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C U L T I V O S C E L U L A R E S

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Índice de materias: CULTIVOS CELULARES
• Introducción a los cultivos celulares.
8 Conceptos actuales de cultivo celular.
8 Tipos de cultivos de tejidos.
8 Biología de la célula en cultivo.
• El medio de cultivo.
8 El sustrato de cultivo.
8 La fase gaseosa.
9 Oxígeno.
9 Dióxido de carbono.
8 Propiedades físicas.
9 pH y capacidad tamponadora.
9 Osmolaridad
9 Temperatura
9 Viscosidad
9 Tensión superficial
8 Condiciones fisiológicas.
• Las contaminaciones.
8 Contaminación bacteriana y por levaduras.
8 Contaminación por micoplasmas.
8 Contaminación por virus.
• Técnicas de contaje celular.
• Métodos de disgregación celular.
8 Mecánicos.
8 Químicos.
8 Enzimáticos.
• El laboratorio de cultivo celular.
8 Cabinas de flujo laminar.
8 Incubadores.
8 Incubador de CO2.
8 Incubadores tipo "roller".
8 Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido.
8 Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido).
8 Equipo de esterilización.
9 Equipo de filtración.
9 Autoclave.
9 Mechero Bunsen
8 Otros instrumentos.
9 Centrífugas.
9 Contador electrónico de células ("cell counter").
9 Equipo de purificación de agua.
9 Pipeteadores.
• Productos

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Introducción a los cultivos celulares.
Introducción histórica
El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la
embriología. Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El zoólogo
americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907.
Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula
espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se
formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba en una
gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada.

La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) empleó
plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los
anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido nervioso, corazón y piel.
Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener
explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos. Demostraron
que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con
extractos de embrión.

Roux y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de
pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los
cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos métodos de manipulación
en condiciones de asepsia que aún hoy día se utilizan.

En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de un animal, embrión de pollo, durante un
periodo de tiempo superior al de la vida de éste. Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años (Sharp, 1977). Gran parte
del éxito en el mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de Carrel.

Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de cultivos y de mantenimiento de las
condiciones estériles, pero sin grandes avances. A partir de los años 40, con el aislamiento de los primeros antibióticos, se
desarrollaron numerosas aplicaciones de entre las que podemos destacar :
• 1948 Earle y col. (Sanford, Earle y Likely, 1948) aislaron células de la línea celular L y mostraron que eran capaces de formar
clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una célula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los
nutrientes correctos.
• 1952. Gry y col. (Grey, Coffman y Kubicek, 1952) establecen la primera línea celular continua, las actualmente bien conocidas
células HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrión bovino y
suero de cordón umbilical humano.
• 1954 Rita Levi-montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en
tejidos en cultivo (Levi-Montalcini y Calissano, 1979). Este trabajo supuso el Premio Nóbel para Levi-Montalcini en 1986.
• 1955 Eagle (Eagle, 1955) realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las células en cultivo.
Describe que las necesidades del cultivo de soluciones corporales complejas (sueros,... ) pueden ser satisfechas por tan poco
como el 1% de suero de caballo dializado en un medio definido de pequeñas moléculas (aminoácidos, azúcares, ...)
• 1961 Hayflick y Moorhead usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos.
Pudieron mantener estos cultivos durante unos 12 pases, pero no consiguieron establecer líneas estables.
• 1965 Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas células de mamífero en cultivo
indefinidamente (Ham, 1965).
• 1969 Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecían
procesos nerviosos y que eran eléctricamente excitables (Augusti-Tocco y Sato, 1969). Se empiezan a establecer las primeras
líneas celulares diferenciadas.
1974 Albert Claude, George Palade y Christian de Duve recibían el Premio Nobel de Medicina por haber hecho posible la mirada
cercana a ese mundo en miniatura que es la célula con sus estructuras subcelulares y organelos con las primeras fotos de una
célula intacta obtenidas mediante un microscopio electrónico.
• 1975 Kohler y Milstein establecen la primera línea celular hibrida productora de anticuerpos monoclonales (Koehler y Milstein,
1975). El establecimiento de la tecnología de obtención de anticuerpos monoclonales les valió el Premio Nóbel.
• 1976 Sato y col. publicaron sus trabajos en los que demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas
de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero. (Sato y col., 1982).

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de una parte. etc. movimiento de proteínas.. Procesos de inducción embrionaria. inhibición por contacto o por adhesión. .. como por ej. • Interacciones celulares. Conceptos actuales de cultivo celular. Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular. de los tejidos que han perdido masa celular..La reproducción y diferenciación celular.Cultivos Celulares www. Documento de Aplicación Page 4 of 31 . cinética de la población celular. a partir de celulas madre o troncales. Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células 'in vitro'. cooperación metabólica. los cultivos celulares han conocido una revolución tecnológica que pasa por la incorporación de las técnicas de ingenieria genética... Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón. manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas. sustitutos de suero.com Desde que Cultek se inició como empresa en 1976... robotización de las manipulaciones de cultivo. estudio de la transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos). estudio de las necesidades nutricionales. interacciones célula-célula. de su diferenciación. entre las areas de aplicación en las que el cultivo celular in vitro es una herramienta basica cabe destacar: . se forman o reconstruyen tejidos que sustituyen a otros dañados por diversos procesos patológicos.El Cancer que se puede considerar como una enfermedad del ciclo celular.. a la Medicina Regenerativa en la que.. bioquímicas y genéticas. primarios o secundarios. y cuyas alteraciones pueden conducir precisamente a la aparición del cáncer. síntesis de proteínas... presentes en las células normales. . así como en el análisis de la genética de la célula somática. Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son: • Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas.. explantes. • Ingeniería de proteínas. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares.. hormona de crecimiento. metabolismo energético. producción de vacunas virales. transcripción de DNA.. que pretende conseguir la regeneración. el cultivo en microcarriers. el desarrollo de nuevas superficies de cultivo en monocapa de alta adherencia. total o parcial.La medicina regenerativa. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos. el desarrollo de reactores para cultivos masivos. En la actualidad.. insulina. como por ej. • Ecología celular.. de otra. así como el papel específico de dos tipos de genes.. infecciones. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales. Sus aplicaciones se refieren.. • Actividad intracelular. • Flujo intracelular. Se están estudiando las relaciones entre la regulación del ciclo celular y el cáncer. • Investigación del Cáncer • Inmunología. los oncogenes y los genes supresores de tumores.. Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos. a la llamada “reproducción asistida” y al controvertido tema de la clonación y. producción de vacunas antivirales. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular. utilizando técnicas de trasplante celular para implantar células troncales o células madre. Los defectos en el control del ciclo pueden conducir a una proliferación celular anormal o a alteraciones cromosómicas como las que se observan en las células cancerosas. movimientos del RNA: núcleo-citoplasma.cultek. como por ej. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares..

