnlo ~ 13 milolli:s oomo 4 1<' mciosis 1 , do Jorma Qut, en et caso de la mi&osls, las dOs clulas hijas reo"bc:ln la mi$11\;t d0t3Ci6n gentiet' que WW'loia la 06Ua madre. En cuanto a la meiosiS. puesto que da lugar a cuatro <:lulas hijas. Ja roplic:t~CIOn previtt permite que tostas tec:iban ta mitad de dicha dotaclon gentica. y no una <:ui!'r\<1 p;~rto (pAg 104). La fel&eiOn eftlfe el est.BOO de repllcaciOo y ta progresin por el ck:IO oeuat se puede resumir en k)S: siguientes principios genet"aleS: EJ lni()O e la teplicaclon del DNA oblga a la clula a emprender t.rta divisin. una vez .-.ciBda &a replicacin. no puede tener lugar la oonsiguierrte divisin hasta Q~ se 1\;ry<' ~ado dicha replc&cln. En teelldad, el final de la replicacin oonstituye PO$iblomonte t.II'WI $01'\~1 ~rtlla dMsiOn. EJ proceso de replicaci6n se lleva a cabo sin ne<:esidt'd ese ur\8. sepatael6n oompleta de ta C8den8 pt0gtet1itora: ta
doble hlioet sc desenrolla gnduarmente y sus oos hebras se van separando a la pat que &e prodUce su replicacin Antts de esrudlar bs detalles moleculares de la sintesis de un nuevo DNA.. procodo ()nt'!iZ;ttf ~$ ec~mdorl$liCM l)rinclpales del I)I'OOOSO, atendiendo a un criterio eminelll.emente didt\c:tiCO $1&$ $0n: eariiCier umlconsorvador, ro;tlil:<'lc:in simultnea en ambas hetlfas, de forma secuencial y oon carcter bidireccional, y ogen moooiOC81 (proeariolas) o mutl.lfocat (euc:erlotas). Otra cera~eri&tica de&&acada. el a-r;ictel' scmidiscontinuo. se e:xpliec'lril una ve! que se conozca el mec:aN:Smo de la reaocln.

12.1.1

Carcter semiconservador

Aunque tericamente SQn I)Oslbles tres mecanismos para la rep!icaci6n. oos oe 410$ $0n hiPOitieOs y pronto se domostro que iOio el tetoero tief'le iJgar en las clulas
R~lk:.cln semiconservadont

Un complep enzim1ico reoorrerla .. ONA. 1'9C0nociondo


lA socu~&neia en ambaS nel'.lras

EJ ONA l)rogenllor se tOfi'C)ef1a


varias veces antes de que &e *'leltz.aran lo& nuwvo& fn'lgmeti40S de DHA. !:.9:105 se uniri.(ltl al DNA progenitor para 43r lugar a 10& dos ONAs hlf06,
31TCX>S 001\ tragrnen1os tanto

para oollilf1as simultneamente.


de forma que el ONA pr.nilor de doble hebra &e conservarl a intaelo mientras que el ONA hijo CCIO'Iendria dos hebras totalmente nt.oevas.

nuevos como de las dos hebras del ONA progenitor.

Es el mecanismo real. Las d06 hebra& del ONA progenifol" &i,....n de triQik:Je pt\r;J 10 & n osis ese sus resp&etivas hebras oomplementanas. Cada ONA hijo est lormado por una hebra proge.nilof'a' y olla hi,j;J {recin Wl4elizada}. El mecanismo se ropite en sucesivas generaciones de clula& Et nombre alude, precl&amente, a que siempre &e conserva ti mil3d de 1;\ rnoleda or!gl!\81.
1.11 ttpli.:aci(m

m~.:ub

u-n~>C>."ln'Ct\'li&'lll*

1lt UNA
pmtll'flll(lfi>

dd DNA e~
rohtn:~~C~e .:.-d

fl'l(llklo de <k>bl.:
~

..

,. .....

......

...

.....
lujll

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN

143

12.1.1.1 Demostracin experimental de la replicacin semiconservadora


El
mecat~~Smo real de la

repllcaclon liJe

emo~redo pot primera

ve2 txW M&!l'leN

Me~n y

Frar,khn W St:Jhl en

1958. mediante experimemos m.ay eg<~nles. &ll'tCillos y representa1ivos de muchos otTOS reafiz9dos en dWersas ateas ~ ln BiQiogt Molceul<~r, .Au'rqu" IQ!I a~b:l$ molo0Jiar8$ de la n:tpllcacin rueron G&tabteciOos po~eriotmente con e:1 f:SbJdro <$~; 1~ ONA p(llil~~. el e,:l)eM'lenlo Mesolson y SWN lione ~nters. IIP<If1t~o de oor w orop~o diseo. por habor sido 13 prifOOr<J vol. qvo $0 ~plicaron tanlo la tcnica de sedimet\1aon et1 gradiente de densidad oomo 18 IntrodUCCin de 1$0101)0$ en 1;)& mo1 6tul{!$ 01: ONA ( 1~, inrrocoon~. y 1'N, Istopo habl,ual) Para comprender lll novedad y troscendel'll;:i& ~ t:$10$ ex~oa en $1.1 momeniQ y cont(lldO, lS4t v.-n a; considerar loa ant~e$ y el plat\leamlento antes de descublr el reSNfladO, So vproY$Ch3 <tSI este eJ~W~plo para lll.lst.rar el mtt!odo <:lenl jf\oo, en es,pecaat oomo un dlsel'\o adecuado del ex>Mrnento, que XI~ sirnplc, permite Obtener una informacion notable

a) Antecedemes
El pnmer lugar $e eJiamlr'la la po6lbAidad de aptcar la l&ctllca de equlldlrno de sedrmentaoCIM en gratlierrt~ de densodiKS, o 0$1\'!tlfvgacjOn JSoplcniC<t (~ 124 al anll&ls de mue&.~m de ONA cuya densidad es dlle!ef\te por eslar rn.-rc..tlo o no oon el is61opo 1~ .
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b) Planteamiento y diseo del expedmenlo


5N y su al\ltli$1s- pot cenlnfugaC'IOn tsoplcnka, se dr:$efl0 el AQ!Icando eiUI l6et11<:tl de m.)t~l~ del ONA oon 1 ellperimento de torm...'i QUot lo$ ft;Sv!l.o."'CCO$ u111on~ permitieran difenciar oul de las hiptesi~ era la .correas

(!) Di~o dd experimento:


S.: cuJII"\'oMI ~In!;~,; de F
<YIIII!aofm~

, ..'11 J( 1COOI'I'IO) mi.:.. flu,:1110: de tUI~'fNW

ll11ll:l!w.!1CII<'I.ICXIIM:~ ~ 1111 rntoJift 'f!l

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Rl:PU CAC.ON DEL DNA

&JO 1~ bipOI:csl> de: rtpl~kln \."\lft.'lft'\ adora:) ~JCOOStf\adora.. ~ n:--.u~ fW"C'\ ~>.tbao scrun. compantt\ -arn.!TIC'"

,.,...._ _

\\ll'loflk nu 'loe 'ln."l>"--ntJin. loi rnultadt~. lill REPLICAC.oN DISPERSA.~TE babri.a (lfl'lb: ~ n11~ua.. de 0' o\ +;:01'1 ltteidaa fcjIIOfia de lllk;l<'illll~l<> l"h'!"flllllfU) IWUo. ...S. tsdlx"it, ftl IOJ 1 Jf~ntoi.Min UN 'lt\1.1 Nnda m

11\lenn..,:hn \"fltR' l;a :~nlem1r )' l.a lkl hVCI\1)

el #l*fimtc ((lcnsKI:Jd ll'll(fme,b.t ('n(f\' "'"Jdu )' lttt<'fO) )' en ht ~CiliO""'" Ultr.a ~o~1l.1 Nndt llklbldad

e) Rosullodos obtenidos y conclusi6n


El rtkiii.IW ob64111'Vi!l6o lA ,.tllllt"r illll)lriml!lf'IIO tue de una banda de DNA 00 ~lOM Wltetmedla en la primera on ._ stgunclt OI'*8CIOn Oe deo:5idadet: baljt, 1 IMtrmedll /IJ oolncidir los da&o& ~1M c:on lOS re.aaOM PRW~tltllft dt l*1f otl'1(;hal de ltllgura, se eondU)IIO QUt t1 h iptn ls ~es Ll ~..,....adora es deCir en a ~~del ONA tilda una oe tas l'l'lOtec:aAas t\ttll conMrvl ~,_.del DNA Pf'OOl"'*W ., en hetn de ~"MM~ Sif'lleiM:
gtntfliiCI(.)n de Cllula& y dtls ~n~

'*"

12.1.2 S ntesis s imultnea, seeuencll y bidireccional


O. ate la ~ ~ "**"'omo 0t
OONtviOal por primera ~ en E 1#11*0 igueli'Ntlet . . . pera eucariotall (,..,..1 11 MCIOn 111 medto de cultiYo CS. lin'tdnO lribldrit ~~ ~r el ONA dlt ~~ til'le.it 'f lllegO ~riO pot IMIOdOa ~tOgrMiooe)

a.

~ ~ ~

carac:tesocas

U tln41fif no c:orn.enza al azar, alno tl'l punlot conc:rft)S de ta molcula. denOmll\ldot ~$ di ~adn En ~ uno de ellos se produce la apenuro loet,l dO 1 doble hlice y COf'Ntf'IZI 11 'Nfltl/f .J'flM't61W de las dos ~ hbras (no~ oonlwdrse a~n.neo oon el t#ltCier cotttlnuo cte la sn1e14 dt Utl{l to'll: dG 1~$ hebras,
QIA M

Como
U

~ de las nebra& progei'IIICWM. QUe ~ en 'Cada ~ ~ tn ~ dlf'tiC:dones.. por lo QUI M d11 QI.Mila ~~!K~ A lot p!,ll"'tcc& de Ir~_., dOtlle hebra 'f l'llltns ~-M

--

..W<,IJ.IIfil ms adelaNe). conHCVenC~a aas dos hebr-.1

f!IWw'M .. van alargando progreslvanwMe, por

~IOn teeuendar

de

,.-.....,..._no debe pa

tcllllllmt IOQuiiN dt~A'CII(Jft. ., ......."ldoM ~Si


M por

.,........o, con
en ....W05

Ncno

de..,.

~data I'IOI"quult ~en ...-.eso~

dedo..,

In 001 ,..,_del OHA ton . _ . .,,su c1t l '*- 5 y para la on

___.. 3' f 11 ~en

on h0nluel1

para_.,_..

E.NZIMOLOGA DE LA REPUCACIN

145

FORMACIN Y AVANCE OE LAS HORQUILLAS OE REPLICACI

en procariotas (ONA circular}


~llflllllr.l

en eucariotas (ONA lineal)

"';::lll ' ~::::o~;:;sr;..~n

II!Jt:"' ok onkov 11

'
K1 Jto K, ~*" Vfl)lt'l'l d! lutJf ~ 1-o inll;wo ,t.; un q:t\ln J;J 0 ' \ unidad run~ic>nal <k l'tf'l ic'<Koi>n t> n'f'h,-

>MilC">" '(I.;IIC!IC>.il.
. . .. .11!'>

btillrt\.-.;M!I! ~

.A ~~;;;::;;;;~"-~

~--

1(

12.1.3 Inicio monofocal o m ultifocal


En e1 cromo~ (;i~ titlic:o e or~as '" re(llicacin comienza &~ampre en oo ~o det.etmlt\a(fo. dei'IQr't'linaoo origen (y mareaoo corno o e); se <liot Qve la ~icacin es monofocaL En consecuencia. PfOQffl$8 fOtmando dOS hOtQuiii:'IS de repic;aci6n. PQf ol oontmrio, on 4:1u~s la replicaCIOn es multlfoeal. ptJes en cada uno ese lOS cromosomas e.xiSien mU111ple$ Otigenes de t~n (centenares o mieos), QUe dan lugar a oo nmero ooa~e oe h()rqullas. GraCias a euo se 1\&Ce l$ible ~t'r en un OOmpo razonable la reprk.acin de los cromosomas. muehO mas largos que en procatlotas.

12.2 ENZIMOLOGiA DE LA REPLICACIN 12.2.1 Requerimientos de la reaccin de sntesis de ONA

Cebador: La s.JntesiS <'e una l'luev:~ hebril de ONA no puede oomenzarw a partW de dos nucleOildos.. sino que requiere un fragmento de hebra iniCiador, <fterl()l'nit'ladO JbtJdor. Que aPOtt un gf\ClO 3'-0H ltbre. Se trata de ul'l ofgonuc:lecido. pot lo comn RNA. que <1e0e estar apareaoo a la hebrJ progcnrtora de ONA. de forma oomplementana y anttparalela. Por 1anto. se p\IE!de decir Que ~ rcplicaciOn no e:s aotoiniciadora (a difefencia de la traM~IOn. pg. 248), Sino que slo f!Jonga o 818rga mol&w!tl$ prooxis1entes. Su~;tr;tos 54 ut601 <.emo &uWatO& el oon,luMo de loe cuauo dN'TPs . <IATP. dGTP. dCTP y dTTP O. C<W.la uno
de ellos quecsa tncori)Ot8dO en et ONA nvevo la ~rte NMP de la moJcula. A estos eJectos lOS oNMPs y dNOPs 6011 Inactivos.. Cofctor9&: Pa~ ~.m accMdad pliT\8 se requiere un klt'l mel.Mieo div31Mtc como cofilctor, i.JSOCI9o a 'OS <INTPs. AunQue in vitJo oste pCJPOf pueden de$emper'latlo tanto Mn~ como Mg2. es eSie Ultwno et <I'U ~ in VIVO Mo lde o plantilla ;;Sta es. QUiU, lo principal caractetl$tca de la reaccl6n. El or~ correcto <f.O -'CQrpOr<c'Cin de tos dNMPs viene detetmlnado pot su comprementeriedad de baMtS ron la sewenoa de cada hebra ae ONA, Qve

aaa asl como molde o pkmli~J~t.

146

REPLICACIN DEL DNA

12.2.2 Mecanismo de la reaccin


Se iric;ialtl r~i6n Q:)l'l ol apare8H'I'Iientode un dNTP oomplemenuwto alnueletldo de fa hebra molde (DNA) en la po$icin ~iMI <'!1 exltemO 3' de la nebra ett ttee*nlento {Wclalmente. el RNA cebador: h.1990. la hebra que se est $intotiUni:JO), La t~ocin propiamente dlcN oonslsle en la unin del dNTP seleccionado. bajo la 6orma de dNMP, con llber9Cin de PPr Ello implica la tormacin de un puen1e fo5fodi6sttf ttre el f0$1<'11 0 a C:SCI <SNTP ~e se lrw:orpora y el 3'-0H libre de ta cadena en c:recimlento (ini~lmeole. dol ~Ot) La I'LJC)Iura dei~Waee JosfOI'Inhldrldo (u-~) del dNTP proporciona la enesgia necesaria ~1<1 impuls.'lr 13 re~(:(:i(W\. ayudttda por la wbsigulente hidrlisis del PP1 a 2 P1 catahzada porta pirofosfv\:;11$0\. Tms muChas reaoeiones similares sucesivas. eJ producto es la nueva hebra de ONA:

n1 dA'rP - n1 d(iTP +- n, dCTP + ~~ diTP

ld~''-1~ --~O~N~':.,::m~o: RN A ccldo>t,


Ml*. DNA rolim~rol$a

,.

...

+~
hebr.J <k ONA t:o t'"'mu:r-of < l'

o,:;:"> l...::.J

\t f('-'l><ISMO OE I.A lli:AtL'1"'l:

cntk.. dc
'ln""kt~

lhoebh d.. I>NA ua.:iOilCl

~ .><~""'\,"
lllllC!aUI

l...!~~~.J B11~

C'.alkl3 de DNA con

""'

oucloot;dos

o-t-o-~ -o

(}

0 ""'
12.2.3 Direccin de la sl ntesis
Puesto que la ad icin de nucletldos se realiza &lempre a partir de S*trif.:)Sft\11:)$ y SOOte un eJitremo 3 '.QH lble.
la hebra crece per $U exlren'IO 3'. y se dice que la slntesi& lran$CI.Iri'O en d i.reeci6 n 5' ...3. Esto es vlido pera toda& !;o~$ ONA polimerasas. tardO <le procariotas como de eucarioeas (y ~mbin cwa~as RNA pollmerasas).

ENZIMOLOGIA DE LA A..EPliCACtON

14 7

12.2.4

Tipos de DNA polimerasas

Aunque la reaet61'1 de Sintes.s ese ONA es vrwversal. es deeir. bene lugar de tnlita fonna en lodos lOs organiSmos y ublcaelol\eS subCelulares $u CM<\Ii$t$ .s efe.;;luada tt1 cada taso por dis1inla& enZIITias. bajo la ei"'mlnaeit'l (()f'nOO de DNA pol!'rner.t$$ (&brevi<M:SM: romo ONApol). ES1rie4amente su nombre es ms oompleto politnefflUt$ de DNA dl;fgi(Jit$ DNA (o dcl>(tndiontO$ d9 DNA) , para i~r tanto la molca que sintetizan oomo la que emplean oomo molde. Mas adelante se C$1udi;)rn otrt\s PQiimera:s<a$ do ONA o de RNA que ublr.tan d1stii\I06 moldes.: pera ofreoet una vlsiOn unlllcooa se resumen a tot~ti'luaei6tt.

molcula sintecizada
DNA RNA ONA RNA

molcula
molde DNA ONA RNA RNA

nombre oomplelo f)OiimetaS& de DNA dir;2da PO! DNA po!imerasa de RNA dingtda por ONA
)OI!metasa de DNA <Jil'igld3 i)Ot RNA

ejem)IOS (nombre oomUn) ONA po!i,....-asas RNA pollmetilsas o transcriplasas

uansCtiptasas invers~s teiOlerasas


RNA repllcasas

......

polimerasa de RNA <!1Q1da por RNA

12.2 .4.1

ONA polimerasas procariticas: actividades pollmerasa y exonucleasas

La p(IIYieta DNA pollmerasa des~ (Mhvr K:omberg, 1958) y la mept es1udiada hasta la fectla es ra ONApoH de schencrua cotl' . la oomprol:laclon Cle que su actividaCI no es $1JfiQ(ttlt$ par<~ JU$1ilicar la veloadad de <(lhcacin del cromosoma bacteriano JI) v.'vo condujo al de9eubrimiento de o~tas entimtts 16$ OHApoiJJ y ONA.po!-111. l as tres. ooeJ~isten en E. coN. con funciones especializadas: pollll realZa la mayor ~ne de la t3fe3 diJ ntPiiCCIICin, mienlr(ls <IUCI pol1 y polll se encargan de funciones aux:Wares (sus earaaeri$1Jcas pat1iWit~re$ se mvestran en la tabla de ~ 148. p.nto oon l&s de 1a:s potimerasas eucari!icas). L3$ tres ONA I)OitnerM<'l$ ~ntan. adems de su accividad enZlmtlca como pollmerasa una o oos :.cti vid3dn nonvcle:~s.;. l~ actividad 3' xon veleasa (taml:lin llamada eonueteasa 3'-t5') )ermrte hidrolitnr el nucleOlido Sl(vMO en el eJttremo 3' oe 13 ~ de ONA, $IQ un nucfleciOO cada vez. Ea.a ehmlnaclon uene lugar cuanOo el t"RJCietido noorporado por la activiOad pollmerasa a la caaena en erOOmien1o os errneo. e:5 decir. no aparea corroct<wnonle oon el pn~Mnte en la netlra molde de ONA.la pollmerasa es a$i capaz eJe r;ofl()I';Cr el error. detener la <tdicin de ms. nlJCiebdos y liberar ese Ultimo dN\IIP mal ln00t'J)01'8do. Los te(ltiOS acti'IQ$ pohmera$<'1 y exonudeasa $0n dif.er~les. En resumen, las. ONA PQiimw~as conigen sus propjos MOtes, en sentidO (3'_.S') contrano al de la polirnerizt'Cin (5'_.3'); por eiO. 3 esta actividild 3' -e)(()t'IIJ(:Ieasa se la llama tambin aetividad correc:to~ d9 prveba& (o de galetaaas. por Malogia a1 prooe$0 en .mprcnt8), o correctora de errores proptOS. De este 1'1'10<10 mejora la ldelidad de la replicacin, en un factor de entre 10t y 10l sotlte h'l que <'POrta la inoorporacl6n de nucleotiCios oomplemel'ltafl<>$ por &a pobmerasa (que \lene una lasa de error de un nucleollCJo por ead<l 10' o 10~)

CARACTERISTICAS DE LA DNA POLIMERASA 1DE E coli


ONApoll (unida al DNA)
uN. ~1>4 ~':'lllcnilp(>ll$'lt'Pit<h~ll.

f ntgrnc:nlo ..gmndc''

103 ~

o de Klerow
"" ~n:r. i)S
polin~<r ...a)

Pfe'etllil ..,, IIQI \ >ll\1~'>


~fftlroll<.t>'('>

u:.-..

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,; ...-\on....:k.c>l M uy l.lcl>~'Uu\lr.ldo. X nnpko;J frocno:"' (lllf~ ..nle<i< in ufm;k DNA

"'*

111

Frn_gm~"nlo ..pl-quc:o..
CICmli~nl. lS k i)J, ~(' >!~ltll lllliCI1\id.d

'\locl\'(llo<Jo nx.... ''fflll'lldoV'I. ~


p.nl" 1k unii'O( la h:bllJ en
~tC,...,..O(Ol...

ll n~lt>.~idc ~ ltnnnul.
f<'ftQmei!U: ,~ r~lk ...., o:timo,....ol< ~><T la

~.c<~nu.:k\1"* Ellnli:U.v~ xoro ~~o.X'ld:.

So~ Cl'll.!ftu.\, """~ dDUOO. . . po><l:>


1>.11\~~

J ..:..~ ..._.

:o.;o.....tod ~..,..._~

._. ONAQQII <le procanas es nica entte tes POiimeraS<~s por poseer adems una segunoa actrvidad eK.OtluCI~Ms~. on esto caso 5' -exonvcleasa (O exonueleasa 5'- 3'). qve le porr'""e hidrolczar secuencialf'Y'le(lte DNA o A.NA a partir (fel elltr~o 5' o la hqbra De nuevo, el centro aalvo es ~ef){!nCiienle ~ los .-nteriores en este caso esta srtuado en el fragmento pequeno Esta activi!Sad juega un papel fundamental et'l la rel)litaCiOn del ONA. procanbtioo al elimnar el A.NA cebador y sustitulr\0 por DNA, dur<Wt4e la stntesis disoonllnua de la hel:lra retatcl&d~ (p."'g 156J Tamblen

143

REPUCACION DEl ONA

oompleiTl@nta la actwrdM 3'~)1.0fMJ(;Iens3i Ol)n'igiendo ei'I'OI'O$ de <Jt$bnt() llpo, y se la lama en ocastOneS aetMdad ele ropo u <K:in; pc>r eompk), inlervene en la escisibn de 109 dlmeros de ptrlmi!W\8 que se forman por expo61Cin del ONA a i.lz W Ell~ritnent;.llmenle, se aprcwha la aCIMdad S'-exonudeasa, por ejemplo. para. la prepar.~ci6n de &anda5 mare<~d0S (1)60 t82,

Algunas caracteristicas de lu ONA polimerasas desde el punto do vis t3 bloqu1mico

'1 tu n cfon~ l

PROCARIOTAS

Pollmeraoa:
Ublc.<JCIO" !Wbcolwtt Actlvida~11 enzim8Uces : Pnmass .-.:io PoWnerMa s 3' 'elo~clbn) a~Exooooleasa (o 3' S'} lcorrecctbD de orueba!l1
5 (ot()nocleat.oil (O 5'

a
nuc:leo

8
no
si

EUC~IOTAS

6
no

nucleo

mitoooodria

nO~

nudoo
no
Si

no

.,

,,

no

e;.mnacon de cebadores Fu nci n an la dluta:

3"

..
no

,,

si

,,

,,
no no

no

no

,,
lti

"
no
~

no

no

no

..
"
"
elevada con PCNA
~s.ooo

..
al

,,
si

no

ReplicaciOn (&inle$!$ conlinui)(Sa de t'!ebras 11Cit\'AS. (OO(IUCIOta y re1atdadf) Empalme 6e kagmentos & Okaur;l
VolocJd.ad <k lteadn: Velocidad de polmeriucin (nucleddosl
P1ot(I$1VIrllld

no

..

,,
no
2S().J000
mvy ;)lit\

slo 1nl c atrnente

no

si

no

no

oon nutleiJSM

"

, ..20
baJa
3-200

2-7
media
10000

(nui'JetJ()S allachdos antes de SU d1SOCIBC10n 1

'

,.

..,.
"" 200

1
*vada oon/$n PCNA

""'

elevada

12.2.4.2 ONA polimerasas euearttlcas: actividades polimerasa y exonucleasa


En eueariOtas, las ONA poijmer~as $0n 4ilcremt:s ~ las de ptocarlot.as.. auf)QO& pre~n cierta 6imililW de seeu&ndSI y 8$-lrUc:tura. Se hao descrito mAs de cJn~o ent:lmas. t.a ONApo4 a se encarga, graCiaS a su aetivtdad prlmasa, e IniCiar la sintests mediante la fofmacin40 un RNA oeb.'kiOf '/. poi' su acllYidad polimerasa. de la olongon lni(l(ll de ese oooadOf'. Es.m tarea se cede Mgo a las OHApol ~y" tespoosables de la mayor parte de la olo~On & an~ hebras, ~hecho. aiiT!bas ttenen ac:li'Jid;,d~s. sin'lii:!IM. pero aUn no est dato si desempel\an incS&tin4tlm(lnl& la mtSma runon o estn HpeocialiMdM. L.a DNApof p no lnlervtene en la JepliCC~oCin, sino q.-t e:sltl .mplieada en ta reparaon de crro,.cs o~ en el DNA (procesos en lo. que wmt:-tn pnrtJc';ipan otras polhoontsas, lnWyendo a '/10). Mientras os.t~s C\l<ltrO en%1mti:S son tesponsables de la ceplicacibn, r~ci6n y teoomblnaciOn del DNA nuclear el DNA mill)()()l'dnai es sintetiZrto por una ~rasa diferente. la ONApol y P UltimO, se han descUbierto recier~Wmt:nt.e 0\!89 poimef'8S8S nUCINt$5, <t~'.-t poca OMOoeidM ( 'J:tetal. 'l leta l. l [~) ). QUe estn 1mpbd<J$ $0bl'fJ todo en rvparact6n y etombii\{ICiOn En cuMt.O t~ la aclNidad exonudeasa de las ONA polimcr~tes eucaOCicas, sto las 3 que se encargan do ~;a ~il)n {\$,y y r., ...er tablal poseen actlvid<td 3' .. 11onuc:leasa, aqu&lla tesponsable de la capaclaad de (lOffCI(lQ6n Oo Motes eome41dos al lnoorporar los nueletdes .a la hebra Que se est &fNetlz.ando Ninguna de. 1 3$ polin1tWaS;IIS eueanOtJcas patece tener acll~ S'...~tonucleasa la b\cibn de elimirtaoibn de oebadOJes 13: desempel\an do9 nucleasas independientos, aunque t.as pollmerasas. $ y e si s.e enccwg.an do rellenar ol huooo eon ONA; los dela!!es se

8UUCiian ms adelt1nlo U*.l 156).

la fl.lnCIOn espoeifiea de eada pollmetasa &to se puede ~<ler ~ el ~nlexto de los mecaniSmos de !nlaacl6n y elongaQn 6ft ll'l$ cadenas de DNA. que so utudi<tn con dc~38e. donltQ del mecanismo de la elongacin
(pg 154)

B.;JtO el alcance de este libro no I)IIII'Oet!t t~doeuado describir In ~es estructu~t~les do 1 (:1$ dis!Jntas En la 1 ab18 &igYien~ o resumen \os dal06 ref:elf\1'05 a t<JmafiO y Ol)mpo$1c::ic':ln on sub~. pero debe teoorse en cuentn q~ l()davla es muy 8\'ada la v;~ria!biiidod ~ citl'8$, en especial pan; las enzimas eucariticas. o !tlcluso la *"ter'PI'01t'ldn dt los mrsmos en los distnlos orQ;)fli$1Y!os e!l.tudlados. oomo para w generariUIOOn a IOdos los
poli~sss
e\lctllfit)l(t$

ENZIMOLOGIA DE LA R EPLICACION

149

Carae-toristic;as ostrueturates do 101s DNA polimernu


PROCARIOTAS EUCARIOTAS ''1

Polimerasa:
M, total (kDa) 171
N11 ~Wbvnidadell M, subunld&9s

1
103 1

11
90
;,:4

111
c900 22

o.
356
4

B
39

5
173 263 125 48

"

'"

160 2 125
35

313
2

258 55

Pt Mt\$.1 molecular rc~t~tivtl <N: la no!Oetlzim~ o tlt"'ZiM:J ful'leic)(ISI oon todas sus St.b.d\idades. ;,. la ONApol-111 de E. r;()Ne$16 torm;"ldl' t>0r 22 $Uti!Jnid<'CICS de 10 tliX>$, con un~ <:Ornoosicin glob<'ll ((J.,c,(l),trty,,Q,-y.lbl\4. De enas. 1a &gt\4)8ci0n ((1,~;,0) se conoce oorno "rlUCieo~ <te 1a PQiirnert~sa. La suDunidad { 130 kDa) llene el centro acuvo pol!metasa, la : el 3 -exorucleasa o correC$0ra de pruebas. ... La ONApol u humana H1a 'ormada por 4 subunldades diferentes: 180 kOa. oon el centro actiVO pohmerasa

\.0$ d3tc couesPOnoen a numanos.

48 kOa oon el oen4:ro activo prm;:~sa; 58 kOa, col~ ele la pnm;:~s;:~; 70 kO;:~, r"'J')I.;~doq~ de 1;:~ POiim~w

12.2.5 Velocidad de replicacin


0..00 ol gran tamaflo ~ 9CAO~ de ..,na c61v!a, <1ue sv ' cplieaor'l COMPiela te lleve il C<'lbo en vn tt&mPO rnzon3ble ell)root$0 de $inte$i$ det>e ser tnvy r&I)I<IO. El'l proeariotas. 13 vetocidao llega 111.000 n~.~CieOIX:I0'5 oor minuto En ...coriolt~s. el m;tyOr l<'tmoti\o dolgenoMa 1\bee pettSt'l e;~ la ne-ceSidad <te vM gtan veiOQ<Iad t1e r~n ~. sin ernt:N~rgo , no POCista se tt\n etevooa grtleias 11 1a exi$teneia de v~\liO$ oigel'le$ de reQiiet'cin on cada crom(l$()tfl;:~, que rodiJCe 18 IOI'Igilud de ONA Qve debe Sinlelizar cada mo1ecu1.a <te polimeras.a t..a consecucin oe una alta velocidad de slntesl& s06o es posible gracias a vn mecanismo peculiar segun el cva1 la molcula de ONA polimerasa se man1iene unida a la cadena de ONA molde, a la vez que asociada POr su oo.ntro activo al extremo 3'-0H de ta flebnl creC181\1e. Oe esta forma puede incorporar numerosos nucleOtidos suceStvamente, oon vntt rOOvoein dol bempo necesario para la ;:~dicin de cada vno: por ejemplo_la 1Xllimerasa puede tardar vn mn-..to en darse y votven;e a urw al ONI\ (por mera difusin de las molculas}. mientras que para aadr vn nucletJdo sin SOII3rse lo OOslan ullO$ milisegundO$ E$11!! capacidttd de I<'IS polimctrt'IW$. vt~ri(lb!e ente e!!tts. se rec;:oge bajo el trmino ~svidtld, que se (Selil'le como el numero de ru:leo!idos que son ineoPOrOOO$ .1 18 1~ 3n1es do ave ta (lnz-n;) so separe del molde (coloqviatmente se dirfa alladiclos 'de vn lirn~). Un valor elevado de prooesMdad en una Cl()lirnerasa es mucno mil$ imPOf1ante para la repbcaetn <P,~e una velociclad alta de calhsir..
las P01Wnera11as de mayor procesivi&ld son fas que intervienen en la elongaCIn de las hebras de ONA (I.Snla en pg. 148), mtetltras Que las de baja procesivicJad se encargan de lareas Qve podrian llamarse auxiliares, la!es OOMO la sintG$i& y eliminltein do ceMdocs. su sv$tituc;i6n oor ONA o la reparacin. Generalmente, la alta proceswldao se QOn$igve gt3Ci3!$ a uno f'n016cvlal que ~<'lbrt'lza o rodCt\ lt\ cadena de ONA, evitando asl Que la enuna se separe: este mecanismo se aenomin.a de 13inza deSlizante. pves l)ermite el doSiizttmiento oonbr'-.~Mo de la polimeras.a a to largo de la cadena de ONA, sin separarse de eb.

wa

(!}NAN~ 111])
2 mot.C,:ulas de la ~ubum1.S:d 13 d.: !:1 0NApo-lllll1 1. c11l1 ~c. : ~t.xa:n r()<lo::m(lo al UNA, y :asi C\'ll~n q\.11! c.l n(~;f~-o de la polnnc:r<~Sll (coo ll41 liUbuntdad t<lllalitl'(a a) se separe del
molde. uumcnta.ndo su proecsividad.

V1SL:I

l ;al c:rnl

J mole.;;ulas de ul\ll pro1eioa indcpendknlc. d "llnligeno nudcar de ~lul:t.:S Cfl prolirci'SCin'" !PeNAl lle llS(K'ian IOnnsndo un anillo que Rltlk::. ::.J ONA y se une a la.i ONApo\ 5 y r. de <:I.IC$-UOI.:I~o, aurnC'Iuand<) su prQCC$i' id:lol.l
(en e~1c <:a$(1, :;.: mut~lf; la post-ctn del 0\JA).

150

REPLICACIN DEL OHA

12.3 ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACIN


12.3.1 Inic iacin

Mienlras que et1 procaOOtas es proball6e que la re(lleaocl6n tenga lugar en conexin con ta membtana celular, pues

el ~o cromoSOO'Ia esta Mclaoo a ena en ta ZOt'la nucleolde. en eucarlotas el proceso ocum~ . toglcamente. en ta matriz nu(:fet!r El DNA se tf!l)llca una vez por cldo oelutar. durante la fase S.
Inicio de la repllcadn: apertura de la dOOie hlioe en et Ofigen de replicacin, creacin cte dos horquillas de replicacin y sintesis de cebadores

L:a um&n <k prtlh.tIIJI) tk i 11k i&li la k"tllenCia \Id urigm lk rcpficf!d6n f31:. 1hla lu !lt"KirJc.6n do: las hebra<~

A panir de abom (co <:SU! figun. y Las $'ilnmlct~). .Wio k rt:pn.'llc. mad una horquilla: en la ou:a ocurre lo 1r1i:.too. aunque oon 1~ p.1pele5 c.k hd:lfa cqfli.IICir:. y retardada in~erc~unhi:dM :

,.
,.

,.
s

12.3.1.1 Origenes de replicacin


La reoicacin sie"'l)fe oomienza en I)Ullos de la molcula de ONA con &eeuenclas caracteri&tica& En et caso de procariotas. el CJOm()$()1!n('t tiene un (rigen de tepllcacln Clnico, Jamado oric: por e;empo, en E. coN et:l<\ constituido po1 \1'\il secuenci<t do 24S pb. En eocariotas, como ya se ha comentado. la enorme longaud de lo5 c:romosomas rei91"9 101 9.Jii~ncin de numerosos origenes de repllcac:in; aunque peor <:Onoc::id06, sto$ ~ tambi6n secuenCias cttr&eaerl sliee.s. El proceso de replicacin :se rea!i.ta en la un~&!S fiJndonal del genoma denominada replk:n. e'finidtt oomo ~la regln de ONA <IVO I)O(KIC ser teplieada a par$' de un mismo origen (pg. 145), Cada replicn oontiono, pues., un orven do ~~~iOn y se replica medlan!e d06 horquillas. MientrM en prcx;Miolas el croiTlOS(lma eotnpleto eons.IIWye un $010 repic(ln, en euear\0&89 son runerosos &IJfren la rtple.(in <$0 IOn'na easi Sinwl'll\ea, k> que supone la existencia oe un complejo mecaNSmo de control QIJ!8 c::oot'dii'le el inidO, elongaclbn y tetminadn en todos los AIC)Iioones do cada CtOI'I'IOSOm&. Estos aspectos estn pendientes <te resoluCin, al Igual que muchos ottoe relacionados, por ejompk). con 111 replicacin de 109 cen1rmeros otra& rogione$ hetorocrotl"'tiee.s alilamente OOf\densadas.

Centtndonos en el Wlicio y progreso de la tepllcael6n en cada replloOn, surgen igualmente grandes coe&tionos relativas a o6mo son las interaociolle$ osoeeifieas entre ONA y proteln&s que desencadenan la inic:iaocin, a la consiguiente aetuocln do e&t<l$ PfQCoint~s y :11 contf<ll del ptOOeSO. Por delante de la nor~ de Nil()lic;M;in, OIP91'1i1S se oonoce omo tienen lug~r la Meesarla deseondensadn de lo& cromosomas. la disi$cin de lOS rucleosornas y la separacin do lit$ pr01e1nas hl540nas y no histonas (lemas 8 y 9). Por de:tr<\s de fa hOrQuaa, debe lambln aclararse omo $0 reuliltan las tw.110nas y no his.tonas P8r8 a. r~ac:io de lO& nudeosomas. o6mo tiene IUI)CW la lenta orgttnizaeiOn COfi'4*1C8 de la cromatina {C~UJ no par~ ~tableoerse hasta que fa horquilla do replicacin se on(:U(Itltra
mucha& kb m~& <1delanto),

etc..

ETAPAS EN EL PROCESO DE REPUCACIN

151

12.3.1 .2 Protenas de iniciacin


Tanto en procariola$ oomo en ov~riOt<l$. 91 orlgon < ropl~cu)n n r9oonoodo 9Qt v<tri<~s molwlt~$ protoi~ . que provocan el piqgue do 1. ~<:lon;t do ONA y c;rf,Wn vntt ton$1n II.IPerhelicoidl 11eg<'!!Wa que racilil<'! sepoW(I(i6n <fe 1~$ ncbr<l $. OtOer.t!met~e ay~a por la aOundanoa de ~res ATen esa regiOn. Po' ejemplo, en ta secutmela 011~ esl3 accin se deoe a la unin especfica oe un Ollgmero oe la proteina denominada OnaA. que atrae a otras protetnas, ptlncipMnente Onae (una heobcasa} y OnaC Tamblen e)dsten proteinas de nlcladn que se unen es.pedflcame.Me a las secuendas de .-.clo eucaribllcas. formando un eompl~jo de reconocimiento del Otlgen.

12.3.1 .3 Conexin entre la iniciacin y la elongacin : protenas necesarias


Unt~ ~ 'ormt~do el oc;wnplejo de iniCiacin. replicaon precisa el desec'lr'OII8mier~IO de 18 OObJe Mliee, 8 M <!e ha<;er 3C08$ible$ 1<'1$ ~se$ oomo tnOIOe ~ Jormar las nuevas hebtaS. El desenrollamlef'lto irlieal en et tramo couespondiente al ori!)e'.n de repllcaciOn. por e.leC$0 de las prote!nas oe lnlclaCIOn. debe oonclnuar avanzaooo por delante de 1& pollmetasa, encabezando la hOrquilla de replicacin. Adems.. a medida que &e van sintetllando las hebras t'KII9Va& se debe r reo,perando el enrollarniento en la& nuevas dotlles h6ices En eS1as opera.eioncs de dcsonrollamiento o relaamlef\4o y ervolamiento o compCtCta.ein in4orvicnen diYorsiS Clf"Q~intts C$00C(IIiUidC'Is, El <::orn()l'-.o mJQiprotoico formado por stas y por IG$ ONA I)Oimor;lr$9$. que viaj& 0\$0Ci&do ;l C<ldi'l hOtQvill<'l y r~t'll.tl rcllie3cirl se COf'loot como repli$omit

a) Heficasas
E$t;ts protein(IS m1.1llim6ric:M (g~er;)!ment~ hC~rnc>rO$) se unen al ONA en el ongen y acWan separando su~ dos en un proceso que ruiere la hiOrOisiS $itn1.1Mne3 de ATP S. crean asl dos horq~ de repticaetn, ~ comienzan a awnz.ar en sentidos opuestos, cada una liderada por uM nelieasa. M ~V3n.u CIOf la ~ segu.da ' l horqvilct inmediatamente por el resto de oocnponentes del replisoma o oompe;o de etol'lg&ein aSO<::iado <'! l..
~$.

b) Pt01.elnas de unkin a hebra sencilla


Una vez separadas las hebras por la hellcasa. lnteMenen las ~rote.inas de ul'liOc'l al ONA de 1-.etlf"a scncina. que eviiM el ftaOOrelm.en&o de las hebr..s. Oe e51a forma. las bases nitrogenadas pueden acoger a los nucleotidos que se inoorPOt.,_ en l;l rec>li~i(ln , Se 1M~ oocnVnmont.e protei n<ls SSB (singfe J>trand bJnding PfOt~). en especial et1 prcx~riOio:l$ E.n oucariotas desempe;la esta func:iOn la proteina de repl icacin A (RPA).

e) Topoisomerasas La: separacin de hebras oca&lOnada por la progresin de la helicasa a 10 largo de la cadeM de ONA eonlleva I.J apariCin de supe.retYOIIa~os pos!livog (X)( oelame ere la hc)fqull!a. Si se tr31 3$0 d$ un ONA lineal y corto. e1
superenrollamM!f\lO se podrfa ellmlr'lar pot Sir'np6e rotacin de la Mtioe en sentido con(r.)rio Sin embargo. s.ta no es posi)le en los ONAs 01cutares (ptocatlotas) ni en lOS lineales de grM lal'nSW\o (eue&nota&). que res.tltan k>rzado& tocxgicamente, detledo a su nal\l'aleza circular y a su unin a ptotelnas. respeeti~mem.e. P;)r;it olivittr e;a tensin de totsiOn te requiere <tlgVn 1iPO de moct1nismo giratorio; e lo conlrario, el superetWotlamlento acumtJ\800 por de!Mt.e cto 10 horquilla llegaria a iml)edir el avance de lo replic;aciOn. Este problema se resuelve gracias a la 8Cdn <re 1M topeisomerasas. et~zimas ~ afleran e1 est...-.to de supecnrolltlmiento del ONA &In modifica~ en ovos aspectos su escructura. E& de~. inlel'(:()tlvierten lODOiSmetO$ modificaOOo el nmero de Mlace del ONA (ni de vuettas que de" un~ hebra respecto a la otra, p8g. 68). Las top<)isomer&sas UWI'Ibi6n intC~Vicncn on b$ procesos de recomblnaeiOn y. PO&~'blemente. troanspo&iciOn. constltuyenoo un meeaAi9mo baioo gret~erat de modifica<:in topol6g~ de ltt motoola de DNA.

152
Alerdendo a su modo de aOCIOn. se distinguen dos gr\C)O$ de topol&omercu;as:

REPLICACIN DEL DNA

l as topoisornera&a& de tl'po 19$Cinden 'ransitoamen1e una hOOfa del DNA (un enlace fo6fodi&Wr), dejan pasar la olr.l por 1<11 brect\it abierta y vuelven a soldar o ig;ar la primera hobrct Comt) C(l(lsecoencia, el nUrnoro de enlaoe aumenta~ o <isminuY$ en una unidild la rooccin lran$Curr a lrtt"" de 1,.1n intetmedi<trio <:ovalentt: entre uno <:kt lo& ex.trcmo5 el ootte y tJtl re$~ de lirCI$in~ <Se 13 et~zim~ . Al Qtrmaneoet 13 enzim~ unk:ta asi al ONA ~bierto Clur8nte 1.1 aociOn eeta!ltiea. se eot~lfo&a en tcXt> momet~tO et grado oe tet'ISiM llberaoa.

AccUm de lns topoisom~'fllS.'IS

dl upo 1:

de tipo 11:

las topois.omor;~us de tipo IL cuyo ej:etr'lf*) dilsleo es ta g.rrua procsr161!ca. oonan transltoriamerrte la& Clo& hebras del ONA, I)Ormitet~ ti t~aso de otra doble hebra, con~. por la brecha abierta y finalizan resellando los cortes.

Por eonsiguien~. er nmero de enlace aumenta o dlsi'IW"'U)'8 en dos ur.dade5. La misin de estas enzima& oonera~monte inducir superenronamlenlos negatfllo& que facilitan el posterior desaparoamiento 10c81 El c:onsumo enetgiiCO cJCI prooe90 eslmportaMe: se hldroliza una molt::~Ait de ATP POr ~ wn ~ 1<' ~.

d) Pdmasa
Como ya se ha Indicado. las ONA polimera$&& no $C)(I ~C:e$ de iniciar la sfnlesis de una molcula de ONA. es deCir unir 10$ dos primerof> niJCietldos. sino slo de alongar untt 1\ebr.t p-eexiStente: ~ ello, e.4 lnloo de las hebras nuevas requiere un cebador. Este es sirrtetizado por ~ polimeta$a de RNA dirigida ~ DNA (pg. 14 '1). denorrineda pr lmasa (oe pn'mef. cebador en ~r~gls). que pr~ ~ cortas de RNA, complementattas de ceda una de las hebras des-emparejadas en el ()rigen de replcadOn. En procarblas. la pRnasa es t.r~a protelna irdependienw que forma parte de un COMplejO proteico oenomlnado prlrno$om;) , ~ado ., 1<! horquilla. Ero eucariotas, ta aetiviad ~asa reside ~ una de las sub\ndades de la ONA polimeras& o:, distinla oe la $Ubunld80 CXlf\ el cenb'O acdvo pollmerasa (taOia en p&g. t419}; por ello, se habla de DNApol <a/prim,

12.3.2

Elongacin

la teplic:acin depene no 5610 do 1<' ONA ptllmerasa. sino de numerosas e~Uimas y fa~ores Pf0'81cos (ms Oe 20 e.n E. cotr). Esle conjunto de Pf(lleiM& que, como $e ha ii"'CJieacto. recibe el nombre de reptisoma o comprejo de reptiC<ICJ6n, se asoci<'t tri torno a 18 hOtQI&l de tepllcaciOn, pal8 pettlper de fonna directa o ~~ eo 1<'1 slntctis
S~multilnea <toe ambas nebras.

12.3.2.1 Asimetra de la replicacin en ambas hebras


Conceptualmonlc, el principal problema de la replicacin surgo 31 ton$1<'ttatSe que ambas hebras son ~s $1thulliu'leamente, a medida <P.19 wvanza ta norquina, mediante enzimas (ONA polirner.'I$C11$) que SoOto &On capace5 ~ &~ntctiz;ar en direccin S' ~3. N abrirse la ~ ~ de la$ IWtf.lras progenitoras se va exponendo en el sentido correcto para actuar de molde. 3'-.,5'. pOf 10 Qut 13 s.tntests de su hebra complementaria puede cranscurrir por simple av<anec 4e la poliMetasa a lo tcwgo 091 molde ltt p3r ouo a:vanu. la hotQuill~ A o5t3 hebra nueva se la llama conductor. lfder o pul y~ sl.nHtd); ero ocasiones, su '*bta molde rcciloe el mismo nomt>te, pero pera evar confuSIOnes la lai'I'ICitemo5 " molde det l<t hCJbra conductora"'. P(l( el conttaliO, la ob'a hebra progeni_,ra se expone en sentiOO 5'_,3', por 10 Que no pue<~e a~uar como mOlde a medida QUe avanza 18

ETAPAS EN El PROCESO DE REPU CACIH

153

norqullla. COrno se -..eta en segukla, ra sJnte$$ de su compSetnentaria A~Quiere oo meC<~~Wsmo P<lt'lioolar que, entre otra&. OOS 3S, SU(Xll'le un desfase con la slntesis de la hebra conductora, por lo~ se la llama hebra retardada o retrasada (lagglng sttand}. La solucin al problema de sintesis de la hebra mardada se re'v"tiO 1111 Of>Sei\' Qve <JurMte ea l'tl)licttoeiOI'I ero pos1bje aislar molculas de pequeo tamao de ONA recin sinM'Ii~do (menor' ert t\.le&tiOtas ~ en procariotas), conocidar. como fngmerutn dfl Okazaki (por Reiji y Tuneko Ok<Jz:aki. que 10$ doSQbierot~) S. l)fopuso <WOI"'Ces utl mecani&mO que e~Ullicase la sinte&i$ de la llOOf<l retan:l8da en J>artllelo 1111 des;pl&lamiento de 18 liOtQu!lla oe tE!C)Iieocln, consistente en la sintesis disoontinua da la hOOra retardada <:ada rragmento de 0k3ntki (OuoSQOI'I<Ie ~ ur\3 l)(lteiOn <M dlct\a hebra, wya sinlasis slO comieru<J (de <Jhi el nombro) cuan():) el 3\'SI'IOe de la I'IOtquiDa ha llletado sufiCiente tongitud 00 hcbr<~~ &enc:iltl eomo ~"'que la polimora~ ta utilice oomo molde, en senlido a- .s. Se propone paca ello ~ la hebra sencill<l f()(m3 un buCle, arrolla sobre &a propia enzima. paca permlbr la sJntem en ef sentido s~ pr(l()io oe la poiWnerasa. La slntesls oonjunta de arreas hebras (la conduclora, de f<lrma continua. y la ~rd<Kia. e forl'l\3 diSOOf\lnua), por dos molculas de ONA polimerasa. se dice que es semidiscontinu;,

I.Qgleamet'l(e, la s.lntesas de cada fragmento de Okazaki requiere un RNA cebador. W\4ezado por una actiVIdad pftnasa (parte del pnmosoma en procanotas. ONApol (l)'prim en ~ettriQIO\$) Qvt vraja eon 1& horquilla y que t.amb~ slnte1lz en el origen de replicacin el iDeo <:.e:bador r~erido POI' 13 hebrt'l OOl\(fuctora.

12.3.2.2 Mec anismo de la elongacin


Avanoe de un.a de las horquillas de reptic:acin; la sfntesis continua de la hebra conductora es simultnea a la sintosis disoontinua de la hebra retardada. n fragmfltos d Okazaki

hl.l'RJuill~ de rcpl~ ,;e lbpl11111

Vl:'1:

co)nlnMrari'ICrlole. y a lil )C ' ':ur Mntc'lu.andu nml).l hc:ba-;

L& hcbrJ. cor~h.tO:'I..wa ,;e\~ clonp ndc de

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En c"111 cupu yn ~ c,;cir si nrcti:tun.:lt> cl e cr.:cr fumcMQ r,k Ol:ll1:1ki

154

A.EPLICACtON DEL ONA

Para que la slntes.ls de cada fragmento de Obz.aki se realice en el enlOMO de 18 norquilla, el l>uC:Ie do hebra molde en tomo al rep(soma debe sufrir algn tipo de eVOiudOn en cuaMo a su tatnal'iO y diSC!O$iC16n, deSde Que $0 comienza la sinle&IS del fragmento hasta que, una vez terminado. se libeta el bude. ya de doble hebra. Este mecanismo refuoru el ooncopiOdt dis<:ontinlidad on la sinlosis de la hebra retardada:

1 Progreso de la slntesis de un fragmento de Okazakl


(slnte&is del fragmen~ n 2. durante el periodo de la figura anterior. &e incluyen en es&e ceso las

1
e
y

ta dtferenle dls)OSicitl y variaCin do


Una r~la llc DNApol &o c. 3.!10Ciad:! a la
hc~!lla.. donga ~onLilliUamcnc b h.:bra ~"*'uctora

-t

,.

,.
1) 2) -

un
un

1:1 iDNAun.cloa b h~o-b111 molde c:s reconocido JIOt' In ij J)fOictnn I'*CIOf" de rc-pl~cl C (RJ-'C). que hace que pOI o. k" iepare dtii)NA y $C ut1a el tis:tM n ( lnr d'
prolif tnein ccl ul r (I'CNA), <lita ptOt.eiiP q~Jt 1 u
ve~ w.e

pol6 os. qm COf11 in6an 111 eloopcitl.

Crecimiano del
ftagii'ICIIW> de Okao:llld

-t
A co:uliMJaCin se coiDC'lzani la sin~cw dt:l

,.

ET A.PA S EN EL PROCESO DE REPLICACIOH

155

lkpn:.')(l.'nl<lCti.n glob<l apro.~w:imada de 1 ~ -.>rgani:wdn de l<ls llrl''llCIOas re;X>ns~bl c& d(' 1:~ replicacin (compon~llle" dcl l\.--plisom:l.) en nrno a bt horquilla de replicacin. 1a ~1rUldbn 1 110Sir.td3 oom:spondc- o un llll'llK'nto mtcnncdJO de la <:kmg.m:JOn, t.:oJfl un JhgnX'IltC do.'Ok:uaki sinlcb:tado a nll:dllls tp.C:J.. el n" 2 colas figur. ~ ;~nt~:rio~. c~p:t U).
I'Q c:bridad, M s.e n'IUC'Stt.ll\ orros liK'tii'CS procdCIO.". oomo l'l PCNA que \'3 a~tnd<il hS- ONApc>l ~.el .~oi~L'fn de lll.tdcas.."'S FEI\'1 I~Nasa H 1 que ltlaiflml l05 (r.\g.mcntOS <k Ok;.;ald. J: u~,, ~~~~~ l. )'I;S tomisonlcti'S:IS q~JC n:gul:m cl.upcrcnn.JIIonnicnlt.> en li.l.; t.luhlcs lu.::bw"' l>fQstfll<\ta e hi1:
(A hd.r, C01\l.f11Cilli':J n~>(le~l:,t

un ecOOOOr lilo IJI ~:ocntnnlr,


hdfi!
t.,l(l,jUdl1101

.;imcti<!<kk> por la w;undud prim.1sa de In ONApol"

Lll>'-1 \pi!

l) hila (;l \;tll

Uil

..m,_.,!~ ti< 11la.-t.r.e nmdu./(1'/J d.:

molde de 1:1 hcbrn cut'ldu<:tora


l.:. ON:\(IUI o micia la
cltl,g:tci(,n.l.'(lfllll ONA.

d-.:1 Rt-. A cch;s.:k> do: l:i


hdw.t. ;,)nthu::lot:l

molde de 101 hcbm .:onductom


m~.>lde di: IJ hdlr.l rctrn!;.'lda

Ml't\ , proi.C'il)l de
UI'IIOn a ho. ....lll ~ACIIL

1,..-n111f 5'~y ndkaOO ('r In~ llt.cl\ ;)7\ll~l .., -

L~hadorpara 1.-ad:e fmgnt.:lliO do: Ok:v.ttkt, ~iiill'111.:11ti!) 'lolf' In fs.::li\ id.1d J'f'lrll.f,;.:j d..: la IP~API)I IX

Ln hcbm n1an.tada ncsltlt un

IL'rl Ir ~ u:ntl'-. de o:...s/.11..11 .1 / '-:;:;:;::-;:-::;:-::--.

1.1 h:lnhl:u.!;~

doble hebn: hija n~

156

REPLICACIN DEL DHA

12.3.2.3 Maduracin de los fragment os de Okauki


Para oompletar la sl ntesis de la hebra retardada. deben U"'lrse 10!1 ffagrnet'llos de Ot<a.zakl. Esae proee$0, denominaQo ~lmetMe maduracin, requiere lit eliminacin de loe cebadote6, la elongacJOn del fragmento adyacente para r~r con DNA 01hueco dej<'do pOr ~d<' RHA cebador y la unin o empalme de lo& eldrem06 resultan~ pera dar una hebra conurua. Tooo tAO llene 1ug1u potiOiemet~Ce en 1~s pt'())timi(I~Cie$ de 13 pt(IC)it t hOIQuilla, o bien posteonne.nte. tejos oe etta.

1Maduracin dO uno de los fragmentos de Okazaki


(se represen&~ y~ $010 tal hebra r etardada y su I'I'IOICit)

La Ultima

e:l~~

on 0$1a

mt~dvr<a<;in

de 1<' hebra re1ard&oa, la unin <te los

ff'&gmet~&os .

es eatatiUda por DNA

ftgasas (o sin'()lerneote tlgat.n). El m&eanlsmo qulmlco <te la reaccin es el siguiente:


c-~~-&1-uli~
(OI)IIM,) I CK"Mede e~!CI'JIII)

NAO""
tiV~wcs

dt h.

y do' uunsl:ul1t'mll)

,w,

A1' P:Mil'"
(li~J."II' de! b..:~~efl6lilgu 1'4

ydt-euttn0118)
~m~" d<l'l hcboto< ..pamola~ ec.mpktimnw: pero C'!ll llllll de- o'lbo ra!Q

Ulltllll:tee~(~

..C ..G 1 11 111 -'1'-'1'-A-A G-C A A ~T T

- A..A- T-T-c-G1 1 1 1 1 1
T - T A AG-G
-o

...

Reaccin total ; D'IIA''I' ,._ H03'-l.l"A + NAU IAlP

0:0.''I>.1'.UNA + A \tP + '')1:0. PI'

a I>N" s -AOf' C'll t r -

t l .u.tllt' nudrolillt(l del J'..QII (llnl-.n-.:rw o:lo'Rille r ~r oldit$11:1

IIC'Ii \11&! dtl ll'l'ntU , p dd DNA

"~ pm~~i1o:

V
~

Adem~s do OS! papel nsdgloo. las llgasas &on en.n-nas de gran utilidad en 01 &ilbora'Orio, jonio nocl8asas ~ ro~ricc:;iOt\. especialmente para la preparacin <kt molQ.IIas de ONA reoombinantc (1 Cri\8J 16).

las

ETAPAS EN EL PROCESO DE R.EPLICACIN

157

12.3.3

Terminacin

Ul'la vez descrlt06 lO& detalles p<trtiC!kf del nocio y etongabl'l oe ta fe9licaci0n (l()(t'e<sponoe e&.tudlar 10& mecanismo~ de la terminacin. Debe i~rso Ql.'t e$1e I>>CCSC> no se conoce tan bfen como lo&. antenore&, entre otra& razones pot ta propia amplrtvd y oomplcjid:ild del CQr"~CCpto de 1.em~ci6n. Se trotat aquJ de exponer lo&. problemas que piJn4ea la tormin3ciQn Cle$de oo. puMO de vl~tatgloo y asu~do su lnsufit~ent. C()t'lfirm~n t:llll)eM'ICnlt~l

12.3.3.1 Final de la elongacin


Se puede oonsiOtrar, OOtl<iePM!Itmenle que lB tem*'laciOn comprende varios aspoc!O$ E1 primero ~ ellO$ es 13 finalizacin proci~~1c dieh3 de ta f!!Mgadn por te ONA polmerasa, que so vcrrfic.tt en 13$ dos horquillaS c:se replicaCI6n de ~ r(l(:6c;On. prcviSitllelente cuando en w avance alcanoen a IO'Is horQui!l" r0$1>e(ti'V3$ de repliOOt'les adyaoontos ste t$ un proceso prctlcarnente desconoado. pero cuya resotvciOn no CIIM~ Clilicunaa conceptual. pues al reler'IO oe nueoos y la unlon de tos dos tram06 da nueva h8tlr<l pve<Je re$0111'etSe de 18 misma fOtlTia que la 1'1\tldur<'CIOI\ y uniOn de los fragmentos de Okazaki en lit hcbr<~~ rcWrdl'ldl"

Pot otra parte. como segundo problema. lalt'l POI' bCI;)rar cul es el nt:.nero de replicones implicados s-'l"'u11Meamente en ta replicacin de cada CJOm0$0~. Mi como tos me<:anismos de oontrot que coordinan E\1 proceso en todos elos. A diferencia del caso anterior no existe t'Un una hiptesis previsible

1Repfesentacin esquemtica de la replicacin de un cromosoma eucaritico 1


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Ml)l tlui~ fll(\~hliMe In e~on.un~in del (fllmento de Ol:~i adynccn~e. 1,..,~ cdllldor~ dr lo-s f)jll(-11\(IS ~ .k 111~ hebrns tille\'~ ~itn ~"len >oel diminnd~ rem "" SU)Ilh"',Jo,., po~ tllo.. lns ll~"bras tiiiC\oiiS qm:~n ms con~1 en 5 ( f\lle ~~~ ""''ldc:

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12.3.3. 2 Replicacin de los telmeros


La replleaciOn de tos exttemos del cromoSOil'la eucarl6tloo supone el tetcer problema de la tem'linaciOn. pues. como &e vera en seguida. no pUede llevarse a cabo mediante la elongaon IXl" la ONA polirnersw. Este proce&O e&. por ahora, ef mejor conocido da la terminacin. posiblemente por su ma)'Of traS<::endencia fisiolgica y pa1ol6gica.

158
Como ya &e ha estudtado,. bs tel6meros son reglones s.tuadas en 10$ e~etremQs dt
ml'l~ de evc::uiola&

REPUCACt0N DEL DNA

(pag. 92,, a las que se unen ciertas protelnas. Estn constituidos por~ ele 1ar:s faiTilias de ONA

m oom06011'1a& lineales de la

repetitivO no eodHiCOU\1e (~ 113~ formando b5oqiJes de 1 a 12 k.b de long!lud, con unidados de 6 ;:~ 8 pb tt~peti!Jas en tanoem O!'!t'ltenMM o mit"s die V9Ce$ Para entender la impllcacl6n de los teiOmerO!I en ta roplla.ciOn debon rooord;<ii$G sus dos a~racte:rlslie3s princi(X'IIcs 101 l'bund.imcia de repetiCJOfle& en tndem y e1 car&cter COiteSvo de 10$ el(trOIT\0$ {Q\le rea.Jef'da aunque $In ret~ 1\Jnc:iOnal alguna, a los elltremo& resthames de la acdn de delttl$ enzimM de reslrlocin sobre un DNA,. pag. 2011 El carcter oot\oe5iYI),. en fOI'l"'''::l de ~tientes 3' en uno de lo& exflemOS de los cromosomas, lat'I!O palflll'IOf. como filiaM&, &e expllca por el mecan.smo de te-plie&ein diSOQn!inutt do loa hebt<J relatdada (figura anterior) Como OOo$0CIJCnci3 tldiCIOflal do dichos saliente& 3'. se I)I'Oduc:e un aoonar't'U!f'lt.O ptogrtSivQ do la$ hellrol$ 00 ONA en sueestvas f'Ondo1s de r~"CiOn

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f 11 .:.111 rond11 IIX'e~iv.t de f~licaci/lrt lul lidltnS fllle\"1111 "-'11 tn.ie\ CIIIM:lti Cl'l 5' q.;,e MI (ll(ll;,ie, (.l)ln.) coaSueocJa, b klll!:itod del tron'IOSOOla w: ,n a.:onando progmi\1llfiCI\1C. M !>115dos ~\U't:tiiiCI~ o 1tk'lm~~

--== ============= = ='

Este acortamiento de las regiones telomricas (calculado entre 50 y 200 pb por cada di'l!sibn celular) 5UP008 la disminucKln ptQgfesiva de 1<'1 Jortgi~(l 6et ( rOnl0$0m{' <'1 IQ 1W:gO <.5t $UOHN':l$ divisiones oolularos. oon ~~ eonsiguien$e probl(lmo ' l p~r..'l la perp~:luaOin del met'$aje gentiCO. Este pr>r.ema se j:XJ(I(Ie rQ!v(!r on ,., cith.Mt I)I..Ci<'I'S 'l ~ aelvt<~c.;)n, lt'lmblft dtlrantla ~ase S del ciclo de di'IIISin celular (tema 9), de un nuevo lipO ~ enzima, ta telometa.s.a. que a&atg:a 10!1 tetomeros. c:ompen!l<lndo asl aa prdida an~rior.

12.3.3.3 Telomerasa: componentes y caractersticas


So M pmpue!ltO qoe la !elomerasa tn un re!lto tWOiuii'IO de una nbozima (p&g. 76) que pudo servir antiifme!\te pam anauuu la slme!lls de ONA; ta~ que pudo suponer un if'llarmeo.ario en la tran:slo6n eVOIUwa desde las RNA repllcasas a las transcriplasas inveJ;Sas proteica&. Se trota d4t una cnvrna d& 1ipo ONA polimafa:sa. ooncret.amente un, pollmerasa de DNA cflri9ida por RNA (p,g 147) y, pc)f taniO, ~una trttns~a!>a in~<t (p~s 196 y 206), pero oon caracterlsticas especiale5. Efecllvamem,, $0 trota do uM ribOnuclcop,otel~ $lo et (<'l)ttt de sinlotiwr una 69CUencra OOte~<~d!J DHA. y qJe nlil for~d., pc)f dos compon4lnt~:
1. Componente ribonucteotldieo o "RNA de la W!fOmefasa {TR o TER, ~ l~ler'lt$e RNA.}, de tainaflo vori;)blc 6e(P(Jil espec~es (desde 146 nudeb<los hasta 1.544), que forma pane integral de ta enzima. tnc:tuye ooa secuencia.

ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION

159

caracterlsbca para cada especie, de 9 a 28 m y tomt'!ementari3 a 1a secuenca telomtlca respeal.a Por ejempio, el RNA ooml)(lnenl e de la leloiTIE!fasa humana ( hl'R) tiene 450 nt f)tltre 10$ Que My una se()l,l(!!t'l(:la f"'C3 en C. (5')CCCU~3'), oomplemenu.ria y an~ra!ela a la hebra nca en G de 13 repetlctOn retomrlc:a (S')TTAGGG(3). Graaas a ona, oomo $t ~ h.Jt90. el hTR s1tve de molde para la sintesis de nuovns. soc~iM: etomMCM.

2 Componente proteico, que contJene la actividad nzimtica, o tr-attSCrlptasa inrersa oe la l~etasa ( TRT o TERT. de telomera.se lflve.t'S6 trooscnpt,se} SI<'I es 13 0\C.tivid~ te.lotnera-sa prop~atnente diCha A dlfetencla de la IT.(InSCriptasa inversa vlnca y 0e1 te610 de ONA pollmerasa&.. sintetczt~ ot ONA te1Qm6nco de (N)VO. sin ne<:e$idttd de c:ebadOI' alguno.. Generalmente suele Ir acompel'lado de otri.l& sub~n~ no cnlalilicas. t~mf)il!n pt01eieas.

12.3.3.4

Mecanismo de ac.cln de la telomerasa

Primera fase (A): La telomerasa alarga el saliente 3'


tdmcro hunUtno

\(
-1'TAQGG'M'A.Q(;C'M' AATOCCAATCCC

tclomc:ru~

humana
pnth m.1

( A 1) """"""';;,., <lo O> 1 C10mo,._O )

~~~~~==~~~~

( A2J """""' .1o......ssn~

apar<'ilmie~n de b11~Hn1n: J)I.~A

tciOOtrico y RNA de l:a tt<h!lllell!l'l

Fl ((l!l~te (ltO!dcndc la k'lorncr~:t au.lix:t la ~ dcl:~ah,'ftlc J' <'fnpii:Jll\lo) onl(l 1!\\lklc t!l bd)l:to de k NA

i.k 1 Pfl)JII!o tdc)mer..-

( A3J ..ns1ocacln )
ni.X'''""' nudrot"""" 1~()1. por b li;IOI'It~ "f*Sa
lil 1\'IOmC!'til ,.; d<->h~ sobr~ (i ~h;.'I'IIC }' f"I'C\'Iilmtnl.(' ~'i(). .IIJ.,,

(>.'otiS..,...undl) 111 ;.'m!lkt'!lCMan.:\lild


p-..,;Q.:< 3 l, tqX\i~III

de> !H,.~'U<,'II~;e.

fiiU,:'~~ ~ lllll~l~'l)ciJ..'~

,.,.

-MTCCCAATCCC
-TTI'.OOG1TAGGQTTAGGG'rt'l't.fi,QI;Tt'AQ;(;t'TAQOO'l'TA<;GC"M'AC<;QM'ACC;C;TTA(;

160

REPUCACtON DEL DNA

Segunda tase (8): la DNA polimerasa rellena la ooa hebra

12.3.3.5 Funcionalidad de la actividad telomerasa en las clulas


prcscn~ en c61u!M de la linea germinal,

En 1(11$ o61ula$ tomfrtiet'IS de 1<'1 m~yOI'it'l de tejidC)$ adultOS no est.e aetMdao ~ICWnert~~so mientn'ls qvc si 0$1;!1 en tejidO$ fetales y en ciertas ClulaS maore (p~ipalmente, hemaiOI)O~ic.$),

todas eliiiS clulas (lOO() diferenci~ y en r;\pi(lal C)n)li~iQn , E~ so oe,. a la r~iQn de la ell'tlfesin g6nica, al igval qve ()l3t3 CU&Iquier otral)ro~ (tema 20), petO aqul no se neoetlta erwar en toiS meeani$(1"1()$ IXlf lOS que $e evila 1 <'1 expresin de 1<t ~rasa , Sino que iMeres~t deStacar sus oonsecuenaas. En ausencia de telometau. a medida que las c&lulas se van dMdlendo -y envefeclendo- sufren un proceso constante- de aoortaiTII8fllO de sus telmero6 (pg. 158). OaOO el ~rc&er repetitivo y oo codificante de $106, inieia!~e esa p6r(j(Ja, de lOs extre!TX)S de cac:.la trOI'T'I()$()rtTI3J no tiene consecuencias. pero noga un pyn~. ~ai:Sas
todas l<ts rcpolic:iono$ IOIOm6rit:a$, en que afecm a regiOnes eoctilleante$.. y entOnces 13 fun~ ~ul3r se ve pcrjudic.dn y IJ ol\.fa; tetmil'\;l par morir, S. M 0Qn$i(Sct&<JO es~ tl~miento oorno p:.rte ese un 1e/()j OiQrgicO o cciufN Que mide el procesc> de envejecl~. contando' el nmero de dhrislooes hasta <JJe la clt.'a debe morir, para oootrolar asl su proli!eraein corretea en los tejidos. Puesto que en la may pane de las clulas de un organismo no 1\ay actividad telom8f"ii$CI, este a00f1amiento es fisloK>glco y se produce oontinuamente durant-e~ la ...~ de oo individuo En ef~:ttto, M ha dem0$1r..OO Que la prdida de repetiaones telomncas aumenta proporcionalmente al nUmero de divisione$ mit4:ie8s e~~:perimel'l~ o a la odad del individuo al que pertenecen las cUM. En consonancia con e&le hocl'lo. se ha ob&ef"o'atlo QI.Mt la inlroduocin af'bllclal de telomerasa en clulas somticas normales repono .., pn:lida de telmero&. Se ooncluye. par tanto, que el acortlwnicnlo tclom6rieo e-sltl telacionado invet'Samcnle con Cl gr&OO de i!"'mort.etid&O O&lular y. en defi!"'itiva, que Cl cnvejotclmleruo es un.a consecuencia de la prdida de telmer os con la edad. Ello e64 tantin de acuerdo con la prdicl<t acelerada de teliTIQfQ$ oblservad<'l en pacientt:s de vttrios si~ <Jo envejocJI'IiieniiO prem~uuro.

La tcJomer-;au est i prc.s.ente. por el eon1rario, en easi todas las oeuas en prOileraeiOn, en espeCial en las clula$ tuMOmles, corrttlbuyendo junto a otros &actofes a la proliferacin lnOOflnlda de tos n.mores. A&l. el aumenlo de accividad telomera&a obMr'iado en fa&e$ tardi<t4 del progreso t~o~morat pUOO. $Or noc....-.r> ~ el crecimieo!O del 1\lmor. 011 impedir Ja, muerte oetult~r
Por con$9Jionte. se NI propt.teStQ 1 3 i'll'lil:lieiOt\ de la accMdad telomerasa eotr'IO un prinCipio de terapia antitumoral y la telot'l'l&tMtl se conSidel't'l una <tana ten~Putlca . Se buscen actualmente lnhlbldores especltlcos del COr'nl)<)t\ef'lte tat8illtieo eJe la telometasa runana. ttwmacos y fac:~es que ac:Wen modulando la telomerasa o cualquier olro companertle asocit'do <' lO$ ~os . Estos aspec:~os tienen lM\ problem*S <Jo envt;eeimiento y Ct'ICer.

gran itllef's aplicado en reladn oon los

12.4 REPLICACIN MITOCONORIAL


la repllcaclon del cromosoma mitooondrial humano se realiza POt oo mecanismo peculiar. di:ferente al $$b./diado para los c;a$0$ de procariotas y genol'l'llll nUClear oe eucano&as.. PreW&mente, se deben ntroduclr alglM\09 conceptOS relativos a esta molCula Cle ONA.

En el cromoeoma ~ocondrlal, circular, una de las hebras PG6M un ma)'Of' contenido en b<J$$6 purinicas. par lo ! ~ora o L (lighl), Por otra patte, ooa zona particular de la molcula recibe el nombre do na de ct..&doblamionto o ckt dotplaumicnto, o bucle O (O-loop): se trata de la riC<tregin oo c:odif~eante del ONA ~Cirial, <11.* desempci\;t el papel de rcgiOn do control. oves OOfltiene el Ongen <le r~n ~ 1& hebra H y lO$ origen~s <Se ltt'lntcrii)Cin <Jo ambM hebrM

que se conoce oomo hebra pe.uda o H (de MJvy. en inga6$). miontms que ea 04ra es l<t hebra

REPLICAC1 0N MJTOCOHDRIAL

161

ONA mi~~C~C<~ndriJ

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La !)limeta caracteri$~ singl)l(lr de l3 replitacibf\ del ONA mdocondrlal es que no tiene llgar especlhcamente en la fa5e S, sn:> a fo largO de 1000 el cielo celular. E1lo e!U de acuerdo oon la dviSin de las mitooondrras durante la lllterrtt~SC', en de~Jfase oon la oM&liOn de ocros orgftI06 y e la c.lul<'l Adem.ias, no tOO;t$ la$ molCl.lltiS de DNA se replie&l\ una ...e.z por clcio, sino que lo hacen al azat,

La segunda peculiaridad que diferenCia esta replicacin de la del genoma r-.,deaf es $V avnnoe: unid ircccton.;~ l, meoiante doS hOrquillas que parten <le origenes distin1015 y avanz-an en sen6do OI):J0$1o sint.ti:ando 1.1n<' SOI<t het>ro caaa una. Cano consecuencia de este mecanismo, la replicacin lamllin s. diferencia de la do! ONA n~.~CIM PO $el' no simultnea, bHocal y conti'nua (no M klrmaln l'ragmen4os de Olt<'Jtaki, !Ois dos llOOr<ls s. sin~i.tan ~mo conductotas).
Rep!icaCIOn del genoma nucM-.-r de eucaliolas Rep -caon cel ge,oma mitoconclrial 00 cuct~riolas Replicacin del flCOOma ptOC&ritiCO

Carcter
semiconservadora

Simultnea en ambas hebras


seeuef'ICiaf Bidireccional Origen

si si si si

si

si si si

no
si
para 1.1nobrfocat

no

miA!If~ll

mlllples

~~~da hebra

NOO

monofocan

SemldiscontnJa

no (C()fltl!\,l'l etl <~~t> hcbl<tSJ

"