confluencia. • Cantidad y costo..com • Estudios de interacción y señalización celular. ensayos de toxicidad.. inductores químicos (ésteres de forbol. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo. temperatura.. Esta desdiferenciación puede. es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de una generación a la siguiente. • Inestabilidad... con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentación. niveles de O2. Estas soluciones complejas están sujetas a variación de lote a lote. Se pueden obtener con facilidad un número elevado de réplicas idénticas. bacterias. densidad celular.. Cuando se establece el cultivo. 8 carece de los componentes sistémicos de regulación. Es diferente el coste de investigación de un nuevo fármaco para la empresa farmacéutica que está desarrollando moléculas si ha de sintetizar de cada una de las que ha de probar en cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) a que baste con pocos miligramos. etc. • Motivaciones éticas.). • Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para transplante. • Validez del modelo “in vitro”.).. con morfología y composición uniformes... Establecer un medio definido supone conocer con precisión las necesidades nutritivas de las células en cuestión. detección de infecciones virales.. Documento de Aplicación Page 5 of 31 . Es de destacar que los avances más excitantes en la función celular proceden del reconocimiento de la importancia de las interacciones específicas de las células con otras células o con el sustrato. Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado). tensión superficial. o de una línea continua son homogéneas. • Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial.. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: físico- químicos (pH..) en los que se encuentran factores hormonales y nutritivos imprescindibles para el mantenimiento del cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. entre los distintos tipos celulares. 8 se han perdido las interacciones heterotípicas.. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa válida en muchas situaciones. Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables. en la diferenciación y en el desarrollo.) pero no está claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de diferenciación 'in vivo'. presión osmótica.. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos. Esto es cierto completamente sólo para algunas líneas celulares para las que se han definido los denominados medios definidos..cultek. micoplasmas. En cuanto a las desventajas del cultivo celular: • Técnica sensible. • Caracterización y homogeneidad de la muestra. las células se desdiferencian. factores de crecimiento. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos. • Economía. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos que suponen el sacrificio de uno o pocos animales. y entre otras cosas se hacen móviles e inician su proliferación.) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Asimismo existe una limitación de producción.. Un medio definido es aquel en el que se conocen todos y cada uno de los componentes que lo forman. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis.. Sin embargo en muchas líneas no se han llegado a establecer medios definidos. Como ventajas podemos citar: • Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de experimentación. especialmente los sistemas nervioso y endocrino. lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulación. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento. levaduras. o después de un determinado número de generaciones. La población celular puede variar su composición si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior. extractos de embrión. implicados en la regulación de la homeostasis 'in vivo'. En estos casos se trata de medios que se suplementan con soluciones complejas (suero. y entre las células y la matriz extracelular. El costo de producción de 1 gr de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al obtenido en el animal. y que para ser superior a 100 gr requiere instalaciones de tipo industrial. pero al mismo tiempo tienen unas desventajas que hay que tener en consideración.. y con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal completo. pero con ellos se pueden ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o cientos. • Aplicaciones diagnósticas. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables. en algunos casos ser revertida por procedimientos de diferenciación inducida por hormonas. y la concentración exacta en que se encuentran. Comprende el estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal. que es del orden de 10 gr de células en un laboratorio normal. y fisiológicos (hormonas.Cultivos Celulares www.. como consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide. Cuando nos referimos a un cultivo celular nos estamos refiriendo exactamente a un disgregado celular de un tejido de origen y que se diferencia de éste en que: 8 se ha perdido la organización espacial tridimensional propia del tejido. CO2.

por ejemplo por ECVAM (European Center for Validation of Alternative Methods). aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Así solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación.Cultivos Celulares www. se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. USA). La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. El crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante. Implica que la arquitectura característica del tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte. • Explantes primarios. • Cultivo celular. con excepción de las células hematopoyéticas maduras. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional. Este tipo de cultivo permite su propagación. algunas líneas celulares transformadas y de células procedentes de tumores. Documento de Aplicación Page 6 of 31 . la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento. Invittox (Colección de protocolos “in vitro”). Se podría hablar de tres tipos de cultivos: • Cultivo de órganos. Sin embargo actualmente se están realizando gran cantidad de estudios de validación de modelos “in vitro” dentro del desarrollo de los métodos alternativos a la experimentación animal. El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la proliferación. pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento. Muchas líneas celulares son anclaje dependientes.com Por todo lo anterior hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos “in vitro” respecto a lo que pueda observarse “in vivo”. y es propio de las células hematopoyéticas. de producirse. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Biología de la célula en cultivo.cultek. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos. Es de destacar que en todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en suspensión. En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación. es decir no inician la proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Tipos de cultivos de tejidos. en general esférica. y por otra capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión. Invitroderm (Alternativas a los ensayos de irritación dérmica en animales). Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen. A pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa ("stem cells") indiferenciadas. independientes de anclaje. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida. ALTWEB (Colección de recursos para el desarrollo de métodos alternativos a la experimentación animal en web de la Universidad John Hopkins. caracterización y repetitibilidad de las muestras. así como por las ventajas en la cuantificación. Este es el modo normal de proliferación de la mayor parte de las células. etc. En el proceso de establecimiento de un cultivo celular se seleccionan las células que crecerán según numerosos criterios.

por lo que deben estar relacionadas con la pérdida.Cultivos Celulares www. 1961). y la glia humana (Pontén y Westermarck. La razón de la inmortalización de estas células es en la mayor parte de los casos desconocida pero se incrementa la frecuencia de inmortalización mediante infecciones virales. Es debido a la aparición en el cultivo de células inmortales. serán las seleccionadas finalmente. fibroblastos de pollo (Hay y Strehler. Así los hepatocitos de adultos no se establecen más que como cultivo primario mientras que las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases.com Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección: aumentan en número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento. 1979. Así pues se ha de entender el cultivo como un ente dinámico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos que lo forman varían en el tiempo en función de la presión selectiva a la que estén sometidos. neoplásicos. 1979). que sigan duplicándose y que desplacen a los otros del cultivo.. con acumulación de numerosas anormalidades. espontánea o inducida por el tratamiento.. Sólo ocasionalmente un cultivo primario se mantiene durante más generaciones de las esperadas. El caso más extremo serían los procesos de clonaje en los que se siembran en pocillos (multiwell de 96 pocillos) 1 única célula. En el caso de líneas celulares establecidas la dilución puede ser tan elevada como 1/100 o 1/1000. como es el caso de las células epidérmicas (Green y col.. de las vías de control celular. aunque pueden existir tipos celulares. 1967). siendo la habitual 1/10. hasta ocupar todo el espacio.. si no se establecen condiciones selectivas las células del tejido conjuntivo. que conducen a la muerte del cultivo. tratamientos con mutágenos. En general. El crecimiento de las células en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases característicos de cada tipo celular y condiciones de cultivo. Se hipotetiza que la capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como línea estable está relacionado directamente con su variabilidad genética. detienen su crecimiento. Así líneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides como es el caso de fibroblastos humanos (Hayflick y Moorhead.cultek. Comparación del número de cromosomas por célula en una línea primaria glial y una línea estable de melanoma. replaquear o propagar las células. Es en este estado cuando el parecido morfológico y fisiológico es mayor al modelo celular de origen. y los fibroblastos dérmicos humanos pueden superar los 20 pases. Es una observación generalizada que después del tercer replaqueo el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo celular de mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo desplazando a los otros tipos celulares. Una vez se alcanza la confluencia en el cultivo es cuando muchas líneas celulares expresan sus aspectos más característicos. Para evitar que las células más especializadas del cultivo se vean desplazadas de éste por los fibroblastos y otras células de rápido crecimiento se han establecido protocolos detallados de medios selectivos. Documento de Aplicación Page 7 of 31 . especialmente fibroblastos. 1980) mientras que otras líneas frecuentemente se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas con mayor frecuencia.. Es también el momento en el que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir. Sin embargo al final todas ellas entran en una fase de senescencia. Estas células forman líneas estables o cultivos celulares permanentes. Thomas J.. en general. En el momento en que se alcanza la confluencia las células. perdida de funciones especializadas. etc. Comportamiento a lo largo de las semanas. Evolución de una línea celular hipotética. etc. En el caso de células en cultivo primario el factor de dilución de un pase al siguiente suele ser de 1/2 a 1/5 pero no superior. En el momento en que las células comienzan a dividirse en la placa su número se incrementa. En ese momento es necesario tomar algunas y resembrar en una nueva placa.

cultek. marcadores específicos enzimáticos. Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto. En la tabla siguiente se recogen las propiedades diferenciales de las líneas finitas y continuas. Se trata de células “inmortales”. en muchos casos de un tumor.. 5 2 <10 células/cm ) >105 células/cm2) Algunas definiciones que son importantes son: • Cultivo primario. etc. etc. Las células mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo.Cultivos Celulares www.. • Línea celular continua..com Existen diferencias muy importantes entre una línea celular continua y una línea primaria o un cultivo primario. Alto (>106 células/mL. queratinocitos. Finita Continua Ploidía Diploide / Euploide Heteroploide / Aneuploide Transformación Normal Transformada Tumorogenicidad No-tumorogénica Tumorogénica Dependencia de anclaje Si No Inhibición por contacto Si No Limitación de crecimiento por densidad Si No Mantenimiento Cíclico Posible mantenerlas quiescentes Requerimientos de suero Elevados Bajos Eficiencia de clonaje Baja Elevada Marcadores Pueden expresar Cromosomales. En general en cultivo presentan una reducción en el número total de células vivas a lo largo del tiempo. células endoteliales de aorta bovina (BAEC). neuronas. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC). Ejemplos: fibroblastos dérmicos. Documento de Aplicación Page 8 of 31 .. se pierden Funciones especializadas Se mantienen Se suelen perder Tasa de crecimiento Baja (24 a 96 h tiempo de Rápida (12 a 24 h) replicación) Rendimiento en cultivo Bajo (<106 células/mL.. Cultivo que se establece a partir de un tejido u órgano. y que se mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. • Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células en el cultivo..

.).com El cultivo de las células no presenta las mismas dificultades independientemente del tipo de célula de que se trate.. nerviosa.... y se convierten en células que mantienen tan solo algunas de las propiedades que las caracterizaban. Esta pérdida de propiedades puede ser debida a desdiferenciación o desadaptación.. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades diferenciadas. Así pues en general se puede establecer como norma que una línea celular será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada sea. Hay grandes diferencias que se relacionan fundamentalmente con el grado de diferenciación del tipo celular..) no puede almacenar glucógeno ni sintetizar las proteínas del suero. mientras que la segunda implica que la característica especializada perdida no es irreversible sino consecuencia de la pérdida de la señal (por ejemplo externa. entre ellas la característica incapacidad de dividirse.cultek.. Documento de Aplicación Page 9 of 31 . 1975.Cultivos Celulares www.) y que basta con recuperarla para que se reexprese (por ejemplo Michalopoulos y col. (Michalopoulos y Pitot. aminotransferasas.. con las excepciones de las líneas tumorales de células diferenciadas. Sattler y col. hormonal. 1978) han demostrado que los hepatocitos de rata pueden reexpresar tirosina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona) cuando crecen sobre una matriz de colágeno). La primera implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular ( por ejemplo un hepatocito en cultivo pierde sus enzimas característicos (arginasa.

las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio. la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación. thermanox (TPX). Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células. de buena calidad óptica. especialmente la humedad y la temperatura.Cultivos Celulares www.com El medio de cultivo El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas. El tratamiento es característico de los diferentes suministradores.). etc. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de células hematopoyéticas y tumores ascíticos. es recomendable probar muestras de distintos orígenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas celulares de crecimiento difícil. en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. El gran interés que tiene el cultivo de células sanguíneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterización de los cultivos en suspensión.. etc. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulación y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante por ej. Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación.. en general células sanguíneas. el uso de membranas plásticas porosas. PTFE). y algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que se pierden las interacciones (espaciales. químico. especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas. Un ejemplo de este tipo de cámara se representa en la figura.. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje: 8 La mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden de disgregación tisular o de tumores formados por células adheridas y mantienen esa característica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse. 8 Plástico desechable.. La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o menos sólido. politetrafluoretileno (teflón. posibilidad de cultivo en mayor escala pues sólo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilización. El plástico más empleado es el poliestireno.cultek. Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica. tripsinización. 8 Actualmente es de gran interés. de adhesión. 8 Los cultivos en suspensión suelen coincidir con los de aquellas células que “in vivo” son circulantes. Documento de Aplicación Page 10 of 31 . y por ello los productos varían en calidad de uno a otro. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento mediante irradiación-gamma. o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofílica. Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes: 8 Vidrio. • El sustrato de cultivo. policarbonato (PVC). Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro.

1951). Estas bolas con las células adheridas se mantienen en suspensión. Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria. por ejemplo agar. o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Se trata de soportes plásticos (poliestireno).. 8 Superficies tratadas. por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.Cultivos Celulares www. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. o "gelfoam". Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo). 8 "Feeder layers". La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo. 8 Matrices tridimensionales. 1979). de paladio (Westermark. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. 8 Otros sustratos artificiales. Estos resultados refuerzan la noción cada vez más extendida de que las interacciones célula-matriz extracelular son determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación. Así. Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos. 8 Interfases líquido-gel o líquido-líquido. debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las células. Son sustratos que no permiten la adhesión celular. Son sustratos en los que las células penetran.. y especialmente de las células epiteliales. mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada (Yang y col... y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran. Documento de Aplicación Page 11 of 31 . vitronectina. poli-D-lisina (algunos teratomas de ratón). 1965). o recubierta de colágeno (Leighton y col. se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/mL) añadido al medio.com 8 Microsoportes ("microcarriers"). 1968). Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las interfases líquido-líquido o líquido-gel. colágeno. y un eficaz sistema de recambio del medio. agarosa. de sephadex o poliacrilamida en forma de pequeñas bolas ("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. estableciendo una distribución tridimensional: geles de colágeno (Douglas y col. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos. o modificación del sustrato. 1980). o con colágeno.cultek. Matrigel. 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Se han descrito métodos para la reconstitución de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular (Reid y Rojkind..). 8 Haces microcapilares permeables (“hollow fiber”). Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente cilíndrico en el que se siembra. o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina. Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular. Una de las monocapas más empleadas son los fibroblastos de ratón 3T3 irradiados.. Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación del medio. 1967). etc. a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg. esponja de celulosa sola (Leighton y col. 8 Sustratos no adherentes. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares. En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera análoga a como lo hacen en el tejido de origen: células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular. 1981).

por su escasa estanqueidad.Cultivos Celulares www. son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células.cultek. Placas de varios pocillos.0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. Documento de Aplicación Page 12 of 31 . 6. emplearlas para el mantenimiento de líneas. desde 6 a 96 pocillos. 8 multiplacas. 8 frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños. Disponibles en 3 tamaños: 3. o bien para el crecimiento de células en suspensión. Es una variante de las placas de Petri. Los más comunes son: 8 placas de Petri (ventiladas). No es recomendable. en forma de diferentes tipos de recipientes.com Tal como se ha descrito previamente. el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable.5.