Tema 13

Hibridacin de cidos nucleicos: fundamento y mtodos de ensayo


13.1 Introd ucci n : De-snatural izacin y renatvraliz:.ac:in del ONA. .............. ~..................................................... 163 13.1.1 Aglen4e& detsnalur;;a,lizOJntG$ .... , ., ........,........... ., ......... -- .. ................ . . ...... .. ..... .. ........ . 164 13.1 1.1 DesMturali2&ein y renawra!lzacln por electo de la temperaiUra ......................... ---- 1&4 13. 1.1 .2 0-esMtura~lon por cu:tos y bases. .. .. . . .. .. .. . . . . 164 13. 1.1.3 Oesnatura~acin por agentes c:p.Jimioos ------"""'' , ... . .............,. 1~ 13.1.2 tnlluencia de fa desnaiUratizaciOn &Obre tas propi~ del ONA 165 13. 1.2. 1 In fluencia 60bte lot vi$C0$1dad ... .. .... , .. ......... ..... ------ . . .. ........ . ........ . . .... 165
13. 1 2 2 lnflvenci<'l $()()re ~ 3bSOre.)tl u11ravi01eta
' " ' ' ' " ' ' ' ' H - < H < > < > H < H H -< <><><< < H H H < < < HHO<-<-HHHH

16S

13.1.2.3 Signmcaco l)f'CiiOO de las OJt'tas de <Se:snawrallzaciOt\ .................................................. 166 13.2 Anallsis moJe~;.utar de la hibridi!lcin do .c:idos nucleicos - ............... -............................. -............. 167 13.2. 1 Principio bsico del en~o <le hit>ridaCIOn ....... _,_,.,... ,._,_,..,, ............................................................ 168 13.2.2 lnfluenci<'l <le U~gvnos f<"Jc:tore$ sobre la Nt:ld::te.!)(l ............. _ . ,_ ............. -............ -..................... -......... 16B 13.2.2. 1 R4got de la h!brldacion..... . ................................ ........ ........ ..... . . ....... . ...... . . ... 166 13.3 Mtodos de en e.ayos de hi brid.-cin ............................................................................. -............................... 169 13.3. 1 H:ibndaci6n en f(l$e liquid3. ,._,_,_., .. ,..,_,_., .,,._,_,_.. .,,. .. _,_,_,,,. .. _,_.,,.,,_,_,_, .. ,,,_,. .... _,_,_,,,._,_,_,_,,_,_,,,. .... _ ,_,.,_,_. 169 13.3 2 Hllrid<~ciOn en $OS)C)t!e slidO ...................... -....................................................................................... 170 1 3 3 2.1 Hil;riclaCIOr'l ~~biOI" y '"StolbiOf ........................................ -................... _ ,_ ,_.,,.,,_,_,............. 170 13 3 2.2 HibfldaCIOn oe Soulhern ......................................................................... ....... -............... 171 13 3.2.3 Hibt'ldaeiOt'l NoMern ........................................................ _,., __.,.,,.,._,_ , ............. -..... 171 13.3.3 Hlbrioaci6nlns1tu ............................................................................................... 172 13.3.3.1 Hibridacin in S/.tutisolar _,.,.,._,_,_.,,.,._,_...... ,._,_,_.,,_ .. --- .. ----.... -----.... _ ,_., --- 172 13.3.3.2 HibriclacininSIJucromoSO'IICa ....... ................. ....... . ................... ..................... 172 13.3.4 Tcnicas relacionadas........................,.,_, ....,.,_,_,.,....,_,_,. .. ,..,_,_, ....,_,_,_,_,_, ...,.,_,_ ,._,_,_, .. ----- ... 173 13.3.4.1 Transferencia Western ......... ...... .. ......... ...... . . . .... . . ............................. 173

l a hibttdacin es oo fenmeno de import.Mte aplicc.cin prctiCCt on IOdas l<tS ilf@iiS do 13 8iologla MoleOJiar e lngenierf.a Gentica. y en especial en la Patologia Molecular Ptatill c.omlltender esta& ~ones es pteCI&O estudiar prevt8me:nte 18 ~se ITI()IeOO.W we 1vn(S31menla este Pf'O(le$(l y los meiOdos ensayo etaDOrados Ntfl su ttOiieaeln (M este ten\8.). asi como la91&enieM de pteparaCin oe sondas (tema 14).

oe

La hlbrldaclon est basada en el pt008$0 de renaturaizacin de dOs cadenas sencillas de un ONA.. que se observa. por ejemplo. al enfriar lenl8mente una &Oiucin del ONA dplex previamente desnaturaizado por calOr. La set~slbllldad del aparearr*!luo por puentes de hidrgeno entre bases complemental'lils (AT. A .U o C-G}. presentes en cadenas sencillas contiguas, da luoat a estructvras de dOble hebra. de gran establiclad Estas QUeden ser l'l.ibtidos ONA..ONA, hibdO$ RNA-RNA (ambos horncxfUI)Ie~~o) o hib ridO$ ONARNA {l'le~plex)

13.1 INTRODUCCIN: DESNATURALIZACIN Y RENATURALIZACIN DEL DNA


Pl.le$1o Que la hi~ci6n surge de la observaciOn del proceso de tet~atur~liU.C:iOn <Jt un ONA prcviamerne desnan.ratzaoo. se estudian oomo ll'lttoduocln tos procesos de desnatura!lz.aclon y renatvrallzaCiOo..
Al .gua! que lcJ.s proteinas. los e~doe nueleloos s dtsnaturallun por e'ecto de ag.enteS qui mloos o ti8iC08. $u OOtl'c>rmaCiOt'l tri(Jimensional. et1 t$1)e(:i<'ll la f0tm3 Ou~i~ <let ONA, La <lt$naturalizacin se debe ltln.a 8 la rotura. de los puente:$ de l'idrgeno ontrc p;are$ do 00$0$ como de lt~' intoraociones hidrofbicas entre baS%
peroie~

164

HIBRfDACIOH DE CIDOS N UCLEICOS: FUNDAM.EHTO Y M T ODOS DE EN SAYO

apiladas AJ <Msnalum!i.uww, I<'IS dos ~s del ONA s. .opar.~n y p;~san a \1'18 oon6ormacln al auw {o de o-.-o aleatono}. sin que se ~ere la esttucnn ptlmat1a. pues oo nay rupttn de ent~cs c<walenlos En el ~o de los RNAs, oon muy distinta con#ormadn tricllmenslonat a pesa' de su analogla en eswcbJ1'3 primaria, 13 Clesnaturaizacin afecta fl.ndamemalmente a los tANAs y rANAs, ya que son lOs que pteSMtan regic:ltles en CIOtllt h61ioe. Al no dar lugar a
apllcac~ experimentales. la de:$nah .r{tlitaC:i()rl dl RNA no se considera de

fOfi'Tla particular en este tema.

13.1.1

Agentes desnaturalizantes

Aunque pueden considerarse desnaturallz:anteS bs miSMOS l&ctotes que aetU&I'I tobre las proloin.M, $IO :;o ci"'rn aquf, brevemente. los cidos y bases y cierto6 agentes qul micos, para oeotrar la atet'lcl6n en el e1& <Je 13 temPatura, oomo faoctot representativo AUJ"qJe cada uno de ellos llene un mecanismo paruculaf de actuaciOn. tocJOS debifllan las intetaociones por poontos 00 t.drgeno ykJ de apila,...,!() de bases. conduciendo a un mismo PfooeSO de OC&n<tl:l.ln'lli~i(ln y dO $ep3:r.Ci(ln de la$ Fleblt\$.

13.1.1.1 Desnat uralizacin y renaturalizacin por efecto de la temperatura


La letnperal\lfa, e1 agoet~&e de$n81llfl'llizanle mM tec)(esenta!ivo. acla <St lt\ torma s~'t::
El r ..knllll1lJC'IIIU :;;nu, u:d del O."rolA okhtlilll "'" rucrt.~~~ <:)lllbiliuo;ko.-~~ O: b doblt.: ~l.:o:, le (Qrma que las U htbfi!J .sc- o,k,;:.:nrnr:tm
hml:.~ ,. ~~~ ~QUI

Si <:1 \n(n,mi('Dit! l't ~ ltlltll-1(' y sinlle~ a N.jalr lt:rnpcm~Ut~~~ (lwm 21).)1) <('). hay pG\tiblli,L"Id

1 molcula de DNA de dobk hebra

"\'flC!UI'Nh.''fl

desnatu ra lb.acln
l>('pk"flll'lllll

fn<:~-WP"X~dc

Cllntl'I1U11 M' CUflllllll& )'

do: ~uc .... ~ (t~mpltmcnlllriao M: !f ~ fOtmen d: 1\UI'V~ kas IIUI:III.:l oJr: hidtg.tno cntn: l;u llebn~ ("ltmplaotl'q. 1..11->W pul<: de lao ude~~~U :ttQCill lommt~ el miSil)(! ONA okoblc aripn.al: s..: pt'l)IJJJ.:e la
del ONA.Hl-JI eli.'l'it.la
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""""""' calcmamicmo

--::,~~~:::::::::~rcl,J :a tu ra

ci n

desn lurA.I i:u.~in

rt'\'cn ib li'.

cnf1iamicmo lento

2 mol(ulull de ONA de: hebra M':nellla

En general. se e~ el proceso de de$nallJra!iz:aci6n para el estudio de la e&ttuclur8 del ONA. micntrn Q1.10 &3 renaturaHz.acln 86 til oomo bas& de la& t6cnic8s d hibridacin, de enorme tr.IISCC~it' en BiOiogla MoleeuiiU e lngeneria Gentica. La do&nliM<~Iit:aciO<I\I'renatur~liUtCiOn e$ e~n1e ctltiea en la tCnica de PCR (tema 15).

13.1.1.2 Oesnaturall:tacln por acldos y bases


Como ya se ha e~udlado (pg. 42). el apareamiento de las bases disminuye o se debiliu. po1 valore& do pH alejados de la netStralidad. con la oon61guiente des~uralizaci6n del ONA Sin ..,bclroo. oo mediO ;)Qdo p~ QOnducir t;~mbi:n <' 1;) rvpturn de 1:- e$truelllra primaria de 109 eidoe nuelelcoe (recuerdese que el medio eido luerte rompe 106 enlaces rostOdiS4er y N-gliCOsktloos. mlenb'as que en oondiciono5 ms &uaY86 -f)Or ejemplo, a pH alrededof de ~ $8 sepet8f\ las purir\as: pg. 35}. Por ello. para la desnaturalizacin del ONA es ms habitual emplear rondiciones alcalinas (a las cuales el ONA. a diferencia del RNA. 86 estarl*t}. l a I'IOIAJ<'Ii:ri~cio dol mOdio puoctc permitir la rocuporllci()n ele la estructura de partida, 85 decir. ltt ronatur:lliuci n 001 OHA (oon OOr'ISicJetaCIO~ similares a las de la deSnallJrallzacln pOr<;<tiOr) ,

INTROOUCCIH: OESHA TURALIZACIN Y REHATURALlZACIN DEL OHA

165

el ONA S(W'I motecutas &enellas atlamente polares. con grupos amino y W~rt)Onilo . stO$ le$ '*milel'l competr en la fotmaOIOn de enlaces de hidrgeno con Sos grupoo amino y carbonio prOP<I$ <le las bases, raciti!ando asl la ruptl.l'a de sus apweamKm1os y la consqnente separacin de las hebra$.

13.1.1.3 Desnaturalizacin por agentes qumicos Algunos de tos tot'l'lpUHIO$ tt"'l:lletldos con ftetuel'leia para d&Snarurauz.ar

Agentes qumicos dcsnntumli..:ntcs. <k uso ms frocu~"tc :

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fonnaldchdo
9$13 ~e &e cli,..,,

Oopc~o del tipo de &cei6fl del agente desnatwallz.ante y de la fOf'l'l\i oomo rC$ oonsoguir la tet'latl.lt'alkzBCin del ONA. de modo anlo)o a lO$ Cii$0S an1oriO

se puede

13.1.2

Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedade-s del DNA

En l<l {)filcUca. ta desnatutaiJZaci6n del ONA. se puede seguir fcilmente miditttm &c:~uel!l)$ propl&OadeS llsicas que permite' dlletenclar eJ ONA de doble hebra y ol de hebra scncil!n V~rins de ~ exJ)eM'IeMan profundos cambios (lurttl'lte e1proceso~ aumento de la ab&eroi6n ptica. cambio en ta rot:aciOn ptJca, avmemo de 1a oeMic:Sao de flotaclon y descenso de la visoosidad. Las ms utilizadas $01"1 la tlb$01'Ci6n en ttl ullt<l'l~;) U 260 r'lm) y 18 viSCOSidad. A pa.u Cle estos cambios tambin se puede oblerMW .,formacin de tiPO .structvrat acer~ del prOPQ CidO t'IIJCieico (au~ este aspecto no se oonsidera aqvi)

13.1.2.1 Influencia sobre la viscosidad


La rel81iva11gtdez de la doble hlloe y &u inmen$<1 aoogitud en ~tlefOn (11 di(l~tro Meen que las diSoh.JCiOI'Ies de ONA de doble hebra sean muy VtSOOI$a5. Por el conlf<)rio, en forma do htt>t<l $enona et p~iei'IIO al azar de la C$(Jf!tl8 hace que la 'IISOO$idad Mli'l menor. Dt ac~o COI'I ~. a1 aumentar la .ernperawra. el pH o la concentraCin del agente QUimtOO y produtirw 1~ df!sf\Munlllit3ci01'1, se obSeMilM\8 Oisminueln en la viscosidad de ta diSOluCIn de ONA. Cambio& en tn vi$00$id00 y 8b$0rtl0tl optiea del ONA por electo de la temperatura (resvllada$ similares se obl.lef'lel'l con c~~ otro &gente desnaru!llllzante)A mayor temperatura, ma r arado de desnaturalizaciln

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IJe &O~ dM~81il:$(111!)
AI.IM(!I't\0 de la abSorCin

Descenso de 13 VISCOSidad

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13.1.2.2 Influencia sobre la absorcin ultravioleta


Recurdese que ltt& base& n.trogenadiils, los nv<:lo$idos y los nocletlos poseen valores milxmor. de ab&Otci6n de la luz cercanos a la longitud de onda e 260 nm. dobidio a ta P1'9$$ncia en &u molo.Aa de sistemas conJugados de dobles enlace&. E!M propiedad se mantiene en los cidos oocleiC06, pero la tna9fW!IJd de la absoran no er.la ITIISma. pU$6 el apilamtento y los puentes de t.:kgeno la reducen (a eSio se Wt llama efecto hlpocrmlco). Pot ello, el ONA. de hebra sen~ atorbe en m;~gnitud simtvr a los rn.~c\ctitto& R:>r.s. mientras ooe el ONA de dotll8 nebra absorbe mel'los. CO<I eonseeuer'M':ia, la <lesnatulaliZaCil'l del ONA va a001pal\acla de ul'l aumento en la A.-x,o (al que se Lvna efecto hipercrmico).

166
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HIBRIDACIN DE CIDOS NUCI..EICOS: FUNDAMENTO V M~OOOS DE EHSAYO

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Ob$f\oese Ol)(llPara1V1!t'rlMie la relaclon exiStente entre dtSmlnudn de la Vt:SCO$da(l y aumen10 de A26Q ntn con el Pfooe90 de desnabJrahzaaon del ONA. El RNA, al presentar en 51.1 ~ un graoo vanable de doble netJra. Pfesen1ara tM'Ia absoran Intermedia entre la de un ONA dple.x de t.amal\o equrvalente v uno de hebrn simple (de&naturaizado), la magnitud depeOOe de la: c:omp&e;dad de &u eslructura &eOUnana y por tanto. lambin del tiPO de RNA (mensajero, ribostnlc:o a de tmnsforencial

13.1.2.3 Significado prctico de las curvas de desnaturalizacin


La 'eposen1 acM g~tic~ de la vatiBCIOn de viscosidad o e ~ lrente a la tempera!IJra (o concenttacion de obtener las cutv.n de desnatutallucln. que &oon caracterlstlcas. para cada ONA en d!soluan. El cerctet slgnodal de es.las curvas Indica qu. la de&noaturMaon se produce brustamtWIO. on un mafVCO muy esttectlo de lemperalura. de pH o de concentr..cln de agente $$n<1Malil.arl\1e Esto oontra&t<J 'n NI tr<~n$ici6n ms gradual observada en la dMnatwallzacin IBrmlc8 d$ proteina$. y~ que las inl.erl)(;ciOI'IC$ QU& tn$ntlenon 13 doble hlioe {aptamlemo y puentes de hdrgeno) &On OOCJI)erativa&, e& docir, lt~ ~ ,r<~Qft de l;t$ ~' on Ul'\ ~ fa'iCM'eCe que se &gan separando en el resto de la molcula. Al ser la trarnslon ~ bru&Cil. I<J d<I$Nttura!i~ci0n t6,mc;a dol ONA es ~lrf'lt.(lr tn cieno mOdo "' la fliSiOn de un $iido, por 10 que s. Mbla lll~ de e utvu de fusi6n, y a la tempen'ltura cenlral del ~ervalo de uanslcibn (50% de deSnallJral!zac:ln) se le lama tempefatura de fu sin (T o T..,, del: Ingls meffing) Bajo condiciones definida&-. cad3 ONA muestra \nl CUNa de fu oon valore& Cilaeleristicot do T..,. y de m<lgnituc:f dcri o!~ hiper'CfiniCO (di~ emte A:;oao !:luma y mlfim;a, o <:0\mbio dO viSQO$idad) ~~os ~tos $0n una medida de U. ~labilidad esaructuNII de la moiOOJia d& Cido nvtlok;o. Sv v;tlol d~ adems. del pH y ta tuenalnic.a del medo, y de f3 composicin en bases dol 6cldo nucleieo Es imporiNI!e resa!r.tw la relacin entre T.., y el GOnleniclo en pares de be$$$ C:oG o A=T del ONA: Cuan\o ~s al)und(ttltes son CxG. ms desplazada hecla la derecha apareoo la curva es decir. se neceW mayo1 temi)Oratvra para l(ll deSnaDJta!lz.aclon, T,.. e9 mayor. V 'lkevtw'&a. cuamo r$ pares A= T, mryor despit.zamktnto a ta izqvierdt' y mcno1 T111 E$10 .$8 debe a ~. al se~ ms fiJene la lntetaocin el'lllll pares C..G (3 puenCes de hidlgeno). necvl5itan ma.yo1 enetgia para dtsodarse
aget~Ce desnarutal!zante) pemlle

ANLISIS MOLECUlAR DE LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS

167

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En decco. al <lete.rmlnar la tetJl)ef'atura de fus-.n para varios DNA$ d4J origenes di~sos, se N Moontrado ur'l8 00fl'ei3Ci0n lineal oon su contenidO de G-+-C (que, de acuerdo oon un<t de I<Js regi<\S oe Chargart, ya esrudladas (p&g. 39), v8tia en1re especies y puede e~arse oomo indiot en cstvelio$ evolut:rYOS}. EIO permite ullaar la T.., de una muestra de DNA para es1lmat su oomposiCI6n en bases Por e,empiQ, MI p~ utiizat J)."'ffl determinar la presencia de reglones r1cas en G+C o de 'islotes CpG', asociados rrewet~temente en el gE!f'loma eucanOtico a regiones promotoras. reguladorM de la ttiW'I$cripein y ~nmefllc metiladas. Finalmente. la rQprc~n grllfiC;ll de 1as cutvas de desnal\.l'allz.aclon y re.naturalizatin de un ONA permite oomo se indiCO a1 prindpio, que la Smllllud entte ambos proceS06 <kJc)ende de la$ condiQIOf'let en 13$ que se intente la tet~a!Ufa&zaCfn . Obviamente. ambas OJrvas di:$wrren en $O:nlidos OPYHIOS. peto slo si el oolrlamrento es ler'lto uene lugar una ren.a!Ufahzaetn, mentret$ cuc vn enfn<tmieMo rliCii<IO tt'l'lpiCJe 13 teasociadn corree1a de las hebras:
observt~r.

Enfriamiento rpido:
No hay renalurallL.adn
( ;\ :.e pc-r manf' casi ("on)t ilnH:)

Enfria miento hmto: Rcnalur ali1..ci6n


(dhrni nud n d r \ ~)

.. ..

.Joble

hcbrn

13.2 ANLISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS


Cebe tcncr11o en went3 que 1:1 tet~attnlizactn aepenoe Sk) de ta completnet'ltatiedad de seeUMCia de 1as hei.Q$. P()f eno. aunque to mtls ptOtlable es que estas se reasocien fonnancJO tas mismas pareja'S o dplex originales. pueden darse otras reasoclaclones. En partiCular. si se parte de una mezCla desnaturalizada de ITI06culas dlstln18s oe ONA, pero con secuencias parecidas en p&rto {OOf e,emplo. de OHA que ocxlifica la misma proteina en espeetes dl6tntas). ;,~1 ronttl\lra!iuw 110 Pvedc pr~it la asociacin p{treiat de dOS hebras proee<~entes de mo61!oeula11 dU(lleK dilltn1a11 Se f()fman asi DNAs hibridos de doble hellta, eon regiones de apareamiento y de no aJ)."'re::t~IO. Esta formacin de molOJias dplex. de ONA cuyas hebras tienen distinto origen (distinta especie o. en general, <i&ttnto ilcldo nucleico) reobe el nombre de h ibr idolcin Es a~r;;~ctcfis1ico el carjctcr ilrtifiet<~l de 11v C.On$qQ)Cin, ~ i!tM QUe tcwnbin se CX)(I$i00te hibridO()(I 1<'1 fonna.ci6n <:Jt: hitndOS et~tte DNA y RNA, o entte un t\CidO nt~eteico y un Oligonuctetl(.tO nctturat o sinttico. si(w'lpro en !uncin de 13 eltisten~ oe s.ecvenei<'tS 1~1 o ~(Cialmen4e oomplcmentanas .
iMIC:a que tos organiSmos oe donoe proceden comparten un cierto grado de netencla eVOlutiVa comUn. y que 541$ RNAs y proteinas llenen esb'lJcturas y fvnclones similares. Se dioe que los cidos nucleicos que codifican estas protefnas y RNA$ benen s..c.vencias si,.tS. homlogas. A mwyor grado de hibridaocin. m<ryor oone.xin evolutiva entre .,pecies, y vioovcrU~ . por tjemp~. t i ONA hvmnno hibtid3 en mayor l)r()C)()f(:iOI'I oon ..- ONA de ((}tn qve: con et d8 1.0 e~bil~ <MI l'librtOO fiS ~ttnto meyor OJanto mas elevada sea 18 ~Cin de b$Ses como~emeM3ti(lS y mfj}'(lt lt~IOngilud ese las Sec:uetlCi&S &p.ateadas. EJ heChO de que cacsenas ~iferenles ae aeido nucteico hibriden et\lre $i

168

HIBRIOACION DE CIDOS HUCLEICOS: FUNDAMENTO Y METODOS DE ENSAYO

levadura. Sin emb3rgo. no e:t 6$1f 11 (;ni<:<\ mucha$ et~tre ellas en e diagnOs.tiOr>Ciin.:;o,

vblidt~d

de I<J hibridacin, WIO que da lugar a runerosas

~ones,

13.2.1

Principio bsico del ensayo de hibridacin

Todo$ los ens&yos de ~daoin se basan en la gran especlflcictad de la iruerac::CIOt'l et~tre b3$e$ CCitfltllemen!(lri<'Js P<!rt~ Que 1;11 hibrid..cin permita kfentfficar en un genoma. u otra muestra cualquiera ae &ciClo oocleleo. una seeuerM:Ia partiCular s.e rec:ui&ren CIOS elementos bilsicos:

La presenaa de .la secuenda d.lana en uno de lOs fragmeniOS, genera!Mentte Obtenido$ con <tn~tl& de tSbiocin. de la muestr.~ de cido nudeeco. Un fragmento corto de cick> nucleioo. llamacb sonda, de secuencia oonoclda y oomplemenl.at1a a la s&euel'leia diana, maleado de bma que pem~ila t;u deteca6n (radiactivo. oob'eado. 1\Jotescente...: lema t 4).
rne:'.dll de (r,;nu:n~

o.kUNA
(de dllblc hchru)

I'IIC:t(b de: flll~ 1k ON A !k hcbn1 ,.,Oo. , ILII (ON A _~llatuntht.-kiJ

,. ':; -~ -
,._ ,_..;;;;r
r

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betcrodliplex, hlbrido~ de
la. :IUQd, """' 1,1111) de 1~ 1'1'28110'1101 de 13 tlll.>blr.l lit< DN1 \

llOfW de I)NA
('fl

n*''U~ COI'I I$ ~~Ca~encU (di11na) q,.e .e bu;o;-,

b muw ra

!J'M.J. .o:n W ia ~,lllbona.qw tllpo.>nt<


W'1 0.0000~"'4 ..1tt111t'0Da ..,...,

.1. T

homodl,lfll de: b
tu~anmJi:tado)

s..m.S.(ONA

13.2.2 Influencia de algunos factores sobre la hibridacin


Adems de la rompo9ein de beses de las cadena$. eKi$1c una $Crie de P<W~ ~ ttfectoln a la po$ibilidad de renaturalizac:in de dos hebras scntiua, y. por tan10. <:Onc:ieio!'l<lln e:~~pe'nontalmente la realil8Cin de un ensayo de hibridacin. Esto6 faacfM, cvya OOsc:Qx;in ~aii..OO <:Orre:$poni:Se a. ~ trM.-do e$f)ec:lfico de mo1odologl<t en 8iol0gi<t MOIO<:VI<w. Ht~n O$CIIC~Imenle relaCiOnadOS OOf\ 13 OOtloer'ltt&CIOn Cle ONA O RNA diana {00 SOlO la ooneentraciOn Cle CXIO t-..cleieo en la muestra. sioo el nmero de oopla!l de la secuencia diana que conuene esa muestra). la OOI'ICenttaCIOn y 18matlo de la sonda. la temperatura y tiempo de hibridacin, y las carae1errs:6c:a& del medio de reacd6n. tales oomo toona inic:a. pH. ooncenlrac:in de agente$ de$nt'Wfi!liZ<W"!tt$. <tdic:in de tiOrto$ pOiimcros, etc:. A ooncin\.la!Cin $0 comento~ $IO un il$pc<;IQ, de inters genere~ en eualquier ensayo ese hibricl&eiOn, determinado por algunos de dichos factore&

13.2.2.1 Rigor de la hibridacin


Se define el rigor (en ingiO$, &tringoncy) oomo ol grado de espocir.eid3d on ~ 3parea.mieMo conseguiOO el'l b$ hlbtidos: es decir. supone !A'la medida de la capacidad de reconocimieneo mutuo de dO$ N ~~~~~ 111 hibridacin. normalmente " bl4c:a ~ ~ro<'!mien'O CQI'MC)Ieto t!te sonda y dial\&, pero en ocaSiOneS lntete~ tolerar un cierto gr~ de csesapateamient.:l. 001\ ellln <M dei6Ct&r reglones del ONA cuya secuencia no es exac:tame.Me igull a la diana. pero pre&enta elevada homologia. Por otro lado. ol ~ontrol del gor on ~ l)licac::in y C$0 conc::re1o et esencial: ni debe Mr tan allo Ql.'8 il'l'lpid3 ltt unin 11t$1 ;ti)IC e la $()1'1(18 a su diana, lli tan bajO que petmfla la hibridacin inc~ifica de 1<'1 sondo oon $f)(Ueneias poco relac::iol'ladas, dBno lugar a una senal de tondo elevada o a falsos po$itivos El rigOr d~l'lde de diversos faclores experlmenlalea: temperaiUta y liempo de renaturalizacin (o templado), longii!Jd y oonc:entrac.n de la& cactena:s, oompos,iQItl de baH& y t~mbicntc Quinico (Pflt$CilCia do c::.lioncs, for~mi!Jil. urea. pH. tC)O de disoluc:in. et.c.). Cuttnto mi11 olovt~d<'l os 1.1 temi)On"!bJrtl dumnte 1. 1 f;)~K~ de ...,p~. m."''s e$00Cib

owen*

M T ODOS DE ENSAYOS DE H IB I\IDACIOH

169

debe ser te lntetacdn entre las hebfas para Q1.Mt M m;Jil4C:"'!);ln vnidas los cationes rnonovatentes { Na) estat:>ilizan el duplex. pues aparua!lan la rept.Asin electrosttica entre los grupo$ I0$1310, facilitando la a.ptoxlrnaOIOn de ambaS het.H'l$, Por !tn~o. la formamid<l y la ~Ji'~ vfoct;t.n a 10$ en1aoes de hidrOQeo!IO {pilg. 165) y son por ello agentes que desesttlbillzan la doble hlice.

En consecuencia. 10$ pm<;ipaie$ faC1ores que se suelen manejar en la prcoca para malOITIIzar el ngor de la hibridacin, y permitir siQ lO$ flibtidO$ que estn apareados oomplelamente. son la eievaan de la temperatura de tnpi..OO, lt~ di$mif'I~~Cin de ta ooncentraCIOc'l de Na y et aumeMo de le de fmamlda. Vl08'Yersa. para reducr et ngor de la hit)rid:.eibn, es decir, para perrn!llr la formacin de hlbrido6 paraalmente desapantados. se emplean ten'IP8fcrt\m.ls de templado relativamente bajas.. oonoontraciones altas de Na y bajas dt r~ida
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13.3 MTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIN


TodO$ los en$<JYOS de hibrldt'lcin se WIS$n en 13 Me:CIIl de hebrM set'leillllS de 6cidO nucteoc:o olutiS.Irtl o <liMa, m;uC<'do, <;on 1.1n& sono. de seeueneia (::()(lOCiCJa.. Mai'C&Cia. bajo condiciones e.perimertales que l)e(MiUW\ e~ a~:.miento enve baSes eornplementanas. SI ta sonda o el ONA dlana sen oe OOble neora. 1\an de w prteviamente Ot$natu~lita4QS, ~mente por caiOf o por tratamiento alcellno. Una vez mezclacas, se petmlte la ren aturaliz.aein e-.n ta ct.lllf. 001"1'10 ya se ha comentado. se pueden tormar hlbrldos sonda:dlana. Se 1\a de diSpor'W!f, Me-mas. de Ul\ MiOdo pata deteclar tos hlbrictos toonados. que viene determinado por elllpo marcaje empteaoo en la sonda.

no

oe

los ensayos de r.i:lndaci6n se oueden clttsifictlr en tres gruPOS:

Hibridacin en filS lquida


''Oot+blot'' \' "'SI\ltblol"

Hibridacin en soporte slido Htbridacin ia sim

1-Jibridaci~ de Sou!Mm o ..Soothcrn bt.o1.. 11ibridadn 1\'orthcm o M'Jorth~~m blot''

13.3.1

Hibridacin en fase lquida

~$~ tv& el mlM<IO iniCJ<~ImrriO empleado. Vliliza,ntto un& muestra de ONA o RNA. en disolucin, se realiza w hlbrldaOIOn con 1a sones: a1 estar ambaS diSUeltas. 1a cintiCa es ms rapiea. Adems, t<X18$ tas rnot6Q.IIa$ CliMa son guatmente accesibles, por 'lo que la tecnlca es ms cuanMaliva que la hlbrldaein en sq:l()tte SOiiclo. ~ ernt>argo e. (JI m61odo ~ menO$ se utiliza acl\la1mente. t\atlienclo sido desplazado por otros ms 0011\'enlentes. Se aplica. por ejem'llo, tf'l el estudio de ~ c~I'\ICI\IJ(I4f los mRNAs emPI&.3ndo lli.'Cioaso S 1

170

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HIBRIOACION DE CIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y M ~ TODOS DE ENSAYO

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I>M'Ia dOieiOII y O.OaN:IIi::iiiln

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llb-oOOIIIPOII' ...... ~

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13.3.2

Hibridacin en soporte slido

se ttata de un tipo oe ensayo mas Si'nple, que permite procesar varias muestras slmt*aneamente y tacll!ta el OQMrOI de la hibriOaein. Aunque 1& ~lea de la hlbl1dadn es ms ien&a y el proceso menos ellclente. se utiliza mUCho MM que .la hlbrlcsacln en <bolucl6n, por ser ms sen~ de realizar y ms verstil.

E.s!OS metodoe han adquirido hoy dla un inters parbculat como herramientas muy vrldas para el an.Msis de ddos nucleicos y el6agnstioo de enlermadade& moleculares con base 98fl6ca. C<lmo antecodenles. PJIO(Ien citarse la lnmc:wlllzaciOn del ONA en nittooeluiOGa, &u det9CQn por primera vez por lllldacin y el OO&OI.Itlrmienlo de un mModo para &a lisis in situ de colonias bacterianas en filtros <'e oetut~ .

El esquema

genero:~~!

de este b1J0 de on~K'YQ$

M puocte ilustrar oon et mModO oomUnmente empleado

~rll

identif~ear. de entr9 voriM QO!Ionia$ b;ac;lcrianas on ptaeas eJe cullivo oon agar, tl'agtr~ento de ONA de lntetos bajo 1a fonne de plsmido recombinante (tema 16),

aqullas que contienen un get1 o

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$t llltljo()lli .. d@

l)&llal 01' ag~r ~u,_ diJ

<tlda ('.0101\ia M PlQIWI I)Cipel.

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S. ~ ., dhoo da PtiP'I con 1.t 101*'- 1)e " ' cx*n... Ot ~

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13.3.2.1

Se~-~Pd

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t~<le~X)

dtclr.- ,~ '1~ (Oillc..... fl

. . . .................... - -l)f<C . .. - ..

,............

'fMIO.-.Ia-.111

Hibridacin " dot-blot" y stot..fllot"

Es ef mlodo m:5 ;imple y eomUn. 91~eias a su J)OI$ibificlad oe empleo con muestras de cldo nucleico sin purificat (por ejemplo, sengH ) , hoots o esr;~utos). la ~ se aplica. bien gota a gota (dot~) o en manchas alargadas (.SSOrbfOf). sobre un "11!110. de n)ton o M rocelulo&a, Oll)'a& prQPO<Iados do 00$01'c;in fijan las molCulas oe eillo nuctelco y prote!na.

ME"TOOOS DE EIISAYOS DE HIBRIOACI:! N- - - - - - - - - - - - - - - - - - - ' 1 "7-'1

13.3.2.2

Hibridacin de Southem

0c$(WIQIItdl! pOI t;,M SOU!hem, al que deb~ SU 1'10\bi'O (Southein ~ . Es &1'13 tCnica Simple yfol de reallz.at 9 d4Jioct~ rr;'lgmenl~ ~ DNA, sepatados por tamatlo mediante electro!oreSis en gel (pg 137) Combina la $CPar~n etoecttOforllca del ONA oon su trans.lerencla a ~ sopotte slido o 'filtro (rrylon o nrtrooetulosa) para su hbrid<t~ Ta1110 s1a como ta posll:lriOf detecclbn se realizan de lorma mas: eficaz 8fl el !'VIro de Jo quo 58 han.a en el gel ES'Ia tcnica ha eonMbuido de forma notab1e a aumentaf la poleru:::aallclad de fa hiboaci6n oomo herra~ruenta enalitica. coostltll)'endo hoy dia en bloQulrnica d imca ct mloOO he~biluol dt.' (ln<\li$is del DNA exlri;I.OO tJe mueSfmS <M

sangre, ~pl.dOS.. reji(SO y Clulas (llnfOOIIOS, 3fMiOCI!O$ .J


Mcx:So~Ogleatne!nle

lmpliea cnco ecapas bien d!rerenc.adas: separacon elecuofortaca, desnatur-alizac:fon,

tr;)n$1ert'hei3, h01daci6n y deteoclon

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13.3.2.3 Hibridacin Northem


A diferencia del caso an.tenor, su Mm~ (notthem .t:tot) t10 COf(espont ~ de ning(ln IIW(I;ligMor, ~a un unple Juego de palabras (southem = del sur, tWJttttem = del none). El procedlmento es.ICIMtJCO, p6fO el CidO nucleier> ;~n::~lir.:ldo n5 RNA Por 5U tn9I'IOC tamilo, nQ 95 no~nc- w ft<loJil'l$nlaca6n IXln e~l$aosat>. pero debe 1enerse es.pee.al CullladO para eW:atla 4t<iei0n ~ RN3Stt'&. l<'lniO en<:lgni!l$ C(lmO OXSJCn<'l$ (contaminacin muy comOO.InCiuso por las manos del anali!lta, y muy dlrkiles de IMetivat. ES uso co agentes dtt$t\o'I!UI';:Ifa;.\ntos $9J'O $tl..'ndo necesano para evitar apareamfefltos .ntmcatanatlos. que a!lemrlan et patrn de !leparaein pot tamaM la tcnca 6e hibridaclon Nortnem se emp1e.a pnnclpalmente para obten&f' lnfOI'maeiOn SObfe el tamano do!! RN.Ali y liObte el modelo do e"presin de 991"" especrfioos. Es10$. une. 'V9l c:lonadot>, pueden & UllltZados. como sondas pam hibrid3r m!Mir<l$ O. RNA t'i~ de vna v~ de lojidos dilerenle&. y oll&i oonooet los tpos. celulares en los que se expresa e! gen. la .abutl<!Jn03 te131lva y tamal\0 de lOS ln:11'1$CNIO$. y dl'lf$0$ de'lalle& de &U procesarmenlo poslerlor.

172

KIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y M~TODOS DE ENSAYO

f.jcmplo de m1crpre1sctn
de un experimento de Southcm.
Las srnaks <Jblc:rudas cD la :.Uion-...Jiogr .. fRI d.:pmdcn del mupa de ~tril:c;in del ONA (dutribo(in de kll5 puMOS de t.'.Jonc J l i.k lb rondas n nplndas.

~=~ ...........
A 0

IIII!Wi'k> jlb)

- ... . -. .-.. _,
~()No\

N$Ullado de b tubnda~ t(to Southern trn~ la aUion.dl()gtal'ia

- .... .. _ .... ...........