por ejemplo NaOH.cultek..Cultivos Celulares www. Aunque aparentemente podría ser posible prescindir del bicarbonato en la formulación del medio. esto se ha revelado falso. con una cara plana sobre la que se fija el cultivo. Cuando la concentración celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO2 a frascos cerrados. con mucha producción de ácido es recomendable. Incubador tipo “roller” “Roller bottles” • La fase gaseosa. aunque existen cultivos. En resumen. • Propiedades físicas. debido probablemente a que la ausencia de bicarbonato sódico desplazaría la ecuación [1] hacia la derecha. y que se incuban en los incubadores dotados de "roller". A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. (Good et al.. de modo que tendería a desaparecer el CO2 disuelto y eventualmente el ión bicarbonato. viscosidad y tensión superficial.. de modo que el pH se establezca en 7. pero si en frascos abiertos. Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio. El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2 disuelto.4. Se trata de tubos. especialmente en los medios sin proteínas séricas.. el pH y la cantidad de iones HCO3-. 1966)). osmolaridad. Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico. siendo la ecuación: ⎯⎯→ ⎯⎯→ NaOH + H2CO3 ←⎯⎯ NaHCO3 + H2O ←⎯⎯ Na+ + HCO3− + H2O [3] De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO2. Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión atmosférica. por la elevada producción de CO2 endógeno. En los casos en los que la densidad celular sea elevada. especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior. Se ha propuesto (McKeehan y col. 1976) que los requerimientos de selenio en el medio podrían ser debidos a su papel en la detoxificación de radicales de oxígeno. cuya concentración esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. Las reacciones que tienen lugar en el medio son: ⎯⎯→ ⎯⎯→ H2O + CO2 ←⎯⎯ H2CO3 ←⎯⎯ H+ + HCO3− [1] ⎯⎯→ NaHCO3 ←⎯⎯ Na+ + HCO3− [2] El incremento de la concentración de ión bicarbonato desplaza la ecuación [1] hacia la izquierda. 1974). Se puede emplear asimismo otra base. los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO2. haciéndolas independientes de la aportación de CO2 exógeno. temperatura. durante el clonaje) es necesario añadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados.) y que se destinan a la producción de gran número de células. Sin embargo. se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios en la actualidad. así como una mayor capacidad tamponadora (los denominados Good's buffers: HEPES.. lo que permite una estabilidad superior del pH en el medio. ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura. 8 Dióxido de carbono.. Tricina. Las características del medio son: pH. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su producción de CO2 endógeno.com 8 "roller bottles". Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH correcto. Documento de Aplicación Page 13 of 31 . Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono: 8 Oxígeno.

5 (Eisinger y col. Cuando se usa conjuntamente con CO2 externo. Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio. y beneficios nutricionales para el cultivo.7 y células transformadas lo hacen en el margen de pH de 7. Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero..2 a 7. Medio diseñado para el crecimiento para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como humanas. y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM.cultek.8. 1955. que presenta color rojo a pH 7. a temperatura ambiente. 1965).. 1980). 1959). Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación. 1959) y el más complejo 199 de Morgan y col. transferrina. con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. 8 Osmolaridad. 135 (Evans y Bryant. et. Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el BME. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7. La solución tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato. 1979). Ham F10 y F12 (Ham.4 (Eagle. Ya se indicó que la principal dificultad para el establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios. Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente. por lo que se recomienda o bien ajustar el pH del medio 0. baja toxicidad. debido a: su bajo coste.4 aunque existen pequeñas variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7.0. El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7. serie de los MCDB (Ham y McKeehan. de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio. antes de añadirlo al cultivo. 8 Tensión superficial. Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue siendo empírica.. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa. Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina.6. 8 Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM).. creciendo bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg. que equilibra el CO2 atmosférico. 8 Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM).com 8 pH y capacidad tamponadora. 1963. • Condiciones fisiológicas. naranja a pH 7. MB572/1 (Waymouth. Se puede incrementar la viscosidad. 8 Medio L-15 de Leibovitz. El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol. Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. 8 RPMI 1640. (Morgan y col. 1950) o CMRL 1066 de Parker y col.Cultivos Celulares www. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: 8 Medio Basal de Eagle (BME). suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir. y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO2.0 a 7. debe estar a concentración doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3. especialmente en medios libres de suero. La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor. La tensión superficial se ha de mantener baja. añadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch y Pitch. o bien preparar el medio completo. Se necesita siempre la suplementación con suero bovino fetal al 10 %. 1971). 8 McCoy 5A. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10%). También sirve para otros tipos celulares. dejar equilibrar en la estufa y después ajustar el pH. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%. Utilizado para el cultivo de virus. Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células. 8 Temperatura. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en éstos casos se produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. por ejemplo Ham F12.4. Documento de Aplicación Page 14 of 31 . 8 Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Influye asimismo en el pH del medio. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle. 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato. amarillo a pH 6. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT. El medio de cultivo debe estar tamponado. a fin de evitar los cambios bruscos de pH. 1973). La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico. 1965). Hacen referencia a la composición del medio. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. células epidérmicas pueden ser mantenidas a pH 5. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización.2 unidades por debajo del óptimo. de ahí la importancia de un buen control de ésta en la incubación.4 y 7.3).5. pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. contiene más aminoácidos y en mayor concentración que el BME. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. a pesar de su escasa capacidad tamponadora. Es el medio de uso más corriente.6 y púrpura a pH 7. hidrolizados de proteína o sueros. 8 Viscosidad. selenito. A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109 (Evans y col. azul-rojo a pH 7. incluso suero. 1956).

Contiene metales como Fe. Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos: 8 Soluciones salinas equilibradas (BSS). El medio MEM sólo suplementa con vitaminas del grupo B. Es recomendable el uso de MEM(S). o PBS de Dulbeco o Vogt (PBSA). 8 Aminoácidos. Debido a su escasa capacidad tamponadora se recomienda suplementarlo con HEPES para pH en el rango 7. 9 su uso en la disgregación de tejidos o monocapas. aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. 9 cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. Una solución salina equilibrada es una mezcla de sales inorgánicas.cultek. Es la fuente de energía en muchos medios. CMF. 9 si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente estos procesos. FCS). 8 Hormonas y factores de crecimiento (suero). 8 Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular.Cultivos Celulares www.4 a 8. 9 si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías. El más usado es el suero de ternera. lípidos. siendo los demás grupos aportado por el suplemento de suero.com 8 Medio F-10 de Ham. En los medios no definidos suele aportarlos el suero.. La utilización de suero es problemática pues: 9 a pesar de que la composición del suero es conocida. suero de caballo ("horse serum". mientras que el suero bovino fetal es usado en líneas más exigentes. y suplementada con glucosa. a pesar del almacenamiento a baja temperatura. lo que complica el almacenamiento e incrementa los costes. piruvato. En estos casos la mayor parte del CO2 parece proceder de un uso de la glutamina/glutamato. La concentración de bicarbonato deberá permitir el equilibrio a pH 7.) 9 el suero varía de lote a lote. lo que representa un grave peligro para el cultivo. Se usan para diluir medios más completos. Su elección dependerá de: 9 la tensión de CO2. Para el crecimiento de líneas celulares humanas. Zn. 8 Glucosa. CF). Un suplemento común es el de glutamina. y no requiere aporte de CO2 en la fase gas. probablemente deteriorándose a lo largo de ese tiempo. 8 Medio F-12 de Ham. La limitación de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular. o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente. lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados. Son recomendables los medios de Moscona. Es útil para el cultivo de células amnióticas. Documento de Aplicación Page 15 of 31 . Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero. y cada uno se puede emplear como máximo 1 año. como medio de disección o lavado. Asimismo se suplementa con otros aminoácidos. incluyendo usualmente bicarbonato sódico. HS) y suero humano ("human serum". intermediarios del ciclo de Krebs.8 y Tricina en el rango 7..2 a 7. 9 algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos. La adición de piruvato en el medio permite al cultivo incrementar su producción endógena de CO2 haciéndole independiente de la aportación exógena de éste. Metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs. Útil para el crecimiento de líneas celulares son suplementos proteínicos. factores de crecimiento.. y genera CO2. 9 crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad requerida. y el suero humano en líneas humanas. y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado. HuS).5ºC. existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables en éste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas. La acumulación de ácido láctico en el medio propio de células embrionarias y transformadas parece indicar un funcionamiento diferente del ciclo de Krebs en estas células respecto al modelo in vivo. En medios más definidos se suplementan todas las vitaminas. a 2 mM final. pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. 8 Medio 199. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Dependiendo del medio. 9 el suero está contaminado con desgraciadamente demasiada frecuencia por virus y micoplasmas. 9 su uso para el cultivo en suspensión o de células en monocapa. El medio de Leibovitz L15 contiene una concentración superior de piruvato y no contiene bicarbonato sódico..54 a 36. no más de 1 semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4ºC). variante de MEM sin Ca2+ que reduce la agregación celular y la adherencia. La glutamina es inestable en el medio. debe ser suplementado con proteínas y hormonas. 8 Vitaminas.. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum".0. suero bovino fetal ("fetal calf serum". Así BSS-Eagle es más usada para 5% CO2 y BSS-Hank (HBSS) es usado a la tensión atmosférica normal. Cu. éste incluye en su formulación nucleósidos. En ese caso deberán carecer de Ca2+ y Mg2+.

). hidrocortisona. Por ello se realizan importantes esfuerzos para la definición de medios definidos para el crecimiento celular. así como que en muchos casos el crecimiento de las células en estos medios es menor. Combinación anti-microbiana y anti-fúngica. Después de la tripsinización de un cultivo el exceso de actividad tríptica se inhibe por la adición de suero al medio. 9 nutrientes: Fe. además de la reproducibilidad buscada. Esto. Asimismo se han aislado otros factores con mayor especificidad de acción. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo. . 9 factores de crecimiento peptídico. 9 proteínas y poliaminas. A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. Cu. tales como hormona de crecimiento. La inclusión de albúmina bovina añade indefinición al medio. Combinación anti-microbiana. 9 Anfotericina-B (2. Antifúngico y antilevaduras. T3. y se cree que puede tener actividad mitogénica.). 9 Gentamicina (50 μg/mL). PDGF ("Platelet Derived Growth Factor") y MSA. Para conseguir reemplazar el suero completamente de un medio será necesario reemplazar: 9 los factores de adhesión como la fibronectina. EGF ("Epidermal Growth Factor").cultek. El complemento hormonal dependerá especialmente del tipo celular. La adición de antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. a pesar de que los fundamentos de su función son desconocidos en muchos casos. 9 inhibidores de proteasas. o bien el tratamiento de las placas con poli-lisina (1 mg/mL) antes de la siembra. Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos. En la actualidad se han identificado algunos polipéptidos de actividad mitogénica: FGF ("Fibroblast Growth Factor"). y otros minerales. Tienen como desventaja la gran cantidad de esfuerzo necesario para su definición.. 8 Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos).com En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarización de protocolos experimentales y de producción. A fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend (NEN). 9 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/mL) / Fungizona. conviene ir alternándola con la penicilina-estreptomicina.. Las mezclas de uso más común son: 9 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/mL). permite establecer medios selectivos en los que crezca el tipo celular deseado. En ausencia de éste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina de soja. Documento de Aplicación Page 16 of 31 . Células crecidas en medios libres de suero requieren el suplemento de fibronectina (25-50 μg/mL) o laminina (1-5 μg/mL) en el medio. 9 hormonas. Ventrex (Ventrex Lab Ltd. FSH.. Transferrina (10 ng/mL) se requiere como portador de Fe. Anti-microbiana. Nu-serum (Collaborative Res. y con un rango amplio de actividad. .5 μg/mL). las líneas finitas permanecen viables menos generaciones. por ello se recomienda el uso de BSA libre de ácidos grasos (usualmente a 1-10 mg/mL). Putrescina se usa a alrededor de 100 nM. Se.Cultivos Celulares www.. dexametasona. así como el hecho probable de que la adaptación del cultivo al medio libre de suero supone un tipo de selección per se.

Los efectos dependen de la especie implicada. Asimismo se utilizan cócteles de sustancias antimicrobianas y antifúngicas en el medio aunque en multitud de ocasiones no es posible usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparición de microorganismos. Otras especies no producen la muerte celular pero retardan el crecimiento celular. No existe un test único capaz de detectar todos los contaminantes. Así las especies M. • Contaminación por micoplasmas. añadidos en los cultivos a corto plazo de forma habitual no son recomendables en los cultivos a largo plazo. tanto las bacterias como las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. por hongos y levaduras. y los procedimientos habituales de manipulación (abertura de recipientes. 8 si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Sin embargo.5 μm de diámetro) que pueden formar pequeñas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumonía bovina (de ahí su nombre de "pleuropneumonia-like organisms". Así por ejemplo M. pipeteado. Se citan datos de que alrededor del 50 al 95% de las células utilizadas actualmente están contaminadas con micoplasmas. No poseen pared celular y por ello sólo son capaces de crecer en ciertos medios. Así es recomendable comprobar el estado de contaminación de cualquier tipo celular antes de introducirlo en las salas donde se trabaja con otros tipos celulares. Para evitarlo se utilizan una serie de técnicas de trabajo que suponen la máxima asepsia. 8 usar pipeteadores automáticos y pipetas automáticas. Una observación cuidadosa de las células en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas: aparición de gránulos oscuros en el citoplasma. M.salivarum se pueden aislar de la boca y la garganta humana.cultek. Los micoplasmas son células procariotas pequeñas (0.hominis parece retardar el crecimiento del cultivo pues consume toda la arginina presente debido a su elevada actividad arginina deaminasa. Existen varios grupos serológicos de micoplasmas de dos géneros (Mycoplasma y Acholeplasma). Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas.arginini o de la tripsina de cerdo contaminada con M. sino aquellos otros de crecimiento lento y que no se producen cambios apreciables en el cultivo.laidlawii y M.. Los contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.mycoides son patógenos pero son poco frecuentes.. La fuente más frecuente de contaminación es la atmósfera.orale (humano). la mayor fuente de contaminación procede del uso de cultivos contaminados. Uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de tejidos en general es el de las contaminaciones. A continuación se detallan algunas de las técnicas usadas en la actualidad para la detección de los micoplasmas: Documento de Aplicación Page 17 of 31 .hyorhinis (cerdo)..Cultivos Celulares www. Las precauciones a tomar serán: 8 trabajo en ambiente estéril. Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el crecimiento de los contaminantes microbianos. mientras que A.gallisepticum y M. Los requerimientos de los micoplasmas son complejos y sólo crecen en medios donde hay células en crecimiento. Parece que requieren los productos de degradación de ADN celular. 8 mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible. Los tipos de contaminaciones más frecuentes son por bacterias. PPLO). pero muchas de las líneas celulares continuas están infectadas.pharyngis y M. 8 ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable. De todas formas no es fácil reducir a una lista las precauciones a tomar y la única forma de aprender es practicar bajo supervisión. con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a las 24 h. Dado que la contaminación con micoplasmas no es tan evidente como la contaminación por bacterias o levaduras es importante por una parte tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre el cultivo. Si se da el caso de una contaminación por estos organismos pueden provocar la muerte del cultivo en poco tiempo. por micoplasmas y por virus: • Contaminación bacteriana y por levaduras.com Las contaminaciones.laidlawii (bovino y también de roedores).) son susceptibles de provocar contaminación por bacterias. Para evitar las contaminaciones por bacterias es necesario extremar las condiciones de esterilidad y realizar una serie de controles sobre las soluciones y recipientes a usar. así como la esterilización del material y el trabajo en ambientes estériles (cabina de flujo laminar). o reemplazarlo si es posible. 8 todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un baño deben secarse cuidadosamente antes de usarlas..laidlawii destruye rápidamente los desoxirribonucleótidos. y en un cultivo infectado es realmente difícil realizar medidas de incorporación de timidina tritiada pues ésta es rápidamente convertida a timina.hyorhinis. M. A pesar de que M. Los controles de esterilidad están diseñados para detectar no aquellos contaminantes de crecimiento rápido y que producen cambios notables en el medio de cultivo pues estos se detectan fácilmente incubando alícuotas de medio en la estufa durante 24 o 48 h.. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación UV. pues los nucleósidos son factores de crecimiento esencial para los micoplasmas. y realizar controles periódicos de su presencia. Las células eucariotas en cultivo crecen lentamente.hominis. La contaminación suele proceder de suero animal contaminado con A. M.arginini (bovino) y A. Los antibióticos.3 a 0. Si no se dispone de estos nunca pipetear directamente con la boca sino mediante un tubo de goma y intercalando algodón en la boca de la pipeta. en una cabina de flujo laminar o en el área de influencia de un mechero bunsen.