......-o~l)

df P>i-'

13.3.3 Hibridacin in situ


E& un tipo espe<:i;lr~t.-do dt hibrid<'Cin en sopol'le Slido, et1 la que la SCl'lda se aplica 90bfe muesttas en su t.bcacin na:l\lrt~l. genoraln'lente aQuellas preparadaS para mlcrosOO!l'a. Supone, por taolo. e6 empleo de la hibrlljacin Np un al)c)((laje eilolgico e hiStolgico. y metodolgicamente e& anloga a la& tc:nlcas innuwx:itoqufmicas e iiM'IunotustoquimiCM. Oe forma muy global, cabe distingt.W entre su& aplicaciones tiQAcw y cromo&Omic...

13.3.3.1

Hibridacin in stu tisular

Se realiZa sobre oones de tejido. clulas In~. ,.j,cleos aisla<io$. , En muc;ho$ ~$0& s. il:rv;) a C<\bO dlltectamenle sobfe tejidos fijados oon f~ incbd06 en pam&\a. oo~dos. eec. es unITIQ<J:IIidad d& hibMaein pattladarmente Importante para detectar virus ~~1'10$, par<' diagn0$~r C61 uiM tanoetOSas 0010 consecuencia de cambios genelcos o para estl.dar canbios en la exnsiOn Q6niea. deteett~ndo secuencias en el RNA oelulat. En es.1e caso. ttas \.W\1'1 r~acln suave de la preparacin. se afladen sondas de ONA <:Omplement<lrio {CONA), de hcbr3 sen~. La delecx:IOn se realiza por euiOtrildiogr<~fi;t y ex.;wne;n de &.1. peltcull'l fologrMlca bajo el mierosoopio, o por l"'''ierosoopia de lloofe&cenciil. s;i se emple ce m;)rC<'Iie PN"ala sonda (lema 14).

13.3.3.2 Hibridacin in situ cromo.smica


Se reaiza &Obra preparaocione$ 4Ml ()Ort.& de ~mas meta1slcos o prometafsk:os (pg. 90), tratadas con fijadores para onnerv<~r l<'s tan'Cicri$tic:as m0r101glces <Jet ctomosoma. Para haoer accesible la secuenQCI de ONA. se lr.lta 13 mucstr;:a ~n enlimas prOieolltlc:as y se desnat!Jrallza el ONA por ealor, lcal o Jonnan.da pera permitir su hibrltt.-.ci6n con 1 3 S<:c~a. l nieialme.Me se emp6earon sondas raciaoctfvas. pero ll'QOiemas tcnco& (1(1 la det:ec<:in de la set'lal lil'l'litan su utilicS&<J. Se ha~ aumentar ~ sens~d y ~lucin <;On ol empleO de sondas tnareadas eot1 nuorescencla. En es1a tcnica. llamada hibridacin in situ POt" fluorosuneia o FISH (/'ttlof'e$'CM~Ce In situ hybrlCNza!ton), la deteocln se haoe bajo lricrosoopio de tluoresc::encia, bien de tormt' directa o IJCI un l'l'ltoOO ~ecto
(pg.

1M>
En cuanto a svs a()(I(;;)Cioncs dada la gtan deteetabllldad de los ftuotoc:romos aecuales se puede empl&ar la FISH

con fines mvy diver$0$ y se ha OClfWertldo en una lcniea con elevado potencial diagnstico en (;J"OI'I'l()$()OP31it'$ (tem3 29), gene.~ tumOtalet.. vlroiOg&a, trasplantes, etc. Vno oe 10$ me-1 000$ surgidos de la hllridaciOn in &itu cromo&mica es el denominado pintado de cromosoi1'1M (cJwomoso~ p.t,imir'l!)). donde se usa como sonda una mezcla d4t fragmentos de ONA PfOCO(fenlcs e un MiSmo CtQmOsoma. con to cual se observa fluoresoencia en el crotn0$0m<l como~eeo. se * ilita ul la ldenuflcadOn visual de eacta CI'Ot'I'IOSOma (o vanos sirrv.ll~~e. si M emplct\n $(lf'l()as con distintos nuorocromos). en lo que se ha llamado un eanocpo moleaiar" E&kl es (ltil ~r<t estOOi<lr gr~tldes reotganizac::lones de lOs eromosomas. que denen h.9lf por ejemplo en proce&O& canceroSO$.

M ~TODOS DE ENSAYOS OE HIBRIDACIN

173

13.3.4 Tcnicas relacionadas


Se eomenta tinM-n~nlf! una llt(:ftca clt! anMshl que, aun no et~l'ldo baSbC.tn en !Qlf. prlnetplo$ de hlbrt;t<Jctn, POSee una swnilltud en tos planteamientos que hace Interesante 'Su eA'posieio ~ este lugar Hil' s~ongid<> l<lmbin Oti'O$ numerosos miOdos de anliSIS de acidos nudetoos, vanantes de tos 8iQU 1expuestos, que oombh\:tn fl!l .cOI"'f)Cil11ief'lto de ros addos noclelcos por sondas con la tnteracciOn espectflca entre aqullos y prnceinas, Ulle$ con'IO tos ensttvos da nHardo en gel o tos mf:lodos SoulhweSJem y FtJfWesrem Su t!escri)Cin excede el l\lieancc ~ eS!o libro

13.3.4. 1 Transferenc ia Western


A pesar de que en esl8 caso no exl~e h!brldacion entre aodot nuCiiiC:OS, se CleSCtibe aqui ~t(t ~ por su slmiltucl tcNCa y macanisbca con las hblda0100es Southern '/ Northern. El ensayo We$tern (we$rcm del C)Kie} so emplea Pll'fCt aetectar ~s prQ tefna& pres~wnes en una mues.tre. Para &110, son ~tidas a eteetrofou~StS en gel ~

proia<:rilamida (separndo$G en funct:)n de tamao y carga. salvo en el CB!IO frewente de electroforess en presencia de SOS, que S~P<If~l S6b en funcin dO ~milfk>) y tfltl$f<tridas a una membraNJ (wesrem brot). La delecan de las-bandas I)J()tiQ1$ en ta memb!'al\8 o muo se reah:a gr;t<:ias a la uni6n O$f.IOCificl.l de un Qn~ c;onlra fa; pro~elna o regl6o proteiCa que se qwete estudiar. Oe ~'arma similar ~~ tMrcaje y dC:teIOn de so~ <k <'tOICk> nuCfoeioo, so puede marCCN' ~IM'Itnle et \lllbeuetJX> o Qetecurto tnedi~nlelauniOn do una proleina liganle marcada a su vez, lanto empleando JS6!opM oomo t~nieas no t.'ldiacsivat El p~r;'llcA$mo (y t.os diklnJnc;ias) entre los 3 mitodos $1) roS\lme en 1.a figura

Southem

Northem

WeSi t'tm

tru'U
L:. ekrofo~i~ de> icld.~
r.udnw!i !le llllek hueer rn &de!!~ tk apow. )'en horit.untlll; b de

clcctroforcsi!i

elccnofot~i-..

proleinu., en F-le~ dr rnfiuenllunida y t(l \CI'I:ICIII

$(1ftd
~

:sc.m<b
~

<;

hibncbcin ..J

Olllllkbc. l p r~~t CJC!Uplp::

nl:J('(II)C q~ w bubl<::ul ltiOOrpmltOO en 111 liUI.dll


m~~m~OO tO;

1 ll l((nica de ~.0., llo.-ptndt dcl b:_po do:


\k'lq,~{m t(n

iWiJ)I.! IMI...tti'o o~Uicm~diosnsf~<~" d.:llo.:'Wr de naoJiucin


OuM~Cmmo

dr:sCC:IOf de lluOrtiCCib:ll
11\'idlllll O C"'tti'IIUI\IICbtllt dn!l diJ'C)Jtir:niiU QIUDii) lile d,l J)II~IJCI.a !WtcadQ, lbtc~IC ct q~nm.il'>lumin~Jli.C

tnOI!nll
dl;<l:u:o.~

eorin

De forrna 81 \8\o9a, lal'nt!l~n ~ re<~Az.an ensa)'os "dolblol" y "siO(bbl' pcwa prolelnas, con un plan~.<~tnief\1o 31miar al cxpoe~o para cidos nuclelcos, salvo poc etlipo ele m~tta y vn ~iento de unio y deteocin completamef't!e anlo90 al del W&stem (en esw caso, otwtameme al no rewar e!l(!~rOf<lreS~S no es p-edsa la 1ransferenc1a).

Tema 14

Preparacin y marcaje de sondas para hibridacin


14,1 Preparacin <te sondas genUcas .................................................................................................................. 14.1.1 Clasificacin de las sonda&. en funCin del mtooode preparaciOn - ---- ---- 14 : 1.2 Sondasconvencronales ................................................... ----.... -. , .. ... --- 14.1.2 .1 Sondas de ONA obtenidas 1)0( dOt'laeiOt\ ct!u!ar (\&Cnologin del ONA re<:ombin<ente) 14.1 .2.2 Sondas de ONA obtendas por donaCIOn acelular (amplifiC&eiOn oor PCR}.. 4.1 .2.3 Sondas convencionales oe RNA (tibosondas) ---. .. . 1 1 4.1.3 Sondassintbeas ... ........................................................ . ............................ .. ----" .. 14, 1 3 1 Sin~si5 quimica de oligonuclei.KI06 ................................................................ ,.,._ ,_ ,_ ,_ .. - 14 1 3.2 Oi$eflo de on3 $()fl(l(l sinttica . ...... ....... ................................... ................... .......
14.2 14.2.1

17$ 176 176 176 176 177 177 173 179


181 182

Ma~aje de l.:ts sonda'S ...... - ... - ..................................................................... ~.~............................................ 180

MarcajedlreciOe.nlamolctAa de$0t'lda ............... ,_,_ ,_, .. . ... ..... ....................... 14.2. 1.1 Marc:.afe con ONA pollrnef'asa.......,_ ,_ ,_,.. ....... . ............. _ ,_ ,_ ,_ ,,........... _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,, ......... <t) M~de ITS&Ia<loe la~ ................................................................ ,,,,,_ ,_ ,_,,,._,_ , b) M~todode iniciacin o oebado al azar ............................... ................. ...... ,_ ,_,, 14.2.1.2 Mareaje lermin;tl... , ,,._,_,. ,.,_,_,_, ...................................................... a) Marcaje oon potinucleolido quinas-.3 - ,_ ...... . ........ .......... ................. b) Marcaje terminal por relleno ........... ........ ......... _,_,_,_ ,,,.,._ ,_ ,_ ,,, .... _ ,_ ,.,,. .. _ ,_ ,
Marcaje externo a la sonda................................. ....

1$2 183
183

184 t84

14 2.2 142.3

14.2 4

Marcaje .-.c!1redo ....................... ......... _ ,_ ,_ ,,,_,_,_, ....,.. . ..., _ ,_ ,_ ,_ ................................. Tipos de grupog marcadotes e h:licadot~ y sudeleoeion ....... -- .......... . .................... 1 4 .2 .~ 1 Marcadoresradiaaivo& ................................. .......... ,_ ,_ ,_ ,_........ . 14 2.4 2 MarcadorN no radiacti\IQ6 .................................................... ---. ,. 14.2.4 3 Gt\IIXI$1~ , , , .. . . ......... .......... .......... ....... ........ .....

,_,, . ......................................... 166 18S

185 185 186 186

Como y: se h;t indicado. la deteccin de cidos nucle.lcos mediante en~m de hibridaocin depende de la presencia <le la seCO(!lcia <lian~ ;) <le~ltlr en la! mt~G:Stra y de la disponibilidad de ul\8 so n& o oligonuclelldo de secuencia oomplementt\lt.t'l a la <.iana P()r tanto. la utilidad de la hibridacin. el puMo Clave. ((ldica en la sonda: de su nawralez.a depende que el ens8yO $C81ructifen> El p;~pet de fa &OI'Ida ~ale al del anllouet'PO en un inmunoensayo y. al eS-lar marcada, es posible localizar y QIM!lflcar cualouiet seruenc!a diana con la cual se pue<Ja hibrittar Gracias al empleo de sonctas. la sensibjj(Ja<l oe 1'8 hlltl<lac:tOn ~ muy elevada. ha&ea un n-.on de veces superior a 13 <JetoociOn diroct.;ll per OITO$ mlodos.. POt ejemplo oe tinciOn Iras elecuoloreSoS. L3 sonc:li $G ;onvietle as.l en un elemenlO esencial para cualquier' estudio moiOcv!ar. en especial para analizar la variabilicl&d o pOii:'norfismo del genom.a. De ahl la converwnela oe eS1udiar lOS ~de ~r<lQII'l y marcaje de sondas. COI'I'o() asloeelos flOilCialqs p.:~ril su empleo en ens<~)'OS de hibricSacin.

14.1 PREPARACIN DE SONDAS GENTICAS


Se vtili:a una gran vanedad de mtoOOS para occener $01'1d3S. ltlnto de ONA (en hebta doble y hel)ra sene:ilfa) oomo de RNA Obviamen~. para su empleo en e1 ensayo oe hi0rid;'ICI6n la &OOda &~ef11Xe ha de enconvarse ~ forma de hebl1t sencilla. para b cual se acude a la simple desn&luralil~Of'l dl8 las sondas de dob6e hebta.

176

PREPARACIN Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACIN

14.1.1

Clasificacin de las sondas, en funcin del mtodo de preparacin

La& $Onda$ se pi.IC<ten clasificar segOO varios Ctltenos: loogltud o rama/lo de la secuencia diana. mtodo de marc<~io y <)c(CK:Ci6n, tarna!k> de la sonda, mtodo de preparacin, ele. Este iltimo criterio e& el mis utift~~do. di$tinguindose enlte sondas preparadas por mtodo& oonYeOCionale$ (POf clon<locin coh..ll&r O t'oelular, lemas 15 y 16) y por mtodos de sfntesls quln-.ca.

obtendn:

celular ctkic:a

acelular
(PCR)

trat\$Cril)t3S3' ill'wer!.a {RT PCR)

sonda formada:

(of'!IJIO(kJ$Q. KinibOnucle6tldo)

14.1.2 Sondas convencionales


Tambin llam'd3!$ soncsu genOmlcas. Clonadas o
especialmente al progrt$0 de la Blologla Molecular.
blolgl~$ .

fueron la$1ri'nOras utiiz&CSas y nan OOt'ltribtMo

14.1.2.1 Sondas de DNA obtenidas por clonacin celular (tecnologla del DNA recomblnanto)
Son e tamai'lo (tongiluG) varl8flle. entre t OO bases y cienl06 de kb A4a'lque lOS delt'llles eK4)ef1me-ntales de la clonaci6n celular se estudian m:s adelante (tema 16). se adelantan <~qui brevemente las etapas principales del prooeso.

C rlB!fl...." ck
O ~A de interec

plid1n.odo>

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VCCIQt d e d onaci6ft 1romo ejemplo,

un pa,crnidu)

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...,..,.w.. ti ,1)1\l,\

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~d~Ayblll:w oq,m.,.()NA~-

OII ........... d ............

lllk'M ..........

l<:plltlldn o.k-1 irnt~ (p<>r 0(111~ eon


1r.in-s d~ ~n)

~ -~
~iblc: u~ rm.ucnc~)

UiO COC'tiO)

(()N,o. ~11tilk1)

"""''

=..

14.1.2.2 Sondas de ONA obtenidas por clonacin acelular (amplificacin por PCR)
Eslas sonda:s $Otl de menor tama"o quo 'M Obtenidas por clonacin llular, entre 0.1 y 20 k:b. El mtodo de preparacin (PCR. lema 15) tambin conMa de un monor numero de fases. por to que la& 5()(1(13!$ se obtienen de forma ms rapid.t y senCilla. En general. paftiendo de OHA de dob6e hebra se preparan &OOtlas de la misma 1\81uraleza. salvo en la PCR it$1m~ea . que conduce a ONA de het:lr<l sendlla. y en la RT.PCR. que pormite Ol*ner sondas de ONA de doble~ lltlrliendo de un RNA (pago. 1 96)

PREPARAC.ON DE SONDAS GENTICAS

177

1 1111 ---f>NA & f'lll'!o.:b

U '(> lil,lt1'\<.

iDNA

""~~"'' nowrarv

'""''I'Ca...,n

(rnpTl~lliO d~ tm.:rb ,,....,li('t< ""!"""")

"""''

~cncillo)

14.1.2.3 Sondas convencionales de RNA (rlbosondas)


la clonecln celular se puede emplear tambin para pre~at S()(ld<l$ de RNI\ de 1.11'10$ milo$ <Se nudetidos El proceso. relativamente complep). se basa en la ~rans~l6n de un DNA pre...lamente dOOttCIO $e v$3 un pliJsmido espeQCII (generalmente el pSP64). que &e caracteriza por lnelur et promotot de una RNA pollrnetasa de tago (PtomOior SP6). El tONA resultante, vna \<eZ purificado y linea!izaao. se utiliza oomo molde para ta transafpclon pot RNA polimentSil SP6. QUI8 transc;ri)e el insetto especlficamente a panir de la seooenaa promotora S/'6. slntetiZaf'ICSO numerosas COI)ias (de heOr'a senc;:i!l~) de RNA. Si alguno de los NTPs. 5u&tralos de la RNA polimeras.a. esl& marcado (~ . 181}. el RNA $e puooe vtwlat diteCh'lrnoetltt como sonda: si no. deber man;arse el RNA pootariormenle a su obtenCIOt'l.

1
('*tm~""' o.k .-r~rec iON A<k<Uk ld>ta)
plh11Udo) eQI'!Illo)

...............,

PNA""""' I"*'I
pl,~nttdo>CS~al

U)N \ <1<-"'*"~ ld><l

rSJ~

plll~OO

fC'llllbinaMC

Ventajas de las r lbosondas Al no I)O<Icrw rormar el homod(lple..K $00da:soOOa. se tavoree& la efie)ci3 <Je la inleraocin de la sonda con la secuenCia diana. Las SOOCJas no unidas espe.cifiearnc:mto pveotSen ser elinmadas por (jges1in oon RNasa. que degrada hebr~s MOCi!tas, pero r@Spela los hlbndos RNA sonda: ONA diana. ~ puede emplear comQ control negativo la !IOtlda oompaementt~rla (socuenciil en dirOCOI6n antl9enddo. pg. 24&, oonsegukla al ii\COC'porar ., in~o jurrto al promot<lt' en orientacin contraria t.

Desventajas de las r lbosondas Es necesario usar un ~lor dlt donaCIOo panicular, con un OfOtllO'Or de transcripcin. Se aanenla ta oomplejid&CI 31 preCISarse l.1 etapa de reacciOn RNA polimern~ P\les-to que el RNA es mUCho mas lbil <Jue el ONA. y la RNasa es una oontamlnaciM muy trecu&I'IIC, M rec)Jiere un manejo cuidadoso de las soncsas de RNA P<'r<t cvitc~or su degradadn y el uso de tecnica9 y rna1erl;\ll O$t6rii~H y ospocificamente bes de RNasa.

14. 1.3 Sondas sintticas


L8 <i3P~id(l(l do &Jntescs qulmca es esencial en lnget'lieria ~6tie<t no slo para preparar 6011das. sii'IO tamf)in para mottlllcat parCial O gr;u~mente un producto gnloo o para sintetizar getlt$ QOn'l~os En general, se oblieflen sondas de ONA mas o::wtas Que vor Cloni!lcin El mtodo mas popular esta sin~esis de $Ond<'S COf't.ls de ONA (de tS a 45 nuclttidos). monocatsnarlas. llamadas otigonucletido' o simplemente otlgos. l!stos pte<len $ertttmbin de RNA, <tunQ~ M Sll'l;ebz.an oon mayor dlflctlltad.

178

PREPARACIN Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIB RIDACION

14.1.3.1 Sntesis qumica de ollgonucletldos


El aspecto bskx> de 1a sfn!e&ls e& la tonnacin repe'litiva de un enlaCe ~or on!re el grupo 3'fotfato oe oo tWCieOtido y el grupo ~'-OH <le otro, para dar un enlaoe ~fo<li~er. Es do(:ir, se parle de 3'NMPs y se a ...anza en sentldo 3' ~5', a diferencia de la sintesis do ~c:ictO$ l'ludeioos en las clulas (lanto repllcadtl como b'8fiSCripci6n emplean 5'-NTPs y avanzan <l4t <' 3'). l.O$ NMPs se aftaden ui'IO a uno partiendo del primer nuclesido, que est Indo por su posian 3' a Wl soporto slido y OQt'ISiitui'a el elCiremo 3' del cido nuclelco W~S vez shezado.

base

base
f\ZUC3

base

base
1

' 1 zuca

' 1
3"

...

la: '1 zuca


2'
(l

zca " >

..
l" n~o.l) ll,.,loe~~un 1<>fii>IIC

,j'lt~t-

q U il'!ll~.

,.nirdc 3'-dNMPs.

El J)rincil)tll proble<a es la gran reecclvidad de 106 dNMPs. <:On grvPO$ ..()H primario y secundario, un NH:: , un grvPO f0$13"1 0 y gt\.11)08 amino ylo carboiWo en la base nitrogen.ct3. I)Or 10 QUe se feqJreten mtodos de bloqueo y (fe$biOQueo que oo afec!en Wreversiblemente a ninguno de 10$ componentes de la molcula de nucletido. Por otro lado. e1 gn.ri)O toslato (en 3') ha de actrvarse p.3r.1 q,e ro~ con el -OH (en 5' del nudetido anterior). \1Ciodo d~m,llado ,
!1)!. ;tilo!.

70

por H. Gobind Kbonanu p;.~.nr 1 ~imc.~s <,rirntea de t)ligmuliCkcKio!>.


he hllll <''~~'~"'"" loJ dcr:llk~ quimiro' pu111
(nfJIIill!r ... <'l~Cnil>l.1t'lf dtl IW~kJ

1(IS'Ii)rl.; olldo

(p1111k11l.u !k Phct)

'
'

PREPARACION DE SONDAS GEN ~nCAS

179

j ' 0 1 :

'"'

1\udOO..odo> s-.crnllllll
<lt;~l)l'l)'Ct:IOo

.."$!1bulin lf.Wt!illn

...

1'.

Estos procesos estn ya noy dla automatiZ:adO$.. son cflciontes y de baJO C06t0. Debido a la que la IOI'Igilud <Jo OSlO$ oligos so v. imitada por el rendimiento de las reacciOneS de Sil'll~is 1;) $etl$ibilidad alcanzacta con euos es, e.n ~~1. ~ Qvo oon las sondas otxentdas por clonaclon. Sin e~r'{IO. la eonlil'lu3 f'TlOioql en los mtod06 de slnteSI$ qui~ permke la (()lcf'ICin <.te ol9n cacta vezl'l'la)'Ofes.
Respeocto a ta quim.ca de sint.eosis de oligonuclelid06 de RNA, es.& mS attas303 dcbicto il la dificultad de Pfote98'r elgruoo OH 2' $11'1 at~ al 3'

14.1.3.2 Diseo de una sonda sinttica


Las sondas sintclcas se dlsen&l'l oe lon'Y'la que COtlte1'9<'n lit M<;uencia CICM'J1llementarla a Ul\8 ZOI'I& del DNA diana, por ejem:lk>. de u~ Pttr1e del gen que intetesa analizar. El oejeeiVo es P"ePt'l31 un Oligonuc:lecido que pueda nlbridarse con dicho ONA. ~!mente. se ~ntenOe localizar el gen que OOCilf.ca ltl sin~is de ._,., Pf'Q(eina detecminada. Para dlsenar a SOI'Ida, t$1'1Coesario: 1 Conocer la secuencia oomple!.a ae la protei~. o ll menos de un fr<19""en10 de ella, M que eorre$()0ndor~ la secuencia diana de ONA. 2 A P<lrtw de esa secuencia anWioacldlca, se es1ableoe {61'1 Nsc al cdigo gentico) la secuenaa tUCieol.,iC:a que habr de tenef' el ONA. Sin embargo, debiOO 3 13 degeneraan del cdigo genelloo (d iSlil'ltos lrinuCiotiOOs ooc1iftean un mismo aminoCido, pg. 295), hay l.-l i'IUmcro cle'v.-cto de secuencia<s de ONA que pueM ooeifi~r el

"1 .:: 8.:: 0 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __:. P ::; R .;: EP :.; A :::;:;:: AAC ::;I ::; N ::..!. Y.:: M ::: A ::; R .:: CA :::J ::; E ;.! OE SONDAS PARA HIBRIDACIN
11'1lsmo polppcldo y. obYiamente. no &e puec.le C00009f' <1 priori f;u~l" 1;'1 qve lo l'l;)<;e en ol gcnom;t rot\1 00 ltt

clula. por lo que es preciso sintetizar sondas que cubran toOOs las posibilidades. 3. Para redu~ su nmero. se &e)ecciona el seg~o de $0CUCnci:~ Q110 poseo a;. menor dogonerac:iOn J)C)$ible. 4. Una vez ~ell:z.aclas todas a..s sondas. &e en&<ayl.l sv hi~ciOn (;(In el ONA de pnrtida; IJI\3 de ellas sern la

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-Ca!la s~-.;u~1a -.k ONA s-i~ dC' ~~!la pata la (llfJ bcbna. X puecL.n, pues. dbcilat d06 gt\lpQJ
lk 16 sondu -~o~~nltt.ca'l fJc: O!"A.

En este lipo de experimentos, los m~ de &i nlo&is y secueneiadtl de proteil'la!l y de ONA convergen y &e conl&)lemeM&n. Como se acabe de ver, la $4JICVOnti<' ese una pro1erna aaslada puede usarse pera aisla~ el 98" cotrespondiente; de uno:t forma Similar. aunque if'IYerSa, oo gen ctonado (y, sxx t<~nto, &oc:venc:iado} pu&de usatSe para aiSlar la protointt prQducto. la secuencia del gen pennile <beflac" y $into6zotr quil'l'oie3imente un pptldo oono que ropre:s&nla una parte del prodocto proteico del gon En.onees.. una de W posibilidades es. pclf' e;etnplo, utilizar 3nliOUI'!ti)OS contra este pptiOO &lnttioo l)all'<t idenlir.e&r y l)uri!'ieaw lal)f'Oielnal)era su estudio potHetior.

14.2 MARCAJE DE LAS SONDAS


El empleo Clt $()(1d3$ de DNA o RNA como herrarrentas anatif~eas 1*'3 k>e3!i:ar secuenCias diana por ensayos de hibrid$CiOn requiere llgamriatnente un proo8$0 O. m<trcaje de la toooc~a. que permita su deteccin. la molcula o grupo m~rcMIOf puede tener diY9t'&a nattxaiUt. siempre y tu8t'ldo se pueda detectar su presencia de focm;t diroc:U o Indirecta: los marcadOfeS mM uliliUdOS son istopos radiactivo&. flvorocromos y enzimas, En gerw!tal. dan lugar am~ &encill06 do r1Zt11. que deteCtan conoenlracione& muy ~ja& do lit soi'I(SI. El mareaje debe ser e&$8ble bejo diVSas rondiciOtle$ oe tempeta.lura. detergentes. disoi..,.,\M, etc . y no afectar a la reacci6n de hibridacin. Lo& mhtoCios r~iaetwos son 106 emplead06 c:l$~menCo. micn!ras que lOS ottoe mareadores surgen prlnQPaln-.nle parn eYIIar klos riesgos denvados de la radittc:i6t\. pata aptovechar la mayor VIda media de &uS re~c:tiVO$ de msrca;e y. et1 algunos ta$0$. p<u<a ~omr et liMite de O&teocln.

De formt~ge,~. jltleden plantearse dO&~ de prooe$0 de marcaje: In viVO (mt\s OONectarnente, en cultivo): S. hace SVITWii$1rando nuclelldos radlactNos a clulas en cultivo, QI.M:t lo$ tnoorpor.an en sus eiclos nuc:Jeloos de nue'Ya slnte:&i& Su uso os muy limitacto, por ejemplo, pars preoarar ONA vir~l mareado en cUas Infectadas por virus.

MARCAJE DE LAS SONDAS

181

In vitrtT

Es mas

de$~

~<ltil Puede haGef'$e e~eando i&61opos radiactivos o por 01ros mtodor. a!lematNos Se "oootinu..ci6n illgunta5 ~ l<a5 divOf5i'l> vt~riantEI$ mel0dol6gic<a$

En muchas ocasiones, en espedal con tlbosoodss y SMdas sinlliCas. la so~a se marcn al mismo t~mpo que

s.e prepara ncluyendo, oon bs NTPs que My que sui'IWits:ITar a la reacciOn de slntesls. 8'gur'W) oe ellO$ rnare&<Jo ceon
un Istopo redlactivo, un f'loOI'OCI'OfTIO o cualquier tipo de grupo kldieadot) mietluas que er~ ()Ir;)$ 01 mt~rti'J(t se re*a tru haber completado la slntesls de la sonda. Puesto que la preparaciOn de $OM8$ ya se M O$t~O. tlO$ <:entTar$0'10$ t~hot<t en eS"te ltimo <:a$0, aunque las consideraciOnes r~1vas a la deleocln Slt'Ye.n ~~gualn'lf!onle para
sondas marcadas durante su obtencin. El pnncipio bsico del marcaje es la umn qutmica o conugaCIOO del marcador a la son<la (en e1 caso radi&c:tiVO. t90IOPO forma parte oe la moi~KUia de so.noa, no se u~ a ella). Como se acaba ele indicar. esk> pu!Se hacerse uniendo el marcador a la sonda y.- preparada o a un nudetldo que se Incorporar durante la J)te$llataei0n <:se allt'l Por Olr.t Pill"l<t, lt~ sondt~ puedo lev<tr unido el marcador detectable (m$todos <JJ.recros de mar~. a conlinuaeiOnt o bien otra mcecula no detedable o orupo i ndicado.- (en ingles. reportllti). con ta cap...-.ci(IOO <.f4:t $Cl reconocido PO$leriormente por una-protei na detectora. que esta que va marcada (tnelodos lllnileCtos, l)bg. 185}

en reaidad el

n-ccto: d marcu.du. que se pucdedl.1cctar , vn unido a la SQnda. Dos ulrcmativas, des us de la slr1tesi.s <k 1 ;, sonda o durante dlla:

N""uckc1Cios _ _ _.,_
pn:pan1tii1U de 1 11 lf<lC1da (p!lf loil!t.:~i
o> m~'<litka~-..)
WliO. O.l~lll~oc.e

tJIIII>;ilft

Nucle!ido M
unt.ln nr~<ablc lllalt" ..Jf

o~ -d.,,
(J

Q ..

ok"

,.;mda .,._,. iillfe'i~


mllf~~oan~'lll

1\'farcaje u1d.1recto: cl"man:ador unido a la sonda no es dccoclabl din.-ct.1m~'1llc: :se le llama indicador. Para lu de1eccin, el il\dkOOor se une uno' proe.:n.1 dt."toctora. que lleva el rnurcajc. Dos alternativas. despus de la sntesis de la sonda o duramc ella:

N\(;lcfiilos
(1

j'lfq~a~:o.;ti:on o.lc 1., lo(lll<b ' ~~<"" sh101.,,,

mo..bf telo.: il\nl

r.,diC3dor
JiruelctiOOS _

___: '....~.. ~

Nuclctido-lndic:l(".>r

.. "
14.2.1

Marcaje directo en la molcula da sonda

El gruPO m<are<ldor &e puede unir C0\1'8!ent.eMe.nte a grupos funoon;~lo5 C$Pecllloo& o fonnar enlaces oova!en~t:S de forma inespeciflct~ I.O$ cidos nudeieo& muestran menos g~ fui'ICionale$ OOecvOOos para este fin que las pt<l(einas, b&tCamente. algunos tomos de las ba$-C$ ntJ'09Cflada$ (especialmente, aqullos no l~acl()$ en el <'P<H~tamiento oon la ba&e compjementarla) y los grupos lermin<'!IO$ Y.QH y 5'-P,

182
tlarcaje cov lent de la
NTPU)ol)uda
-t

PREPARACIN Y MAR CAJE DE SONDAS PARA HISRIOACION

'""'

lluo)t(J('t(liDO t~o ~m
~~.,-u~r-a fC';O<XO\IIW- ba.,;~)

"'"'
teleciOn "' OOI)Ugecten
(enl~

N1'f' o klltiiJ" mn~


(fl\llf\')CCnk:>)

GeleWOn POI'

nuornnettia

C:OWII$rlal)

( ofltrPJ

+>-~-.:
r~esentattvos.

"

:k e-;~~ 101 "1 ~


(6...-:t~ll.,. ~

"~.-'"-'"1""""'"'-'"~~~ ~
'"'

Ejemplo de' nudtillidu


nuo~h. -:

un deri\'lldcl do. ' dUTP y


cll!bcolljflU(IR':ICdna. lll bnlaH!~f"CoadOI' ~ lll!p(IRif!IC J"'r.:l ~o!oiQI' 111
onl~ ,Jcll~lo<\0

- ~'

'ft el .'i11l-.:lri:l'> U'<"'~" hllcrl-laron la f . - n & !a Jo)blc hlkl

En esta categorfa de m'todos puodcn <nsiderarse tanto la lncluSiOn de nucletidos marcOOos drxante la slnte&is de la sonda como el marcaje de la so~ y3 ~rminaa. De estos ~ltlmo6 m4odos, se ocwnerrtan a oontinuacinlos ms

14.2.1.1 Marcaje con ONA polimerasa


Se de meiOdos de slntesls enzlm;itk:.a. los ms comunes. LOs cuatro tipos Cle nueletido (al menos uno de &os m:trcado) se il'leotperan <b"ante le r~ de t;fntttsis do una ~ de DNA. Exl!lt&l'l dos variantes: lra&lado de la mela (ruck 1/an.sfatiot'l) e ir.ei<'eil'l o cetlado al azar (AMO'om pnming).

Ira'*

a) Mtodo de traslado de la mella


Es un mtodo facll y rpido, coosictot11dO ft ejemplO c:taslco de Incorporacin enzlmtica de oo 1Tli1~. sin neceslaad de desnaturalizacin dt ltt $0ni3A de DNA doble. Aeqtjefe dos enzimas distil'llao unt~ ~)ljrril)onuCieasa (ONasa 1pancretica) y I.JI\3 ONA )(llimet"asa ([)t(Apc.l de E. colf). El resultado del marca+o es l8l SUSbludn de una gran pane (30-60%) ~ 10$ nucletieloe Oflglnale& de cada hebra de ONA por otrO$ mare&OOS tfldiactlvamenta en su

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La DN,\ polinull 1 do t: rol!. l'lo tn~ ''"r~ll de DNA ptlomcr.u:u., p(ISII:'t ll'tll 11eliido~ e!Uimit~ (pis. 141): pohmcnts:t. J'CXOII\k'lefl~ y 5'-<'~OOucl.e-UA, de b$ cw.lt"'!ll' llpN\'C~hu'l f!Q,Ui dO!>. a) La actividad c\OfiU(k-~ S'-4)' u~lila sobr~ el g:rupo Y .Jt de Cllila mella m d iroinac:i6n ~~u~nc:ial
de IL...-t-11~.

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b) Simullinl.'ament(':, la aeli~ 1iJad pOimKft.Sa ~ue,a Si111 nI0.'6ti~. U'l('orpot:t,.ll) (llf(l~ n~~~o,"''<IS sobr< el 81>11)(1 .l'.011 do.' 1 :. mella. a IJQJ11t d._, dN'I'IOo; mnn;ndo~o. 1.'!1 la din:eclim l1 abnual de la Siflttl>is ~oh; DNA (5'-..J'), El pmo.'eW el id&JbCO en IO!Ia.'l las lk'~Cilas y, otniamen.e. OClltT\' tD lCfll.do 11pues.10 ""' cf!iJ:l h~bt'u.
Con~ ~~:sutuuJo. lar~ 6c la~"'

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lat. nldlaue despl111.11n a lo Sipc habiendo DNA dobk. ptrOIIpar'C'C\'t'l eo amt111s htl:n; rej.onc:c marclldll"
(que k'l"\ 1(:\o ((111'10 SM\bs), Su 1nmuilo puedo.'
~rlrolf!rso: 3 lt:n de la J'lroporcin ele t!Wmas en la mndll d~ t\'ll~ci6n. U11a ' 'l'T.I)lltlii.U 1:a

.........

rucci6n C(lll clllc~t )' EDTA. )(' !l~pQnltlla<> s<tndllj 6e ICIS rmdocitidos 1!1) illCOtpo)T'oldo!\. por (11.'1111'1(1, pM etoll!rol.'UStafiu de fiJtr-:od6n ~'ti @('l.

P\JeSIO que el ooeie61iclo rn.arc.OOo se inOOfPC)I'tt a ta sor'ltia, en lugar del marcaje radiaciYo (en lt~ rtg1.1ra) pueden

emplearse nuctetlclos ~ (On fluorocromos o oon grupos indicadore6 (pg&, 181, 185).

MARCAJE DE LAS SONDAS

183

b} Mtodo de inc,acin o cebado al azar


E$1~ <lftorniiltiv.-, 011 dif4:n11c101 de 101 ;,r~tcrior. rOQ~ ltt dC$ntt!Ur;JiiZ<J~ inittl dc:l ONA doble, parl' que hbnOO un a reoti~iOn POI ONAPOII de E cotl A,_,., bion. en este caso slo se oligonoclo61ido qve aCIV<'t como Qtl:)<'ldOr de 1 roo~,.~ief"e ~~ t'C:Civid3d l)()limer*sa. !)(Ir 10 que se prescif'l()e del frbgt~O l>t<JU(h'lO y $C svele ulkar et fragmento de KJonow (pt,g 147), Eslt'l 16cnicoa Qlroce \lnt~ $Cric de ventt'ljt'$ ~ ct~r(l~cr t6<;:n.co lli$P8'CIO a la antenor. cuya conSideracin escal)3 ~ t~Jtslros obf8.1ivos Clc C<'ri\Ctet esenCialmente conccpt.ual

~tl ok'<n.wlunaliJC:uJ,;, por ~lor t i DNt\ dobk. !lt' h1bnc:b knf.llmmt.: wn unll m~l:o ok

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<rh,;o.:mudtllduo:. Wllt(otf(l.);l ( I:OOIUI\ItiCIIk' btXIIntA"koi!tob: ni b f4tU~ l~'tiOIIfluek<ol>d&.~)


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Al Igual que e4 m40do anterior, aotnlle la~ nucleolidOS- marcadO$ oon nuorocron"IO$ o con grupos indicadores.

14.2.1.2 Marcaje term inal


E" osto ~$0 se aplica, en IU9'1' de IA\a sfntesls, una modlfie&eln en.zimtic3 de las hcbtM do t!CIOO rNC!eu:o exiSt~te$. modiante la ncorporaocin de uno o unos poros nuclelidos marcados a uno o ~mi)Os ex:tromos de la 50flda ae DNA o RNA. A~e se utilixan rnetiQ$ que 10$ onteriores. son mlodos .:rUles en Ciertos casos, ~ ejemplo ~r(l matear ollgos de hetlta sencilla. Se IJilllztll'l dos S)latltC.&micniO$: el mafCC11!8 oon polinuclebdo qu!nasa y e-1 marcaje

t.minal por ~leno (fi-in endfabebng}.

184
a) Mar caje con polinucJOOll do quinasa

PREPARA CIN Y MARCAJE DE SOHDAS PARA HIBRIDACIN

rxw et k>5tato (marcado) en posicin y de un dNTP. con la uel\>endn de pciA'wclelldo q!Mnasa y. opcionalmente. rosratasa atc:ain3
' . p. .... .... .... . ... .... J'. .............

Este mttOdo Moepetlde de la eltbtet'leia de una IM!Cta molde y. pot tanto, puede emplearse para cualqUief tipo de sond'~~ ONA senCillOo dOble, o de RNA. Consiste, en esencia, en un intercambio del S'P terminal de cualqulet hebra

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Se <tlimin.1 el 5'P con fodalflll alu.U~ )' fueso 1 11 pllliltdl'iltldu qinn dtl r...o T4 h.clroli7A el ATP. mto>rpolnftOO s u 3 n1p y-lo>t>f'11to al .QU fll.lf\' t ll ~ dtl

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Si,;.:.~ Wflda' man:&dob ~ un Jl(!IO f.),ll'\:11'10. 1111111 ti rro<J!A"t(l C(IU4UJII ('110l.l~ll.'llo11 (k

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iiapm;!l~ ma!Wo\k.s en (In ,olo e un::mo (5'): ~ COlTII> $Cono:lu

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llllllo:lbn

r~n1tdli (pc\11,. 199)

En este caso SOlO pueden utilizarse matea}es ra6activos. PUM lo Unioo que se i\cOrPQI"& <' la S(W'o(la es el foS!ato y
def ATP

b} Marcsje terminal por relleno E&te mtOOO &e ~rtl1.ta por ser el Onlco que utiliza una enzima de re&triccln especifica para
e11trernos eohe!liYos.. (ltJeluego son reuenaoos POI' t;t ONA;Jol.t
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S' Ktiutn c-omo molde paraquo; ti KlviHI"' tll b ON" pll+ti m~uul l' o:r lfltoll)do de ccblldo 21 anrlafllld11 I!Udcliodllll JNn:lldll!l a l.:t~ cx~mu, . l '. L-. sabcntc~ rra;,m~t\1 tlf

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con fiUOtocromos o con grupo& Incitadores,

E&M mtoOO de nue-Yo permite el uso canto de nudetido$ radiactiVO$ (en la figurtl} como de aqullos marcadoe

MARCAJE DE LAS SONDAS

185

14.2.2

Marcaje externo a la sonda

En lklgar ae matear sus ptoplos nucleOildos. la sonda se puede unv 1n otra mOiC\Aa que a su vez lleva el mcwcadof. Una posibllldaa e& la unin de Pf'O(elnas mediante reactivos oniTOc::rvuan10S (CtO.sstinll:6f.s: ~. glutaraldehldo. etc.). Tambin puede uNrse el marcador por inter..ccin Oloctr0$1ilt~ ton el ONA o e~l'$9 agentes intetea~ntes, cuo se in$Cr1<'!n entre lO$ l>(lfflS do wscs dO 1~ doble l'l!ioe (hibriao 9C)(Ida : DNA) de forma no oovalente Unin de una enlima a la &ondil oon tfhlctivos enlt9cnrr.~ntes
li(>lliJ,~ ::; !'1:'0~Minw. (P())

\lt'lin eiOCITO$lt.l~ ~ 1(1 $0fldlll de un 'lOiic;ntin oonugado oon etlllr'I\SI


p:ro~idit:Q. ( r Ot .. p<~httk-ninum

Marca,e ese 10s hibridos oon llgen!e$ 11'11en:d, , nt6


ltlbnOOWpk'\ .tondat--I)'IA diana
IIJ!Cil~

+ eh.aarald~:IUdi)

phcn:wqu!CIIIfla

t eei<<n <le QOti)V!l~ (8f'lla0t covaletr~e)


~1'0 4100da1811n.'lilal

IMC!tlll:afUC

- -""'=."'
~l~rkmtt\11\aI'O
(tiOf~talo"ln) ~tQ

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~I)!Qteii>J,)

o 11.111\!ni,:OX~(K

14.2.3

Marcaje indirecto

Como se ha indic<~do (.Pg 180), PI*Je ~nvm Qve n 18 $Onda so un~ 1M\ gn.sw no detectable o ino'ic.1dot. ol cual en una segunda etapa es reoonoado por otra rnoliJ.cula, generalmente una proteina. que ln(;OrPOfa el marcador dot:table Para la unin del indic<'ICSOr son ap~gb16$ laS oonsil:5erclciono:s ytt ~~~ rC$PCCIO a 13 t.~nin dol marct'dor en aos ~odOs <lil'eciO$. se lkl$lftl l,lf\ ejemplo oorre:spondiente a 13 rnodif!C3Cin <le 10$ NTPs:
'udecuJ() (d.'(fl'J
gt\lpcl h'l!htlllktr

ti &tapa un1 n covalente de nudecldo y gf\100 ind~r

1 lhgandol

rncori)Ot<lcin a la sonda per


enzimiltMXI& (Ir~ de mella,
miii'Cl!IJii W!rfi'Witl )
oualq..-era de ~ rn1odos

2c~pa

:oppN

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~

l- etaP& rec:onoca1'iento del indicador pot su proteina detecao<' .,.._C<lda

!ol)nda lll/IIC,Ja

14.2.4 14.2.4.1

Tipos de grupos marcadores e indicadores y su deteccin Marcadores radiactivos

El marcaje r&IJiacl.i-..o o iSotpico es el que se !\a el'f!Clle..do con m~s froooenCJa. auncue va &18000 de$pazado ptogresM'Imente por lOs mtodos no rac:rraCilvos, Aur.que no e.JCi$tt 00"101'1$0 ..cerc:a <lef marcaje ideal, en 18 mayoria de b& casos se hace oon 32p. Pueslo que ltl ootta vida media de eS1e iStopO (14.2 dias) crea dificultades en la pntparaci6n, oomeraallzacln y uso Mlnarlo de tos ensayos.. se ullllzan tambietl: O lros ~ern3'1iVOS (35S, lt.t. t251 o 14C).

Ls <tetocciOn y reg.slto de 18 hibriclacin se haoe por autorradiogra/la; el sopotte oon el ma1erial nibridaao se pc)nll;t oonl<'tcto con una pelici.Aia folOgr.ifica (del tipo empleacb ~ralas radlograflas). 1e ouat queda if'I'C)(eslor\3o::ta oon"""' mageo_n que muestra 1~ ptO$CI'ICia de In r<'d~tivid<td {ver, por e,empJo, el mtodo de Soulhem, pg. 171). la lntef'lsidaod de la~ depende de l<t iwllcnsid~d de fa racf~C~Cin erMicia por el i&iOPO y del. tiempo de eX'posiCin.
e;~

1 86

PREPARACIN Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACION

14.2.4.2 Marcadores no radiactivos


En funcin del marcador empleado. la deteccin &e haoe por lluorimetrla o atladiendo oo sustra.1o especifico cuya transformacin enzlonllCe por la enzima marcadora pueda detectarse por alguno de bs siguiente& principios: Espectrololometria medida de la absorcin de la luz por lo& productos de la reacci6rl. bien &olubiN o in501uble&, et1 et u!tta'fi:>leta o el ISible (*>rim ettfa). FluoM'Ielria: mediOs de la luZ emitida por pro<ludo& e la teaociOn que po&ean un ttuorok>ro (pg. 126). OuimiolunWII&eenaa medida de kiZ emltlcia como con&ecuencla de reaccione& con esta caracterl$tace (por ejemplo. la transklnnacin de fas luciferina&, cata!iz:ada porlucifwasa. o la oxidacin dellumno&l OobG Mi\t~lttrse Qve f$1 0$ y OCIO$ prooec~imifmlo$ no 501'1 C:lt.l$i'l()$ Oet m~r(;;3je de $01'1(13!$,. $i1'10 qve M al)lie<tn igva!menw en lt~ do1occi0n do ~in~&. antigenos, POQt.te/I0$ 1ig;:tnciO$ ole.

Re$1111. , , de rnsreadorc:s, ,)('licsdOC'cs y n\codl)s para su dcL eccin 1

Gn1p11~dur
(bgtan.Jo)

Prolcb..-. ft'fflii';J o l~lrlk( Jhidin11,


O YllrillllleC l 0 0 1

Man:.!or

.0.

~ltli!O

Ol:t.t>:o:i&! del mlin:.dur


" lllo)fi'IIJiosnJb

de la rr o~.:o:i61! t'n~timil~ ..
d.:~~t6n

B oan

lli&topo rodillo.'ll\0
f
l~~o. --.roemmo

l~1r~'idin11,

nuoriO)eUill
M.t. a:t1611 t

Dir;u:u.;cni~~a

MI~ :UIUOI(.i

l'l:midlJj:j
l~l.ofolt(-

rObtlgCnxa.

ABTS
T MtJ

u l'"'"ti.,.u......... ..nm.lAIJ:,!! #IJI"l ~....


v._n<k.-.... otw~,.~~;u<.o ~ t.J.,..~llltdlolo ---

I'IC)

1'()11,1UU(l. IIKI"J

Derivn.!.u ,J.: ca~llol RewcibQ F'luorostni.:a: Qui.-.i<ltlumillisccocia:


Derin~ oJo: diu~e~anu

.....~"" .. """' 111 dt.wt...

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Fo:sbuun Ab.liM

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Rca.*l:o(on CrOU'IOtl.bl.c.a Micrmt!lpia

('PRG

14.2.4.3 Grupos i ndicadores


lO& grupOS mM OOI'T'IUnmente usados 900 la bk>tlna (vitamina natural) y la digoxlgen if\lt (este~Qide do && pl;tf'll<'l Dig.ifatls ). Ambos son l~ente oonjugable& a lo& nuclelido& y se unen con gr~n afinic:Ja!!, respedi11'81'1'1enle. a te9 proteinas avldlna o e&treptavldlna y a antJcuerpo$ antkligoxiglenint~ Al igut~~l que l)tlra t>$ detivtldOS lluorescentes. se

dl81)006 comercli*nerrta de dNTP& ya unldOf lanto t~l>iotina oomo a digo)dgenlna.


La detoocln de las &Onda&~ llevan biotint~~ o <Jigr)xigenna se realZa mediante ensayos de unin. similares a bs emplead06 para el inmunoensayo. A es~ fin. 13 l)rotelna oetectora. oon allnlded por el grupo Wldicador. se marca prelf'l;lfi'IOnlo Q)n un ISOIOPO tadiaetivo. un grupo nuoresoente o una enna.

SOt'lda biounilad3

sonda mn~-<~dll

('On dgoxig.o:ni""

Tema 15

Clonacin acelular: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)


15.1 Introd uccin general a la clon,acin ................ "........................ - ................................................................... 187 15.2 Amplificacin /rt vJYO del OHA: Re-acdn en cadena de la poUmerasa o PCR ,_................................. ~ 188 15.2.1 Pnnc!plodeltnlodo ............................................................................. _ ..,,.................................. 188

15.2.2 Etapas del proceso.....................................................................................................,_ ,_ ,_ ,,, ............... 189


15.2.3 Algunas caracterfstJCaS del proceso......................................................... , ... ,.,_,... 15.2.4 AU'Iomatizaan de lit PCR
15 2.5 V(lll"f3ttte;$ ~ m61(l<k).,_.. ,_ ...... -------.. ------ ...... -------------...... ---------- 15.2.5.1 PCR 'larga....................................................................... . ................. ... ......... 15.2.5.2 PCR anlclada ...................................... -...................... -.......... ,_,.,. ............. ,_.................... 15.2.5.3 PCR lnV'E!rsa ........................................................................-........................................... 15.2.5.4 PCR con adaptadOtes .................................................-.............................,_ , .................... 15.2.5.5 PCR asimtrica ........................................................... ......... ............................................ 15.2.5 6 RT-PCR <'mpli~n <:fif RNA

192

19J
1 93 193 193 194 195 195 195

15.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA CLONACIN


Conceptualmente. el proceso de Clonac-In (cton.edo o Clona)~) con!ll9te f!f'l la obtM<:iOn de un don, entet~dido oomo un conjunto de 'elemenlos gentiCamente Idnticos entre si y a su precursor. Estos etetr~enlos pueden ser molculas. clulas. te,.:le&, rgano& u orgarusfT\06 pluncelulares oompl&los. Cada componene lndMdual de un don oontiene lt~ misma informaCI6n 98f10:1 iocl, ol mi5mo 91J001ipo. que el elemenlo de partida: por ele. &e puede con&klerar

mol&ula de ONA prccun;cw.t.

~ precursora

ch,dt1

188

CLONACIH ACELULAA:: REACCIN EN CAOENA DE LA POUMERASA (PCR)

qve ,., Clon<'iOn SIA)OnC un3 amp lificacin gen6f~ . Ah0t3 bien, ~ t'>e$lU do la dofinici6n Mteriof". cmtre 10$ de un ~1011 ambi6n se dioe que C60a uno es un dOr'l de tos ceros (pof oj . einoo oYe~ gcn(tti~me:ntc iCSMtiCM lormM un don, y 31a vez <:ada O<vejal es un C*>tl e cualquiera ele 13$ dems. o toda$ son ~ tnl:re si). Debe ,ndlcatSe que la Clonacin es un proceso flsiol6gloo normaL son Clonlcas las OJUI.8.s embriorwla.s tolipotetlte.s IOM\9Ca'9 por mitosis a panlr del Cigoto: cada una de estas clulas da lugar (medlanle ~ procesos de diferenciacin y desarrollo) a individuo& adultos fotmad06 IXIf clulas &Ofl'lticas Clnicas. genticamente ~ errtre si y ala clula embrionaria de partida (ex.cepto en lo que aktct, a su cliwH$idad o polimotfismo gentk:o. resultante
CQmpOI'IC)flte;$

ele mutacin. recombinacin, transposicin. etc.). En el ni~ do <Xg<anismo& compielo&, son clnicos los gemebs monocig(ic;O$ o univitelinos. procedentes <lo un mi$mo vulO recunc:!OOo.
El intor$ de la ~iOn r<'Ciiw C$0t1Ci811monto en su a'lr~Cier biot.ec:noiOgie:O tc)mO proceso de mulliPiic:tei6n de m016cdas de ONA o RNA. Clulas. tejicbS u Otg81'11Sti'I09 oomp1E!It>6, med!WI~e mecaniSmos de manipulac:i6t'l 9f!Wl'lic:a. La Blologla en general. y lB lrwes.ligBcln biomdica oo particular, estn avanzando enonnemente y lo harn an ms en el futuro. oon la val'iada ~a de (;()pia& de Mnl$l'llf)$ ~.icos ya omplc;~clo& e>era mudi,r y tftOivcr problemas tanto de carctel bsico como ;~plicado

Globalmente. intesa de&eribir la clonacin dosdt el punto~ vis~~ su

lln~!id<'d.

os de<:ir:

Cton.a.;in dt Ofgnismos Plt'nlas o ~imalts cmple-IO$. Cfon.aci n de clulas, aisladaa o klrmanoo t.eidos u rgaoos. Cfon.ac.i6n de molk ul.as. sean Sias genes o fragmentos de ONA o ~NA. Ore acuerdo con et proceso e~tperlmentaf. esla Clonacin puede <Widlrse a su vez en dos tipos: Clonacin &cel ular, es decir, clonacin de molculas sin tntervencin de clula alguna. Es sintWno de a~caciOO In vi1to de molculas de ONA o RNA mediante la reaccin en cadena de la OHA pollmerasa (PCR. potymerase ch8in reaction). Se de&cribe en este tema. Clonacin cetul ar (con oUM, no de~) . Es l<a ampli!lcacin do moiOOJias de ~c:itlo nveloioo modionte su !nb'Oduccl6n. a&i&bct<t par ~~-$ , en ~$ omfifriorltl$ en culliYo. Em~ la tecnologia del DNA recombin~ml e Se esi!Jdia et1 etl teMa 16.

15.2 AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR


conSidefaela f10V ola como una herranventa ~ndlble en el labor.IIOrio de Biofogla Mokx:ular ., lngeniorla Gen6!iQIII, et ()tljelivO de- esta tecrica es la amplkaciOo dtecta de un gen o un fragmemo de DHA. o irdrocta de un RNA (en es1 e caso. a travs de su ONA complemereario, o cONA), Pf9&Gnle& en mezd;;l& do nJJV divo!1<'5 f\.lentes, sin nocesid~ de ~ por'llcaciOn previa de la muestra Integra original. Se puede pa~tir de hOn"'ooenaoot, e~ Ctu<IOS ele lejir;lc>. sarqe eornple4a. mezclas de fragmeniO& de ONA obten~ con onimt':s ~ resttioci(ln. mues11as resultantes oe- la extntc:c:i6r'l y at51amento de OHA. etJ; Sin omb<WgO. debe resbltar.W:! que. por raz:ones (Jle se oomptendetn msadelanfe, es un requisito imprMCindibleQU$ se conoz.ea b s.ecueneia de una parte de la regln de ONAo RNAcue &e CJ,iere ampiicar (&atvo en el caso do algvnns v8rianles del meoclo dsloo. eomo la PCR l'lven;e, pag. 1 94). Por estas caracteristl::as, en ewecial la te~paei(13(1 e ampl~ 19 PCR es un m!Odo muy adecuado pan~ ptep.arar clc.to$ ~en una C8r'lliclad muy superior a la de la m.~estra origrlal, Ctlt*) como mtModo de c:tonacl6n aoelolar
comoper<~lll~n .

AMPUFICACIN ptop&ameonte dicha

ObJCll\'0 biiSJOO de la 1
amplific11r ONA

. .

. .

'CR

:
{

Para disponer de cantidad suficiente oomo para utili.:wlo. eoo fines diversos
DETECCIN

Para podcflo dcu:ctar en mucslras oun !X(Iu1.:.;~s c;an1id.1d~ dd DNA di11n:1

us aplicaciones de la PCR eon rmy 111.1'1'11Jt'0&a& y ~ . Como ejetnpiO&, pueden CifatSe: dOnaCiOrl aoelulal' oe tragmenlos oe- ONA. deteccin de secuencias &in pVribc;in previa, s.ecueneiad6n de cidos ru:::telcos. eatableclmienlo de ~ de seaJE~ncia. mtJoo de; mul3ciones. fPaCb oe- ONA P8ffl tf8S4llan1es. diagnOstico de enfermedcldes genticas. prenatllc$ o no. dclen"'''inadn de secuencies especfficas de ONA relacionadas con situaclone$ ~icM cklflnida;.. ~de p(()()lemas totenses o atqueolgioos. esn.iOS eYOivtivo&, dcloccin ele microorgt'nisrnot ir'lfeOCic:leOS, dclocc:i6n de c:61ui&S rumora~&&. ampllflcaci6n de DNA para $U ~ ~ <;:Cl.ll<tr, eh;.

15.2.1

Principio del mtodo

trC$ conceptOS. ya oescrli.OS

y PCR nQ es una lt)cr'lica analltlca per se. Mno ms bien una metodologia. '9$\.lltan.. do lit tll)lica.ci6n P'kliea de (pgs. 163, 16? y 11. re&peetjvCim9l'flo):

1. 2.

O.Snaturatlucln del ONA par;~ dt~r hebr;)S sendlas. Hi bridltc-iOn e$p0Cifie& de la nebra sencilla con un oligonvelebdo. Tambin se denomina etapa de t~JmPI<~do (enlcndldo oomo diStnii'IUCin de temperai!Jra que pern'Mte la reasodacin de hebras senolas tras lo

AMPLIFICACIN IN VITRO DEL OHA: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR

189

do$Miur.'l!i.taeion termica; en i'lgls. annealing). !:sta es la elap;) q~ e:xpliea pot qu se debe c::x>nocer parle ae ta

3.

seooencia. Replicaci6n de la heOta senCilla por una ONA poknetasa a p,&(lil del lt'mbil'l. elongaeit\ o extensin del cebaclot, o pol imri~acin.

Qligon~leOti<IO

at\teriOt OOti"'O oeba<IOf.

~e ta apllcaciOtl en forma cfclica de es1os tres llfOCC&O$ $& OQI'ISiguetl mUIUI)IeS copias 001 lragmei'IIO de Cido oocleiCO et1 un OOtlo espacio de tiempo. como ;e ~r 3 contirM~CiOf\.

A pesar de esta aparente c.omplejidad. en teori(l e. un f'l'l)( sencillo. !ien!llbte y relativamente rpido para t'lmplitlcar secuencias. En la praica. se raquicre un conlr()l preciso de 1M variables que condiciOnan este triple prooeso (secuer.ela dlal\8, cebador. enanas y resto de oompol'llt\1es). ~M~ iMI.nJMI'!f'l(()9 Bdecuados (tefi'POrCJCiadores de DNA) pata estable<:er las condilciont$ cte cada e-tapa y repetlrta9 cldic:amente (tiempo, temperatura. nmero de ciclos. etc.) Se oon$igve tt&i arr()li!lau ~neias ele Lamai'IOs diversos. oomprendldoe entre 50 pb y 2.5 kb. Patt~la rct'lii.:Cic~ pr&ctiea se preel$;81'1 en la mezCla de reaccin 106 59Jioentt1:6 'rot~ctivos:

a} Los cualtO d NTPs, en exceso. oomo

&u$lr.lto$ par.~ la si.nlc&i$ de li\$ i!V'IUI'n!'!t1ltlles COI)ias de ONA. Pata ser reconoad06 por la I)CIImerasa, delxln ir ooom~ de Mgt<. b} Oos ol~onuctetidO$ do ce4entt sencilla (COIOQuiatmel'lte. ougos'}. generalmenle sinttiCO$. de 18 a 30 nt Sus secuenc::ia,s 1\an ~ser complementarlas. te'Spe.ttfvamel'lte, a loe dos ex11emos 3' de I;J regin diitnt~. vno en ~da hebra. de modo que &o$ ()ligos Pued3n eieroet de cebadores para la replicacin da las dos hebr.ls ef'l la regin diana. POf esta f8zo no te oueoe M'C)ilicar vi\SI regln de DNA si no se conoce la secuencia de sus do$ oK'Ircmos. De hacflo. t t &3 poe<i()n dOildO hlbf'idan tos cebadores la que defne la lo"91'ud del fragmento quo so amotif~Ct~ (secuencitl di:lna)

REGtON OE ONA OE LONGITUD VARIABLE


,)' .......,. .. 1
~

,.

--Como ya se 1\a fldicado. se ~viere


utl~

r ,.

e;) Un<t ONA polimerosa tefl>est.Bbfe, es decir, enzlmdcamerue actwa a tempetMura& relativwnente altas (al! menos 75 c. y estable oon ltecuencta 1\a'SUI 95 e). Esta caracterlstlca permite su actuaCIn en suoe&iY06 CIClos sin n<~Ciival'$0; adems. 1& tef.llicaciOn a tempetaturas eleVadas Impide la formoon de hi bndos pan::ialmente desapareac~os y contr'l!Uye a la especificidad y rendimienlo d8il proceso. La enzuna ms en'C)Ieada $(1 llama ,xJ~Ntleta$8 Taq, pot proceder de la bactena fhemw.s CJq!Jatiws. QI.Mt Yl\e on mt~I\CIItltitllc& ~ t~gva c:aietltc E&t<t oozlma tiene el inoonvenienta ele carec.er de lt~ ~ctividad oom:~Ctort~ de prvcblls (eonude<ts.<t 3')., por 10 que 13 frecuencaa de errcwes e& supeor a &3 do la r~Cin (atrecteoor ese un e~ pot eada 5 .000 l'lueteotiCios n::orporadOIS); de ahi que en ocasiones se wsbtuya por otras ONA polimera&as wmoestables.

15.2.2 Etapas del proceso


Sv<:e$i0t'l de ciclos (gel'leratmente etltre 20 y 40, oe 1 5 a 5 minutos oe

y replieaelc'lfl. para conseguir \M\8 e~ ampilicacion del numero de molculas que conlienen ict secveoc:ia de inters o diana. La duraciOfl total es de l!lltededor oe 2 hOras. dependiendo oe tas condic:iooes elq)E!rimeontates concretas.
dl.lt<~~ein ~uno) de dcsnttl\lrllliVteibn. hil:lrldaei61'1

Cada Cdo de una PCA. 001'1618 . pue&, dt

'*

G~P<t:&

1. Oe&naturaliuc;in: Catont<Nnicnto parn la ~ttciOon oe las dos hebrlt$ del ONA. mCCiionte unt'l intutk"'CI6n bl'e~
2.
(:J0.-120 &) a vl'l<l tempeft1\\lrQ ontrQ; 68 y 97 e , que debe ser 5UPCriOr 3 13 <le tusiOn (T.,, p<\g. 166) do la regin de ONAQI.Itt &OQI.I._. 3mplll\c31, lemp&<ldo (O hibr~in) : enfnttmiemo tlll)i<IO )Or deWP de T..,, Cle form3 que SC permite 13 hibridt'lon (pg 167) de 13S ~s senCillas oet ONA oe ~e(es OOt\ 1os Oli!gOS cebadores. Gef'leratmente se usan tempetaturas c:te 37 a S e Qve &a mantienen entt910 y 120 & Elongacin (o n.~ptic..cin) : El<tP3 do ;,wnplifle3Ci0n propi3mente ditn<'l {7275 'C, t-3 mtn}. en la que la ONA poliMet&Sa lermoestabte e1onga tos ceb&OOtes, empleando como motc:te ambas heOtas originales. La replicacin traMwtre (p&g. 14-6) en dlrecciOn 5' .-,3' a partir del exttemo 3' -OH de cada cebadot. empleando oomo sustrato tos cuatro dNTPs, haSta tetmlnar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva ecapa oe desnalurallzaciOn {s~te ciclo).

190

CLOHACIN ACELULAR: REACCIN EN CADENA DE lA POUMERASA (PCR.)

fta& lefi'98180Jrat v. eapeciellnellle 108a.e~ aon. on&ni::IIIYos. ~n pera 11ecuaf'!e ceda 11"1111!6n COI'Icret.~

Esquema temporaJde una reaoc16n cte PCR pn' l


1a. ddo

1 :

f=:::;:;;=~~:--r.---1' o

"-'"~P

u so

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zociClo

JCII .:,~111 ".!~pa

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40

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r~mpllld!

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10

1
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30

o
.c;ic~Q$. clc:vad<~

150

160

tiempo (mint
Ade!Tis de &as 3 Olapas de Cilda cidr:J, comUnllMiflte M'l ai\OO!e una etapa previa y una final al conjunto de IOdO& los
La provia .,
ICITIJ.l(lr.Jt\.lr.l (illth..l$0 $Upcrior <' IP do ict$ e~ do de$na1Uralizaan), ~e b&icamente

!*'* INI<;hv3f S)(OIO!l$<1$ y nuele;)&aS ot tt1 mliHiro asl eomo par~ 0$0QW.W ~ <l~$00.turt\htaein c:<>mplcrta dol ONA de pMida, es;peclalmente si este es de gran wnano o posee regloneg nwy compactadas (c:O dt un DNA gon6mioo coi'Of'l(e!O). La etaps final. por su pana .conSdle en una prOioc'lgaCIOfl de la Ulbtna ~ae~ para pefmihr quiO so completen todos los fragnl!Wos. Esquem!lcamene, el OOOJU'Ikl de reacciones y los resuhados correspondientes a los PM'\6109 daos son los siguientes:

1*' ciclo
la d UIIII {IIIC ~ llft h,1'1dC Mlrl ll'lclr ~ l;
~"11Cn(o.o ~llmjl.--1"1'' r tllft l():llllldu~

tu~~ ~ c
1 '11111

lle rickl:

una pa!W dt 111111 1110lhuk ~ 0)\A

m;~yllf'

&1 f11 mcn10 <li11111


~ .

~ ~-

~
- .,..,...lo !> ll:lltiJ..

IJ":\ d.' O.:~t lltbt.l. &:vl r.:. '-lfi . Qtbto.i>='- m -'111dll!lCl11N

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~ cr
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NNIIIIUIII~I\\n lcii)J.,I dulkll f(!f'll(!l.ldio, (1 !ol~ll(lll l!!l IU5 ~~ ~

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c.:OO~-.

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f'llln~tm.,.,..,ll

1 rase de diiJIIIIIO.

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tq!IIQ.J t11 III$1111U !!ICdld.l l.iii'("~IMp"';Jm:~ ~.V.\11.1

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2 copbl,
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1H l h~:brfi'J !IU('\'tt-( KlJ lh l Wlt ) 11 ms .:l)m qllt tl l)l\ \ dt pJirtiob

AMPU F ICACtN IN VITRO DE.L DNA: REACCIN EH CADENA DE lA POLIMERAS A O PCR

191

2" cic-lo
(o:omicnxa dl!lldc' termIS:a ~ 1 ptiiDC'tUI
.~

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JI.>C

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2 c:opi8'S, de doble hebr

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"'!Jc. ltltl!ll.,dbn..

4 copias. de doble nebfe

8 c:opiN. de he~<~ s.ncltl


l~ olc bll. l.n ~llli

8 toplu, <j,e dobkl M-t>ra

t:a"""' ; ~r ~.._-.:.ap:ul'.~" P'f' ,.,._,. \1/J ~"""*''


)ojuco.WI\'~knaii.'I~IA

.m.'""'oo. bll>~ :llllo vvdll(on:n copo.. 1mslb(a.

Debe hacerse notar que si la muestra de particla.. romo OQJrl'9 en el ejemplo dncrito, est bmada por1 mol<.:ulas de ONA de mayor lamao que la regin diana &lo a paftir del tetcer CIClo apa1 ocen ~i<J$ eactas de la dian&. Si la
mvcstr<t de p;)rtidtt twbicse ~ el ptOpio fr<~gmeoto ditm;,, lodl!s l;,s OOI)QS llparecid;,$ desde el primer ciclo ~eri.,n
igu~IO$ t'l#:l

192
4R ciclo

CLONACtl'f ACELULAR! REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA {PCR 1

'. -~~~
.

16 eopiu, de

d~

'

8 eopia.s, de dOI* hebra

16 coplas, de Mbi1

~neilla

hebr.

[
Ademils de fa amplificaQ()n globQI, por ac.~memo del nUmero de mol6culaa de ONA, debe not<ne cmo el numero

de c:<lP3$ do la ~D aumenta ~ho ms ttp00;nen1e quo el de (){rM ()()J:li3S mM largas. Todo ello Mee Que en la
nJ$zCII.'I
fin~l.

el teoninM 1& PCR, Jos lragmanlos diana $14)efen abrumaooromente en

n~ a

cualquier otro tipO de

ffflgmnnto, inclu~o obviameMe la~ molc:utas de DNA otigu\l'lles de la m1.1e111111 (q..e no tlan sido ampfllicadas).

billn en 40 clcloe.

Observese en 18 labia siguiente el eoorme gredo de ampllflcaceon conseguido, de un milln de veces en 20 eld06 y un Esto es lo que permite aplicar la PCR a muestras poco purificadas y analizar los rewltados directcwnenle on los que $61o M podr dolec::lar el fr.lgm&neo arnplif~Wdo.
n~ de celos

realiZados 1 2 3

n~ total de coplas 2

n'i de coplas
'18!]8S

n2 0e cqias
dot~na

dlanasllotal

5
10 20 40
X

8 16

8
10

o o
2

o o
25%

32 \ .024

8 :22
1 004

69%

..1(Ji
., 10 11

20

40
80
2x

. ,Cj'
10'1

99,996% 100%

50%

2:~C

15.2.3 Algunas caracteristicas del proceso


Rendimiento: Pues1o que los prcx!Uctlo6 de cad& cido sirven do moldo par3 ef siQvi<lnte. ltl ao.m.l<lein de copios vez do &noal- Sin Qmb8tgO, en 13 prielic::3 flt rtndirnic!1to de~~ no os complelo, por lo que las cil'ms MI ven algo reducidas. A pe$<11' do olio, $k;ucn lSiorldO muy~;)$. El nUmero de.'! Wl)i3$ el !iNf de m <:ido$ ret~~$ $& puede ealcl.llar como:
(tanto~ como dianas) a& axponencial en

AMPLIFICACIN IN VrrRO DEL DHA: REACCIN EN CADENA DE LA POLLMERASA 0 PCR

193

Siendo

N =nUmero oe <:OP'8$ <lClflenidas ~ = nUmero de molclAas ink:i81e$


R =!'$~lo de c..-.d:. c:.c:lt)(ge~lt't'leMe. de 70a

85%). Cl(ptM8do en tanto por uno (0,70.0.&5)


X n(xnero de ciclos

hatl aesarr<*ldo modlflcacionft del mtodo dec;ritt>. cncanw'laCias a aumen\ar la eftclenc1a. sobre IOdo en lo relaiNO a la conoen1racin de Mg1 ' (normalmerl1C ele 1 a 4 mM) y al tiempo y temperSiura de lemplado

se

Dur acin: La dur..ci6n <.!e Clld3 ul\8. ele las 1res etapas de cada ciclo y el nmero de e:octos Qebcn optimiZarse. ese la secuencaa oonc:reta ave se q.liera 3r'l'()lillcar. En m.~coos C890S. la eleoci6n de e&tas oondicionos def.>e hacerse de forma o~irie<t EtipeclfiddOKJ E$ mvy elevada ESI& oetetmlneda especiameMe pot la &eCOOnci<t de 10$ >s ceb:ldores util:zados y por las oondicione6 de templ3d0 $e pueo& determinar la especificidad anaiz:.ando pot OIOctfOfOrC$i$ lO$ pn)(I~O$ generados: la aparion do uno bi'lnoo Uniea ll'ldiea que la l<:niea es especlllca. P e,amplo. $11il to~tura de tert1lladO se reduce excesiv.,en!c se pr~ falsos pos!wos debidos fundamentalmenle a ~eamtef\\OS impettectos del cebador c;on sec:oetlcias disbtlta!l oe i8 diana. aunque similares. ~ resuiWn <~&1 ~.<~I'I'Clin amplificadas.
dependiendo

C111paeldad de delecdn (oomUn. aunque intlQfT'OCt.amon~ c:tenominl!da sensibilidad): Es muy alta (bajo llmM de e*'Ci6n). tanto que la PCR puede permitw de1ectar una (il'li(:;) f'I"'IOeula oe OHA en ces cualqUier tipo de muestra clinica, lorense o arqueolgiCa (~ll. pelO,~. eet.). Sin en'()atQO. esta C818C*fsllca supone ....,bln un e~;)()) IIC$90 de coMaml~ por mole\A<Is de (!rigen ~no a la muestra. Fidelidad' E$ doeir. 18 eapaciclad de ooplar secuencias con precisin. $11'1 W!ti'OI).IOJ mulaeior.es (carOOios en la secuencia de nucletldos). Esta caraaerhl!ca depende sobre IOdo do qve 1<' enocima emp~e~a tooga o no acuWded correcsora de pruebes (3"-exonuc:leesa. pg. 1117), Asi, 1 <' ~encia de en osola en!re 2 10_. de una polimerasa Taq coNYer.clotlal y 10 de la poimerasa Pfu, que $i tiene ~ividad 3'~XOr'ludeasa. En 1000 ceso. la eleccin de la enzima depenclef del objetivo de '<t PCR NO es muy impMance 1a ftclel(led s solO se prelerde ob1ener u03 sond<!l, oero .s fundamenlal si el objotivo tn la ictentir.:tldn de mutaciones pooo frecueM&S.

15.2.4 Automatizacin de la PCR


La au10matlzacl6n es sencill;l y 00 bajo eos4e. dadO e1car&c:ter eieleo <1e1 prooeso. el empMo de componente$ eSiable& a1 c;aao, y el delK!rrollo de lermocielaootes pata ptogramar los camtos de temperarura. Al mismo tiempo " lmptesclndible, pues slO mo4i<ln~ lf <'lu!Om31i.taei0n se hace faC11ble la realizacin de un rnero elevado dlt ciclos y se aumenta la P~Ci&in del proceso Ello lacilll.a un empleo cada vez ms e<spec.ffico y senSible en ellabonctlorio climoo.

15.2.5 Variantes del mtodo


Han surgido numerosas modiflCCIICioAC:$ dcrivttdtt$ <lel miO<IO ~ioo IniCial,. con el prop:'l$110 de mefotar el rendlnW!nw o la espeCificidad, adaopUtrse il muestrO$ Ntticu!tm:)$, ampi!lcar molculas de RNA en lugar de DHA. pro(!uc- c.-dona!! de hebr~ set'ICila ... 1>ot ejemplO. una !TIOdlflcacln muy comUn en la aocrua!lda<:l (denoiTIIflada ~c:om.ienzo en caliente. hOt stan PCR) cons.s:le en privar & la mezclo de reocc~ de algt.:> de ws COn'CX)c'lentes (frecuentemente la polimera&a} haJt.ll Q~ w Mv<t aleMJ:&dO un.a letnpe!&tura supetlor a la de templado. De e&le modo. &e e~a la elongoOOn de ceMdor~ asoc1aoos inlcil*nente con poco rigor (a secuenaas de homoiOgla parcaal con la diana) y, como re5Uitado. se aumenta muChO la eS(leelllcldad de la amplificacin.
A oontinvalcin. 110 (Ometll;)n bre-Yemente alguMS de 18!1 variantes ms &~gnltlcatrvas.

15.2.5.1 PCR "larga"


Oenonw~ada l.PCR (long PCRJ o LAPCR (LOI'IgC'I' -'ncl' ACCu!Mt PCR. 'PCR m:\slargtl y tJttl~), su Ollj!livo es superar lOs 11mltes de la PCR convencional para amQiifiCal con fidelidad region&ll <fi<'IM do gr.'ln t&mao (entre 5 y 40 kb). EJ principal fat*)r limitante es lil OMJ$Cn<:ia de aelrviOM ~IOI'a de pruews en la potimerasa TaQ {pl\g. 189), por lo que se aade una cantii:Sad menor O. otrt1 cnzirn3 con etlpaeidlld de OOtr'eOCiOn <le pruebaS (por eje~o. la Pfu) pata con!rarre!l'ar la carencia ae esta aC1MCiad y. mismo !lempo. seguir apovechando la efiCSeta de e10ngac10n de lj, polimetasa C)tlnciPQI (T80 o &~mltar).

15.2.5.2 PCR "anidada"


La espec:if'IC~'Itd OUOCSt aun-.enwse re..'Vi.lanOO IM\8 ~unca rescc.on de PCR. con dos cebaoores nuevos que hltw\dan <.len!ro del tragmer~IO diana Ml)liritado p:~t el primer pat. dando BSI lugat a prodllc:IOS de PCA mas 00tt06. pe~o mas esleO!Icos. Las coplas oonect.as de la prWneta diana contendrn arrtlas seruencias complementarias a lo6 l'l.levos ~dOres.~ diferenCia 00 10$ ()r(ldue10$ t10 especilleos generaoos en la primera PCR (que se obsel'\fan en la electrotore!lls 0010 varias bandas o uM bai'ICJ3 fusa}. que pot eiO no resunarn amplllk:ados en i8 segtM'Ida. Este miOdo tarmlen StW !XIt8 at#lef'ltar el !actor de amplificaciOrl <Xlr\Seguldo. al suponer dos rondas de af1l)llflcacln.

194

CLOHACtN ACELULAR: REACCIN EN CADENA DE LA POI.IMERASA (PCR)

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, . ,dHo.lilll!

3'

'1~

________
y

J'

~ .. 1

S'

__..

15.2.5.3 PCR Inversa


Esta varitlfUe &e empl9a para Clonal r~ desconocklas de oo ONA, Situadas en P<>$iC:in vccin<tl a M<:VG;ncit~s oonoc:idM E$ decir. en lugar de a~if ~ear la regin interna, ltanqueada pot 109 dos c::ebadole$ (PCR <XInvencionat). " ampliflctt la reg.On axterna. que flanquea a los cebadores. Para etlo es neces.arkl eottat el DNA a 811'1"1bOS lados ele la regin diar\3 con un<~ tna:iiTlil do r9$lriocin (pg, 1 97). de tal forma que los extremos eoheatvos tesultantes pue<~an hib~ entre si, tOI'l"'\\WWo Ut\8 mol6o.Aal c:irt1.1lar. EJt;t O li oorrnda DOf una ligasa y &e realiza la PCR
~:1

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S' AGCTT

.
OesnaiUralzacin 1 + Templlldo 1

,.
. ftCGA S'

ONA \,K'Uiar de
&>hk hclxtl

c.'lllretnU:~ c~i\'(>1;

A l q;_l.ll:ll quo: en 111 PCR nurrn11l. 111 d 0Jigad6n .,..001! progr('.Uir lfl,! u 1rl(fi()L pero l6kl jo,' a n plif!C'IIdl el
l"lJIIII.'MO Si sobt\-p~~S~ Ia IM'k&l o.k la otta d~au

hibricbdus y tip:~dus

AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA: REACCION E:N CAOE.NA DE LA POLIM "'"' ER"' A ._S,_ A ,_,O~PC"R ~----~ 1~95

,. ,.
~o.:

,. ,.
twa unphrt<'"""' ;nnlxb
"""'~ ~~ llrtm~ut-JNn
1;,~ !o('(UC!!d:o ~I)Nio,:o,U.

oon ceb<adof~ Qve htitlri<IM oon 106 extre-mos 5' de la secuencia oon(l(;iO;II. po1 k> que la eiOo \gaeiOn se exlef'lder a!redfx:lo' del ci ret.AO. Se generan copias de un ONA. Iif'IOOI delimitOOQ, como en la DNA normal, por la po9lel0n de ambos

oebadoros.
1 5 .2 . 5 .4

PCR con adaptadores

$0CUCn~ <le:SOOI'lOCida ligando a ws fragmentos de rq$1riocin I,M1()S tJdaptadof'fJS, ollgonucle6lido& sinttico& (.Qn extremo$ (.QhC;$iYO$ oompatlble9 ooo k>9 generados en la mve:slta. A connnuaCin. ooa vez desM!uralizadO$. se <'!&oe:n ce~es especlfloos para las secuencias 3' de los t~d:tptactores. Se amplifica asl el eonjunto de adaptadores y sec;uc~~Ci<'l ~1'18 pero deOe senalarse que se amplifiCan pot igual tOCIO$ lOS lragmentos de resltJCCin presentes. no ~o :slo

Tomt)i4fl puede amplfficarse una regn de OHA de

~In que se ~uere nmpli li~11r, do! 'l'.:~.~Cm:-11 de.roll(l(td~o

'\' AGCTT

l" , A. -adaptaOOr 1 S' GT'CCACTCC

adq'ludiJf =
TTCTTACTCAC l' 'l'CAGTG 5'

J" C>GG"!GACG::'TT0:::C'5:

AAGCTTCTTAGTCAC )'

IX'.t!ildut 2

[TTG] S.
~

TTCGAAGAATCAGTQ

1Ei y l'e$to do QciQ, de PCR 1


S' G'l'CCACTGCAAGCTT , , 3' CAGGTGACGTTCGAA .. , AAGCTTCT'l'AGTCAC ) ' . TTCGAAGAATCAGTG ~

15.2.5.5 PCR asi mtrica


Er'l f;$!e coso, ~ !rata oe geht!ftlr copla-s de hebra sencilla de un ONA. En la vanante ms &~mple. se al'laden c:ar'ltiOiaoe-s muy doteret~-les de ambos cebadores, de modo que tras los pimetO$ cic:fo& de PCR uno de 911os se aQOia y, disponibles ya sufiCientes cooi11s 081 ONA ditma, $(AQ vn.11 de sus hqbrns sigoo ampifidil'ldose grncias 011 ocb:ldOI' rnts abundan1e.

15.2.5 .6
amplif~taCI6n

RT-PCR: amplific.acln de RNA

El nombte. MPCR oon transcn~a inven;.( (inicitlle$ do /V'I'Cilo tr<Jn$Crlj)r.;;$<t). mdieo ~ so lr<tla de un<'! de RNA (cspecicllmonte mRNA) <'1 tro~ ae 1a sln.leSis pre-v1a ese su cONA (DNA complefl'lentario al RNA), que despuh se amplillea por PCR. Es de<::it, no se OfJCienen Clelt)ias del ANA de pattlda, sino de ONA. aunque se OOI'lsei'Va ocvlamente la secuencia de aqut.

Es el m&iodo con mayor capacidad de detoecin de los disponibles pt~ra lb medida de la eJCpresin ~ni(::. in vit10. Se utiliza greierenlement. para an'Cllific<u mRNA$ do ekA&S asequiflle$, PQ1' t'je<pb sal'lguir'let~S, COI'I utl:'l e;,cpresiOI'l

196

CLON:ACIN ACELULAR: REACCIN EH CADENA DE LA POLIUE.RASA (PCR)

eltrvada de caeno& gel'i&$ (pot ejemplo. globlna). Tambin se ha alle~ "' a~li$1$ de lran&eritos da genes expresados tn gr..OO minimo La mezcla inicial conltene IOdos lo8 eompot~entes neoe:s3rios muostr<11 de RNA, tran5Criptasa lm.eraa. ONA J)OiimetM3. <:eb<ldores y dNTPs.. El proceso comienza (por ejemplo, 45 mln a 48 e} eon la si ntesi$ do una hebra de cONA pot la aoein de la trotn.SCriPtM<' irrvor$a. una polimerasa de ONA dirigida por RHA ~- 14 7}, ~icnOO et cONA unido al moldO <mo ~ RNA: cONA. En una segunda etapa (por ejemplO, 2 mln a 94 "C) se CIOSMturaliu el dllplex y ~~~ la a~~tacibn $09Un el mec:ani$ITIO de una PCR nonnal: la nee de cONA liberada acwa eomo ple.x se a~~ea en woeslvos ciclos.. molde para una segunda hetlta eso cONA y 11.11g0 el dU
R""A. de' hc'br11 tn~oll~

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1E2 y ddos suoesiYos T+E D1


.;1)' .o. oh: oJOOie h..:br" (llot~rhlkado ..:n { c:...JM.dc 1'\'ft) j. GCGOCAD'l"CCGAAJ'GGC

J' !'rCAGC'TU('CCGQtATAGQCT'I'

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. . . . J'

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j' . . . . . . . . ... AAGOCGIUUGCGiC~

Te6ric<l~t. Mst3 con \IN! rnolk~o~l3 do ANA Ql}e este i'1tact3 entre ~ do$ &itios de unin al cebadof pera conseguir 1& amp!ir-caciOn. BajO et mismo Pf!~. ~ se pueoe ~irlear RNA usanoo 1 8 potimctau Tth (1811'1bi6fl ller'mOes&able. aisiada de 1a bader'ia leM'IOfll& Thennus ~). que ~lene 111 mismo tienl>o aclivid~ ONA po~tnetasa y IJ'ansctiPiasa ii'YVef'SS.

Tema 16

Clonacin celular: Tecnologa del DNA recombinante


16. 1 Et\Zimas de r estrfec.in,_,_,_,_,_,_,,_.. _ .._,_,_,_,_,_,,,_,,_,_,_,_,_,,_..._.,,_............_.,,..._,,,..._,,,_ 19 7 16.1 1 lnlt0duccl6n a las nudeasas .,.,_... _ ,,_,,,_,,,...,_,,,_,,,,,,,_ ,.,_,,_,,, ..,,._ ,.,._,, ,........ . .... 198

16 1 2 Entim.<l$ de re.lroeOIOf'l .. ,,_..,_... _,,, __,,_... _,,,_ ..,_,, __..,_,,,_,,,_,,, ------........ ........_, 199 16 1 2 1 C<n ;)Cteri5lic:.a$ gcner31e!S ..... - .... .......................................... .......... ......... ... ..... 199 16 1 2 2 P <IC)OI bdgico del sisl.em" rne4ill.'ICJI6o.4'esl.ncc01. 200 t61 23 Aeci6ndol&$9n.vm&500to$1riccindebell. ........... ................. ............. 201 16.2 Clonacin cel ular de motkulil& de OHA , _ , _, _ , _ , _, _ , _,_ _ _ ,_,_,_,_,,_,_, _____ _ ,__ ,,.,,._,,,.,,._,,,_.... 203 16.2.1 PreparacindeiONApara~c::lonoon .. , , , , 205 16 2. 1. t Insertos de ONA .- ... - ....... - ... - ....... - ....... _,,_... _,,_.... ,.. _... _....... - ... - ... - ... - ....... -........ ..._. 205 16,2 . 12 l n$Cr1QS de ONA compler~~entaotiO proee<~ene de un mRNA .. ,_,,_,...... _,,,_ .,,_.,,_ .,., ,.,_, 205 206 16.2.2 Preparacin del vec4or de clonacin ,,_.,. ,,_.,, .,, ,, .., 16.2.3 Fof'l'n8Cion de la moic::ula de ONA reoatnbinante .... - ............ - ... - ... - .,._ ., ,_.,_....... _.,.,_, 207 16 2.4 TiPO$ de ve<:!Otes ._.. , ... - ... - ........... - ...... - ... - ....... - ... - ... - ...-... - ... - ...... - .... - ... - ..... - ... - ... -........ ..._. 208 16.2 .4 1 PliiSmiOos ,.,_ .,,_,, _,,_, _,,_... ...-... - ........ ,,_,.,,_,,_... ,.,_.,,_,.,_,,_.,., ... _. 209 16.2.4.2 S..Ctorifa~ , .... 2 10 , 210 16.2.4.3 Csmdos .... """" .,, 16.2.4.4 Cromosomas attifi~ .. ... .... .... .. ... ........... .. 211 16 2 .5 Incorporacin del ONA reoor~~blnante ala cUa anfltrlona .. _,, _,, ... _,.,,_,,_... .,,_,.,_,., ...... 21 1 16.2 .$1 Tipos de cth.JI<' <1nfiri0na .., .., .., ..,, 211 16.2.S.2 Mtoo& de introdoocin del tONA ,_,, ,, .., ,,.,, ..., __.,, _,, __.,_, __., __ ,,__ _,,, __,,,_.,,_.,, __.,, __.,,_., 211 16.2.6 Propagac::l6n en coltrvo .. _ ., __,.,_,.,_,.,_ ,,_,,,_,., __,.,_,, _,,_, _,,_,.,_,.,,_,., _,., __.,_,_,, _.. , ... -....... _...,_,., __.,,_. 213 16.2.7 DetecciOn y selecan de tos c:Sones reeotnbinanJes ... - ... - ....... - ................... ,.,_,.......... - ....... - ............... 213 16.2.8 E11ptesl0n genlca ,_.,,_,, _,,_.,,_,.,_ .,,_, _....... -... -... -... -... -... -....... -... - ........ ,_.,.,_,.,_ ,.,_.,., .. ,_.,,.,, .. .,..,_ ., 2 15

16..3 Gcno tcca s ...._,,_,,,_,.,_,.,_,,_,,.,_ , _,,,_.,_,.,_, _,, _,.,_,,_,,,_.. ,_.._ .._,,_,.,_.,_.. ,_..._,,,_, _.,_,,_.,,_,_,,_.,,.,.,_,,_.,._, 21S
16.3.-1 Genotecas9@nmicas ,,_.,, __,, __,, __, ___, __,., __,_ ,, __,., __, __.,, __, __, __, ,_.,,_.,,_,, . 216 16 .3.2 Genotecas de ONA OCHTlplen'lentano , _............ -... -....... -... -....... -.............. .,..._ .,, ... -...... -....... -... -......... 216

E1 mtodo clkioo de donacin de Ac:idos nu~os os el Que ~ocll<~ la c::apaCJdOid do l<at; clulas par01 replic.at ef ONA. Sorge gracias a la aparicin de una: &ene de tcncas que oenniten elal&lamento del OHA y al descubrimiento en los al\os 70 de las enzimas de teslnCCin. qoe hace postie en el labofatorlo cortar el ONA e ineotpe)tar tos lragmenlos a w~ctoteJt, que a su vez se inlroduce.n en oMullls anf,'ff10ttas, dOI"'de tiene lugat su replicacin . Aunque . etl ~ipio e111a teenologi a SOlo se planteaba pata c:toi\$Cin oe1 DNA . eJ~is.ten ~tu/lln'lente vri3ntes. Que ol'lllltion su eliaenc::ia y exbenden su aplicaci.n al RNA.

16.1 ENZIMAS DE RESTRICCIN


Arttes de Clesc:tit>ir el proc:eso de ClonaCin del ONA, es I'W!oees.ario Moer ~ inCJ$0 Pilq~ et;tutiill con CJet10 detenimiento laa propiedades y earaetetis.ticas de las endonucte~LS.:Js ~ restriccin AvllQ~ cst<l<$ enZimas Cleser~~pel'lan un.a funeiOn propia t~~ l as C61 u!as proct~rio!M en l~s q1.10 w doscvbr..,ron, $0n P<'rt<vl;ument ImPOnentes POr ~ er11)100 O!';J)Orimentaf en vt~rios rea~ de la Biologia MolecWII. de intets tanto bsiCO como aplicado al di<~gnsbco d inioo En espeCial. se utilizan en el proceso de la cionacln mo6ecular del ONA. de ah la oportuf"'icSad de su esludiO en e$te ~r. AOems., bei'Wsn aplica<.:in en otra& t6cniet$. oomo la seeuenciacin del genome y el estudio de

198

CLONACIN CELULAR: TECNOLOGi.A DEL ONA RECOMBINANTE

tos po.limorllsmos (temas 18 y 27}. Se IniCia eJ estJJdlo oe estas er'IZimas OOf'l un ~e re.cordat.orio do&&:$ ooclea$01$ en gel\er&l.

16.1 .1 Introduccin a las nucleasas


Se denomina de fonna genrica nudeesa a cualquier enzima con eapadctad de escindir los et~laoes tosfOdlifJ:$tor de le cadena polinuCieotidiCa de los ~i(J()s nuleico$: $0n, POt tal'llo, fo5fodiestera&a&. Su espec:jicid-00 puede

""*ar$0 CC)tl ~pecto" tros cmerios:


1. hci$in on posk;iOOC".s intomi'ls o respectivamente):
tot~

en la estructura primaria (endonuc:IN&as

y exonudea&as.
fo"l$to en lU8

L:i.l f)oouch::!'S;:s hulmlatlln


rx<-IIUl~uu,,.te cnla('(';i

qt.te pwbcip& d nuo:lcUolidu t~-nn.itul

(bi<-.n 5' o bicl'l i . dcpu~dicDdo de la nonudeao). (knan, por ~nto. Utlll C11okn11 pohnuct.wtfdK:aliCOrtadll y un nucic+&ido(N)..

ut ruaclt~&t-nwoofo~fato tPN o 1\' p)


o un n1.aCiefidobi;(osfnto (p.-.:p). vbc"
p~p
1)

"u;:n

<; bocn

..

t\pNp~'pNp_.

.. .fl~'pNpNp .. NpNpNp_.

..pNp}\pNpNp N

Las tndoouch'llw k'llo l'lldroliat~ .:~~bien internen M 1~ cadena. r~ decir. ~in af~ar a lO!> nudHido; !~itul~. Qcncr.m do1 ftamcntu8

polinuckochl:ici.
2 ActunciOn $Obre uno de 10!1 dOS tipos M enl ace IOstoE!stet:

... pNpNpNpNpNpNp...
J;C'

Alunu lliOICieliSDlium::a:) nct'-'n apcciticammtc: bidrol ~o los '-'fllll\4 fosf.aao


(Cimllldoo tUII d 011 3', mi<"l1!nu: que UCtaJ OuM j!] bi.Jrol rnu'll~ f..-.rn~ oon OH S'. Oc CStt mudo, lu de: liJ:Q.::L d11n l up 1 C.XIr\:II'IO!l J' OH y$'P. lllknll'llS QUC l:!S 0.. LiJiu..:ll:: produo:cn C"X!n:mc~ J',p y S' .OI I.

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ooxle;u.;. dt IJilO ~b

lftllllll" t 1 . ~~ \-.011 ) ' PI

trompe j ' .f'. tntk $ OU ) 1


,p}.'pNpNp _._ NpNpNp...

fjnttshtiJCC3itl 1 (k rrn!.1'11\ tk srmimtU b una 3' cM"udcasa de tipo a... por nmo libc:rn el nuc~ido ,}". t..-noio.;a! <n forma de: nuc~i<b-S'P. Su amOO <"Xhau5u~a ( hk!rlii-1io t(!hal) pf'\Jduce lll ln(>.lCII d-. ni.ICIC\.\stdos,.j ' .p
pNI)Np. ...~ ...,~ .

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c:0010 rnontnoch:(o,:uSc~oJ' ,S' .JM.:J(I,fato. S1 la eSC'Isln C$1\"J''(:lili\ a. 114'1111\'CCU kw PJeesi,os monon~leOsiOOr~ .p y('! n~K:ks.i!J ~ 4ef11'1inal
p'pNpNpNp.. 1\'Plto'pNpN ~ )o..;pNpNp ......NpNpNpN

p.~p.r E Np+N
c-.,nP ,. N., >-l' NMh)

P''

Np

Np

3 Reeonodr'!"'ienlo de nucle6sld06, bien por la pento&a o bien por la b&M nitrogonad<' ($(:110 en t'lgu~ nueleasas): desox.irribonuclus.as o ON asas. que actan slo sobre ONA; ribonucloaus o RN<'I$M,. Que hielr01i%an RNA;

r..,alrnente, algunas nucleasas distinguen encre nuclesidos purlniCO$ ypnnidlnk:os

ENZIMAS DE RESTRICCION

199

R)1n1 1 (.k nirn;a hmmp) . EfldrrJbnucl~.tSU <k ltP..' "b" .u.: ~tW s<oto iQI!te cnlllc~' en t.o~ que el rtbottu.:lcMidl) dd lado S' r$ puimidinieo !C.L:t Se IUmt;m, po;-.r 141110. uU~ud\'OCk!Os <un <:'-l~tO !i'..QII } .:\ltc'lll(t 3'P pirimidlnico !m~~. en $1.1 caso, d s ..nboruu:ll'~tdl) pmt!ll'llttuco> Ytenuintll) d niiOnud~'S.td.:l
l'l<munall: fiA.I'{;fll. p <'ipl p( !l<ip( fiA~
p.>\ ....

pt\pGp-tp ' G~lp ( 1

Gp< P

Aplp

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nNaso 11 1d,; bll?Q: Se (oona~~.

tlU.Cih~ClS purft'li.:O

GIS 1, Enchs!csu:\imhon+Xka.~~ de tipu ...,_.. que h.ll<li:o:a pn:fcn:I'II~'J'It~ w t-1 t-Illa' o:nll\" y pirirnidlnico; con ll1C'ftlll fn:~urnna. entre plnm!dinoro ) punn.w u cotn: pun11oro ) purintOO. 10..-s. uaig~u~'lcudos oon cxrr~n~ (' .fil! y )'.p:
pltp(;pl plopl pCp C.o( p.\pl pi\ pAp(.p l p(op
t

imo

l r('p{..p

( " '"

-t

l l'\11.

16.1 .2

Enzimas de restriccin

16.1.2.1
oe&SQ'Ie$.

Caracteristicas generales

las enzimas de rc$1Tlitl se llamM tambil'l nuc:teaus de restl'lc:cln, endonucleasas de rHtrlcdn y. en enzimu r0$trictivn o rcsb'ic:luas. Pettenecen a este grupo una gran di'Yer&IClad de endodesouribonucSN$~&. dOKI,Ibiort~s <:amo enzJrnas ~s !Se diStinJas tlactetlas y caracterizadas en lOs anos 70. Se dispone hoy comercia!mente de un gran r.Cmero de oll&& ton elcv~ e$pecifiOdad esaabii~&<J y pureza.

Se nombran con tres Jetras tomad~$ del 96nero y es!)eeae de le l)acaeria de la que se aislaron orlglnatmen!e, !eguldas a \teces por una lelta ms, que dentifica el scrotipo (VC~ri~nte ;tntig6ni~ de llltlaeteria}. y fin...,el'lte P<W un nVmero romar.o ~ las idenb'llea en et caso de que en una misma vaname se hayan encontr<KJo varia& enzimas oon di&tint<l esl)ec;ificid~d :
bn~'1<:riu

de rig.:tL

flw:mlJJit{//J~ twg1ptl115

---

/lad ll

8(l(i/lm own/oliqvd';~
Cl.--p3

Hum 11 1
fl

la lf'f'lportancia datas enz;imt~& do re&trioci6n r:.clie3 en su granespecifieidadde reconoc:lmien1o de una seeuenela 00f1a de ONA dl:cllex y 1 Q()n$iguiente hicltOii:$iS de un enlace los.loellester en ca<la heb'a, jusUimoo.le en secuenelas concretas del OHA llamadas sitloti de reconocimionto o de rastricc:i 6n , Los rmgrnoet~tos de DNA originadO$ $01'1 Ulles !)ara iniCiar la ctonac:ln celular o aoelular, para el aniisis de ONA. ONa elaborar mapas fi.sioos de re:stricOOn (pg 22tH. !)ara 18 eteoein de pownortrsmos (pg 381), etc.
l.~s di~t'$ enzimas de restriccin se agrupan I'IOrma!menle en

!res tamilias. oe acuerdo oon s.us propledaoes.

Endonuc:-leasas de restriccin

Tipo 1 Endonucleasa y medtasa en una mi&ms ptQ4einil ~en distintas subundades) ATP, Mg~ . SAM (") 3 Sutlul'lklade:S. S recono(:imienl o, R re$.1ricc.n. M motilaciOn No pellndtmlco. dos partes sepatadas (ej.: TGA(N)$TGCT) Corl8 les 2 hebras et1 ~I'ICO$ cerceonos entre si. poco espocirt(;Qs. 8 unO$ 1 000 pb dol Sitio de rOCQnQ<;imiento Dentro de la secUMCi& de reconoamien1o. En ambas flebras

Tipo 11 Endonucieasa (mctUMtt Cf'l \11'14'1 OfO'&inO'I independienle)

Ti.po 111 Endonudeasa y meblasa n 1.10<\ t'nl$ma, protoi M (en distintas subumdade&) ATP. ~'9'"'. SAM{) 2 Sutluntd8Cies. MS rooonocimiento y
m~~ttJI.&ein,

ActiviCI&C!
emimie\Jclt Coel'lzimas o
00$U!If(MO$

Mg ?"
1 subunidaa. aunque actua oorno h0!1'\0drnero Pallndrmlco (48 pb) (pOg. 57)
C,O.,~ las 21\ebrM en puntos oouwalenle&. muye&pec.-ft<::os. denlto de la SEIQJenCi& de re<:onocimienlo

Estruccura pro!elca

R re&1riecin
No pa!lndrmtoo C01'11;1 tas dos llebl't~s en punl06 diM&nlesentre sl2 3 nL srtuados a 2426 Pb del sflio de roCQnQ<;imt(ltl\0 Aden1na det'tlro de ta secuencaa de re<;onota'l'lie:nlo en una $013 hebra

SitJOde rec::onocim.eniO Pvnlo <le eorte

PunJo de metilacin

Aden1na ocitosina rooy especificas den!Jode la $e~neia e1e reeonocim.et~lo. En t~moos hel:lrss

Inters en trg.erueria i!nlica !mplos (") SAM

No
EooK.EooB ..

S
Numerosos (pg . 202)

No
Eco PI, Eco P15, Hin/111 ..

=S-adenosilmetionina (pg. 201)

200

CLONACIN CELULAR: TECNOLOGIA DEL OHA RECOMBINANTE

Nos oonoentraremos en el estucliO de las ei\ZiMaS oe tiX> 11, pue$. 1/A ~rtnr on soc:vencica:s muy definida&, son las utmadas como herramientas en lngenlerla gentiCa.

16.1.2.2 Papel biolgico del sistema metilacln-restrlccin


la e~tis1encit~ f\lltural do '-1$ nu~$3$ de rost.ricdn en mucba$ beelerias ofrece a &tas un mecanismo Cle

Cletensa COt'ltra la entrada cM M(ttf!l"ial ~iCO do 0110 orgt'nismc>, ooncrelamente de virus beelerifagoe (cuya reproducan depende de la ~atta gentica de la baeleria): se trata de lOS sistemas Clo ras.tric;c;:in.modfficacin o metllK.In-restriccln. Para cada enz:Wna de restriocln, una metllasa reconoce la miSm8 seeuenei<'t que con$1il\lye ol sitio de 1$1tiocln y une COYalentemente grupos metilo a determinadas bases del ONA en dicha Seouet\Cia. En el C3$0 de et~timas de lipo 11, la metaa&a es una proteina ndependiente. mientras que las de tipo 1y 111 poseen las acliv!CadeS

y mcti3$a en su ~ulal oliQOmrica. oomo subunidades qt.Je actan coordinadamente (ver tabla anteriot). El rnoeeanismo de defensa es el $iguiente 01 ONA propio de ~ bacteria es metilado de una lonna especl11ca. earacterl$1lea <le <:ad3 esl)eeie baC1eti~n3 (on 1M secvoncits reooncx;idas tamo por la restrictasa como por la metilasa
nVCIM~

oe esa e~le). La l'rle'lllaeitl oe las bases itnp~ la uniOn Clo la enzima do rostricc:in, oon lo~ el ONA propio no es

loti:ZBdo. Pot ef conttarlo. al enttar et1 la clula ONA de otro organiSmo, no metlll'OO o oon un p~rn de melilacibn diferente. este ONA puede set oegtadado por la enzima de teS~tlociOn, ya que eareco de los grvl$ metilo en la secuencia diana (por razones I)IM'amente alee1orias, en cualquier genoma habr~ CiertO nUmero <le secuencias de 4, 6 u 8 pb iguales a &it roconoada por l<l enzima, "-'ego 1\abr secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo <le oocin combinada S!A11i pteCisamente el nOI'fll:n de enzimas de restriccin: la accin Cle la nuclea!18 te8trltrge ta J)C)Sibili<2ad de inft<;On POf virus. D.\ .\ no
I~Jteibdo

0\A l!lf'libdv en v.v adenma ~cifiQ del s1tiu

con sir"> di!" te$tti~in pan EooRI


~ AA TT.('.)'

de rtStriin pan lia.JJU ((1'1 arni!Gs hbras)


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En resumen:

1 1) restrictas.-' :.etc'&~~ sobre s11ios no mecilados. y


la mctilasa 31.1\ia sobre sitios no oonados.. ~(Mr(K:itndb ambas la misnL'l ~C\1encia.

& est metilada una sola h9bra del ONA.. el sitio no es reconocido 001 la enzima de restricoin. pero si OOf' la metilasa. <PJe allade el grupo melilo a la otra hebf<t Esto es 10 oue OQ..ne, POI ejemplO.,. fi~ de ta reQiicacin, donde ol ~ cst;\ k:wm3do por u!\11 hebn!l molde. pree.xi!denle y. en eonseeuetW:ia, metii&Oa, y olnl ~ red61'1 sftletizac:Ja, Qve aon carece <le grupos met*>. E.'lta aocln de las metllasas asegura que todo el DHA de tas dos clulas hijas quede n-.e(ii&OO lo antes poslbte. la metlacin del ONA afec:Ca prin~lmente a Qtosi~ y adeninas de la sec:uenciit reconodda En a.. reaccibn. las nwtil3:;os~o~an oomo don&OOr del grupo memo el (:01'11)ueS.IO S.adenoSilmeotloniM (pg. 22).

ENZIMAS OE R ESTRICCIN

201
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S.:.dcn~lhllfl:lll.lO.'I!dn:.

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Oebe adelant3r&c que ~ m.etiltlc.!ltl (lol ONA in.tetvieM en eucariotas oomo un mecan1smo de regulaCIn de la e)(presln gnica. aunque este proOHO no cienc nOO;a QVO ver eon. ol rne.canismo ese proteociOn que Clesempel'ian 106 sistemas me~a-restrlctasa en procartOtas. Esencialmente. en eucariotas 106 oenM tiot1den <' est'*r desmetil~$ on tos cejldos donde &e elq)I'9S(In y metilados donde no se e~~ProS<~n. o.pe~ente en las regiones ese ONA llamadas 'iSIOl&$ cpG-. pot tener es.ta secuencia dinucteotldica en la que C &ufre la meliaGin.

16.1.2.3 Accin de las enzimas de restriccin de tipo ii


SOfl estas las restnct.asas estructuralmente ~ ~PIO& y IN me;o.- fltudt~d.tl$ por su utilidad et\ tngenieria Get'ltlca, a mOdo de t,eras para el corte del ONA. El s.itio de restriccin es a la vez toga de roconocimionto y do r'lidrlisit.. S hidroriz.an oe IOtma muy especifica etMce& f06foster del ONA. uno en cada hebta, getMWtlnd06e d06
fragJmMtos. de nntriccKm El enl tloe hlc7tOiiZado es siempre el 3 'P (es decir, son E!f'ldonuc6easas del tipo a. pg 198). POr lo Que el fOSfato queda uniOo as. deja~o en ambos fragmen1os exttemos 3'0H y ~.P. La reaccin no necesrta A TP. k:> qvo la diftreneia de te cataliz.ada J)Oitas enzimas de Upo 1y 111.
l 111> SltiCI~i .;k ftlllnCC'tiln .)1."1'1 lO.~UMCo~ Q;:B,[u )' pul mdr(m!!''> geucr.JI.tl!i.'tlll' dt ol :l 1'1 pb

Al~unas
~n.amas

CMiitl

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PJ.Iindromo):

~ di.'IIOfl1111:u'l ~ ~lrtll!tl\ notriCb ( hl.,m ..,rdr)

l'llln"lt'Nill llSI coniM!!Icn b:~c" dc!iap;"adM5:

-!.,.,

cu)~

01ru c~v.ima ttiM clllla


ll.;btl} (11
puntO!I di>I1111Cii.
Soii'I'In<O,.,;

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1 f 1 1 tl ~~-'=-T-1 A-AI';.

--o1 ' ' ' - .,-~T-':'-A-ARei~uhan dl."l::

-A-A-1'-T-r-' ' ' '

fr.1pncntn." ok ONA dtlrle~. cuy~


"~ot~ekr ~W

l'llll'\'molll llenen b;ec ob:ifl'U\'a.b; ~ iJ~'Ik!mll'lati\' ~ I ...IW~ et~beooho.,. ot


oc~tlun.ad&.~ (rolldi\W'

llu&~rncin de los disaintos tipos de extremos rcs-lltantcs de

la accin de enzimas de rcsuiccin:

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202

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CLONACIN CELULAR: TECNOLOGiA DEL DNA RECOMBINAHTE

Algunas enzill\CII& de restriccin de tipo n empleadas en ingeniea gentica

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fJ Mrnbrc de la enzima es una abrcviuturn <Id de La


~:u:tcna en la q~ k
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mi!lnra

ObsfVe&e que en lodos tos casos tos extremos de tos dos fragmentos gonor<tOo$ &Of'l idntiCos. tienen '- mismt' secuenei3 (se puede ver girando tao uno de ellos). E.sto es oon&ecuenda de la simetria del palindromo y de la posicin srmtrica de los punto~ de COfto en c&cltt llet>fj. TOOO ello se deoe aqueta enzima actUa en !onna de dlmero, por tanto reconociendo una misma &eeuenCiill y cortando oo mismo tiPO do ontnoe e11tas dOS hebras: por e_emplo, Eco Rl eot\8 el entace (5') G-AA1TC (3') en ambas hebtas. y fOrmacin de e ..~ttn'I09 OOfleSivos es de gran Inters aplicado en ingenierla gentica (pg. 207), pun fr.-gmonto$ ~nor.OOS oon una MiSma restttctasa a partir ele dos ONAs ddtos pueden interaccionar rne<fJ.a(lto ol apareamienlo de 1M ~$eS sut e1t1re.oos COhesivos {tal intetaccn no es posible entre eldremQS romos). Igualmente se pueden asociar los fragmentos producido PQf enz:im<J$ distintt~s que prOCiuoetl exltemos compatibles.

oe

Oebe resa!tarse que ef produao ~la I"O?I$0Ci<'lci6n de lOs dos ttagmentos en ninguno de lOs casos es Idntico al ONA de partida, pues e~ formt~do 11' dos molkulas.. La falta de enlace oovalente entre los extremos de los lragmet~tos reasoclados se indica con el nombre de ~mella o 'nMt:$c<l~ t*k. pg. 156) . stas se pu&&n <*lt&t o sellar" w 1<'1 t'CX::in <Se aas erulmas l ~asas (o DNA lig.a.sas). dando una molcda .:mica de doble he:tlra. Como M visto (l)llg 156), 1M ~as catallzan la lormacl6n en ceda hebra del erce fo&b&tef que tallaba. oon consumo de energja, Pueden, Incluso. unir o '1ig.ar" do& fragmontos 00 ONA<:on ex~s tOn'IOS. aunque oon nu::ha metlOf eficacia, pues no hay aparea~o entre elos. la acci6n de l<as ligt~W$ pues, contr3ria a la de las nocleasas (IOrmacln de enlace fosfostor fref'lte a su hidrOiisiS). pero et mecaniSmo de la reaccin no es exactamente opuesto. por ef

CLONACIN CELULAR DE MOL.fCULAS DE ONA

203
r~~ un grupo S'.P

requerirnien1o ei'M!'rgllcode la primera. Debe teSaltatse c;ve la liga$<' $iO:ml)tc propiedad que posee utilidad e)(pe(IIT'Iental (pg. 208).

para S.u ndui)Qf\,

ACCTC-G -A-~T

1),, ,

-~~AG-TAG-C~

U\\!

1111 1 111 111 111 11111 1 TCOAG < -'11-A-A- CC'fCA'fCG-C

TT A CACC'fACCCCG AAT-T-C-GC'f 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 AATGTCCATCGCCwC t ~ A A G~C CA

ACCTC 1 1 1 1 1 1 ' .- ' ' 'l'CCAG 'f-1'-A-A

CCACTACCG ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ~ -CCTCATCGC

r-<:-G-G-t 1 1 1 1
TTACACC1 A~~C~C.C~G

c -e-c-A

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 AATCTCCA TCC CG-c-T-tAA

I.IN!\!

'\VIJ:IIUI ~

1::::\ awo----..-c-c-T..,-e'~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~"t fh\


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twl\ tC'.'Ofltorl.... 1:Z

16.2 CLONACIN CELULAR DE MOLCULAS DE DNA


El objetivo cenlnll de etla ctonaon es la ptoeluocln de un gran n~mero de cop&as de una regln de ONA (fragmentos o genes) o de cONA (f()fm<'ldo e: P<Jrtir de \10 mRNA), $4) lr318, POI ~lo, de un l)tQ(eiiO 00 don<oci{)n de liPO cel u.lar {pues se consigue gracaa5 atmpleo ele ~ur~. ~g 188) QI.Mt. pOr <:ontr800$ici6r'l <'1 la clonacin .o~cetul;:r POI PCA:. m vkro. se puede conSiderar qve se realiza in vivo (e:stclamente I\OO&ilndo, en cultivo) Se Da.sa esla donacin. al ig~l qve ''-' PCR. et~ ra realizacin de ,_,pres rondas de replicacin, peto en este caso catanzadas pot ta ONA peolimerasa propia de 18 eerura en raque se lleva a cabo el proceso. clula <mtttrtona. Para eJIO. el 1ragmen10 de ONA o cONA a clona1 (llamitdo in serlo. POf razone$ <u se o:>mprenderan dCSf>JS) &t vno et otro ONA ( vector dt cloMcin). y la ITIOievla de ONA recombinante formada se incorpOra a la clula anfitriona donde tiene lugar la amplifiCacin por repllcaciOn. Una vez detea&da la presenoo del ONA de inters y &eletcioMcto& tos clones que lo han amplificado. se alsca el gen o fragmento de ONA o cONA. que se emplea oon disdntos fln&S , esencialmente el e$ludi0 de caraaerlstlcas

S'--eucndadn
. .. Amphh<:oc10n Obje-t i\ ,-s d~: la doni11n F.:audio de l:l CSLrucrura d::: cidos: nucle-ict-.;. _ . . EstudiO de homolog1a entre csp."eii!'S {
l delllili~'tldn d.c

multldoncs; (1M ejemplo, :lSoX:ia<bs :l enlt:tml."(bd

&.tudio del proc.::so de tmnS~:rix;in y tmduC4;ifl F ~11M.iio de ~u regulacin: $'--cucnci a.~ de conLml ((\(!( cjo:mpl(l, pt~)f'll(~O'tS) Prdoccin de la ptotcina o RNA (formas nom1alcs < :o ltcr.td~)

1ura su Kkntilicactn Para su estudio (pruptl'<ladcs. iUnctOn ... ) f,M uplicarn, (producdn <:om~naal); diagn-M1oo. tcrupu11ca. nu1r1<:1fl. mdustna ... lng<:nicria de pr01cinas coo altcl':)('i(J(l di." sus. J'lf'()pic~dc~o (par:l l."~ltdto o :lph'-O'Icin)

204

CLONACIN CELULAR: TE,CNOLOGiA DEL OHA RECOMBlNAHTE

fiSICo<t$, sec~~i<' . 0$11\ldurtt, prQS)iod.adO$ 1\!n~. tP(pre:sin gnica a proleinas. eK.. (muchos de 96106 objetiYOS

pueoen set apliCables tamtlit'l a la PCR o Clooac:i)tl

~!utar) .

Pot razones peclagoglcas. a la vez que de enfoq.se experimental. pveoe <le$Cribil'$e lll clonacin en siete etapas: do& de preparacin de muestras. cuatro sucesivas de Clonacin proplameo~e dicha y. segUn los casos, una de e11pre&i0n. En oca&tOfle&, &e aliada la amplificecin por PCR del ONA donado (en esle caso. et p100e90 oompre~a dos donaaon8$ sucesivas, oeUar la primera y acelular la seguncta). Hoy die, todas las etapas se realizan de forma rutinaria. a veces induso automatizada, al disponer&e de fama oomercial de las enzimas. suslta.tos, vectotes, etc., e instMneniOs adecuados para &u reaizadn.

Esquema ~tntra l del proc('().imienlu d(' clunnci n:

*<<r de ckl!l:.cll'trl:
phb~:~~iOO

('omo vce~or
.:k clonacio6n 9C' pu..odc utili.tier un p~iOO, un ~rt'lldl). "''
\'i ru& . ..

So propiedad
i.":$fr~r1d

es que

!IC'Jin au~

n."Piichlivos
lillbrcl'ldo.~ c~>nado el DNA y d V<lQior con un. rnl1>11 0 tnd\'Onuc:1~'3:!111 de ft'illncc!Cin, ~

~en unino: rncias !IDa bgasa, Al C01 1JiliKI. \ 't:CI(Ir t iSfnO, il' k

0000

l ~tnil D ...A

l"f'lnrbhra lt

( ~ )

F J ONA rcootnl!iflamc se intmducecn

boc:ri.s.

('ll'tpol'lll)d(l
rnlllcllllli\~

El ~'''or ~ rephora 111 doVlduu la bm:w:n a y tatnbM de ronna III.IIIIO:lln/1. C<tll tUI>,IIIllntnta d nmero de copill$. C.-da bllctcria. bryB i~o no UD \'t'ft(lr y un I>Ni\ reombomlltlt~ ,_. mull1phca ~ lbf lup a un ~f'lon". pOOI~~eirl de bacenas coo idmico
IIU:I\'tlll] ~'ilt"Lil.lO (ll'll:hudo el fC'(lOl'lll!iflll~l<.:)

~y 6 ta'l:lS (silnulr:\tlcas): p~1c:i6n etMar y t~tletc-in

No lodo~ lq. baclcrin& h311


int.t:t$ rCinn/ltiiJO ps~ del
\'lar 1'\'CUmb:matll.('. Se

UICOr110r*J0 d 0NA !k

(de las clulas que: han incorporado el ONA eJe in.:r!l)

&ciQI).fllln l t$ que a{ lo

han h\~bo,. nonnatmc:n~ot

cull\frndola~ 1:11 Ull nr,'\'1;(1

con antibi6tao. :r;:i \'JI d \' lor ~ indu}'C:I #Cn ck m!l.'ltCI'Ida a cst atlllbitir.

7'napa (opdooal): expresiOO del DNA clonado

CLONACtON CElULAR OE MOlCULAS DE ONA

205

16.2.1

Preparacin del ONA para su clonacin


pre~r<~~ein

Esu. prim~ el<'IP<l de lal cton<Jcin, &;1 esencial del proceso

inicral del iiCido nvcleico que $9 quere

ctonat, es una parte

16.2.1.1 Insertos de DNA


Se p3rle Ot olul:l$ nueleadas I'IOrma!I'IWI~ ~guir.eas, JiSadas pot SC)(Iicao:;in o f>Ot llu$0en&i6o en un medio nipotf*::o. una vez elln-.nadas las molculas ecompanantes, tanto RNA (con RNas,a$ o llidrOii$i$ <'IIC311i!'WII) oomo ptOteina$ (OOtl proteasas) y enzimas o fragmentos ptOteolili009 (en SiSieM3$ M.&tieos tenov~gu$), $e pretip.ta y ooncontrd el ONA {con etftOOI y sales). ~ste posteriormente se fragmen ltt <;on onzim<l$ ciG restnoc.:in, P<JI'<I dar lugar a una mezct& cuyo eont~idO, en tll.i~o y tamafiO de rtagl'nel'lto$, depende <1~ nU"*o dt $itiQ$ (lo; rostriccin y de $U aocesl;libdad para las enzimas. El fragmento que se va a Clonar del:>t Mlat$e, o sep$rat'$e Clel l't$1 0. mediMte <'llguno t~ntca aaecuaaa, por f!tertl)tO etectroloreSls en gel de SQ&rosa, ceniiWugaeton en grB!fiM!e <!e ae.nsidad, CJ'O(nalogralia 1~ de alta presin (HPlC), etc. Cuando$$ desee expresar el fragmento clonado (etapa 7). es neces:ano preparara adems un int;erto ao11liar que: oon40ilQ<l elementO$ ~guiadores de la epre&IOn gNca,

OC'talles del p rocedimiento de t lonllcin: prtpar acln d el O~A (erup a 1)


3 posibilidades de gcDtrac.n dd fragmC'nlo de ONA que se qui~-n: clonar

""'"'" Ls
lip.l.k

muesllll

dt; (roq:m~mudll, putitiuda..


~utofr~o;cll.lla.da. dt

f"''

---c.a.UOOCAAUCC--- U u u uA IJ"

1 ~intouddl).\.f~ ' tdJNAo ;,.,...,,_...~ ,;...-~;

pn:pnmcin de un inserto IIWtili.1r pn01 c:l caso de: donacin con c:tp~in: t

....c::JC'Iapa 3

16.2.1 .2 Insertos de DNA complementario procedente de un mRNA


En muChOS casos interesa ctoflar la
Secuet~Ci$ Codific.n'O dt un

gon ~cariola , para lo cual se parte de mues.tras

~ f'I'IANA que debe ser convertiOO en et cONA (:(ltrCSpotl(l~lct (pti9, 195) par.;t ~ M!f donado.

En es:te caso no es Indiferente la eteocin oe laa oell.fM de partida, pues c:o<!:. tipo cetulo C)(ptCSt1 tMt oon1unto de prOIGin<IS diferente y, por <;on&~guiente. no <;onbene los mismO& mRNAs. Una vez lsadas las oiul&$ del Otgano, lcji<:So.

206

CL.ONACtH CELULAR; TECNOL.OG(A DEL ONA RECOMBINANTE

tipo celular, estadio oe oesarrono. etc .. elegidos. se purifica ef mRNA, generalmente aptOYeehando te presenola en su mol&eula de la OOl8 <Je poM(A) (pg. 280). Se emplea para ello crornetografla de afinidad en eolumr.e o 11'kroe6feras magnlbs de afinidad (pg. 136); en ambos casos. la matriz cromatogrfica o microesfera magotlca llevan unido un olgo(dT), Cuando el mRNA ca donar no e5 ~te , se puede amplific:cM' mediante PCR. filCilitanOO a&l su clonado postenot en clulas. Pata ptepatat el cONA se em:Ma la transcrlpta&a inver&a. de forma anloQ& a lo estudiado en la PCR (pg. 196):

Oolil)('ldG): en (1~ uJOS. Wtapl'\)'l.\~ha una ((1'1,..'0C'UI nol>;u'allkl c~o )' n formar uN bbtqtuJI11 que hace el pt~pcl de eebeOOr sin M$i&d de inlrodtK"ir In c:oln .1' p)lj(d(),

El cONA w:lusii'Vo:" <k JOOI.:k JQI'I la slnle11S do: unn ~ullda hcbn. mcdianu- In ucc6n .k 111 ONAp:,ll !k E.. roiL El salict11.: poll(dC) sirve: de molde a un c:c:blldor

16.2.2

Preparacin del vector de clonacin

En general, un vector es un;a motecutt\ do ONA de tamaliO pequer.o, lc:t de aislar y C81'acterlzar, oon secuenca y mapa de restrlocln (pg. 226) conocidos. de fcil inlroducdn en la c$h,.1la anfitriona y un.- voz cali oon ~od dll Atp.licaocM autnoma. es decir, independiente de la replicacin del oenoma de la o6IIA;II arrlltriona. E$ QOI'I\OOnienlo que el vector po$68 el mayor n6mero posible de s!bOs de restriccon. P.,.llll"'<5$rtM el fragmcJn1o~ ONA q.,.e so q.iore clonar. y qutt incluy3 al monos un ge11 marc.&dol (pof eempb, un gen de reSIStencia a un antibitico) que permita identificar yfo seloocion<ar las~ que lle\1111'1 el DNA recombinante {pag. 213). Lo com6n es qoe 106 veetore& naturales no posean todas este~$ carac;teristic:a4, p0r 10 Que Mbitua!met~te se etl'lplean vectotes modltlcedos (a su vez. obtenidos pot tcnicas oe DNA recombinante. pero ya di~ oomorcialn-.n1 COfl todas an prestaeiol'les deseadas).
La rntsin del veelor es unirse con el fragmento de ONA Que se Quiere clonar (llamado entooces Inserto) para facilitar su entrada en la clula anfitriona y su replicacifl Par.t ~r unir con fa<:Jir;18(1 ambOS, se debe cortat el vector con 1<1$ mi$mas onzimas de restrlocln que se utJtzaron pata escindW ej DHA de la muestra o con enzirT~M que proporcionen xltefnOS CQmpatictes: de ese modo, sus secuencias complementarias pueden asociarse y ser unidO$ !Xlf la ligasa. dando tu9ar a una sola ~ul<' do ONAdebte hebra, llamada DNA ncomblnante (rClNA). En funcin de tos oo,etivos de la clonacifl (ampiflcacin y xposin). so suese Mbtar <te dos graneles grupos de Por un lado, los vectores de donacin, que &e emplet~n ~nicamtn1o P''" ;lml)lifiebt ef DNA de inters; lr.mbi6n ~ los llal'l\8 a veces vectOtes de Insercin o vectOte:& de pro~gacln Tericamente. $lo inooparsi&n el in~o do inc1S (p&g. 205). Por otto lado, lOs vectores de expresin. que poseen adem$ car~eri sliccas ~e f'o~cilit&n la e.prosiOn por lt'l eetuta anfitriona del ONA de lntefs. En este caso deber incorporarse. adems de 51e, et ya mencionado in&ef1o au~~;ili<t con una tegOA oe ootltrol de la exptesln {pg.. 205). En ia prctica, bs vectores de exp~esiOn comerCiales suelen lnck.w Yil un<a regin <:s. <:QntrQI, comUnmentc ~ promotot potente que se indulea fcllmente bajo condclone& experimentale& oontrolables. viiliclo PVt'l o~a' <:u~ inser10 <Se in.ter6s que se SitUe tras l en el rONA.

veciOte'S.

Aunque exi&ten dlvet$os IJil06 d molcula pequet\Cl de ONA c:wcutar

vec::tore:s

(~ .

208), pc)f

la descripcin

se

har con un plsmdo, una

CLONACIN CEl ULAR DE MOLECULAS DE DNA

207

Oetalle:; del procedimiento de clonacin: preparacin del \'tor (etapa 2)


(<.-ortc del vroor para ~oenmr <:xtrcmu5 compl~"ftldltlnos a 5os dd 0"11/\ l

..

t~RI

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yf'owlf

po,~oh;fofiWI,

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c.(..,,.,~w., m i<lllpi~Of(~J rombo~~oa6n

t-ctrntc: cmplelt cull(l~,t;let .k cfl~omQ ;:k tdlrio:~il l~'')"" s itof>l> .k


CGI'IC d !in fCJWC~nlii.J~

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W\'I<Jr pco:polalJo ~

b ..0\':l,.:.n

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f"-Jfl!~llt(ldt; O"" A

-e::,...
CUlpG

16.2.3

Formacin de la molcula de ONA recombinante

Coosls.te et1 la unin eovatet'lte, kt vtto. del inSerto ~ DNA a1 vector fragmem~~M:So. mC(Ji3nlo "'"' lig;.a, La especificidad de la unin depende del tipo de e11trem0$ q11e hayan resultado al prepatat el nserto y el vector:- SI son cohesivo6. w ~uencii'l es 1& especlfiC8 de la enzima de rutriocln etnpleada y slo se asoCian los eJttret'riO$ compatibles (pg 202): una vez asociados POf ~areamrento de bases. la ltgasa estabJece la uniOn covalef\te s.euartOO las dos mellas. Si se ttata de e)(lte<IS romos, no pueden asoeiarse ~ ta lig;)UI lo$ pvccJo unir, illunQve con rnenot el'icaeia y ('M) suporte nmguna diferencia 18 6f'IJ:ima dt teStfie:ti(ln cn 1<'1 que te tlfCPtUC'ron (se ClOeda decir que todos bs c,xtromos romot $On QOtl'lpaijble$),

Detalles del prf)(. e <Hmi('nto de clonacin: pre-paracin del rONA (Na pa 3) {untn <kl Ol"oA que: so: quKTC c.:lonat al \'t."Ctor)

lhip:!'lC!flfO dt r.>NA ~lllt ~~ p (1 quc ~ 'lil lfl'C <:lllfl:)f fins.cnodt in1crb1

''*'':.

+
f.-.:m~mo

ll '

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dt' l)}b\ (oJn . , . . ~1!-"" ok eon~rolllc ht ~wrnon ~~ ~n ~G~ lmstnO;v.no bafl

208
Er~

CLONACIN CEL ULAR: TECNOLOGIA DEL OHA RECOMBINANTE

lt\ prtlcticao, pu&den OCUtrif dNersos t4)0S de asociacin et~Ue ftagmentos oe restriec:iOn eot1 exttemos

eo.,.,....iblos. IO<Ias etla4 ettt311ilodas IX>' la ligasa. En primer U)at. sien"())'e puede darse la asociacin i ntram olecular. es decir, enb'e los do& extremos de una misma molkula (vuctor o inMrlo); lli se trate~ de un vector c:Wcular, da lugou a &U reclrcu181tzacln. Esta Interaccin e!M favoreetda wando la ooncentr..cin de ONA es~ (pue$ la probal)iidad de que dos mOlcula& se enOJentren es menor). En segundo 1~. puec:M t9rter lugar una i1$0CSOCin ln termotecular . tanto la ~ oonduce al tONA (vector+inser1o) como otras q.ae oonc).Jcen a produaos no deseados \'9Qor+vectof, irtSeno+inumo. unin de ms de 009 mOlculas. etc.: !Odas eb9 pueden ser clrcdates o lineales. E!Uas Interacciones

son m#l5 probnblos p,ttrtt ooneenltaelones elevadas de DHA.

~~'C'IUU<llloC'~ Jtl Jll'li'f KI

.:;--\_~

o- o o-en
o)U11S \' CCI Of'
tl',iKUIIIl'i~o

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:J)IM.'1&i.'i( oll\ 'll' d.,~t \ffii)J'

ri)NA
b~cado

ll!~ICiOlOl'lnC's

Para evtear la formacin de e5to& prodl.~Cto$ $0CVndnrios. que disminuye el rendl~o de la elonadt'l. se acude a eostra!egias expennenlales. previ.,s n 13 mezCla oe veet!lf e inserto. taleS como la esdsiOrn oon dos enzimas de re:tttieeiOn Cllferen!es (pg. 207), que e~a ta recWcularizacin del ~tof o. oomo t;e di8$Cri00 ;) con~i6n , l;t oet!Qslol&cin del vedor oon fosfala&a alcalina.
~ ~ .l pum(K de !N.I'>blc ufUOn, ... ~ : p\ledcn unm e eon 1 lit:~.._

vcctOf al:licno
f)f)I I ~ U

~~s los 5 '.Pdd~)

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fi' ~lfh.'C'..tn

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dt I)~A dt 1

"tlut:r llllfiU'll(lna

La lilt& de grui)06
impode l.a rccucu1Util3Ct6n par 1~ ligua
( ' .f~fnto

16.2.4

Tipos de vectores

Los ~ores empleados para la donacin de inseftos de 0NA$0n mvy variado$, Pue<fien ClaSif~tatSe segUn varios cnterios. t&lt$ oomo

Su procedencia proc<~ritiett o e~~C&riOtiea . Ell4)0 de ITIOikula a partir de'- Qvt $0 preparan:


Plllsmldos: bacterianos. de Mdur<'l o

oe pcan1as..

Virus: que Infectan bacterias (bacunlfagO$ o $implementefegos). planl.as, ii'WerteC!tados o venebrados. Cromosomas artificiales: denvados de elemento$ eromosmiOO$ de lagos (PACs). de bacterias (8A.Cs) o de
ICYI!M).Was (YACs).

$$ deot, MOlculas fQtmadas combinando partes de otras cuyo origen es difofente Normalmente, Quimeras OC pi&SMI y lago: esmls. fagmiOos. fllsmld06, El pO de oUa anfitona en la que el DNA rec;omDinante resultante se puede luego lnoorpctar (etapa El gen de teslslencla (Jie conbene er1 V9Ctor para $U poslerior detee(j()f\o seleedn (e!apa 6). El tamano Ge' OHA que admiten como ln:sCf1o,

Quimeras.

>.

CLONACIN CELULAR DE MOL~CULAS DE DNA

209
MC1odo de prop3gaci0 n

Tipo d9 v9ctor Pfasmidos normales Bac:tenbfagor.. pot insercin (fagoi.)


~let'Wa!)Os.

Tamao del inserto u~ atdmitc 0-IO kb

Replicacin prora del fago 923 )(b 30-44 kb Replicacin ptopla det fago Replicacin a modo de plsmido

por sustl!ucl6n (fago A)

C6smidos
Bactenolago P1
PACs {cromosomas artifiCiales de P I )

70-100 kb
130150 kr> H.Mt8300kb
0,21 Mb

BACs {croi'I\OI$omas ertifieialesoe bacteria)


YACs (cromosomas artifiCiales ae levaoura)

Debe, adems. setlalarse que continuamente surgen f'K.Ie\'0& bpos de vectores oomo consecuencia el avance en las tctlCas de lngenlerla gentiCa y las necesadades 1~188 por el de68rrolo acelerado de bs Proyec:IOS Cenoma.

16.2.4.1 Plsmidos
Son molculas de ONA de doble hebra, de peQuefio lamao (25 t:b) y forma cvcular. presentes en terma libre en el eilo$(:11 de mucnas baeaerias (de 1 a 3.000 p&ttsmkiO&foellAB) y de algunos eucariotas UW\Ieelulares {1)01' ejemplo. el pljsmicto J de ~duta.s o ~eireuiO de 1Jtn1 son ladtes de puritlC81 a partir ae1 cultivo cacteriano Pen1'111en ~ incorpot;)C*)n clo inl;cr\0$ ~ ONA do un tamt'o m~ imo de un~s 10 t~b. Los f)ltlsmidos nnturtlle$ conl~et'l 1)0(:104 genes propios, ninguno esencial para la viabilidad de la olula. po1 10 que pueden ser modificados sin afectarla Para su repllcaciOn autnoma (inOependlen!e de la Clel cromosoma bectenano. aunque UllliZanclo las mismas enzimas), se requiere una s.ecuencia origen de replicacin. En cada divisin tlular. el cromosoma ong.'\<1 una sola oopa por otuta hija. n.e:nlras que el jll!I'I'IICfO (en su caso. el tONA IOf'mado a partir de l, etapa 3) sufre replieaoooes mUitiples y origina varias oopias por <:elula {oe 20 a 50). Los plasmldos son asJ tepliCOnes (unidades de repliCaeiOn, p&g. 150) que se trnnsmi!en y ma.n.lienen de l'l\8f"oee'8 e,stallle cornoeiteulos e.~ttt&erom0&6mioos El empleo d9 un pt$mido oomo -..ector de cton.ocin se favoreoe cuanOo ncluye genes marcadotecs. euya presencia pueda ser delectada o OJya expresin confiera a la olula anfitriona portadora del rONA una sene oe propiedades especiales (pg. 21<1). Por ello, se U!lllzan eomntr~ente plsm.ld os artiflei ales o sint(ioos, obtenidos a $U voz por tcniCM do ONA re<:ombinante ydi$poniblos comerei;'t!mtniO. Saosle tomo ejemplo el ll&:smdo pUC19

1GAATI,GAGC TC!G_GT')CSCG5GATCTCTAG~GTCGA.9C TGCA.,GCATG ~ AAGC1


1.~-r,RI
.\r,q l

Al l

.\N..tl
\-....,., 1

nu..,l ll

,,.,, 1

1 111: dl
1

~11 1

l'r l

-"tlrl

ffmdlll

l:lll\lhOOt'11l'f t'<btuo!' th!nas un teas J'll,. 1} ;;nzirtb d;; r..-suk~lkl. Su pos.i(in dt>Mro dl."f ~~~ flllt'/ pemlll.:' 1 11.ih1. U ti rnec.an~Snu.> ele 1-'fl'/lt'fll~" Nirt 111.\o"rt'llNJ-,/ p.:tr.a la sek.. .,'ll)n

<i<n de (i.-gabc1~11i~ (g~n


tna::diK). l n!~"mltnptdo jX't

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pi~Nludo plt dt:-~hn'lll':> pu11111'1 s,."'illlb M'-dadn de TIIS~n:c'tn lse mua.lt\lll s04u lb \le <'JMUltb

que- Nn<W~ en un uru.. -o pune()

210

CLONACIN CELULAR; TECNOLOGIA DEL OHA RECOMBlNANTE

16.2.4.2 Bacterifagos
{ll'llecc:i6n). E~a propiedad re&UIIa til pera

Los virus en general se replican modiante l<a QrOOJ<:cln de su genoma en clulas procarlotas o eucariotas oon&egl!M una alta efiCiencia de clonacin, empleendo como vectores virus modificado&. Cada tipo de virus infecta a oUas espeeffica.s y, dependiendo del tamal\o del genorna vfrico, dnlle ll"lserto6 m9 o meno& grandes. pero en general mayores que 106 que se pueden in&er\ar en plsmldos. Asl, para clonar en baoctenas w vson b3(;.t ctri f;tg0$, baculovirus Pf!r<'l ~ltts de inseclO. y vY\.1$ SV40 o retroviru& para oUas de mamiforo L;a l)f"Oiif~ de lO$ virus recombir\hntes $e oonsigue en un cu!liYO do &M~ anr.rio~ AJ$pectiva5. en tas <ue el virus se reprOduce. El uso de virus es especialmente adecuado para la clon~ein en Q&lui<'IS do mttmiforo, I)Of su elevada elieacia de ntr~ oet rDNA. pero dada su compleleiad y pot razones de eldef\o!liOn no se tratar et1 este tema. Los vWs mas ~nte empleados oomo \'&ClOI'ee son lOs parslt06 bacterianos fagos M13 y A(l.ambda) . El tamai\o def vector recombinante se ve rmilado pot la necG$idad de su em~amiento dentro de la cpsida. El Wlserto M puede introducir do 1<'1 mi$111<1 form<t q~ por<'! lO$ v~or" ~mi<ioos, " dO<:ir. corWndo inJOrlo y ONA dol folgo con las !Mm.as enz-onas de r8$lriocln y ligando para ObWottr un rONA. ei!Ao M denomina lkni~ d4.t in$on;i6n, y estoo voc&oiO$ osPOcifloos p&ra eno. CUando et tamallo <tet DNA de interes que se ~iere donar es may, se puede II"IOOrporcw etlminMdo previameo1e la Nt'e del oenom3 viricO Que no se reQuiere l)at8 13 infeQCin y repUeci6n: se lltll)le entonce$ de tknic:l de JusfittJCIOn o '"m~ramienlo . V'-x tor<.'$ de donacin basados en

el fago lambda

ONA de intl'tS

(..o)Oo \ 'NU)(q d t

i-d.S. lOdltUicn
~~IIKM(IS

peq~. p.tc'~ i 110

.o se pu~-d('o

;jplid ~w ...

e.tl'!l\i( !UCIAf C.

1 \ l d iminarw 1, ~~i.)Q no
,.;o lll , l(l.

"''dtwilio ...Jroi~n Wl~.t'r\(ll de ma~Qr Ut!Nikl si -.Pt'r"~r d Um~e


JW'II que pu.:dM tmpauo:lllnt

,. K!..,.,., tk

Sl>lcnut do;
eltl~liuftitrnl) del \ 'U'IlJo.. ~pcn~<k

lnun:utnc:i-s ""'~

16.2.4.3 C6smldos
Son vec-tores s.lntllcot.. quirnerM que COI'I'IM earacwisaieas de plstnldo!l y legos para eomblnar las ventajas ele ambos dpos de V9Ciores El fragmo.nto plasmidic:o propOrciOna las caractetistlcas de tamallo pequei'IO (5-7 kb}. ~ oo origen de repticaCI6n. un nUmero oe siliOs de reslriOcin <lOMe se va a Insertar el DNA. uno o ms marcaOOfes &eleecienable$ y 13 prop~iOn en t:laC'erias oomo SI f\Jesen plsmldos. Del fago >. se toman las secuencias oos (del inglk IXlho~ Sres). que propordonan al COSmldo &a capacidad, propia del ONA del fa9o. de &er em~QuotlldO en dps!Oas vi ricas In VltfO. l.06 csmldos son ties para donar 11"1$01'10$ de gr311 tam~r'lo (!'lasta 45 kb), especialmente en &a preparacl6n de librarlas genrri:as de organi$11l0$ supori()res, ya Que dlsmlruyen en gran medda el nmero ele clones necesariO$ para que todo el genom<'l 0516 rcpro&ontlldo en la genoteca (p&g.. 216). Los ml!odo!l de k\troooecin del f{)NA C06mkico (e~ 4 ) dependen det tamallo del In~. SI sle es pequeflo. se puede introd\lcir por tran3bmacin (ltts dlul~ts se nnocn compotefl1tts p:wa inoorpotMO en forma de pl!lmdo rec:omtwlan~. pjg, 2 1 1) Si el tolmailo " r.WMmeote grande. la transfotmacln se complica y debe acudirs.e al ~quetamionto CJteviO en torma de tagos, Bprovechando las secuencias oos.

CLONACIN CELULAR DE MOLCUlAS DE ONA

211

16.2.4.4

Cromosomas artificiales

Este bpO 4e veelOte-s se h&l'l disellado f!f\ especial para adapt81'8e al gmn tamano de insertos requericJOs f!f\ el casooelgenoma humano y de otros mamfferos. y para la clonaan en <;lulas eucariotas.

a) Cromosomas artificiales bacteriatlOS


$1} lOS 11.3tn<'l oomUnmettte BACs ~ttwkW att.fiCiat cltromosomes). Se ttata de vectores Sil'lt&ti(X)S derh<aoos del ptsmldo F o o1 ftlgo Pl. Se c;.o.ra.cteri~3n, en primet lugar, por aoepl.at gtan<~es nsettos Cle DNA, er~tre 100 y 300 k:b. En comparacin con otros tipos de vectores. los BACs oontienen genes que reducen $U capac:dckJ de copia. es decir. de teQIC&Cl)n oo la clula anfitriona del rONA fonnado (elapa }. Como rewl\ado. se con&tgue mayor estatl6d.ad de lOs ii\SOrtos <)t ONA <fe origen eucariOtloo. qoo en cosmldos wfren con frecuencia reordenamlentos Internos. Gracias a estas dos c.aracteristica$. tos BAC$ $01'1 voctorO$ a4ecuados 03re~ '" elabor<tein do gonotecas ~.-,riOtie<'ts (p&g 215)

b) Cromosomas artmciafes de fevedora


Los YAC& (yeasr 6ftiftCJaJ Chromo.s~s) $0n vectores &intboos que oont!enon tas1ros regiones rolt'ClOfladas con

aa lunciOI\&IIdad de U1\ cromosoma (pg. 92): secuencras constituyentes de un oentrmero, de dor. telmeros y de un oQen de re(lf~taeiM. A<JemAs. inCorporan ef'l general genes rnatcadores sete<:Cion.ables (etapa 6) y un s.tlo oe ctooaoo mU!tlPIO (t(apa 2) en el q\Je admi!en ul'l inseoo de gt&n tamallo. que puede alcanzar t Mb, to que constitUye una ~~acristiCa fundan\IGI'It&l. En OC:biones. e-ste llpo < veoclOt~ se del'lomir\81\ A~SfCENfTEL. pot lOs 3 tipos oe
secuencias que conbooen. La &ec:UMCia oentromnca permite la $egregacin oorr.ct& de l<ts;;~ QOS:llit$ hij;;~:s del cromosoma durante la divlein de la oluta (pg. 92). rr.entras que los telrnetOO elitabililan. como ye~ se ha estlldiitdo. 1()$ (;r'()<0$018S a to tatgo de sucesivas dMsooos (p&g. t S7). Et origen de repiM:acln o secuencia de rel)tiC8CIOn autnoma (ARS, autonomo~~Sfy ropflc<.tbng ~e) permiW l<1 form~C*)n de oopiil$ del croll10$0mll Mifici311 dt form;~~ Jndependtente a la del genorn.a propo de la ci!Aa anfitrioM. los YAC$ se utilizan en part!Wit'r ~q p-ep,JtCJt genoteCM de genomas MIJY grande$. o para manterter un gen oompleto en un Unioo dOfl

16.2.5

lncorX>racln del ONA recomblnante a la clula anfitriona

La repllcaclon de las molculas de rONA (donacin) requiere que stas se r~uoctuzcan en una dlu la anfitriona (receptora u hospedadofa. inocwrectamente llamada CliMa husped). Para que esta noetp0r8c1n. que en general tiene IIJ08r por mecanismos POOO conOQC.IO$. setl ef~z: 95 preciso empl$lar telul;n espeetaiiZ<ldil& (oon un genoW seteoclonado} . adecuadas al vectol de donacin ubiiZado y con c::apaetdad de diVisin.

16.2.5.1

Tipos de clula anfitriona

COI'I ttecuenct8. laS clulas anfttrlonas son procarttlcas. pnnclpalmente cepas de E. ccN. O<l' w f&Cilt$ <fe obtener. maniP',IIar. JOOI!iplicar. ytonooerso M~ geo(ttic& Al proceso de .,troduoci6n del rONA plasmid1<:0 se mdenomna vansl ol'mselrl (pg. 212)-. L&(s) molaAao(s) de rONA plasmidlco lnOOfPOfadSs se replican luego V81'13$ veoes del'lltO oe la clula. de acue((lo COI'I las propedades de 10!1 ptasm!OOS. El inSerto de ONA p!JeOe per~t~ecer un.O<> t'll ~"*'<> (10 m$ frecven4e) o rec::ombi~rso con el ONA del c::rol1l(l$oma Si se integra en el vector ms de un 1Jp0 de ONA, pot eemplo, dos genes o un gen y un regulador de la transcnpcln, eJ proceso de lncorporacklon a la clula anfllf\ona <lel rONA se llamacormnsf0rml8ciotl. Las cl ulas a nfitrionas eucartUcas son ms dtllclle& 00 obtener y m&tltenet, pot roque Slo se utili%M oon rWteS especil'ieos, rur.oamen111ftnen!e pata el anill:iSis oe la regulaeifl gflle&, la ex!)(e$i0n de unt't prote-ina eucaonbtica. etc De enlre el&s, lt'IS m$ ~en c::ul!ivo $01\ 13S ievaduras quoe, a,mqve manbeOen .-nas caracterlsucas Similares a llf(lC;)riotas (~ indiY'Id\lales. c::recimien40 rpido y ec::on6mioo. manipulables, etc.). tienen una organizacin oetulat Plll"<t de eucanot&s y $0n de- intet's bio!oc::nolgico por su caopacidad de expre~ y madurilciOn de protelnas. Enlre la$ clula& animales que pueden eslablecerse en ct.mlvo, se puede>n cltat las c:lu&as Het..a oe careir-.oma Aumano. Jos fibroblastos N!H de ratn y BHK de rll'ln de hmstet. los OYOCitos de tatOI'I, ele. En~. pueden divdrse multrtud de veces conservando los mtSmos caracwes. pot lo que su r~iei'IIO de Clonacin elevado.
eo~tmioo

e.

16.2.5.2 Mtodos de introduccin del rDNA


Pt.le-sto que I'IOrrnalmenle la !1'4mbr;)n;) P'Mmtlllic:a moostre~ ~ pen'I'IOilbiliciad selectrva y no admite gcat~des rragmMtos ~ tONA, se act.H.St tt diV9rsos mtoOO$ para facilitar su captacl6n por alterac::lon uansllorla de ta per~ad celular (m!Odos paSNO&) o lnttO<Iuclr et rONA directamente (mtodOs activos). En muchos e-.tl$011. 10$ mecanismos son pcx:o oonocldos y bs mtodos resultan ms o menos eficaces del)el'l<liel'ldo del lipo do voaor y de cluta. EJ proceso suele denominatSe ti!Wt.sforl'n.9c.ln o tllh'ls/eocc.Qt, aunque es.trictnrnet~to ., prifTI8;r trmino OOtte-!pol'lde a 13 intrOOUCQt'l on btt~eric-s <mfitnonas y et segundo al empleo de Vlf'US como "eaores. tos trlbtodos utDiZados Pueden dividir11e lai'Yll:llln en fi>sioos y qulmiOO$,
Eltralamienlo m$ freo.Jente 9$ de tipo fi&~co-qulmico y se dtce que la clula se hace eompetMte. Se ~:.ca con una incubacin en presencia de CaCh a o seguida de un C'3mbl0 t)(u$CO a 37-43 que induce a las

c.

c.

212
ba<;ttri;~s 3

CLONACIN CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINAHTE

<'OOf)lar mol6culas do ONA.. Se dispone de eop3$ eoslnblocidns espqc:i81mctn1o $1.15C(1ptllle$

es-le

proceso
La lncorporadn pasws de OHA se favorece cuando sus rnolciAa9 se 1\811\ agregado o oopreelpitaCio por

lnteraoc:ln con cationes. tpicamente rosra~ clcioo o OEAE~no (dlelilamlnoecil~tteno . un pollmero poiicab:)nic:o) Otros agentes ouimoos. en O$P8Cilll41 porictileng!iCOI (PEG). avrnen~n 13 permeabilidad de ta membrana oolular. a.n 10 que se incorpora mM teoeirmente e1 rDNA, lamllitl de tona p$SiV8.

EJ ONA se OUOCIO i!'Corpor3r en liposomas, Que luego COf'l raciliciad se tuslonan oon la rnetnbrtt~~ celular y lii)Orttn su contenido al inttrior (inCluyendO 01ONA we. en rc~1~. ~ l~Si~f'$0 "'"superficie txtorior hitfrofilic<~ del
JipOsom:a).
Un tnt!Odo oon gran efiCaCia es el empleo de vectotes de tipo vi rko, ~ por su Vla natutal de lnfeocln ln(rodueen e.n &a o&ltAa anfJtrlona su ONA. en es\e caso reoombinanle. Para este tipo de ncorporacln se ha ecutlado el

1efl'l*to rtansleccin.
Oet alle~

del proct.d imienlu de clonado: intOrJU')racin del

rD~ A

(elapn 4)

e )\ +J!~~~~
~lilno,M;t ~~~,.

~'=I.ICOI6rl<lel rONA (l'l'le!OC* .,Y&ftOf)


''o:attwl!.'l((lml~..

eada t clllil.
......... jl},.

run~.-0

frn:ucnl<'mcnl<'l
~;orilU

'"'o:tl(

t: fl'l(llce..la4
cttWifl

o -.olk.,.

de ON!\
1\''ll!'-"k. '$Uab (1 d,.;,olltMI;

disllrnas de rDNA .,.tluJ)

,.,_

dcONA

t>r.ccria 1111ntf0ro11111Ja

o .:th..S. tr:ut,;(cclllda

Aplicando ~rgas etic.tric;il$ on Jon'ntt de pulsos breves ele atto vonaje se consp la apeftora de poro$ ttansiiOflos en la meombranca. POf IQ$ que puede pa~ el tONA. Este metodo de el~ N 00$\ante habirual para c;lulas eucari61i<:M, ttui'II)Je de resultados muy variables. Un mtodo wrio&O y de ;)pl~cin creciente. la -blollsrJca~. consiste en el bombardeo de lt's c6lulta5 ~nfitonas oon microeS'eras (Cie turgsteno u oro) recubiertas con el rONA. So omplec:~n Clisx>$1tivos &Ciecuados ("ppstolas de gel'le!l1 que impulsan NOS ml~ile$ meditmte un g3!1 a presin. pt.dieil<lo Bf*&rse sobre auspenslones

CLOHACIN CEL ULAR DE MOLCULAS DE ONA

213

celulares. clulas en cultl-.o o lnduso kl VIVO (sobre la piel, hOjas ...). A9lnos de 10$ ptoyt'es impa<:tat'l y l)efV!(ran f!n ras~. cuya mef1'1btl9n8 se re~la rlllliclamer\te, quedatldo et DNA illCOrporltdQ qn su mt9riot En casos doMe ta etlclenaa de Stlmlnlstro del rONA debe ser maxlma se acucie a ra i n yeccin <lirccu ~ ONA en la clula o en su nUcleo, empleando rrucrornanipuladotes y agujas de ondrlo (n-.:rojerl~ o micropipei3S. de ~a eKtnwnitalmenle fiAC~;}, bajo Ob&$rv..cin ill microtK:Opio. Obviamen~. el iloonvenlente es el escaso nUmeto dlt dlult\$ quo so pi.'Odon tr<tl3r I)Or C$tO mlO<Io m<~M.Ial., por lo QI.Mt 98f!er.tlmente se utiliza slo sobre oocltos y cigoros. Dado su car~lef directo, se p~ incluSO presei~ del YeCIOf y sumini$tr;;n el rragmemo de ONA deseado &11'1 modlbr. A gente promotor dec la inco r por :.c.io N ombre cspocffico dol mitodo

Caricter
Quim.eo

OEAE -de)(lrano
PEG (polielllengticol) lii)Osomas descargas elctricas inyecon dil"ecta c.on ITIICropipetas electropotacl6n ITIICro!nyeocl6n

qul"""'
Ql,lim(;O

leo
fi$iOO

...... ...... ......


P~~o

ns.oo
li$ioo ti.sioo

activo activo activo activo

16.2.6

Propagacin en cultivo

La divi.$io de 1M c61~ (Jnfitriol'l;ti$ en cultNo pnxluc:d. junto con la rel)kac:tn de su propiO genoma, la torm<lCIOn de COQi;;~s dol rONA ~e hay<~ podi(Jo inOOfP(l(ar y, po1 tanto. la clot'N'Win propiamente dic:na. En la ptctlca, se $Uel(l; h.t~<:er uf\3 primer<' $111mbr(J colultlr sobro una placa de agar para que c:tezcan la& colonias (cada cOlonia proviene de una clula, $01'1 crones) y una resie~ I)OSierior de t.s colonitt$ on medio liquido, que fotma poblaciOneS con mnlples c::op;as de cada oluta Originar (clone$ oelol:trcs) Dcpe;n(fiendo de &as propiedades del YeaOf'. ef rONA puede replicarse de forma rpkta e lndepetdetlte del genoma de la ce-rula anrttriOM

Detalles del proedimicnlo di.' clonado : pre~pagacic)n telular (et:tpa 5)

0
dct~"'-ion n i~ll-c.:o&n ICUJU bl

Slm.JII.neament.e con esta et~ <le M)f)09<'cin wele tener luJat eKpreSIn opcional del gen donado.

ta

selec:c:i6n ae CIOfles reeoml;llt!Mtos y l(l

16.2.7 Deteccin y seleccin da los clonas recombi nantes


Oado el gran nUI'I'Ief"o de 06Uo'ls eml)leMO\s en la donac:~n , y la dlversld9d de prOOUCIOS que pueden origii\(M'$e en

el proceso de eteacl6n del ONA reoombWiilfe, es csenc:~ POder diferenciar~ oetulas (o colonias a 1M que hM OOOQ '-'90r en w!trYo) 1\owl incx.wporado roo!men~ el ONA recoml:>inante dese~do Esttt do~in se POO<Ie oomblf\81 oon una
.setecc:u)n, es dec:lt, c:on&eQt* que $OJO las ~1t.11M lldCc:t.~ildil$ &ebrovtYan en el ooltNo. Esto laeilita muehO 11' Ulrt3 <10 ~gacln celular. reduciendo el nmero de done$ que $C deben $Q\1uir cu!6vando. Dependiendo del mel!l<lo utilitlldC, ..s posible distingWr clulas que 1\an hcorporaclo Cl vettOf {nxx>tnl)inttnto o no), que 1\an ncorporack> tONA o il'lCiuSO que han inCQtPOr-8do el rONA con el ftserto dispuesto OOt'l'ectamet~te.

Se pu&~Jen oonsicSerar 11ft tiPOS de mtodos de detec:cln.


Mtod os de hibfid ;u;JOn: deteccin de una sec:uenaa del ONA clonadO. o cre1 mRNA transcnro a partir de l. por nlbriC!aCit'l c.on ~ $Qn(l<\ mt~rcatS<t Mtodos inmunoquim.iCO$' <lete<:cin de la protelna c:o<ldicada pot el gen CIOn<\Cio, mediante un anticuerpo especilloo.

214

CLONACIt4 CELULAR: l'ECNOLOGlA DEL OHA RECOMBINANTE

Mi todos genticos o de sel~dn fenotlplea: en cienos casos. la expresiOon del ptopilo Inserto ptOduoe CIWI'Iblos
apreciables en 1& 04!1ula ar'!fitr'iOt'la. que tif\oen pata rellejat su c:tonacin con xito. Sin embargO. la eslltltegla ms conUl es la detein y s.ti&CeiOn baS&d.s en~ presencia oe genes mareadores en el Yee~or: Gens qu codi~n una protoint~ dotoct<lblo, cornnmonlc uM enz:i!TOOI po~ 1(1 quo so dispono diJ un ensayo. Por ejempJo, laP-ialacto&Qasa (gen lacZ de E. coll) transfoonil el 54Jstr.lto sinttioo X-gal {5-tlfomo.

4cl0ro-3-lnd0111-J\-O-gatactopiran6sido) en un producto de color azul. GoOC!'.s de resi stencia a un anti.bl.lleo, que codifican una protelna que permite el crecimiento de &e clula anfllrione en pr0$0nCi' de un <tetermn&cb atltibiOtloo. Por ejelfiC)IO. el gen amp' COdifiCa una 1}-lactamasa capaz de degradar la ampiCI T111oa. una peniQlil $0misint.,i~. El gen do rosistencia a tolrot;il;iil\3 fotA) ooalrtea una protelna de membfana que act6a como una bomba. Glltrayendoeste antibitico de la \lula. GeM.s que compt~mentan defectos nutrlelonales. En e-ste caso. se emplean cepas mutantes de la clula anfilriooa. QUt nc> ~t<lon crecer en aus.et~cla 6e un nutriente. Por ejemplo, clonandO en ~&duras con un de~ metaCOtico en la ruta de bbsfnteStS de ~fano. se emplea un ~ que oontiene el gen TRPt oorree1o. con lo que slo las clulas trensforrn.ada& crecen M Trp en et medio Los planleamientos e.xperlmenlale& son ITK.IY diversos y gener<*nerrte combinan varios de; o$10$ mare<~don:l$, Por razones <Ji::l.kticO$. $C ~en ui'IO$ ejemplOs que ilustran &1 uso de varios genes mareadores. aunque no se ajusten a la prilebca del llbor.ltorio. Un oo~epto il'f'IC)(M1ante a este respectO es el de lnecti'llseln lnurclonaJ. la lnetu&ln de un polloonector o &iOO de clont~do ~Pke {p41g$ 207, 209} fft et interiOr de un gen nwcador hace que la accin de ste se ejerza slo en las clula& que han incorporado ~tOf sin W1$9rtO

Octallts del procedimiento de clonacin: deteccin y selecc:1n de clonei recombinantes (etap 6)


EJemplo de un \(('l()r JX.\I'll dO'I:cin: oontenc; d insc:no de I)NA (gen de: inters). uoo n-gin de conlrol )' un ~~ nu ~ ili31 ' (tJtn m3rc3dor o gen de
rt-sis1e.~ia 3 31 \libilioos)

)'

\f(lpf~....... ~llfli~Wl~n
Jo~oliM(A.

Dctt'l:d<in de- d''"Cl: el gen A seria un &ocn narcador. codifica una pt(l(C'Ina que se pu~-dc d~1octar

Seleccin de dones:
(t~mt..!lt ~~~

romu okt~'iiO)

4:lgcn A scris un gen de


1\.'Si'\l.Ct"'ia a antibitico

lktoccin de cloocs oor in.'lcti\acin insert'iooal: el &~n A scrfs un gen JMn:ador, coditia. tma
1)1\)Cdtla qul.' se puede detectar.
t..(L m(mlmrock>.

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.,,.,,_ X .pl l

"- ""'"P'........ ~

w-

GENOTECAS

215

16.2.8

Expresin gnica

Eh a~ casoe se :we-tende no 60io 1& aml)l.tlcaclon del ONA clOnado. sino &u e:.pre&iOn. l:llef'l para esl\l<lf.CII este

ptoceso o para investigar el produC10 (RNA o ptOielna).lg!camente. el ONA clonado ser en eMos casos un gen. y pot etto COfl r,.cveneia $C trtttara de un cONA. Para con~uif esta elq)fe-sl61'1 se e~n \lfetores dtJ ex~sln
especializado$. dislirrlO$ de tos vocaoros de cl011aci6n por present;u Wr.'lciOri$tic&$ ~ fn vorecen la trM&eripeir'l del gen una vez inoetpOtado ala olula anfitriona. n picamente, un veclOf de expresin incluye (o se debe nsertar en l a la ve:t que e1 get'l, pa,g. 205) ul'l promotor. l'egiOI'I reguladora de la ttansa'()eln (pag. 264). Es lfeeuente emplear promotores induciblos. ajenos ~~ organi$mo dt' que ~ et gel'l CiOf\800 wo que ~ &el:tvan DajO COI'ICii~XltteS e,.;penment;(lles control;sblcs, como la lldicin de ~ nuti'R!flte u otro tipo de compuellto, disparan etllOneell la transcripcin d9.l gen clonado.

16.3 GENOTECAS
Se llttma genric:ornente gcnote.e.a o &it>!ioteea de Ot.IA a ooa OOie<:OIOn de Clones IOrmados a pal'tM" de todos tos fr,.gmomos <.le ONA obtenidOS previarnet~.te por esCiSIOn del genoma de una espece o de un tejido. En el caso de ta CIOMcifl celula1, cada uno ce e$tos l ragtnentos se presenta integra<fo. bajo la forma de rONA. en un vecaor lncorporaCio en uno de bs dones oelutares que componen la genoteca. En la clont~CJn i:teeh,lln se Pt9Sentan oomo fr(9'"entos Individuales independientes.
Dependiendo de si tas muestras de parbda para la donacin son fragmentos d9.l ONA gef'lmlco o molculas de mRKA (~ 205), se destingve el'llle gMOt~s genmleas y genotecas de eDNA. Es imoottame indicar que 18 lnklrmaci6n proporc::eonac:ta por ambas genotecas no $$ idntica. pues slo las primeras incluyen tanto las teg!Oni&$ oodlflcantes oomo tas no oodificantes. ademM:. las genocecas de cONA son dferentes segOO el tejido pattlcular del que $0 han pteptlflldO, p.~ Slo contienen &as regiones. cdiroea.ntes que $0 e:~epresan en ese tepdo, tic celut;:.r. elbpa del de~r f(:A:) o ditefef'ICiaeiOO, ei'IIO\\ bioquimiCO... De aouetdO con tAo,~ utiliZan an.e~atM!U'I'I(!\te dis.tintas gei\Oiecas oomo pul'ltOde partida para la c tonaeion, seweneiaeiOn. ete. Clel ONA.

GE~OTECAS CE~.\11 CAS

ONA .:rom0o16mi.:o
C~t~a tompl<ru. un.o lln<ll> o.'ln~:ISI f;n h ~o~nuno~o l3 l O" pi)

mRNA Ull<~l d~ l11 c~:tul;,


1!i:ll\'fli;t.l> qu<', ~'fl ~'OflJIII'II(l. ll'ldU)t'll lod.v> loto fell\'S QIIC ~l.;in ~iCfl00 C\pt<'SIJ~J
trt.~&en p~.asa

------..:o.'Pkin de fl~m\'tiiOS
(Un~)$

1(,5,()0( tll I(IIJol ,

----.:uk.:dn dt tnutoknlll)' de ONA o.'Onpki'IICIIIiil'lo> !CONA)

8 !<ib>

20 tpb elld~ u ll(l pot trmioo m<.Pt

o
senltc.:a de doncll gc'llmi('(JS ( unos 76(1,000 dones e" tOllll)

Una Yltl plep.-rada una genoM<:a. sta se convierte en el punto de partida para 18 f)Usqueo;a de Cu<t!QuWll regi6n de.l ONA o de genes y so estudio mediante clOnacin adlc:IOI'Iat (que recibe et t'!Ombf de wbcron;~c.'n). secuencaadn.
10$ e$1udiO$, el poblema genrico que se expreStbn, etc. Con respecto atuso de las Qei\Oteeas oomo luen~ pa.ra 01 ~tea es ta tocaiiZaCIOn en la genoteoca del don quo <:Ontiett~c ot ONA b\.1$~. Para ello se acude a lo& dlsl!ntos mtodos de detecciOn yseteoclOn. pteviamente OQmentados ''describir la <:lonaetn de un solo fragmento (p&g. 213).

216

CLONACIN CELULAR: TECNOLOGlA DEL ONA RECOMBINANTE

16.3.1

Gonotecas gonmicas

El conoeplo Cf.slco de genoteca oorresponde en realdad estrlaamente al de genoteca genmca, representativa oel genoma oompleto. El nmero de Clones componentes debe !lef, en la prActica, suficiente para abareat .000 el 9tnoma. inch.lyen<IO tat~o el ONA CO<Iifieante tomo el no todil'ie<\ntt. U. prcf)MI(;i(>n del ONA de pt\1 se~~ pOr 9Kisi n del geooma oon ef'IZimil<$ de re$1riocin bajo colldiciones de rotura pan;:ial. es d~ir. que no permilan la actuacin exhaustiva de la en.nma &Otn \odos 106 sitios de restriccin presentes en el ONA. la rotura se produce en cada molcula alealOrlamente sobre el conjunto de &Jtloe <le reS1J'lccin, de fonna que aparecen un nCimero menor de fr.<~gmentos, y ttos soo de mayot tamet.o. teSP&ctO a lo t&ricamente posible, y diSerentes de una a otra mOlCula.

Gcnmn: oompk1o
mu.:h <J- <,lt t"lfono~f1

Mot.:c11bos d.:
D~A ill.,nlic-. io;Qn~t>(l""''l!"

X X

X X

A]UJtMKIO \.1$ wndoc-i'*" 1C o:un""'f:"'IJU!I. d11 111!> ~ili,.do 'suicci dosp.niNt:s en d Dt-A.
MilO~ tll(ipda IIUll 1111111~

.,nriJfv;...Jo.
~~~~~,..

.,_.,d......,
~

unA enli~t~.t. de n:uricriOO


l e(f11d(>nl lnl)ta~CMr)

4lci!c<!lol" lliUialtM

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cloooi. <k r.odll frapnt:niO P<'f


~uudo <n C<'l~ nr.ln(oau

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q.,c, "" tWf~Julllo.l. cubt~:n 11.l0Jb la; rtsiillws del


tcn(lfnll

D"" m.:I.IO'Ibo.,...,;

A partir d$1 tamalio delg4tnom<!l completo y e11amai'IO Medio de los Insertos &e puede calCular el mlnimo nmero de Clones necesano para que la genoteca ~nto al genoma tomP'eto. Sin embargo. el carcter aleatorio de la pteparacl6n de fragmentos y del prooeso de donaCIn ~n QI.IO , l)&ra l.etler certeza de que ooa genoteca cootlene cualquier regln del genoma. se requiera en la prctica un nUmctro <le <:lonM muy superiOr al terico. Este nUMero de clones nea1es dividido por el nunero de Clones lerioos define el parmetro conocido como cq uivalcmte gcn6 mieo ~GE) , Qut C$ de 3 a 1O ()3r;t COnSeguir un 99% de probabilidad de clonacin.
Retacln entre tamaos de genom~ e i ns.crto y n .tm-HO de d ones ter icos y prcticos Organcsmo eeccenar.
Le'VBOOOIS

Tamano del

genoma (Mb)
-4 -1 4
~3.300

T;~""'I\Q de in$CrtO (kb)

N" de Clone!!. independlertl&S (lel!lrlcos)


4 .000/20 210 14000120=700 3.300.000120

W de Clotles

en la prcdca
-900 - 3.500 ...7<1Q,OOO

Equhtalente genmtCO (EG) 900/210 4 3.5001700 5 760.000 1 165.000 4.6

20 20 20

tl.m311'10!1

= 165.000

16.3.2

Genotecas de DNA complementario

A di'lerenc:ia del caso anterior. las geooteus de (:()NA representan elCCiusivamente a la parte oocliflcante del genoma. Son e$peocitllmen1e Uliles en eucarlotas. donde una celula &Ok> expreu un;~~ pequefl fr.Cci6n de su genoma (menos del3% en humanos), lo que reduCe el t:amar.o del material gentioo disponille para oonstruir la genoto<:3 y. pOr n~nto. e1 nmero de dones. El m~JtElrl81 de paftda. el mRNA de la olula, contiene mencxs de 20.000 mol<:ulas diferente$.. con un tamano mediO de 2 a 3 k.b. Por oiJO lado. puesto que ti rU'Yiero de OO(lias de lOs dlsb\los tipo& de mRNA es rooy Vl'laf>le en eucarlotas. su representacin eo la gonotec<'l no $en'! unif()tme, PueSio que los eCHAs carecen de seAiiiG$ de cu:;presiOn. cuando se pretenda la expresi6n del gen ciol\ildo G$ imprcscilldiblt inctuW en el \'8Ct0r oe expresin un potente promotor ~uado parata oUa anfitriona. de modo que sta ex:prG$& kl Pf010IN OOOir-caCia por el cONA.

Tema 17

Genmica. Obtencin de los mapas gentico y fsico del genoma


t7.1 lntrod uccibn ...................- ..... -.................. -........,_......................................................................~.................. 217 17.2 Map.as genticos .................................................,_,,__,.,,,,,_,.,,.,_~, .................... ~ ...................................... 218 17.2.1 Fraccin de recombnaan romo medida de d1stancra en un mapa gencico 218 17.2.2 Obtenci6ndelrnapa98fltiCO... ...... ...... .... .. 220 17.3 M01pas; fis;kos .................. ~- -- -- -- - - - ..................................................... 221 17,3 1 Obl.eflciQn do~~$ tiSioos a baja reSOiudOr'l .......... ,.... _ ,_,_.,,, .....,_,_.,.,_.,,.,_,_ ,_,,,................................. 221 17 3 1 1 MC'IOdos b3SMOS ~empleo de line:tt ce1U1ates SOMticas ntbticlas ........... ............... 221 17 3.1.2 OOtet\CiOn de mapas tne<Ji8tlte ensayos de hbttlaciOn oon sondas fluorescentes ............ 224 a) Mapas por hibtidaeiI'I iln Situ (FISH) cromos<iCa ............................................ 224 Ol Mtlll)a$ oorcilometria oe nuo .... ............. , -----... ,_,_, --- 225 17.3 2 M.-PM fisiCOS dt <'llltl resQIUCiOn ........................................................................... 225 17 3 2 1 Mapa f!stoo por hibridacin in s-Jiu (FISH) de afta teSOJoCIOn .... ,_,_,_,_,.,._, _ ,_.,, .......,_ ,_,,_,_ ,_ ,., 225 226 173.2.2 Mapaf!&looconenzmasoerestncon ....................... , ,_ 17.3.2.3 Mapaos, fiSICO& de STS y EST,_,_,_,_,._,_,_.,,._,_,_, --- ,._,_,_,_ -- -----... 228 17 3.2.4 Mapasdeentigos ., .. . 229

17.1 INTRODUCCIN
Se conooe hoy dia como genmiC<J al oo~o de es:lrategaas y t.cnologias empleadas para la caraclerizacion mole<:ula 001 gonorna. en su mbs <tmplio sentido. pero con vn etlfttsis tspec.ial en el Q8f'IOffl<l humcano. Conceplut~!mente, 1:. gen6mica QOt'l"eSponocle a la Obtetleitl del mapa de un genom:a, que <t sv ~ puedt ser consideradO oomo la estNC:1unt fina del matenal. gentloo de cuakpet espeae. Pot !.afilO, constiruye: 1a O*Se ~ una Blotogla MOlecular e lngef'llerla GentiCa modernas aplicadas a la s..dad
De acuerdo con esl06 oo,etrvos. se pueden di&tif'9J.r d06 oireas dentto de la Genomica, oonsecuttvas, aparentemente independieole& pero totalmente relacionadas entre si:

En primer ._,g.,r 1~ genmica fltruclurlll, Qt~e corretpO~ al estudio de las tcnicas y estrategias necesanas para obtener aolo 1 os mapas lisieos. del ger'IIO<&. posibles a diSllr'llos ni~et <.loe teS<llt~on .-;omo lt~ secuencicllotal dol DNA gen6mieo. o mapa flsieo a la reSOiudt'l maxima. el l'luCietdO r.div~. Los m..'lo>a$ fi$1CO$ IMto d6&1Q05 oomo modem06, se descnben en el presente tema. mientras (J.le la secuenciaCOn prop~Stnen-te diCha. o Ot$<;ift300 e1e1 conunto de "1ecra!l que oonslltiJYen la informaciOn bblca ele OIJ8lquier orgat~isrno (3 300 Millones de pb en humMO$}. se descdlen E!f'l et rema 18. La mayoria de IO!l ptOyectos genoma ~ (;t~r$0 $0 cncuentr.ttn denlro de alguno de estos ot;t01dio11 de la gcn~ G:~~truclurt~l En el ~so del Proy~Peto Ot'nom1 Hmnano (PGH) , &e est llegando a lO largo del ttbn, De ahi la etl<)lm$ tra$CCndcnci~ de lodos lO$ proyeew& mpicados en este gran objetrvo. no 2000 ~ Ullin-:> e$1
En segundo IU98f. la genOmiea funcional, c:otl"espotlCiiel'lte a la caracteti!aei61'1 del prolcomOJ, C$ doeer. el conjunto de todas las proliltna& Ollglnadas pot el genoma, bajo los diversos petrooes poSibles de expresin gniQI 3 proteinas. modificacin y degradaon ptOielca y desarrollo de su 1\inc:IOn. IOdo euo dentro de cada tipo de oful3, momen1o oelul<lt, condiCI()l)l)$ partlc~Aares in VJVO. etc. C<ltresponde. en deflruuva, al estudio tt.w.c:lonaf del ONA toclir.eante. Por anaiOgia se l, 1 ma prol,pmic-<J conjunto de tcn1cas y e&trtttegias utilizadas para el estiJCIIo del proteoma. En COt'llraste con la genmi~ estructuf'i'!l, la protcl)mic:. so oncventr;:. en &1.1& ncios. y slo se tienen datos para alguf'i06 organismos mooelo Traosct~rfiriw\ ~!\OS ante$ de COI'Iooet' al COOl)fleto la t\lnci6n dG tod06 los genes humanos y sob'e todo para dar Vlllidad ClfflCiiC3. en sv caso, a 1M l)tl::)(eil't3$. IMto c:n ~ W.SiCOG como aplieados en fa'IOI' de ta rn.nanldaO (por eje~ a la tliome<f!Cil\8).

'*'

218

GENOMI CA. OBTENCION DE LOS MAPAS GENTICO Y F iSICO DEL GEHOMA

El PGH es un proyecto de tal ewwergdn que sus ~lvos oo se puedlet'l alcanzar con el Simll"t (ll&tltcamiento de buscar mlodor. para la etapa de secuendaci6n. a pesar de su creciente eficiencia. De hechO, el progteso logrado ha &Ypue~o la lmpcacin de numerosas Hciatlvas y mecodOiogfas que superan con cteoe9 dicha etapa. Ante te lmpostlilldad material de recoger toda esta informacin (por otro lado. ya disponible de forma espec.allzada dra a dla en lntomet), M prO$Ctlt;tn en O$le tem<' y el sig~ tM lineM *i~s ~ra un enfoQue 'lgico" del oonocirn.ento del geooo>a. la elaboracin del mapa. o -mapeo". de un genoma, tanto el tunano como lOs de ottos organlstnOS, se ha abordado a lo largo del dempo en varia& e4apas consecutivas, a niveles credentes de resolucin. E'5109 se
corre&pOnden. a orandes rasgos. con tres grandes estrategias metodolgicas. oomplemenlaria& entre st mapeo goniltico, mapcro fis ico y sccuonciaci n Adcmlls M sidO neot'$t'rio el dc:st~ rrollo do l6<ric&ll informMi~$ para re190r. aimae4)nttr, distritluir y analiU~~r et cr&Ciente VOlumen de oa~os Oblenictos.
Fases del PGH Mapoo Caracterl&licas

Mapa gJentico Prol)(lrCion3 1;~ mellC' roSOiuc;iOn. Sit<'l ~ IQITI'III <'!proxi~a en k erom0$0mt'S o de ~l'~Wf!to dlvtrsos IOCi (de genes y de oi!O!l marcadOteS o secuenCias Identificables)- El cl~ de la <iStanCia y. por ~nto. la ubicacin relativa de genes o marcadote-s, se basa en la frecuencia oon la que los pares de loci se tr.lnsmiten oorlootamente a la

de&Oendenciil.
Mapa IISiCO ASigna IOcalizactones a loe marcadOtes, definidas por dlslandas en pares de bases. Oestacan entre sus variantes los mapas de reatrlccin (ordenaci6n en el cromosoma de las danas para enzimas de restnccin). Eql.livt'le a l;t obtencin del mapa genmico en su nivel mas delai;ldo. Su Ol)jecivo es estaOieoet la secul!tncia nuc:le<:ltldica c:otnple4a del getiO(N!I humano. e.xploraf'ICJO lO$ 3,300 ~.,de pb (te la Oklla 1'18pi01de {6.600 en la clula d!plolde). Se lleva a ~ en paraii!IIO y oon ef apoyo de 18 ln!Otn'\8CIM proporelonaca por los rnapeos gel'l1loo y trsloo. Hace u90 de planteanW!n~ y mtodos sumameole especlflcoe, ceda \'Bt mas automcnizados e informatizados. S. describe en o' toemtt 18

17.2 MAPAS GENTICOS


lnicialmome, los map{'$ ge'*!i(:(IS oonsistlan en una representacin grfica de la ordenacin y ubicacin de los genes en e&da cromosotY~a. Sin e~rgo . acbJalmeole se InCluyen en est06 mapas no &lo genes. sino otra.s regiones del ONA, de MOCIO que pata e"'JJIbar a arOOos se emplea el til"'*"o lt\lllrcador gen4tlw: est. papel p..ede desempenarto cualQUier caradertsdca flsice o molecular del ONA que dffiera eotre D:lividuos y sea OOtoctSible en el laDOtatotb. para poder seguir su patrn de herencia. Como marcadores gen&ticos, por laniO. " inc::lt)<cn tan10 rogiones que fOrmM parte de un gen (m&.rcador g'nko) oomo &egm$nl05 no coctilic:aneos (marcadcwoA no gO nicos). La gran mayora de man:aCiores ~iCOs en 1 0$ mapas actua'eS son marcadofes no gnloos.

de~.e~:.:.c'm de

la bm:od11:

rnarc1nlurb senCdi.l!l

se OOI\5IJ\I)'e0 irNI.irt;.Jrwmc,a pnrtir dt la


hercno.-.a do:: los maretKIOte& (enl.:vlnOOo fr"uccx:i~de ttCombiNICi6n)

Mapas C~ctld<"&..

.o

Mapu Hdeos
~.: Cl)lll>11VyCil rfin"('Uin'JT/t',

loeahunOO b

poJ.ciCl dt

luo:

milll:lUklrn m ~i crilnl~

17.2.1 Fraccin de recombi nacin como medida de d istancia en un mapa gentico


0\w-ante la miJIQI5i$ tiene lugat el $0rbt'eC~l~Zsmie!'lto, o lntetcambio reciproco de fragmentos de ONA entre cromosomas homlogos (tOQOmO.ir)8CiOtl hOm.loga o meln'ca. pg. 106). Debe destacarse que la r~eiOn nunca tieno tugt~r enlre cromosomas diferentes, sino Unicamen1e entre los dos miembro$ de t.l"' l)t'r de Ct'OI"''W)SSmas hOmOIOQOS. Los mecanismos moleculares de ia rec:on'lbin.aci6n no se dtseribcn on q te libro, IXlt ootres:poMer a un tratado oe Gentlce. Aqui interos.,n esoncial~o. las eonseouet\Cias del pt'CICIMO. Por un lado, qJ$ toe crornoeomas ff#COmbimmtt~s Que t~!><'reeon en gameto ya no son ldntl009 a los originales (paterno y materno) y, IXlt olro, que la vatiBCion gentiCa te-sutt&nte depende. obviamente, de la po&~eln del &ebrecruzamiemo en cada par de aomQI$0m<ts.

e.cs.

MAPAS GEH~TI COS

219

Como 1;)$C ~3 a &a Obltl'lol'l de mapas getleleos, debel'l recoroarse algunos l&rmlnos btlsiOQS;
"~'Vl 1ti"'ci6on"

de \'t\)liiO.Xtll'llll.-.

ho,_nklll>~l)'i

(}' ffi>!l'l;ih..iM; 1

Wfl:.l r.cl6 n de lo)' .:1\'lH loOM'In\M<

h~tnl~ en 111 n-.ei~i~ l (jlliUI fnmm pal'le de I~U gal!-.-.cll:l11l!' ,...1'\lfld:tn~l do: be! ('1\111lllbdil;, (1l 1:. tll>. -,tl,.l~ 11 IX'll':'lu il p.lf:lt a g:Jl'lll'"lo.'S d i fl ~llfleS) , ('adll ~ $1' ~I'!PTIP de fnm l lk-IM"lldk-ntC' di' 1 \"'lS ;jen,'i,; ( ~Xi'- 105 ). L<tc rmce-~u e~ md.:prnlbc'nto: dr q~ r \l.ilil o no,) r'(mtu~.

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"St-:reww-iOn" di' ald.;.'l!l "' ~;~....ci n lk o.kiJ 11!d<J!, ok kN:i dlf<"l\"tt!CS oJe un ffibii'IO cromOISOOlll du rante 1 11 m~:05S 18 ) l-- Skl pu~Jo: dlli'$C si ha t.~.ttillc> rn'llCllhi~tudoc'm entn- o o)!; b:i. y ~.. 1 1'1AnirteSfll <t'l el mo)men\1> de la ""gfl:lt:tcin de llH o:nm!OSOOI:tli y bl l'RIIl'liltdll.. ti tkrn'tu'l(l ..l'IW'I:rt'!:IICiUD" ok alfiOS (A } U) J'IW& p!J(I'Cff CMU'lldiclo.'rio. P'IC'S indi(ll o.]lll' Csi\'\S ~n1...,1'11 JUIIWS.. ("S ..1-ir, !K~~~ $1'JP'.-p6c}n l'llltl:' !d.

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(lllllll'\111-Hk 11 ~ 1-:.<~Mt~-k..; U y(

La c:arac:ISI"isuca que daMe el mapeo genooo es el anilli$1$ dtr le~ f~c;cin o fro<:u1tnci<~ d ntcombinaci n. deh !a oomo la probabildad de que los a!elos preMfl(os en dO$ 'oei direren!a (corre11ponclientes a la pc)Sicin de lOs mcweaOOre:s <:on$iderMO$) $C $eparet~ o segreg~ como OOI'ISeCueneia oe la tecomblnacin meiOilca. Olcno de otro modo. es la llocuenc:ia oon la qvt dO$ alelO$ deterrt*lados apatecen recomblnado9 en la descendencia. Como se diteute 3 oontinu&eiOn. e~a tracciOn depende de la distancia entre los dos lool en el cromosoma. iO que permite e~rta pata estableeer el mapa.

I:J~mplo. 11);;. 3 l"ci >On htti'I\'ICr!.-.'lt.Co.'l.s.. (Qb\ iamo:ntc. b rccombinxi'm rwltt!\r

llar.cclldn'l.:-ia en Joci 1'100\IX'i~Jii~~ ~

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A ) (.se h11n sc n. -gndo

220

GEHOMICA. OBTENCtON DE LOS MAPAS GEN ~TICO V FISICO DEL GENOMA

Conclusiones de mtcr-.s. r..:tocionndas con la construccin de m.npas gc:ntlcos:


a) S d<r..~ IQCI
~1lln

muy pr:um~ en d cromosoma (fKK ej .. A)' U:

E$ dilicil que: se prodUZ(11 r'-""Wmbinacin en una posicin intci'ITiCdla entre a.mbo.h: pt>r tanw, hay baja /frt,"'lJCmtiJ de rct'OI11binJ('iOO t2 de un total de- 12 game1os = 16. 74}~). Con a ha probab11id3d, IOO dos aldM quc:dtln en un rnu:m<1 ci'Of'l\05\)l'lla y l'(lfllilltda t>C roiN.-n.:vJ;nL L~ aldos q11e se t.obcrt:dllo con frcoucoa ntil;llima (es decir. que c~si nunca se SICgregall) se dice que

esuln ll~ados. L!,ic:amc:ntc:, kls )ocj de cromosomas difercmcs nui\IC"a estilo lig:ados. o tienen un
li$.1hl1t'111<' ;Cnk-., nulo A l C:OOJWliO de 11l<los klotnhM,)s en UN! rc:gJ6n ~-qu.::a dd cromosoma se l e denomina baploti>o Se
Cfll'aCI~ "f'iza pootquc sus aletos !lC ttan:.~nite11 eO!lJUI,amcnle {S<"' :ddos lig.ados). b) A mll) or ..CJ""na.:l(>n O:nln! lot~I!Xt ~n d trortl<I'Mm'~ ( pqr ~j ., 0 y C o, ~~~aUn. A )' C); EMstc mayor probabilidad de rccombinacin en posiciones intem,cdlos: por Lanto. hay mi}'Or ftiXucrt.,;il d.: recontbiuein (para 8 )' C: 4 <k 12 .-. 33.4'-. paro A y C: 6 de 12 - 50%,. J\l sufrir la rttOtbina.::iI'. l<l d<Jo$ ale los queotbm en distmto eromo~m~, por lo qul! h11y m('nor problbllidiJd de q.x ~ hcrroen JIU11(K. Nta: la tennin<llogla es an m.ir ' 'atiadil de la QU: ~ha nnpkll.IOO ilquf: pt ejctn)IO. una illt.a frocuct~eia

de I'OCO!nbitlll.CJII ~ rjntUmO di.' htl't:IICtfl tl'lnjUtltll infn.><:u:l'ltl.', OOhCI\":!I<:i:l infrt~CII!C, SC$n.-saein de 11lc:l<n~ (roc:u..:nle y CQ$('JI:r\.-"l.IICIn infru~nt~ . ~10 puede dificultat, n vcc~ la cornpren. "jtn dd stgmiic:do de -rn:cu1!71cla do: ret(lfllbl1lxt6n".

17.2.2

Obtencin del mapa gentico

Una \'8Z oonocicias las po&iCIOfMI$ relativas de un n(lrnero elev<ldo do m~~ores gen61ico$, so I>UO(kt 0$1udit~r 13 frecuencia de reoom~acin oon respecto a ellos 00 c~ier IMtYO gen o $4.1(;Uoncia y asi sit...., su IOC:US en el ~mt'P3' definido por aqullO$ Do OSt'l fonn3. se c.1ico Qt.Je $e N mape&CSQ' su POSicin en el (n)c'n()$0ma. Ur'l8 vez localizadO, el nuevo 98'1 o secuenci~ ~w <' ..-.grQ$11' 01~ do mrc~dore:s que forman el map{t

l a escaltt en losma~s gentiCos $e rricle en uniclacles c:entimorgan (cM). 1 cM oortesponde. pot' defflcln, a la diMancla Que separa o:>s to<::i que e.xperimentan reoombii"'&Cibn en el 1