pero aún cuesta 10 veces más que el ensayo de Hoechst. 9 sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 mL de citrato sódico 0. Esta técnica detecta el DNA de los micoplasmas pues el colorante (Hoechst 33258 o 33532.cultek. Un cultivo contaminado muestra señal autoradiográfica fuera del núcleo por efecto de la degradación de la timidina a timina propia de muchos micoplasmas. Todos los micoplasmas presentan gran actividad del enzima adenosina fosforilasa. 9 sembrar las células sobre cubreobjetos de modo que no hayan alcanzado la confluencia en 24 h.6% y añadir lentamente 1 mL de agua. Es el caso del Método directo de cultivo que propone ATCC en su servicio de detección de micoplasmas. 9 montar en DPX. 8 Sonda DNA para micoplasma. 9 teñir 10 min con orceína. capaz de convertir 6-MPDR (no tóxico) en 6-metil purina y 6 metil-purina ribonucleósido. Es una sonda de DNA tritiada capaz de reconocer el RNA ribosomal de micoplasma en cultivos celulares. Dejar 10 min y añadir lentamente 4 mL de fijador de Carnoy (1:3 acético:etanol). Cultivo negativo a micoplasmas (ATCC) Cultivo positivo a micoplasmas (ATCC) 8 Test de crecimiento para micoplasmas. 33217 o DAPI. Existen sistemas de cultivo de micoplasmas de gran sensibilidad que permiten detectar la presencia de pequeñas cantidades de contaminante. 1968). Se emplea la misma técnica de tinción que para la tinción nuclear. 9 dejar fijar durante 10 min. observar con el microscopio de contraste de fase. Dejar secar. 1982). Supone obtener un lisado Documento de Aplicación Page 18 of 31 . Sacar todo el líquido y reemplazar por 2 mL de fijador de Carnoy. 8 Autoradiografía de cultivos incubados con timidina tritiada.Cultivos Celulares www. 8 Tinción fluorescente con Hoechst 33258. Es muy sensible. o el DAPI) se une específicamente al DNA. ambos tóxicos para las células de mamífero (McGarrity y Carson. y lavar 3 veces con etanol absoluto. El efecto letal de la contaminación por micoplasmas sobre el cultivo puede acentuarse mediante la adición al medio de 6-metilpurina desoxirribonucleósido (6-MPDR). Este cultivo sin embargo tiene como gran limitación los 28 días que precisa.com 8 Tinción con orceína (Fogh y Fogh. Las células contaminadas muestran los micoplasmas preferentemente en el borde celular y en los espacios intracelulares.

Cultivos Celulares www. 1960). M. En el caso de cultivos de líneas tumorales se ha revelado como especialmente útil la inoculación a un animal de experimentación y la recuperación posterior.orale. (95ºC 1 min. En el laboratorio se emplea un método de detección mediante PCR que se basa en el descrito por Wong-Lee y Lovett (1998). pero los más peligrosos son aquellos que crecen a baja tasa o en unas pocas células tan sólo. Los virus pueden tener un efecto citopático marcado. cuando solo unas pocas células muestran inmunofluorecencia positiva (Henle y Henle.cultek. Empleando una sola pareja de cebadores correspondientes al RNA 16s de 8 especies de micoplasma (M. 1988).pneumoniae. • Contaminación por virus. M.1 mg/mL) previene el crecimiento del micoplasma (Fogh y Hacker. como ciprofloxacina (Schmitt y col. Las quinolonas inhiben la DNA girasa procariota. Protocolo: 9 Secuencias de los cebadores: ª Mico1: GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG ª Mico2 : CGG ATA ACG CTT GCG AC TAT G 9 Concentración de trabajo de los cebadores 10 pmol/μL 9 Condiciones de PCR: 95ºC 1 min. no muestran señales de EBV en cultivo hasta varios pases. producido por EBV (Epstein-Barr virus). La manera más eficaz de detectar la infección por virus es infectar un animal sensible y seguir la aparición de efectos citopáticos. Documento de Aplicación Page 19 of 31 . 1966). M. Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirum). Así. si el cultivo es reemplazable. como el producido por la ATCC que permite detectar 5 especies de micoplasmas responsables del 95% de las contaminaciones. Para ello hay varias posibilidades: 8 Tratamientos antibióticos.30 min) 35 ciclos. y se han comercializado kits. El sistema inmune del animal limpia el cultivo de micoplasmas. Asimismo son efectivos contra micoplasmas las quinolonas. eliminarlo.com celular al que se añade la sonda de DNA. El tratamiento del cultivo con sueros anti-micoplasmas se ha revelado como efectivo. se hibrida a 72ºC durante 1 h. 8 Pase por un animal.hyorhinis.0 μg/mL). 8 Detección de micoplasmas mediante PCR. Se ha descrito que la kanamicina (0.arginini. en general se recomienda. esterilizar todo y volver a empezar. Desde que se descubrió que el suero bovino podía ser una fuente importante de contaminación por diferentes virus (herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente. así como la tylocina (6.. M. 72ºC 1. y MRA. 55ºC 1 min.fermentans.5 kb Para la eliminación de los micoplasmas.pirum. Por ello la única alternativa es el uso de medios libres de suero. Se han propuesto diversos métodos para la detección de micoplasmas mediante PCR. 8 Tratamientos con sueros inmunes. M. Sólo cuando el cultivo es irreemplazable o importante se recomienda proceder a su eliminación en el cultivo. pero costoso. se precipita y se lava el híbrido DNA/RNA y se cuenta la cantidad de radiactividad retenida. en células de individuos con linfoma de Burkitt. La contaminación viral es un problema grave pues su prevención y eliminación es realmente difícil. aunque la validez de estos ensayos es limitada. 4ºC mantenido 9 Tamaño esperado 0.

000 ⋅ 4 En la imagen se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0. Es un cuadrado de 3 × 3 mm. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. la concentración en la suspensión celular será: x Concentración en la suspensión (células/mL) = 10. y un microscopio. Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas. La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen.1 mm respecto a la superficie. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases. independientemente de su forma. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Una pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión.Cultivos Celulares www. El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio.25 milímetros de lado. es decir 0. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje.1 milímetro. Controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo. la cámara de Neubauer. de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.com Técnicas de contaje celular Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Sin embargo. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado.cultek. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Documento de Aplicación Page 20 of 31 . hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter". desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes. con una separación entre dos líneas consecutivas de 0. Nos basta con una cámara de contaje celular.1 microlitro. entre ellas la cámara de Neubauer. por ej. color y densidad. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 milímetro cúbico. y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.

son consideradas no viables.Cultivos Celulares www. En la imagen se puede observar una cámara de Neubauer doble: Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. Así pues las células que aparecen en la imagen. claramente de color azul. determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. El más común es el de tinción con azul tripán. En la imagen se han representado células vivas como puntos blancos y células muertas (teñidas con azul tripán) como puntos azules. Documento de Aplicación Page 21 of 31 . por exclusión. Corresponde a una de las áreas de contaje de la cámara de Neubauer (1 mm2). a células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión. Asimilar células blancas. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana.cultek.com Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopía. Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.

Documento de Aplicación Page 22 of 31 . • Prelavado con PBS. picar. En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar las células adheridas. En cualquier caso se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares.25% y colagenasa 200 Cultivos gruesos formados por múltiples capas de células. hialuronidasa.) Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres métodos.). aunque algunas pueden ser sensibles a mL/5 cm2 EDTA • Prelavado con EDTA. Hay que tener presente la posible toxicidad del EDTA.01-0. • Químicos. dispasa. A continuación se muestra una clasificación de métodos de disgregación celular clasificados según una severidad creciente: • Agitación (sacudidas a la placa)..1-1 mg/mL) o pronasa (0. y muchas líneas celulares a pases bajos. Tripsina 0. Generalmente los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías: • Mecánicos (por ejemplo cortar. 1 Células epiteliales. Algunas líneas celulares que se adhieren fuertemente. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa. tripsina. • Añadir dispasa (0.25% en PBS. 37ºC.1-1 mg/mL) al Suspenderá la mayor parte de las células. • Enzimáticos. papaína. • Prelavado con EDTA 1mM. elastasa. etc. 37ºC.com Métodos de disgregación de células en placa La disociación tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que es necesario separar las células entre sí y de un sustrato manteniendo la viabilidad celular. Puede ser dañino para algunas células. 5 a 15 min. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. etc.. rascar.25 % en PBS. centrifugación de la suspensión para eliminar el enzima no inactivado por el suero. • Rascar (“scrapping”) Todos los cultivos. pero requiere la medio hasta que las células desadhieran. 37ºC. • Prelavado con EDTA 1mM. especialmente epiteliales y algunas tumorales. Algunas células en pases bajos fuertemente adheridas.25% con EDTA Células fuertemente adheridas. Para conseguirlo es necesario romper la malla de proteínas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las moléculas proteicas de la matriz extracelular (por ej. aunque puede producir daño mecánico y usualmente no produce una buena suspensión celular. dejando en EDTA 1 mM.cultek. cribar. Tripsina 0. Tripsina 0. La elección de uno u otro procedimiento dependerá fundamentalmente de la naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las células obtenidas. Se separan las células que están en mitosis y las adheridas ligeramente.Cultivos Celulares www. secuestrando los iones calcio que permiten la unión)..5%) en PBS. o bien rompiendo proteolíticamente (mediante la acción de proteasas) las mismas proteínas.. La mayoría de las líneas celulares. • Tripsina (0. Tripsina 0. pronasa. • Dos lavados con EDTA 1mM. U/mL en PBS o EDTA/PBS especialmente en cultivos productores de colágeno.

El aire sale siempre estéril. El flujo del aire es laminar. En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho se encuentran los siguientes tipos de instrumentos: • Las cabinas de flujo laminar. y.com El laboratorio de cultivo celular.. La característica principal que define al laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia. 8 Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes. y por ello para el mantenimiento del cultivo será vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo indeseado. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99. Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto. generando un déficit de presión en el interior de ésta. más sofisticadas. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos. como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas.. levaduras.) que puedan acceder al cultivo. especialmente de posibles contaminantes (bacterias. alejada de las vías de paso y a ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de células. experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina. A fin de evitar la salida accidental de éstos agentes se filtra el aire que sale de la sala. se segura una buena protección del producto.cultek. • el laboratorio de cultivo con patógenos supone un nivel de contención superior. Esto define dos tipos de contención y de área de trabajo diferentes: • el laboratorio de cultivo de tejidos general. El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila. para la manipulación de cultivos no patógenos se instalará preferentemente en una sala aislada y a la cual se le suministrará aire filtrado (normalmente mediante un equipo de filtración y regulador de la temperatura). Las necesidades de asepsia dependen del tipo de material que se va a procesar en el laboratorio.Cultivos Celulares www. generadores de intensas corrientes de convección. Su función es la de mantener un área libre de partículas. dependiendo de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. La tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos. bacterias y micoplasmas. En las cabinas de flujo vertical. pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto.999% retiene las partículas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0. desde el medio exterior o laboratorio general al interior de las cabinas de flujo donde se manipularán los cultivos y del incubador donde se mantendrán.2μm. 8 Protección del producto. levaduras. Documento de Aplicación Page 23 of 31 . sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. La solución ideal es disponer de una habitación aislada.. Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del área de trabajo pero aún así es recomendable mantener un gradiente de esterilidad. Esto produce un aumento de presión atmosférica en el interior del laboratorio (típicamente entre 15 y 20 mm de Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al área limpia. Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes propósitos: 8 Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina.

Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la protección del usuario. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ella se recirculariza sólo el 30% del aire en cada ciclo. especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el sistema y de flujo vertical.cultek.com Cabina de flujo laminar horizontal Cabina de flujo laminar vertical Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata de cabinas de clase I. donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases: 9 Tipo A. En este tipo el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado. eliminándose el 70% del aire restante. no retenibles por el filtro HEPA. 8 Cabina de clase I. La tipo A. 9 Tipo 100% exhausto. El punto de calibración o ajuste es dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la protección al usuario. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la protección del producto y del personal depende de una correcta calibración del instrumento. 8 Cabina de clase II. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior. y a la eliminación de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol.Cultivos Celulares www. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo riesgo. Este tipo de cabinas protegen el producto. Se trata de una cabina en la que el 100% del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos. que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables) es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos. al personal y al medio ambiente. superior en el caso del tipo A. II o III. y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases". 9 Tipo B. Documento de Aplicación Page 24 of 31 . con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio).

estanca.Cultivos Celulares www. Se trata de una cabina de seguridad. Documento de Aplicación Page 25 of 31 . Permite mantener al agente patógeno en un ambiente completamente estanco.com 8 Cabina de clase III. para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de éstos.cultek.

.. Es conveniente no cultivar en el mismo incubador cultivos primarios con líneas celulares estables. pero en ese margen presentan importantes variaciones en su tasa de crecimiento. y por ello suelen estar equipados con camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia térmica. capaces de regular la temperatura de incubación con gran precisión. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas. pues los primeros son una importante fuente de contaminación. 8 dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2. o eliminarlos inmediatamente. La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador. Un incubador moderno dispone de: 8 dispositivos de control de temperatura. Esto es en la actualidad innecesario en los incubadores modernos. Algunos autores sugieren incorporar asimismo un factor de seguridad a la temperatura de incubación.. entre el 4 y el 7%. Las células procedentes de animales poiquilotermos soportan mejor un amplio rango de temperaturas de incubación. 9 la especie y el tipo de células a cultivar. con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía. cercano al valor de la temperatura corporal pero un poco inferior para mayor seguridad. desinfección periódica del incubador.5ºC) que su precisión a fin de mantener a las células en condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de calibración que se produce periódicamente.) con la excepción del incubador de CO2. Como consecuencia la estabilización de un incubador puede tardar varios días. Para determinar el número y tipo de los incubadores requeridos se tendrá en cuenta: 9 el tipo de cultivos a realizar: primarios o de líneas celulares estables. Así pues las células humanas soportan incubaciones a 4ºC durante días y pueden ser congeladas a -196ºC durante años (con sustancias preservantes). • Incubador de CO2. Por ejemplo para la incubación de células humanas sugieren el cultivo a 36. En un incubador de células es por tanto más importante la consistencia de la temperatura (invariabilidad durante prolongados periodos de tiempo. baños termostatizados. Sin embargo no sobreviven más de unas pocas horas a variaciones de 2ºC por encima de 37ºC. Por ello se deben usar incubadores con movimiento de aire forzado en el interior. siempre que sean por debajo de la temperatura corporal del animal del que proceden. Para evitarlo Documento de Aplicación Page 26 of 31 . En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cámara de incubación.5 ºC. en la proporción deseada. cultivos contaminados en el incubador. Las necesidades de asepsia en el incubador son considerablemente menores que en el área de trabajo (cabina de flujo laminar) pero sin embargo es muy recomendable mantener una estricta limpieza. y del incubador con "roller". Las células en cultivo son capaces de soportar sin daños importantes variaciones de temperatura. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer"). Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los laboratorios de biología (estufas. con oscilaciones inferiores a 0. y se mezcla en el dispositivo de inyección. Así pues serán necesarios tantos incubadores como diferentes temperaturas de incubación se precisen.cultek.com • Incubadores. El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2. y especialmente no introducir. Es importante la determinación exacta de la temperatura de incubación para la que se tendrá en cuenta la temperatura corporal del animal del que proceden las células. y realiza las correcciones necesarias. así como cualquier variación regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura inferior).Cultivos Celulares www. y colocar los contenedores de células sobre estanterías agujereadas y nunca sobre el fondo o las paredes del incubador. Las células de homeotermo suelen crecer bien entre 33ºC y 37ºC.

Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes.Cultivos Celulares www. en el interior del cual se ha instalado un "rotor" de baja velocidad.com algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor determinado de CO2). humedad atmosférica y niveles de CO2) son características de cada línea celular. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos días en caldos de cultivo. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Las condiciones del cultivo (temperatura. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada. La finalidad es disponer de una gran superficie para la adhesión de las células. En estos instrumentos se incuban las células en el interior de “roller bottles”. botellas con una gran superficie de crecimiento. Se trata de un incubador o estufa. inyectando agua estéril y filtrada. En los instrumentos más modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica. • Incubadores tipo "roller". habitualmente al 5%.cultek. Incubador tipo “roller” “Roller bottles” Documento de Aplicación Page 27 of 31 . Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas (no requieren CO2). Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador. a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. 8 dispositivo de control de la humedad ambiente. a fin de reducir la evaporación de agua del medio de cultivo. y se asegura la esterilidad del ambiente. 8 dispositivo de recircularización de aire.

cultek... antibióticos.). PBS.. colagenasa.. • Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido). es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina.Cultivos Celulares www. mitógenos. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm en el caso de frascos de Roux de 250 mL) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal).. Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas. glutamina. Documento de Aplicación Page 28 of 31 .). 8 congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero.. para el almacenamiento de las líneas celulares. por lo que se han desarrollado microscopios de diseño original..) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento. inductores. La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color. El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional. para lo que se requiere: 8 neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios. Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes.. 8 unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC). 8 congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero. De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior. fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos. . Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio. aditivos (glutamina.com • Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido... El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo)..

22 μm. La esterilización se realiza habitualmente a 121ºC. La esterilización por gas.com • Equipo de esterilización: autoclave y equipo de filtración. tubos. autoclavado. En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril muy recomendables para el trabajo rutinario. o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad de filtración hermética. 8 Equipos de filtración. y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio.. a los medios líquidos o sólidos. pinzas.. La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo. por ejemplo hospitalarias o industriales. su elevado coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables. En ambos casos la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro 0. y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su manipulación (pipetas. filtración. Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacío conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado. 1 atmósfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min. puntas de pipeta automática... Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. Sin embargo.).cultek. En el laboratorio general de cultivo de tejidos se suele disponer de: equipo de filtración y autoclave. instrumentos quirúrgicos. material variado de vidrio. 8 Autoclave.)...Cultivos Celulares www.. de variada naturaleza se emplean una serie de métodos: irradiación con radiación gamma o rayos X. y la irradiación son técnicas propias de grandes instalaciones. Para esterilizar todo este material. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión. Documento de Aplicación Page 29 of 31 . esterilización por gas. tubos..

El sistema está formado por los siguientes elementos: 9 dos electrodos. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics. y a pesar que posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en día el mecanismo más empleado. uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas a contar. pipeteadores. para evitar las turbulencias de aire que genera. y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión.. El tubo con el orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. La centrífuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar. El manómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexión y desconexión de los electrodos. 8 Centrífugas. 9 un amplificador electrónico de la señal. 8 Contador electrónico de células ("cell counter").Cultivos Celulares www.. o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamaño pequeño (por ej. balanzas. o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso más general (centrífugas. el contador electrónico de células). Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Documento de Aplicación Page 30 of 31 . En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada.). para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 × g. conectados a los electrodos. equipo de purificación de agua.cultek. un analizador de altura de los pulsos. Además del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros instrumentos que. • Otros instrumentos. pH-metro. y una escala. preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 mL) a botellas de gran capacidad (250 a 500 mL). Normalmente.com 8 Mechero Bunsen.

Cultivos Celulares www. manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta.cultek.com Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0. Estos datos se registran y se analizan. una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Es muy importante la eliminación de apirógenos. El aire bombeado es filtrado previamente. 8 Pipeteadores. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño.5 mL de la suspensión entran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo. Durante ese tiempo los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Pipeteador automático Sistema de aspiración de líquidos Documento de Aplicación Page 31 of 31 . y restos de materia orgánica. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador. de los aditivos. 8 Equipo de purificación de agua. Es de gran importancia en la preparación de los medios. Los de uso común en el laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas.