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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

2012
BIOTECNOLOGA

Chacaltana Lozano Carlo

PROFESOR: M.Sc. Jos Gavidia Valencia


20/02/2012

Biotecnologa A. H. Scragg La federacin Europea de Biotecnologa defini a la biotecnologa como el uso integrado de la ingeniera, la bioqumica y la microbiologa para conseguir la aplicacin tecnolgica (industrial) de la capacidad de los microorganismos, clulas de tejido cultivado y sus partes. En resumen la biotecnologa es la aplicacin de agentes biolgicos ya sea en la industria manufacturera o en operaciones de servicio. El termino biotecnologa puede significar que se trata de una disciplina individual, pero la esencia de la biotecnologa en su naturaleza multidisciplinaria, la cual requiere amplias aportaciones de la ciencia y la ingeniera. Esto quiz se ilustre mejor en la figura 1.1 es debido a estos requerimientos multidisciplinarios de la biotecnologa que este libro, y el curso del cual se derivo, se diseo para presentar el tema a los ingenieros quienes por lo general tienen muy poco contacto con la biociencias. La terminologa propia de cualquier materia puede ser obstculo para entenderla. A menudo se piensa que la biotecnologa consiste solo en la ingeniera gentica y anticuerpos monoclonales. Tener una definicin tan simple sera un error puesto que ignora la mayor parte de la biotecnologa, incluyendo algunas de las reas ms exitosas. En la tabla 1.1 se da una lista con ejemplos de algunos productos se la biotecnologa. En contradiccin con la creencia popular, la biotecnologa no es un tema de creacin reciente, sino que data de los sumerios y los egipcios, 6000 a 4000 aos antes de Cristo. La escala de tiempo en evolucin de la biotecnologa se ilustra bien en la tabla preparada por Howink (1984), la tabla 1.2. la evolucin de la biotecnologa se puede dividir en cinco eras. 1.1 LA ERA ANTERIOR A PASTER Esta se basaba en los alimentos y bebidas fermentadas tradicionales sin ningn conocimiento de biologa. La produccin de cerveza fue producida por los sumerios hace aproximadamente 6000 aos a. C. fueron los chinos quienes inventaron la destilacin en el ao 14 d. C. para la produccin de bebidas con alto contenido de

alcohol. El uso de levaduras para formar dixido de carbono y, as, esponjar el pan, se introdujo tambin en Egipto 4000aos a. C. en esta poca se crearon otros usos de los microorganismos, en la formacin del acido actico a partir del etanol (vinagre), la elaboracin de queso y yogurts. Sin embargo, no fue sino hasta el siglo XVII, que Antonio van leeuwenhoek demostr por primera vez la presencia de microorganismos.

Tabla 1.1 Ejemplos de productos de diferentes categoras en la biotecnologa (segn Cooney, 1983). Masa celular Componentes celulares Levadura de Baker, protena celular. Protenas intracelulares.

Productos biosintticos Productos catablicos Bioconversin Tratamiento desechos

Antibiticos, vitaminas, aminocidos, cidos orgnicos. Etanol, metano y acido lctico. Jarabe de maz rico en fructosa, acido 6 amino penicilanico.

de Lodo activado, digestin anaerobia.

Tabla 1.2 Biotecnologa calendario de eventos (segn Houwink, 1984) La era prepasteur, antes de 1985 Bebidas alcohlicas (cerveza y vino) Productos lcteos (queso, yogurt) Otros alimentos fermentados La era de pasteur, 1865-1940 Etanol, butanol, acetona, glicerol cidos orgnicos (acido ctrico) Tratamiento aerobio de aguas residuales La era de los antibiticos, 1940-1960 Penicilinas: tecnologa de la fermentacin sumergida Gran variedad de antibiticos Tecnologa de la estructura de la clula animal, vacunas contra virus Transformaciones microbiolgicas de esteroides La era post antibiticos, 1960-1975 Aminocidos Protena celular (SCP) Tecnologa de las clulas y las enzimas inmovilizadas (glucosa isomerasa) Tratamiento anaerobio de aguas de desecho (biogas) Polisacridos bacterianos (goma de xantn) Gasohol La era de la nueva biotecnologa 1975-

Tecnologa de los hibridosomas: anticuerpos monoclonales Prueba diagnstica con anticuerpos monoclonales (1980) Ingeniera gentica (1974) Vacuna de origen animal contra la diarrea (1982) Insulina humana (1982)

1.2 LA ERA PASTEUR El trabajo de Pasteur mostro por primera vez que los microoranismos eran los agentes activos en procesos como la produccin de cerveza, vino y la descomposicin de los alimentos. A este trabajo lo secundaron escasos progresos en el estudio de los microorganismos hasta el comienzo del siglo XIX, cuando se introdujeron los procesos microbiolgicos para la produccin de acetona, butanol, glicerol y acido ctrico. Quiz fue el descubrimiento de weizman, realizado en 1913-1915 en manchester, de un proceso microbiolgico para la produccin de acetona y butanol por clostridium acetobutylicum, el que anunci el comienzo real de la biotecnologa. Este proceso solo se optimizo en los aos 50. Otro proceso importante creado en manchester fue el uso de lodos activados para tratar aguas negras, el cual comenz en 1914. La primera guerra mundial impulso la produccin microbiolgica del glicerol a partir de la glucosa en Alemania.

1.3 LA ERA DE LOS ANTIBIOTICOS La investigacin entre 1920 y 1940 gradualmente dio como resultado una mejor comprensin de la biologa, y se reconoci a las enzimas catalizan los procesos biolgicos. As mismo, los estudios en gentica introdujeron el concepto de que genes individuales llevan informacin para formar enzimas particulares. Aunque Flemming descubri la penicilina en 1928, no fue sino hasta 1940 que los avances en su aislamiento permitieron su produccin en masa. Al principio la penicilina se produjo en botellas, pero se aplicaron las tecnologas de los procesos qumicos y de los alimentos, las cuales permitieron que por primera vez el cultivo en gran escala de Penicillum en fermentadores o birreactores. En la actualidad, cada ao se producen unas 12 000

toneladas de penicilina. A la produccin de penicilina le siguieron una amplia variedad de antibiticos como la estreptomicina y la eritromicina.

1.4 LA ERA DE LOS POSTANTIBIOTICOS Durante este periodo el reconocimiento del metabolismo microbiano permiti una explotacin mucho ms amplia de las capacidades de una variedad de microorganismos. Estos se usaron para producir las vitaminas B2 B12 y los aminocidos lisina y acido glutamico (glutamato monosodico), los ltimos en volumen de 30 000 y 40 000 toneladas, respectivamente. Esta era tambin presencio la produccin masiva de enzimas para uso industrial, como la adicin de las proteasas a los detergentes domsticos y la transformacin enzimtica de la glucosa a fructosa para producir un high-fructose syrup, HFS jarabe rico en fructosa. En los inicio de los aos sesenta se estuvo de acuerdo en que habra escases de protenas, en particular en los pases de tercer mundo. Entonces, se buscaron otras fuentes de protenas; estas incluyeron microorganismos como algas, bacterias y levaduras. En 1964 el profesor Wilson del instituto de tecnologa de Massachusetts (MIT) acuo la palabra single-cell protein, SCP protena celular para denominar las protenas microbianas. Los microorganismos tienen la capacidad de crecer en una vasta composicin de compuestos. Estas fuentes se dividen en dos grupos principales, renovables y no renovables. Los recursos renovables son mucho de los productos de desechos agrcolas como el bagazo (residuo de la caa de azcar), el almidn y la celulosa. Muchas compaa grandes, participaron en la creacin de estos procesos. La mayora de las investigaciones se enfoco al mejoramiento de estos desechos agrcolas para producir alimentos para animales, pero una compaa, la Rank Hovis Mcdougall, procedi a cultivar un moho para producir un alimento para humanos. Tuvieron que pasar 20 aos para asegurarse de que el producto conocido como microproteina fuese apto para el consumo humano. Las fuentes no renovables investigadas para usarlas en la produccin de protena celular fueron, principalmente, subproductos de la industria petroqumica, como los alcanos, el metano o el metanol. De nuevo fueron las compaas petroqumicas, quienes participaron en la investigacin. La British Petroleum (BP) investigo el uso de los alcanos en la obtencin de protena celular a

partir de levaduras (tropina), en tanto que las industrias Shell y la Imperial Chemical Industries Lid (ICI), utilizaron metano y metanol respectivamente. Solo el proceso ICI alcanzo una escala comercial con el cultivo de la bacteria methilophilus methylotrophus en metanol, en un proceso continuo con un volumen de 1.5 millones de litros. El mejoramiento de este y otros procesos, condujera al avance considerable en la tecnologa de la fermentacin. Sin embargo, la disponibilidad de protenas de soya barata ha hecho que el proceso SCP sea incontestable y, segn parece, el mundo actual no tiene dficit de protena. La era pos antibitica tambin presencio el mejoramiento de la fermentacin en la produccin de etanol para que fuera utilizado como combustible (gasohol), provocado por la crisis del petrleo en 1974. Otros productos formados por microorganismos son los polisacridos extracelulares, como la goma de xantano, usada para reemplazar la goma natural en los alimentos y en los lodos de perforacin. Al mismo tiempo se ha creado los cultivos de clulas vegetales y animales para la produccin de compuestos especiales. Los microorganismos se han usado tambin como auxiliares en la lixiviacin de minerales como el Zinc y el cobre a partir de minerales de grado menor.

1.5 LA NUEVA BIOTECNOLOGIA Las nuevas biotecnologas se consideran a menudo como la biotecnologa misma. Sus principales avances han sido los anticuerpos monoclonales y la ingeniera gentica. Los anticuerpos monoclonales son los productos de la tecnologa del hibridoma. Esta se basa en la fusin de las clulas animales, las del sistema inmune que, por lo general, no pueden ser cultivadas in vitro, con clulas cancerosas que si pueden hacerlo. Las lneas de clulas hibridas que se forman, tiene la capacidad de crecer y producir anticuerpos altamente especficos, los cuales se conocen como anticuerpos monoclonales. La produccin de anticuerpos monoclonales ha sido rpida, desde su descubrimiento en 1975 y, actualmente, hay ms de 50 en el mercado. Se han utilizado en pruebas de diagnostico rpido, frmacos de accin especfica, purificacin, y su comercializacin es cada vez mayor. La ingeniera gentica se puede definir en forma simple con la capacidad para transferir genes de un organismo a otro, para cruzar la barrera que no se podran mediante los

mtodos genticos ordinarios. El avance de esta tcnica dependi de tres descubrimientos independientes. El primero fue el descubrimiento de las enzimas de restriccin, las cuales pueden cortar el ADN en sitios especficos para producir fragmentos discretos. El segundo descubrimiento fue al presenciar, en las bacterias, de ciertas molculas de DNA circular con reproduccin independiente (plsmidos), las cuales se pueden cortar con enzimas de restriccin y posteriormente repararse (reunirse) para incluir otros fragmentos de DNA. El tercer descubrimiento fue el mtodo de tratar las bacterias para que puedan captar el DNA de un plsmido y, por tanto, contener nuevos genes (transformados). Estos tres descubrimientos han permitido la evolucin de la ingeniera gentica, la cual ha mostrado tan rpido crecimiento que ha formado la base de muchas compaas nuevas.

Tabla 1.3 Eventos principales en la comercializacin de nuevas biotecnologas. 1973 1974 1975 1976 Primer gen clonado Primera exposicin de un gen clonado en diferentes especies de bacterias. Anticuerpos monoclonales. Primera firma (Genetech) en explotar la tecnologa del DNA recombinante (rDNA) 1980 1981 Informe sobre biotecnologa en el Reino Unido (Spink) Primer paquete de diagnostico con anticuerpos monoclonales aprobado en los Estados Unidos. 1982 Primera vacuna de origen animal producida por rDNA (colibacilosis) aprobada en Europa. Primer producto farmacutico del rDNA, insulina humana. Tabla 1.4 Nuevas tcnicas en el avance de la biotecnologa (segn Dunnhill y Rudd1984) Cultivo de tejidos, clulas vegetales y animales. Fusin de protoplastos. Modificacin estructural de protenas (ingeniera de protenas). Clulas y enzimas inmovilizadas.

Biosensores. Uso de las computadoras en fermentaciones. Nuevos diseos de biorreactores.

La tcnica ha mostrado aplicacin en el campo de la medicina en la generacin de muchos sistemas diagnsticos, la produccin de insulina humana y la hormona de crecimiento por bacterias y la produccin de diversas vacunas. La ingeniera gentica tambin ha tenido influencia en la agricultura y en la industria alimentaria. En la tabla 1.3 se muestra algunos conceptos de los principales sucesos que ha tenido lugar en la comercializacin de la ingeniera gentica. En la figura 1.4 se muestran otras tcnicas que se estn investigando en reas importantes de la biotecnologa. Estas incluyen: el cultivo de clulas vegetales y animales, las clulas o enzimas inmovilizadas , los sensores biolgicos, un sensor que detecta materiales biolgicos o una sonda que contiene materiales biolgicos, la modificacin estructural de protenas (ingeniera de protenas), el uso de computadoras en las fermentaciones y nuevos biorreactores. Este libro est basado en un curso breve de biotecnologa bsica para ingenieros, impartido en el wolfson institute of biotechnology (instituto de biotecnologa de Wolfson). El curso intenta, en una semana, presentar a los ingenieros, directores y a otros profesionales no-bilogos, la caracterizacin principal de la biologa y como se relaciona con la biotecnologa, e incluso con otras prcticas y conferencias de personas eminentes que trabajan en la industria. No se debe esperar que el libro cubra la biotecnologa en su totalidad, por ejemplo, no incluye una seccin sobre anticuerpos monoclonales, pero debe servir como una introduccin a un rea fascinante y excitante como lo es la biotecnologa.

BIBLIOGRAFIA Brown, C. M. Campbell, I., and Priest, F. G. (1987). Introduction to biotechnology. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Bu`Cock, J. and Kristiansen, B. (1987). Basic Biotechnology. Academic Press, London. Cooney, C. L. (1983).Bioreactors desing and operation. Science, 219,728.

Higgins, I. J., Best, D.J,. and Jones, J. (1985). Biotechnology. Blackwell Scientific Publications. Oxford. Dunnill.P. And Rudd, M. (1984). Biotecnology and British Industry. A report to the Biotechnology Directorate, SERC, London. Houwink (1984). A realistic view on biotechnology. European Federation of Biotechnology. Dechema, Frankfurt. Prave, p., Faust, U., SIttig, W., and Sukatsch, D. A. (1987). Basic Biotechnology. VCH, Weinheim. Smith, J. E. (1985). Biotechnology Principles. Van Nostrand Reinhold, England.

2.- ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR 2.1.- INTRODUCCION:

Todos los organismos vivientes, ya sean bacterias, levaduras, animales o vegetales, comparten muchas caractersticas comunes. Todos los organismos con la posible excepcin de los virus, tienen una composicin comn que consisten en cidos desoxirribonucleicos (DNA), cidos ribonucleicos (RNA) y protenas.la molcula de DNA es la que constityelos genes, los que a su vez contienen toda la informacin requerida para formar y controlar el organismo. La informacin contenida en el DNA se transfiere al resto del organismo para ejercer su funcin de la manera como la informacin almacenada en un disco de computadora necesita ser leda. El flujo de informacin desde el DNA hacia el resto de la clula esta mediada por molculas de RNA, las cuales finalmente dirigen la sntesis de protenas que, como componentes estructurales o como enzimas, dirigen y controlan muchas de las funciones del organismo. El proceso de transferir la informacin gentica del DNA a las molculas de RNA se conoce como transcripcin: la transferencia de informacin desde la molcula de RNA a las protenas se conoce como traduccin. Adems de contener estos tres tipos de molculas, los organismos realizan ciertas reacciones qumicas comunes conocidas colectivamente como metabolismo. Para crecer y dividirse, se necesita un organismo para sintetizar sus propios constituyentes celulares a partir de substancias qumicas externas y, para lograr esto, a menudo organismos diferentes tienen vas enzimticas similares y una estructura celular bsica. 2.2.- LOS COMIENZOS DE LA MICROBIOLOGA La microbiologa es el estudio de los organismos que son demasiado pequeos para verlos a simple vista (menores de 0.1 mm) y que fueron descubiertos en el siglo XVII por Robert.

ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR.

ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO, DNA.

Transcripcin ACIDO RIBONUCLEICO, RNA. Traduccin Protenas Tabla 2.1. Evolucin de la microbiologa Hook publica la micrographia, en la cual describe e ilustra la estructura celular del cerebro. Leeuwenhoek mejora las lentes del microscopio y descubre diversas formas de vida unicelular. Lzaro Spallanzani aporta evidencias de que los microorganismos no surgen espontneamente. Wohler sintetiza la urea desmintiendo el punto de vista de que los compuestos orgnicos solo pueden ser sintetizados por organismos vivos. C. Cagniard-latour, th. Schwann y F. Kutzinzing proponen de manera independiente que las levaduras que aparecen durante la fermentacion son plantas microscpicas y son las causantes de esta. Schileiden y Schwann dan argumentos convincentes para la doctrina celular. Pasteur propone que todos los procesos fermentativos son el resultado de actividad microbiana y descubre los organismos anaerobios. Tyndall cre un mtodo de esterilizacin por calentamiento discontinuo. Roberto Koch demuestra la causa bacteriolgica o etiologa del ntrax. Roberto Koch y su grupo introducen las tcnicas de cultivo puro, incluyendo la caja de petri inventadas por Ricardo Petri. TIPOS DE ORGANIZACIN CELULAR

Hooke y Antony Van Leeuwenhock (tabla 2.1). Con el uso de microscopio simples. Leeuwenhoek describi diversos microorganismos, incluyendo las bacterias, con extraordinaria exactitud. Sin embargo, no fue sino hasta la mitad del siglo XVIII que Spatlanzani concluyo que dichos organismos eran llevados por el aire hacia las infusiones y que no se originaban espontneamente. Pasteur demostr ms tarde la presencia de microorganismo en el aire y que al excluirlo, las infusiones podan mantenerse estriles por periodos considerables. Antes de esto, Schwann y otros investigadores haban propuesto que los organismos estn constituidos por clulas y que la fermentacin alcohlica era causada por la presencia de clulas de levadura. Unos 20 aos despus, al estudiar un nmero considerable de fermentaciones, Pasteur propuso que todos los procesos fermentativos eran el resultado de la actividad microbiana y que podan proceder sin oxigeno. Mientras tanto, en Inglaterra, Tyndall haba confirmado que los organismos provenientes del aire eran las causantes de las infecciones microbianas y que estas no se formaban por generacin espontanea. Alrededor de 1876, Roberto Koch fundo la microbiologa medico, quien mostro la causa bacteriana o etiologa del ntrax. Esto fue confirmado despus por Pasteur de manera independiente. Estos experimentos no solo demostraron que las bacterias eran la causa de ciertas enfermedades, sino que cada tipo produca una enfermedad especfica, es decir, que existe especificidad biolgica. El trabajo de kosh estableci muchos de los fundamentos de las tcnicas de esterilidad que son la base de la microbiologa moderna. La inoculacin de bacterias sobre un medio solido, de modo que cada colonia formada que se hubiese originado de una bacteria individual, permitindose el uso y estudio de cultivos puros. Al principio el medio se solidificaba mediante la adicin de gelatina, pero ms tarde esta substituyo por agar, un extracto por polisacridos obtenido de algas marinas. El medio solido de coloco entonces e una caja de petri, inventada por el italiano Petri y que ahora es de uso universal. 2.3.- TIPOS DE ORGANIZACIN CELULAR

Los organismos vivos se pueden dividir en dos reinos, los vegetales y animales multicelulares y los protistas y los virus (tabla 2.289). La estructura celular de ambos reinos ha permitido la divisin de los tipos celulares en dos grupos (sin incluir los virus). Tabla 2.2. Grupos componentes de los reinos de organismos Plantas Multicelulares que muestran Semillas de plantas amplias diferencias. Helechos Musgos y hepticas Protistas Unicelulares, cenocticos o Algas Protozoarios Hongos (levaduras) Bacterias y virus Tabla 2.3. Diferencias entre clulas procariotas y eucariotas. PROCARIOTAS ESTRUCTURAS GENETICAS Numero de cromosomas Membrana nuclear DNA nuclear unido a histonas DNA en organeros ESTRUCTURAS CITOPLASMATICAS 1 >1 + + + EUCARIOTAS Animales Vertebrados invertebrados

multicelulares sin diferencian.

Naturaleza

de

los

ribosomas 70s Ninguna -5x10-15 g (1)

80s 70s + + 3x1012 o 0.5 x 10 12

citoplasmticos. Naturaleza de los ribosomas de los organelos. Mitocondrias CANTIDADES RELATIVAS DE DNA.

Estos grupos son los eucariotas y procariotas; la diferencia entre ellos depende principalmente si los cromosomas (DNA) estn contenidos en un ncleo bien definido. En la tabla 2.3 se listan las principales diferencias entre los procariotas y los eucariotas en trminos de su estructura celular y de contenido de DNA. Los procariotas contienen un solo cromosoma, en tanto que los eucariotas contienen muchos cromosomas, en tanto que los eucariotas contienen muchos cromosomas en una estructura unida a una membrana. El ncleo, en los eucariotas, el DNA contenido en los cromosomas esta unido a historias, protenas bsicas ausentes en los procariotas. El DNA del ncleo en los eucariotas no es el nico DNA presente en la clula, puesto que otras estructuras unidas a membranas, los mitocondrias y los cloroplastos, tambin contienen DNA, en estructuras rodeadas de membrana, conocidas como organelos, no se encuentran en procariotas. Los organelos tambin contienen a las estructuras capaces de sintetizar protenas. Las cuales incluyen a los ribosomas de los procariotas (70 s), en tanto que los ribosomas toplasmicos miden 80 s (son unidades Svedberg). Los virus se incluyen con frecuencia en el grupo de los protistas. Los virus fueron detectados en 1892 por Iwanowski, quien demostr que el virus del mosaico de tabaco pasaba atreves de un filtro a prueba de bacterias y no poda ser cultivado por la gentica, pero dependen de las clulas husped preexistentes para su reproduccin. En incapacidad para existir sin usar otras clulas, ha originado muchos argumentos cuanto as los virus son o no organismos vivos. Los virus afectan vegetales, animales y bacterias. 2.4.- PROCARIOTAS

Los procariotas representas las clulas ms pequeas del reino protista, el cual consiste en bacterias y algas verde- azules. El resto, algas, levaduras, hongos y protozoarios, son: PROCARIOTAS Tabla 2.4. Caractersticas fsicas y qumicas de las clulas bacterianas. caractersticas Forma de las clulas Tamao de las clulas Presencia de esporas bacterias Bastn, esferas y espirales. 0.5-3 um Por ejemplo bacillus(aerobio) Por ejemplo, clostridium(anaerbico) En algunas levaduras Elipsoides, esferas, micelios, cadenas. 1-5% 5-15um, de dimetro; 50-5000um de largo. En algunos. mohos Micelios, esferas.

COMPOSICION Protena(N x 6.25)(nitrgeno total) Acido nucledo (RNA y DNA) Carbohidratos y li8pidos 1um=10-3 mm

65-75%

45-55%

25-55%

15-25%

5-12%

5-10%

5-30%

10-50%

10-50%

Eucariotas. En la tabla 2.4. Se comparan los protistas, las bacterias, los mohos y las levaduras, en cuanto a su forma, tamao y composicin. Las clulas bacterianas se presentan como bastones, esferas, cadenas y espirales (figura 2.2), que en general son ms pequeas que las levaduras y los mohos. Los tres grupos contienen organismos que pueden formar esporas cuando las condiciones son desfavorables. La composicin de las bacterias nos muestra que contienen ms protenas y menos lpidos o carbohidratos que las levaduras o los mohos. Las diferentes formas de las bacterias se usan en las primeras etapas de la identificacin, pero debido a la falta de otras caractersticas, se usan las nutricionales para una identificacin ms detallada. Segn su fuente de energa, las bacterias y las algas verdeazules se pueden clasificar en cuatro categoras: 1) Organismos fotoautotrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energa y utilizan dixido de carbono como una fuente de carbono. Este grupo incluye las algas verde-azules, pero tambin ciertas algas fotosintticas (bacterias sulfurosas purpuras y verdes), as como plantas superiores y algas verdes eucarsticas. 2) Organismos foto hetertrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energa, pero usan compuestos orgnicos como fuentes de carbono. Estos son las bacterias purpuras no sulfurosas. 3) Organismos quimioautotrofos, que dependen de varios compuestos qumicos para obtener su energa, pero usan dixido de carbono como una fuente de carbono. Esta capacidad se asocia con la de usar compuestos inorgnicos reducidos como H2S o HN3 para producir energa y est restringida a las bacterias. 4) Organismos quimiheterotrofos, que dependen y obtienen su energa su energa y molculas de carbono de fuentes orgnicas. Estos representan el grupo ms grande de bacterias y eucariotas y es muy diverso.

ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR

COCO Por ejemplo, Micrococcus

DOS COCOS Diplococcus cocos en cadena Neisseria

Algas verde-azules

mixobacterias

Bacterias

Eubacterias

Bacilo Flagelos Escherichia coli Desulfovibrio

bacilo en cadena

Espiroqueta

Bacillus megatrium

Rhodospinllum

Bacteria anclada Caulobacter

Flagelo polar Pseudomona fluorescencia

Flagelo multiple Proteus vulgaris

Si se combinan las caractersticas estructurales, la forma de movimiento y los grupos nutricionales, los procariotas se pueden dividir en cuatro grupos principales (tabla 2.5). De estos, las eubacterias son el ms grande y de mayor inters en la biotecnologa. En la figura 2.3. Se muestra un diagrama representativo de las clulas procarioticas. 2.4.1.- PARED CELULAR El citoplasma bacteriano est encerrado por una pared celular rgida altamente Estructurada que determina la forma de la clula. La eliminacin de esta pared provoca, Tabla 2.5. Los cuatro grupos de procariotas.

espiroquetas Movimiento Pared celular CELULAR Organizacin unicelular + + Por desplazamiento Desplazamiento o ninguno gruesa, delgada, flexible rgida Filamento Mediante o

axial delgado, flagelos flexible. + rgida. + + +

filamentos micelio + FORMA DE LAS CLULAS Bastones. Esferas Espirales Clulas en reposo nutricional Grupo Fotoautotrofo Fotoheterotrofos Quimioautotrofo Quimiheterotrofos. + + +

+ + + Acinetas Microquistes

+ Ninguno

+ + + Endosporas

+ + + +

Que la clula adquiera una forma esfrica conocida como protoplasto cuando la membrana celular tiene poca resistencia intrnseca. Si el protoplasma se coloca en un medio hipertnico, una solucin ms diluida que el citoplasma, se provoca una rpita captacin de agua y, finalmente, la ruptura de la membrada. En las algas verde-azules, la pared celular se compone bsicamente de celulosa, en tanto que en las bacterias la pared est formada por un polmero nico de amino-azcar, peptidoglucano o murena. La composicin qumica y la estructura del peptidoglicano, se muestran variaciones considerables entre diferentes organismos, aunque su estructura bsica es la misma.

detincin que divida a las bacterias en los grupos Gram-negativas. La composicin general de la pared de las Gram positiva y gran negativa se muestra en la figura 2.5. Las bacterias Gram Positiva tienen una estructura bsica de peptidoglucano unida a cido teicoico, en tanto que las bacterias gran negativas tienen una membrana fuera de la capa de peptidoglunano que consiste en una bicapa de fosfolpidos con lipoplisacaridos y protenas. La difencia entre las bacterias gram negativa y gram positiva detectadas por la tIntacinGram, se puede correlacionar con otras caractersticas (tabla 2.7) como la

sensibilidad a la penicilina y a la digestin con lisozima. La penicilina es de muchos antibiticos que se sabe inhiben la sntesis te peptidoglucano al unirse a la enzima responsable del cruzamiento de las cadenas. Puesto que ninguna otra actividad biocintica es afectada, el crecimiento de las clulas continua, pero son incapaces de producir paredes celulares adecuadas y, por lo tanto, producen formas anormales y finalmente se lisan. Las clulas humanas y animales no contienen peptidoglucano por lo que son afectadas. La enzima lisozomaticas encontradas en la clara de huevo, las lgrimas y otras secreciones, rompen el enlace entre las unidades de cido N-acetilmurnico y N-acetilglucosamina (figura 2.4).

En la parte exterior de la pared celular de algunas bacterias, se encuentran polisacridos de alto peso molecular formando un gel hidrofilico, conocido como capsula (figura 2.3).El espesor de la capsula puede variar enormemente desde 10 nm hasta 1.o um, y puede varias de acuerdo con el aspecto fisiolgico de la clula. La capsula no tienen una funcin bien definida, sin embargo muchos patgenos estn encapsulados y os componentes de la capsula pueden ser antignicos. N-acetilmurnico

N-acetilglucosamina

lisozima

Figura 2.4

Table 2.6 Tintcion de Gram

Procedimeinto Gram *color cristal violeta y lavar con agua *colocsr yoduro de gran y lavar purpura con agua, secar con papel secante

Tiempo

Gram +

30s

purpura

purpura

30s

purpura

*aplicarle etanol al 95% y lavar con 20s agua, secar con papel secante *contrateir con un color contraste, 15s por ejemplo amarillo

purpura

sin color

purpura

amarillo

Tabla 2.7 Correlacionn de la tintacion de Gram con otras propiedades

Gram positiva

Gram negativa

Sensibilidad a la penicilina Digetsion por lisozima Espesor de la pared Contenido de lpidos de la pared Acidoteicoico

+ + 20-80nm 0-3% +

10nm 11-22% +

Gram variedad de aminocidos en la pared Ejemplo Escherichiacoli Bacillus

(1nm = 10-6 mm)

2.4.2 Membrana citoplsmatica Debajo de la pared celular bacteriana esta una membrana de unos 40-80 A de espesor. La membrana acta como una barrera semipermeable que controla la captacin y la liberacin de materiales, ayudando a determinar la composicin del citoplasma. Alrededor del ao 1990 se descubri el primer indicio de que los lpidos, molculas orgnicas pequeas insolubles en agua que incluyen a las grasas y aceites puedan ser un constituyente de las membranas biolgicas. En las dcadas de los aos cincuenta, J.D Robertson propuso que la membranaconsista en una capa externa de polisacridos, una capa interna de protenas, entre estas, una bicapa de lpidos conocida como unidad de membrana. La bicapa lpido consista en fosfolpidos, molculas de glicerol con extremo hidrfilo ( el fosfato) y un extremo hidrofilico (tallo de cidos grasos), arreglados como una capa doble (figura 2.6). Hidrofilico (fosfatos)

BICAPA LIPIDICA Hidrofo bic

FIGURA 2.6 Sin embargo, los adelantos de la microscopia electrnica (crio-fractura) revelaron un cuadro ms complejo con protenas asociadas a la membrana. Adems, aparentemente las protenas no estn fijas en la capa de lpidos, sino que estn libres para moverse en la forma lateral. Estos descubrimientos surgieron el modelo actual para al membranas, el mosaicos fluido (figura2.7), el cual se aplica a membranas de todos los tipos.

Figura 2.7.Modelo del mosaico fluido para la membrana celular

En las bacterias, las membranas citoplasmticas es la nica estructura membranosa real, aunque existen una membrana similar en los eucariotas alrededor de estructuras como el ncleo, las mitocondrias y los cloroplastos. 2.4.3 Flagelos Las bacterias pueden moverse en respuesta a varios estmulos o a compuestos qumicos al alejarse de los estmulos o al acercarse a ellos. Se ha demostrado que muchos nutrientes simples, como los azucares y los aminocidos provocan respuesta en las bacterias. El medio de locomocin principal de las bacterias es el flagelo. ste es un cuerpo basal embebido en las membranas citoplasmtica, una regin en forma de gancho que se conecta a la base con un eje flexible y delgado (figura 2.8).El flagelo se compone de hebras de una protena llamada flagelina. El ordenamiento de los flagelos en las bacterias determina s tipo de movimiento, a menudo se puede usase en su clasificacin.

Figura 2.8 Cuando son vistos en el microscopio electrnico, pueden observarse otros apndices sobre la bacteria, que consiste en delgados flagelos filamentosos conocidos como fimbrias o pilis, los cuales participan en la transferencia de material gentico. 2.4.4 Esporas

El citoplasma de las bacterias contiene muy poca estructura separadas de uno o dos agregados de material nuclear. Sin embrago, se puede hallar una estructura que solo est en las bacterias Gram-negativa, la endoesporas. Cuando la condiciones son difciles, o bien, en alguna etapa de l ciclo de desarrollo, las bacteria forman una espora refractiva a partir de una invaginacin de la membrana citoplasmticas. La gruesa pared de las esporas les confiere resistencia al calor i a la desecacin (figura 2.9).

Figura 2.9 Endoespora bacteriana 2.5 EUCARIOTAS .La clulaeucarsticaest representada por plantas, animales, levaduras, algas y hongos. A pesar de la gran diversidad entre estas clulas, hay muchas caractersticas comunes a ellas(figura 2.10), lo cual incluye un alto grado de complejidad interna. Las principales carteristasson : 2.5.1 Pared celular En los hongos, las levaduras y las algas. La celular est encerrada en una pared celular rgida que consiste principalmente en polisacridos, los cuales le confieren una forma fija y la protegen del dalo mecnico y osmtico. La pared estabiliza la estructura celular y , en cuanto a los procariotas, pueden usarse como una caracterstica taxonoma. Las levaduras

pueden tener forma casi esfrica u oblonga y se divide pro gemacin o fisin ( figura 2.11) , en tanto que el crecimiento micelial se realiza por elongacin, el cual puede incluir ramificacin.

2.5.2 Estructuras de la membrana Las eucariotas estn limitadas por una membrana de estructura similar a las de los procariotas. En cuanto a los eucariotas varan mucho en tamao de las estructuras que rodena la membrana dentro de la clula (tabla 2.8). 2.5.3 Ncleo Las caractersticas mas sobresalientes de las clulas eucariotas es el ncleo, el cual contiene el DNA de la celular y esta limitado por la membrana. Dentro del ncleo se pueden ver reas ms densas, ricas en RNA, conocidas como nuclolos.

Figura 2.10 Estructura general de lsd clulas eucariotas. 2.5.4 Mitocondrias

La clula eucariota contiene estas estructuras, las cuales, a menudo son grandes, cilndricas, encerradas por una membrana doble y contiene invaginaciones numerosas conocidas como crestas. La mitocondrias es le sitios principal de generacin de energa y contiene su propio sistema sintetizado de protenas y su propio DNA (figura 2.12) 2.5.5 Cloroplasto El cloroplasto tambin es una estructura rodeada por una membrana y , al igual que las mitocondrias. Contiene un sistema separado para la sntesis de pretinas y su propio

DNA. Como su nombre lo indica, los cloroplastos contiene el pigmento clorofila y en ellos se lleva a cabo la fotosntesis.

2.5.6 Otras estructuras membranosas En la tabla 2.8. se describe un amplia variedad de otras estructuras membranosas, descritas en la misma, seencuentra en asl eucariotas: su origen se describeen la figura 2.13. El retculo endoplasma tico es una compleja de membranas que participan ne le almacenamiento y transporte intracelular de varios productos. El retculo endoplasma tico tambin puede tener muchos ribosomas unidos a su superficie y ser participe en la sntesis y secrecin de protenas. La mayora de eucariotas contiene un complejo de membranas denominadas aparato o cuerpo de Golgi, algunas veces nombrado dictiosoma. Al igual que el retculo endoplasmtico
Tabla 2.8 Estructuras membranosas en eucariotas

Estructura Ncleo Retculo endoplasmtico

Funcin Contiene la informacin gentica de la clula (DNA) Una red complicada de membranas que funciona como sitio de la sntesis de protenas.

Aparato de Golgi

Complejo de vesculas y membranas. Algunas veces llamado dictiosoma, responsable de la secrecin desde la clula.

Lisosoma Peroxisoma Mitocondrias Cloroplastos

Sacos membranosos que contienen enzimas digestivas. Vesculas limitadas por membranas que contienen catalasa Sitio de generacin de energa, contiene su propio DNA Sitio de fotosntesis, se presentan solo en las plantas verdes, contiene su propio DNA

Plastidios

Las estructuras membranosas de plantas pueden contener aceites o pigmentos

el aparato de Golgi participa en la secrecin de substancias de la clula en partculas enzimas. Las vacuolas se encuentran en muchos tipos de clulas, especialmente en plastas. A menudo se usan para almacenar enzimas o productos que podran se disruptivos o txicos para la clula (las vacuolas pueden llegar a ocupar de 80 a 90% del volumen celular total). Muchas de las estructuras citoplsmicas descritas estn en equilibrio dinmico y son sintetizadas y degradadas segn sea requerido. Las diferentes estructuras parecen derivarse, ya sea directa o indirectamente, del retculo endoplasmtico de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 2.13.

Figura 2.12 Mitocondria Envoltura nuclear Retculo endoplasmtico Aparato de Golgi Membrana plasmatica

Lisosomas

Peroxisomas

Vesculas endociticas

Figura 2.13 Origen de algunas estructuras membranosas

PROCESOS QUIMICOS DE LA CELULA

3.1 Introduccin

En el capitulo anterior se considero la estructura de los sistemas celulares y los diferentes tipos de clulas que se encuentran en la naturaleza. Ahora es necesario considerar la constitucin qumica de los componentes celulares principales, y como se sintetizan las unidades bsicas de construccin de las estructuras a partir de los nutrientes disponibles en un medio de crecimiento adecuado. En este captulo se examinara la qumica de las clulas vivas y se sentarn las bases para la comprensin de los captulos posteriores, as como las rutas para la generacin de la energa por estas reacciones biosintticas.

3.2 Composicin elemental

Todas las clulas vivas, incluyendo los microorganismos, requieren ciertos nutrientes para su crecimiento y desarrollo. Los nutrientes deben contener los elementos qumicos que constituyen los materiales y estructuras celulares, as como aquellos elementos que son requeridos para el transporte a travs de la membrana, la actividad enzimtica y la generacin de la energa necesaria para los procesos biosintticos. El agua constituye el 80 y 90% del peso total. El resto de la clula se compone de carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrgeno, azufre y fosfato (en concentraciones mayores de 10-4M), adems de unos 18 elementos ms que con frecuencia se presentan en cantidades mnimas. La tabla 3.1 lista lo diez elementos principales encontrados en las clulas microbianas con detalles sobre su origen y requerimiento de la clula. El carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrgeno, azufre y fosfato, constituyen la base de los componentes celulares como protenas, lpidos, estructuras de membrana y cidos

nucleicos. Sin embargo, estos elementos forman parte de componente relativamente estables y solo reaccionan lentamente con algun otro. Las reacciones qumicas entre estos compuestos necesitan catalizadores biolgicos denominados enzimas. Estas son protenas que a menudo requieren de ciertos iones o elementos traza como componentes estructurales para ser catalticamente activo (tabla3.2) las enzimas se mencionan con un sufijo despus de la reaccin o del sustrato. La mayor parte de los elementos se presentan como sales en los medios naturales como el suelo y el agua. Sin embargo, con frecuencia se necesita aadir fuentes solubles de estos elementos a los medios de cultivo de laboratorio o industriales. Algunos microorganismos, como por ejemplo Escherichia coli, pueden crecer en mezclas simples de estas sales junto con una fuente de carbono y energa, mientras que otros, como Lactobacilli, necesitan otros compuestos que no pueden sintetizar por s mismo. Los constituyentes inorgnicos de varios microorganismos se muestran en la tabla 3.3. Los microorganismos muestran cierta diversidad en cuanto a los componentes que pueden usar como fuentes de C, H, O, N y S. As el azufre generalmente es tomado por las clulas como sulfato y residuos de sulfuro para propsitos biosintticos. Sin embargo, algunas bacterias como Thiobacilli pueden crecer en compuestos con azufre reducidos como sulfuro, azufre elemental o tiosulfato que las usan como donadores de electrones, en tanto que los metangenos crecen solamente en presencia de sulfuro de hidrogeno. El nitrgeno se presenta en la naturaleza en muchas formas como el amoniaco (NH3), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), compuestos orgnicos que contienen nitrgeno y nitrgeno molecular. La mayora de los microorganismos pueden utilizar NH4+, el cual con frecuencia es el substrato preferido. Algunos organismos pueden usar NO3- el cual primero debe ser reducido a NH4+ antes de incorporarlo al material celular. El NO2-, un producto de la respiracin anaerobia, que utiliza NO3- como aceptor de electrones (Nitrosomonas sp.), pueden ser reducidos a NH4+ o a N2 por algunas bacterias desnitrificantes, o bien oxidado a NO3- por Nitrobacter sp. Ciertas bacterias fijadoras de nitrgeno pueden usar nitrgeno molecular como fuente de nitrgeno (Rhizobium sp.), mientras que muchos microorganismos pueden utilizar complejos, fuentes orgnicas de nitrgenos, entre las que estn los aminocidos, cidos nucleicos y aminas metiladas.

Los microorganismos pueden usar C, H y O, ya sea en forma de compuestos orgnicos o inorgnicos, incluyendo CO2, H2, H2S, NH4+, NO3-, NO2-, SO42-, etc. Con la posible excepcin de liginica y ciertos polmeros orgnicos hechos por el hombre, casi todos los componentes con carbono son substratos potenciales para el crecimiento de microorganismos.

Elemento C O H N S

Fuente Compuestos orgnicos, Co2 O2, H2O, compuestos orgnicos, CO2 H2, H2O, compuestos orgnicos NH4+, NO3, N2, compuestos orgnicos SO42-, HS, S, S203, compuestos orgnicos HPO42-

Funcin metablica

Componentes principales del material celular

Componentes de la cistena, metionica, pirofosfato de tiamina, coenzima A, biotina y cido -lipoico.

Componentes de los cidos nucleicos, ATP y otros nucletidos, y fosfolipidos

K+ Mg2+

Principal catin orgnico dentro de la clula, cofactor de algunas enzimas.

Mg

Cofactor de muchas enzimas (particularmente cinasas), presente en paredes y membranas celulares

Ca

Ca2+

Cofactor de enzimas; presente en exoenzimas importantes, por ejemplo, amilasas, proteasas; componente importante de las endosporas

Fe

Fe2+, Fe3+

Componente de los citocromos; protenas fierro-azufres, por ejemplo, ferredoxinas; cofactor de muchas enzimas (por ejemplo, hidratasas)

Tabla 3.1 Elementos principales requeridos por las clulas microbianas

Elemento Zn

Fuente Zn2+ Mn2+ Na+ ClMoO42SeO32Co2+ Cu2+ CrO4 Ni2+


2+

Funcin metablica Componentes de la alcohol deshidrogenasa, fosfatasa alcalina, aldolasa, RNA y NA polimerasa.

Mn

Componente de la superxido dismutasa bacteriana, PEP, carboxicinasa, citrato sintasa.

Na Cl Mo

Requerido por bacterias haloflicas Componentes de la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato deshidrogenasa.

Se Co

Componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasa. Componente de la vitamina B12 y enzimas con vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa)

Cu Cr Ni

Componente del citocromo oxidasa y oxigenasas Componente de algunas formato deshidrogenasas Componente de la ureasa y del crecimiento auttrofo de bacterias que oxidan hidrogeno.

Tabla 3.2 Elementos trazas requeridos por las clulas microbianas

Elemento

Bacterias

Hongo (g/100Gg de esp seco)

Levadura

P S

2.0-3.0 0.2-1.0

0.4-4.5 0.1-0.5

0.8-2.6 0.01-0.24

K Mg Na Ca Fe Cu Mn Mo Total de cenizas

1.0-4.5 0.1-0.5 0.5-1.0 0.01-1.1 0.02-0.2 0.01-0.02 0.001-0.01 0.001-0.01 7-12

0.2-2.5 0.1-0.3 0.02-0.5 0.1-1.4 0.1-0.2 2-8

1.0-4.0 0.1-0.5 0.01-0.1 0.1-0.3 0.01-0.5 0.002-0.01 0.0005-0.007 0.0001-0.0002 5-10

Tabla 3.3 Constituyentes inorgnicos de varios microorganismos

3.3 Los nutrientes como fuentes de energa:

Los nutrientes requeridos por microorganismos no son para reacciones biosintticas que dan lugar al crecimiento celular, sino tambin funcionan como fuentes de energa para alimentar los procesos biosintticos metablicos que demandan energa. Los microorganismos se pueden clasificar por la naturaleza de las fuentes de carbono y energa que pueden utilizar. Los organismos que utilizan luz como fuente de energa se denominan fottrofos, mientras que aquellos que obtienen su energa de reacciones qumicas se denominan quimitrofos.

3.3.1 Fottrofos:

Es comn que los fottrofos utilicen CO2 como fuente celular de carbono, en cuyo caso se denominan fotoauttrofos. Durante el crecimiento, el CO debe ser reducido al nivel de la materia celular usando donadores de electrones que con frecuencia son inorgnicos, tales como el hidrogeno molecular o compuestos de azufre reducidos. Cuando los organismos crecen de esta manera se denominan fotolittrofos (tabla 3.4). Alternativamente, algunos fottrofos (tabla3.4) pueden usar la luz como fuente de energa para su crecimiento y fuentes de carbono orgnicas como succinato o acetato. En este caso, el substrato orgnico aporta los electrones para las reacciones de reduccin y el organismo crece como fotoorgantrofo. El substrato orgnico aporta tambin carbono celular en lugar de CO2. En consecuencia, los organismos crecen como hetertrofos. As, la autotrofa y la heterotrofa reflejan la naturaleza de la fuente de carbono, en tanto que el littrofo y el organtrofo reflejan la naturaleza del aceptor de electrones.

Tipo

Donador de electrones

Fuente de carbono CO2

Organismo

Fotolitotrofa

H2O, H2S, S, H2

Plantas, algas verde azules, Chromatiaceae, Chlorobiaceae

Fotoorganotrofa

Orgnico

CO2

Rhodospirillaceae

Tabla 3.4 Crecimiento fototrfico

3.3.2 Quimitrofos:

Muchos microorganismos obtienen energa (ATP) para su crecimiento mediante reacciones de xido reduccin de la forma:

Xred + Aox

Xox + Ared

Donde un substrato se reduce a expensas del otro. La mayora de las levaduras, hongos y organismos superiores utilizan donadores de electrones orgnicos (Xred) y O2 como aceptor de electrones. Las bacterias, sin embargo, pueden usar NO3-, SO42- o CO32- como aceptor de electrones en lo que se denomina respiracin anaerobia, compuestos orgnicos (fermentacin anaerobia) u O2 (respiracin). El donador de electrones, Xred, puede ser orgnico o inorgnico (por ejemplo H2, H2S, Fe2+, NO2- o NH4+). Los organismos que utilizan un donador de electrones orgnico se conocen como quimioorgantrofos, en tanto que los que utilizan donadores inorgnicos se llaman quimiolittrofos (tabla 3.5). Los quimiolittrofos tambin son quimioautotrofos, ya que generalmente usan CO2 como fuente de carbono y no metabolizan un compuesto organico. Sin embargo, tambin puede crecer en forma aerbica como quimioorgantrofos (por ejemplo las bacterias que oxidan hidrogeno y algunos thiobacilli), mientras que Nitrosomonas y Thiobacillus Thiooxidans son quimiolittrofos obligados.

Tipo

Donador de electrones H2S, S, H2, Fe2+

Aceptores de electrones CO2,O2, NO3-

Organismo

Quimiolitotrofa

Bacterias oxidantes del hidrogeno, tiobacilos, Th. Desnitrificantes, Ntrosomas, metanogeno.

Quimioorganotrofa

Orgnico

O2, NO3-, SO42-, Organico

Pseudomonads, bacillin levaduras, bacillus lincheniformis, bacterias

reductoras del sulfato, bacilos del acido lactico


Tabla 3.5 Crecimiento quimiotrfico

3.4 Otros requerimientos para el crecimiento:

La mayora de las levaduras y las algas pueden sintetizar los componentes orgnicos necesarios para su crecimiento a partir de la fuente de carbono. Muchas bacterias no pueden hacer esto y necesitan la presencia de factores de crecimiento especficos en el medio, adems de una fuente de carbono y energa. El requerimiento ms comn son las vitaminas, las cuales se necesitan en cantidades extremadamente pequeas como cofactores para varias enzimas. As, Clostridium kluyveri requiere un medio complementado con biotina y acido p-aminobenzoico. Ciertas bacterias lcticas tienen necesidades muy estrictas de prcticamente todos sus aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. En consecuencia, estos organismos realmente pueden crecer en un medio en el que no se conoce la concentracin de uno de estos nutrientes necesarios para el crecimiento. El grado de crecimiento esta relacionado directamente con la concentracin del nutriente esencial. Esto constituye la base del ensayo microbiolgico. En la tabla 3.6 se listan algunas vitaminas y compuestos relacionados que a menudo se necesitan para el crecimiento. Tabla 3.6 Vitaminas y compuestos relacionados requeridos para el crecimiento Compuesto Funcin metablica

Acido p-aminobenzoico Precursor del Tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de un carbono. Biotina Acido flico Coenzima que participa en las reacciones de carboxilacion. Tetrahidrofolato necesario en la transferencia de unidades de carbono.

Acido nicotnico Acido pantotnico Piridoxina (vit. B) Riboflavina (vit. B) Tiamina (vit. B)

Precursor de NAD y NADP. Precursor de coenzima A(portador de grupos acilo) Fosfato de piridoxal usado en reacciones de transaminacin y decarboxilacin. Componente de los grupos prostticos FMN y FAD de las flavoprotenas. Componente del pirofosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y transcetolasas.

Coenzima que interviene en reacciones de rearreglo(glutamato mutasa). Cianocobalamina (vit. B) Vitamina K Precursor de la menaquinona un portador de electrones (por ejemplo, fumarato reductasa). Coenzima M Interviene en la metanognesis.

3.5 COMPONENTES ESTRUCTURALES BSICOS DE LA CLULA Las clulas microbianas, como todos los sistemas vivos con excepcin de los virus, se componen de carbohidratos, grasas, lpidos y cidos nucleicos. Estos materiales se forman a partir de las unidades bsicas de construccin o productos metablicos primarios, a saber, monohidratos, cidos grasos, aminocidos y nucletidos (o nuclesidos) y, por otras reacciones metablicas, se convierten en los componentes estructurales principales de clulas, como paredes celulares, membranas, enzimas, protenas estructurales y DNA o RNA.

3.51 Carbohidratos Son compuestos orgnicos con frmula general (CHO)n, donde n>3. Existen dos formas principales de carbohidratos, los monosacridos y los polisacridos. Los monosacridos o azcares simples, son los carbohidratos ms pequeos que contienen entre 3 y 9 tomos de carbono y son las unidades de construccin de los polisacridos. La D-glucosa (hace girar la luz polarizada en el plano de la direccin +) es el monosacrido mas comn. Se compone de 6 tomos de carbono y, al igual que otros azcares, es un derivado polihidroxialcohol (figura 3.1)

Aldolasas

Cetosas CH 2OH C=O CH 2OH Dihidroxiacetona CH 2OH C=O HCOH HOC H CH 2OH D-ribulosa

CHO
TRIOSA HCOH CH 2OH D-gliceraldehdo PENTOSA CHO HCOH H COH HCOH CH 2OH D-ribosa

HEXOSA

CHO HCOH HOC H HCOH HCOH CH2OH D-glucosa

CHO HOC H HOC H HCOH HCOH CH 2OH D-manosa

CHO

CH2OH C=O HOC H HCOH HCOH CH 2OH D-fructuosa

HCOH HOC H
HOC H

HCOH
CH 2OH

D-galactosa

Figura 3.1 Azcares aldosas y cetosas

Para muchos microorganismos la D-glucosa es el compuesto base que se metaboliza para formar los dems componentes celulares. La mayora de los microrganismos (particularmente las levaduras), pueden crecer en glucosa, la cual se transporta a travs de la membrana hacia la clula de difusin pasiva, transporte activo o translocacin de grupo. Cuando hay polisacridos en el medio, es comn que sean hidrolizados a unidades de glucosa por enzimas extracelulares (invertasas, celulasas, amilasas, aminoglucosidasas) antes de ser transportados hacia la clula. Los monosacridos se clasifican como aldosas o cetosas (figura 3.1). As, la glucosa es una aldohexosa (aldo=azcar aldehdo; hexosa=6 tomos de carbono). Hay dos formas de glucosa (y otros azucares) llamadas formas D- y L- (figura 3.2 (a)),

CHO H HO H H C C C C OH H OH OH HO H HO HO

CH2OH C H C C CH3 H

C H CH 2OH

CH2OH D-glucosa

L-glucosa

a)

formas de cadena recta

-D-glucosa b)

-D-glucosa

formas en anillo (piranosas)

Figura 3.2 Formas estructurales d e la glucosa que son imgenes especulares entre si. Los azucares de origen natural por lo general son de la forma D-. La D-glucosa se presenta principalmente como una estructura de anillo, denominada la forma piranosa (figura 3.2 (b)), en la que - y - representan la posicin del grupo OH del tomo de carbono 1. La unin de otros grupos qumicos a la estructura bsica, da lugar a una variedad de derivados de azcar que incluye alcoholes (glicerol, sorbitol, etc.), cidos (acido glucnico, acido glucornico), fosfatos (glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato), desoxiazcares (desoxirribosa, figura 3.3) y aminoazcares (glucosamina, galactosamina, acido N-acetilmurmico). Estos son componentes importantes comunes de la estructura de la clula microbiana.

HOCH

H OH

HOCH H

H H H

H H

OH

OH OH D-ribosa

OH H D-desoxirribosa

Figura 3.3 Azcares pentosas importantes

Bajo la influencia de enzimas, los monosacridos se pueden condensar entre si para formar polisacridos. El grupo OH sujeto al tomo de carbono en la posicin 1 de la molcula de glucosa, es relativamente reactivo y se puede condensar con el grupo OH en la posicin 4 6 de otro azcar par producir un disacrido con un enlace - (o -) 1,4 glucosdico (figura 3.4)

-D-glucosa Figura 3.4

-D-glucosa

-maltosa

Formacin de enlaces (-1, 4) glucosdicos

Si las unidades de glucosa se polimerizan aun ms mediante la formacin de enlaces -1, 4glucosdicos se obtiene un polmero de cadena recta con un peso molecular de hasta 500.000, denominado amilosa (un componente del almidn: figura 3.5). La amilopectina (el componente principal del almidn) se compone de unidades de -D-glucosa unidas por enlaces -1, 6glucosdicos. La molcula completa de almidn (un polisacrido comn de almacenamiento) es una combinacin de amilosa y amilopectina (figura 3.5). El glicgeno, un polmero comn de almacenamiento en bacterias y levadura, tiene una composicin similar al almidn, excepto que esta mucho mas ramificado que la amilopectina, con ramificaciones -1, 6 que aparecen cada 8-10 residuos de glucosa. El dextrano es otro polisacrido importante de almacenamiento microbiano, similar al almidn y al glucgeno, que esta formado de unidades de D-glucosa unidas principalmente por enlaces -1, 6-glucosidicos. Sin embargo, los puntos de ramificacin son caractersticos de las especies y

pueden ser enlaces -1, 2, -1, 3 o -1, 4. Los dextranos forman soluciones viscosas que tienen aplicaciones amplias en la industria como lubricantes, en la separacin de molculas orgnicas por filtracin y cromatografa de intercambio inico, etc.

Un polisacrido estructural importante es la celulosa, la cual contiene ms del 50% del carbono orgnico total de la biosfera. La madera contiene aproximadamente 50% de celulosa, en tanto que el algodn es casi celulosa pura. Se compone de unidades de D-glucosa unidas por enlaces -1, 4 (figura 3.6) y es el componente principal de las clulas

Figura 3.6

Estructura de la celulosa.

vegetales y las algas. El potencial de la hidrolisis fsica o enzimtica de la celulosa (papel de desecho, peridico, viruta, residuos de cosecha) seguidas de una fermentacin posterior para la produccin de biomasa o alcohol, representa uno de los mayores desafos a la industria biotecnolgica. Las paredes celulares bacterianas estn formadas de un pptido polisacrido complejo llamado peptidoglicano o murena (figura 2.7). Esteconsiste en cadenas paralelas de polisacrido compuestas de un disacrido de N-acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurmico unidos por enlaces -1, 4-glucosidicos. En el grupo hidroxilo del acido lctico unido al cido murmico, se encuentra una cadena lateral de tetrapptido compuesta de L-alanina, D-alanina, acido Dglutmico y acido diaminopimlico o L-lisina (figura 3.7. La D-alanina terminal de la cadena pptida lateral de un polisacrido

Figura 3.7 Componente peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas. puede unirse con la cadena peptdica de otra cadena de polisacrido, ya sea directamente o a travs de otra cadena polipetdica corta (en Staphylococcus aureus, esta cadena de polipptido se compone de 5 unidades de glicina). Por lo tanto, el peptidoglicano consiste en cadenas de polisacridos paralelas con muchas uniones entre las cadena que le confiere fuerza y rigidez a al pared celular. La enzima lisozima hidroliza los enlaces -1, 4 del peptidoglicano para producir disacridos de Nacetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurmico a los cuales estn unidos los pptidos (figura 3.7). Este es uno de los mtodos usados para obtener protoplastos de bacterias gram +. La penicilina, un antibitico importante, inhibe la formacin de los entrecruzamientos peptdicos de las cadenas de polisacridos, formando as paredes celulares dbiles. 3.52 Grasas y lpidos Los lpidos son compuestos orgnicos insoluble en agua localizados en todas las clulas vivientes, pero son solubles en solventes no polares como el benceno y el ter.

Tienen cuatro funciones principales: 1)como componentes estructurales de las membranas: 2) como materiales de almacenamiento intracelular cuya oxidacin produce energa para el crecimiento; 3) como fuente de combustible (energa) transportable; 4) como componente protector de paredes celulares de las bacterias, las hojas de las plantas y la piel de los vertebrados. Las grasas y lpidos se componen de cidos grasos de los cuales se han aislado ms de 70 tipos diferentes. Los cidos grasos se componen de una cadena larga de hidrocarburo con un grupo de carboxilo terminal con la forma general mostrada en la figura3.8, donde n esta, por lo general, entre 12 y 20. La cadena de hidrocarburo puede
O H3C (CH 2)n C OH

Figura 3.8 Frmula general de los cidos grasos. ser saturada (sin enlaces dobles) o insaturada (uno o mas enlaces dobles). Los cidos grasos difieren principalmente en la longitud de la cadena y en el nmero y en la posicin de los dobles enlaces. Algunos de los cidos grasos ms importantes y comunes se muestran en la tabla 3.7. Casi todos los cidos grasos naturales tienen un numero par de tomos de carbono y se llaman saturados si no tienen dobles en laces. Los cidos grasos insaturados presentan uno o ms dobles enlaces (tabla 3.7). Si bien las plantas y animales superiores tienen predominantemente cidos grasos insaturados de 14 a 22 tomos de carbono; los microorganismos, y en particular las bacterias tienen tipos ms simples de 12 a 18 tomos de carbono y cidos grasos insaturados C o C. En las bacterias no se han encontrado cidos grasos con ms de un enlace doble. Los cidos grasos solo se encuentran en pequeas cantidades en forma libre. Se localizan en materiales estructurales y de almacenamiento como esteres de glicerol (glicridos o acilgliceroles) o como fosfosteres de glicerol (fosfoglicridos o fosfolpidos). Los glicridos son la forma de almacenaje principal de grasas en los microorganismos, plantas y animales. Tabla 3.7 Algunos de los cidos grasos naturales comunes.

Estructura de tomos de carbono Saturado 12 14 CH(CH)COOH CH(CH)COOH

Nombre comn

Temperatura de ebullicin (C)

Acido lurico Acido mirstico Acido palmtico Acido esterico Acido araqudico Acido lignocrico

44.2 53.9 63.1 69.6 76.5 86.0

16 CH(CH)COOH 18 CH(CH)COOH

20 CH(CH)COOH 24 CH(CH)COOH

Insaturados 16 CH(CH)CH= CH(CH)COOH 18 CH(CH)CH= Oleioco 13.4 Palmitoleico -0.5

CH(CH)COOH 18 CH(CH)CH= Linoleico -0.5

CHCHCH=CH(CH)COOH 18 CHCHCH=CHCH Linolnico -11.0

CH=CHCHCH=CH (CH)COOH 20 CH(CH)CH=CH Araquidnico -49.5

CHCH=CHCHCH= CHCHCH=CH(CH) COOH

Hay tres clases de glicridos, dependiendo del nmero de cidos grasos (o grupos acilo) esterificados en la molcula de glicerol (figura 3.9): 1-monoacilglicerol (monoglicrido); 1, 2-diacilglicerol (diacilglicrido); 1, 2, 3-triacilglicerol (triglicrido).

Los ms comunes en la naturaleza son los triacilgliceroles. La clase de triacilglicerol depende del tipo y posicin de los cidos grasos esterificados en relacin con el glicerol, por ejemplo, triesteroilglicerol. Los fosfoglicridos se encuentran casi exclusivamente en las membranas celulares, siendo escaso en grasas de almacenamiento. Son similares en estructura a los glicridos excepto que uno de los grupos alcoholes primarios del glicerol esta fosforilado mas que esterificado con un acido graso. As, el componente bsico de los fosfolpidos es el glicerol-1-fosfato o el glicerol-3-fosfato, al cual estn unidos dos cidos grasos. Los fosfoglicridos (figura 3.10) poseen una cabeza polar (hidroflica) y otras dos cabezas hidrocarbonadas no polares (hidrofbicas) y, por tanto, se denominan lpidos antipticos. As, en solucin acuosa, es fcil que formen micelas con las regiones polares de un grupo de fosfoglicridos en contacto con el agua, en tanto que las cadenas

Procesos qumicos de la clula

Laterales no polares se agrupan entre s (figura 3.11.). En interfases aire-agua, los fosfogliceridos formaran monocapas, mientras que en solucin, particularmente en aperturas que separan dos compartimentos acuosos, forman con facilidad bicapas de aproximadamente 70 de espesor (figura 3.11). Estas bicapas son muy similares a las de las membranas celulares, las cuales permiten el paso libre de agua pero son impermeables a varios iones. En la tabla 3.8 se listan algunos de los fosfogliceridos ms comunes de los microorganismos. 3.5.3 Esteroides Los lpidos complejos, los cuales no son saponificables, incluyen a la clase bioqumicamente importante de los esteroides. Los esteroides se obtienen de una estructura bsica (figura 3.12). Los animales sintetizan un gran nmero de esteroides, los cuales tienen

diversos papeles fisiolgicos y bioqumicos, incluyendo a su funcin como hormonas. Algunos ejemplos son: colesterol, cortisona y testosterona. 3.5.4 Protenas Las protenas son las molculas orgnicas mas abundantes de las clulas vivas, comprendiendo entre el 30% y el 70% del peso seco total de las clulas. Son componentes celulares muy importantes puesto que son copiados de la informacin gentica de la clula y, posteriormente, dirigen la maquinaria metablica de ella. Componentes estructurales bsicos de la clula

Las protenas se componen invariablemente de carbono, oxigeno y nitrgeno; casi todos contienen azufre. Adems, algunas protenas contienen otros elementos como fierro, fosforo, zinc y cobre. El peso molecular de las protenas vara desde 5000 hasta ms de 40 millones. Sin embargo, ciertas cadenas peptdicas, como las que se asocian con el peptidoglucano,

constan de pocos aminocidos con pesos moleculares tan bajos como 240. Las protenas y pptidos se componen de -aminocidos, los cuales representan las unidades de construccin de las protenas. Existen 20 -aminocidos comunes (tabla 3.9) unidos entre si mediante enlaces peptdicos (figura 3.13) para formar polmeros grandes, no ramificados o cadenas polipetdicas. Los enlaces peptdicos se forman por una reaccin de condensacin entre el grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino de un segundo aminocido (figura 3.13). El numero y secuencia de los residuos aminocidos en una cadena polipeptdica (protena) determinan la funcin y la actividad cataltica (si existe). El peso molecular promedio de un aminocido es 138. Sin embargo, puesto que se pierde una molcula de agua en la formacin de un enlace peptdico, el peso molecular promedio de un residuo de aminocido en una protena es de 120. Las protenas se dividen en dos categoras principales: protenas simples y conjugadas. Las protenas simples se componen solamente de aminocidos con aproximadamente 50% de carbono, 7% de hidrogeno, 23% de oxigeno, 16% de nitrgeno y ms de 3% de azufre. Las protenas conjugadas contienen, adems de los aminocidos, otro material orgnico o inorgnico llamado el grupo prosttico de la protena. Estas protenas conjugadas se clasifican de acuerdo a la composicin qumica del grupo prosttico. As, las nucleoprotenas contienen acido nucleico; las lipoprotenas contienen lpido o fosfolpido; las glicoprotenas contienen carbohidratos; las hemoprotenas contienen una estructura de porfirina asociada con fierro; las flavoprotenas contienen grupos flavin y las metaloprotenas contienen iones metlicos. La estructura y, en consecuencia, la funcin de una molcula de protena, est gobernada no solo por su composicin de aminocidos, sino tambin por su forma tridimensional caracterstica o conformacin. Muchos de los aminocidos tienen cadenas laterales ya sea hidrofbicas (no polares) o hidroflicas (polares), que determina la manera en la cual se dobla una molcula de protena. Adems, el aminocido cistena contiene un grupo sulfhidrilo (- SH) que puede reaccionar con otra cistena para formar un enlace sulfhidril covalente (figura 3.14). estos enlaces, junto con fuerzas de van der waals, puentes de

hidrogeno e interacciones polares, son los causantes de la conformacin tridimensional de una protena. Existen dos conformaciones principales de las protenas (figura 3.15): 1) Fibrosas 2) Globulares

Las protenas fibrosas son ms fuertes fsicamente y son insolubles en agua o soluciones acuosas diluidas. Se componen de cadenas polipetdicas arregladas en paralelo a lo largo de un solo eje para formar fibras grandes o laminas (figura 3.15). Representan los componentes estructurales bsicos del pelo (queratina), cuero, uas, colgeno y tendones de los animales superiores, as como de los flagelos, cilios y pilis de los microorganismos. Las protenas globulares consisten en cadenas polipetdicas estrechamente empaquetadas dobladas en formas esfricas o globulares (figura 3.15). Por lo general, son solubles en solucin acuosa y se difunden con rapidez. En consecuencia, son bastante mviles en el citoplasma celular y, a menudo, tienen una funcin cataltica (enzimas). Por lo tanto, la mayora de las enzimas y protenas de transporte son protenas globulares. Se observa que hay tres niveles diferentes de estructura protenica, las cuales se pueden resumir como sigue:

Componentes estructurales bsicos de la clula

1) estructura primaria. Secuencia de los residuos de aminocidos unidos por medio de enlaces peptdicos. 2) Estructura secundaria. Se refiere a la forma de la extensin o del enrollamiento helicoidal de la cadena polipeptdica, en particular en las protenas fibrosas, la cual es resultado principalmente del establecimiento de puentes de hidrogeno entre los aminocidos. 3) Estructura terciaria. Se refiere al doblamiento y curvatura de la cadena para formar protenas globulares inducidas por enlaces disulfuro covalentes, puentes de hidrogeno o enlaces salinos e interacciones hidrofbicas e hidroflicas.

4) Estructura cuaternaria. Es la manera en la que las cadenas polipetdicas individuales se renen para formar una protena multimrica. Los enlaces responsables del establecimiento de la estructura cuaternaria son similares a los mencionados en 3).

Las protenas que tienen ms de una cadena polipeptdica se denominan protenas multimricas u oligomtricas, y cada polipptido se conoce como subunidad o protmero.

Procesos qumicos de la clula

En general, la mayora de las protenas grandes tienen dos o ms subunidades que pueden o no poseer ningn enlace covalente entre ellas. Ejemplo de protenas oligomricas son las enzimas, hexocinasa de las levaduras (4 subunidades), triptfano sintetasa (4 subunidades), lactato deshidrogenasa (4subunidades) y la sintetasa de cidos grasos (21 subunidades), aunque la ribonucleasa y la lisozima poseen una sola subunidad. De ordinario, las subunidades estn asociadas estrechamente, aunque puede no haber enlaces

covalentes. En consecuencia, la protena acta como una sola molcula y, de hecho, casi siempre se requieren todas las subunidades para el funcionamiento ptimo de la protena. En la tabla 3.10 se listan algunas de las protenas que se encuentran ms comnmente en la naturaleza y su funcin. Una de las clases principales de protenas son las enzimas, las cuales funcionan como catalizadores biolgicos. Esta clase de protenas se considerara con ms detalle en el captulo sobre Cintica enzimtica.

3.5.5 cidos nucleicos

Los cidos nucleicos se componen de nucletidos y participan en el almacenamiento, replicacin, transcripcin y transferencia de la informacin gentica. Los nucletidos tambin tienen funciones importantes en el metabolismo, particularmente en reacciones de transformacin de energa. Los nucletidos sirven como enzimas portadoras de energa, como coenzimas en la transferencia de acido actico, azucares, aminas y otras molculas y como enzimas en reacciones de oxido reduccin. Los mononucletidos se componen de una base nitrogenada, un azcar de 5 carbonos y acido fosfrico. Hay dos clases de bases nitrogenadas: las pirimidinas y las purinas. En los nucletidos se encuentran comnmente tres bases pirimdicas: uracilo, timina y citocina (figura 3.16) y, en una cantidad menor 5-metilcitocina y 5-hidroximetilcitocina. Hay dos bases pricas principales, a saber: adenina y guanina (figura 3.16) y formas menores como 2-metiladenina y 1-metilguanina. Los nuclesidos son similares a los nucletidos excepto que carecen del grupo fosfato unido en la posicin 5 del anillo de la ribosa (azcar de 5 carbonos). Hay dos tipos de nuclesidos: los ribonuclesidos que contienen D-ribosa como el componente azcar y los 2-desoxirribonucleosidos, que contienen 2-desoxi-D-ribosa (figura 3.17). los cuatro ribonuclesidos principales son la 2-desoxiadenosina, 2-desoxiaguanosina, 2desoxicitidina y 2-desoxitimidina. Estos nuclesidos no se encuentran en cantidades apreciables en forma libre dentro de las clulas.

Los nucletidos son steres de nuclesido con acido fosfrico y, otra vez, son de dos tipos, a saber: los ribonucletidos, que contienen D-ribosa y los desoxirribonucletidos, los cuales contienen 2-desoxi-D-ribosa. Es comn encontrar a los nucletidos en forma libre en el interior de las clulas. Los ribonucletidos son los constituyentes principales (bloques de construccin) de cidos ribonucleicos (RNA) y los desoxirribonucletidos de los cidos desoxirribonucleicos (DNA). El grupo de acido fosfrico, en general, se encuentra unido en la posicin 5 de la D-ribosa o de la 2-desoxi-D-ribosa, pero puede asociarse con las posiciones 2o 3e incluso formar grupos de acido fosfrico cclicos, en forma notable, la adenosina-3, 5-monofosfato (AMP cclico), la cual es un compuesto importante en la regulacin del metabolismo (figura 3.18). Los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos pueden existir dentro de la clula como 5monofosfatos (nucletidos), 5-difosfatos y 5-trifosfatos (figura 3.19). Estos grupos fosfato forman complejos con Mg2+ y Ca2+ dentro de la clula y tiene funciones muy importantes. La ATP (adenosina-5-trifosfato) es el portador primario de energa en la clula, que transfiere energa desde reacciones catablicas (oxidativas) a reacciones anablicas (biosintticas) (ver capitulo 6). Los nuclesidos di- y tri- fosfatos sirven tambin como portadores de molculas especificas. As, la UDP (uridina difosfato) es un portador especfico de residuos azcar en la sntesis de polisacridos, esto es, como UDP-glucosa para la biosntesis de glucgeno. Los nuclesidos trifosfato funcionan tambin como precursores de unidades de mononucletidos para la sntesis de DNA y RNA. Existe gran cantidad de otros mononucletidos importantes que contienen bases que no se encuentran en los cidos nucleicos. La nicotinamida adenina dinucletido (NAD) y su forma fosforilada (NADP), as como la flavina mononucletido (FMN) y la flavina adenina dinucletido (FAD) (figura 3.20 y 3.21), son compuesto cuya funcin

Protena Enzimas Ribonucleasa

Localizacin o funcin

Hidroliza RNA

Citocromo C Tripsina Hexocinasa Amilasa

Transfiere electrones Hidroliza algunas protenas Fosforila glucosa y azucares relacionados Hidroliza almidn y glucgeno

Protenas de almacenamiento Ovoalbmina Lactoalbmina (casena) Protena de la clara de huevo Protena de la leche

Protenas de transporte Hemoglobina Mioglobina Albumina de suero Transporta O2 en la sangre Transporta O2 en el msculo Transporta cidos grasos en la sangre

Protenas contrctiles Miosina Actina Dinena (flagelina) Filamentos estacionarios en las miofibrillas Filamentos mviles en las miofibrillas Cilios y flagelos

Protenas protectoras Anticuerpos trombina Forman complejos con protenas extraas Componente del mecanismo de coagulacin de la sangre.

Toxinas toxina de clostridiumbotulinum Causas de envenenamiento de alimentos por bacterias toxina diftrica venenos de serpiente Causa de la difteria Enzimas que hidrolizan a fosfoglicridos

Hormonas

Insulina Hormona de crecimiento

Regula el metabolismo de la glucosa Estimula el crecimiento seo

Protenas estructurales Glicoprotenas Protenas de la estructura de la membrana queratina esclerotina protenas de la cubierta viral colgeno Piel, plumas, uas, pezuas, etc. Exoesqueletos de insectos Cubierta alrededor del cromosoma Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso, cartlago) Tabla 3.10 algunas protenas comunes y su funcin. Paredes y cubiertas celulares Componente de las membranas

Principal es actuar como cofactores o enzimas en reacciones de xido reduccin en el interior de la clula. Otro mononucletido importante es la coenzima A (CoA-SH) (figura 3.22), la cual contiene adenina y la vitamina cido pantotnico. La CoA interviene en la transferencia de grupos acetato y cidos grasos en relaciones celulares, por ejemplo, en la formacin de citrato catalizada por la enzima citrato sintasa:

El DNA (cido desoxirribonucleico) es un biopolmero no repetitivo que contiene toda la informacin gentica celular (en ciertos virus esta funcin la tiene el RNA). Durante la divisin celular, cada clula hija recibe una copia exacta y completa de DNA parental. En los procariotas (bateras, algas verde azules) hay una molcula de DNA nica que forma un solo cromosoma, el cual tiene un peso molecular superior a 2 x 109 y constituye

aproximadamente el 1% del peso seco de la clula. En los eucariotas (levaduras, hongos, animales y plantas superiores) generalmente existen algunos cromosomas (molculas de DNA) los cuales, en clulas diploides, se presentan en el ncleo en forma combinada con protenas bsicas llamadas histonas. Adems del DNA nuclear, las clulas eucariotas contienen DNA satlite, especialmente en las mitocondrias y en los

cloroplastos, el cual es diferente del DNA nuclear. El DNA procaritico de ordinario est unido a un pliegue o invaginacin de la membrana celular llamado mesosoma en la regin nuclear (los procariotas no poseen un ncleo verdadero). No hay protenas asociadas con DNA. Los procariotas tambin pueden tener material extracrosomal denominado plasmidos o episomas, de los cuales se tratar en captulos posteriores sobre biologa molecular. Todas las molculas de DNA estn formadas en cuatro unidades de mononucletidos principales unidas entre s por enlaces 3, 5 fosfodister (figura 3.23) para formar una cadena de polinucletido larga y sin ramificaciones. Dos de tales cadenas, las cuales son

complementarias una de la otra, se combinan para formar una estructura de doble hlice en la que las dos cadenas permanecen juntas por la formacin de puentes de hidrogeno entre pares de bases complementarias. As, la adenina de una cadena siempre est unida por puentes de hidrogeno con la timidina de la segunda cadena y la citosina se une por puentes de hidrogeno a la guanina. Los enlaces de hidrogeno estabilizan a la molcula de doble hlice del DNA y, puesto que las bases G-C se unen por tres de tales enlaces en comparacin con dos entre las bases A-T, mientras mayor es la cantidad de pares de bases guanosina-citocina (G-C), la molcula de DNA es ms estable (figura 3.24). Dentro de la clula el RNA (cido ribonucleico) existe en tres formas, a saber: RNA mensajero (mRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA ribosomal (rRNA). Todas consisten en una cadena

individual de polirribonucletido compuesta en cuatro ribonucletidos principales (aunque el tRNA contiene adems algunos ribonucletidos inusuales que incluyen a los cidos pseudouridlico y ribotimidlico). En los procariotas todos los RNAs se encuentran en el citoplasma, en tanto que en los eucariotas el rRNA se localiza en el citoplasma (en los ribosomas) y el mRNA y el tRNA se encuentran en el ncleo, mitocondrias, cloroplastos y citoplasma. El mRNA se sintetiza por transcripcin enzimtica de una hebra de la molcula de DNA. Las bases que constituyen la hebra individual de mRNA son complementarias a dicha hebra

(excepto que el uracilo reemplaza a la timina). Despus de la transcripcin, el mRNA pasa a los ribosomas donde sirve como molde para el ordenamiento secuencial de los aminocidos durante la sntesis de protenas. Los tripletes de nucletidos (codones) a lo largo de la hebra de mRNA determinan un aminocido especfico.

Los tRNAs son molculas pequeas (23000 30000 de peso molecular) que actan como portadores de aminocidos especficos. Durante la sntesis de protenas, cada uno de los 20 aminocidos ms comunes tiene al menos un tRNA especfico que lo conduce hasta el

mRNA que se encuentra unido al ribosoma. Una vez all, el tRNA transfiere el aminocido correspondiente a la cadena polipeptdica en crecimiento. El rRNA constituye hasta el 65% del peso de los ribosomas y se divide en tres tipos, a saber: rRNA 23S, 16S y 5S, dependiendo de su capacidad para sedimentar en la centrifugacin. Durante la sntesis de protenas, el mRNA se une al ribosoma, y un tRNA se adhiere al mRNA y transfiere su aminocido a la cadena polipeptdica en crecimiento; el ribosoma se mueve entonces a lo largo

delmRNA hasta el codn prximo que da la informacin para el aminocido siguiente. La sntesis de protenas se explicara con ms detalle ms adelante, sin embargo, la verdadera funcin de los diferentes tipos de rRNA se desconoce an.

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BIOLOGA MOLECULAR 4.1 LOCALIZACION Y ESTRUCTURA DEL MATERIAL HEREDITARIO 4.1.1. Introduccin El DNA es la ubicacin de la informacin hereditaria y est contenido en estructuras conocidas como cromosomas. Las clulas contienen cromosomas que se duplican antes de la divisin celular. En este captulo se analiza la estructura del DNA de procariotas y eucariotas, y el mecanismo mediante el cual se duplica el DNA durante el crecimiento y divisin celular. Se estudia la naturaleza del cdigo gentico, tal como es el mecanismo mediante el que la estructura del DNA imparte la informacin que da como resultado la sntesis de protenas. Se explica tambin la base molecular del gen, los tipos de mutacin y los mecanismos de mutagnesis. 4.1.2. El material gentico es DNA En 1944, Avery demostr que el DNA (cido desoxirribonucleico) es el material que transfiere informacin gentica de una herencia a otra. Ahora se sabe que, con pocas excepciones, el DNA es la informacin hereditaria de los sistemas biolgicos. El DNA es un polmero cuyas unidades estn constituidas por cuatro nucletidos distintos. Cada nucletido consta de tres componentes: 1)Una unidad de desoxirribosa. 2)Un grupo fosfato.3)una base nitrogenada que puede ser una purina (adenina o guanina) o una pirimidina (citosina o timina). La molcula de DNA tiene polaridad porque los nucletidos estn unidos por su residuo fosfato, cada uno de los cuales une el tomo de carbono 3de una molcula de desoxirribosa, con el tomo de carbono 5de la siguiente molcula de desoxirribosa. Lo anterior de un enlace fosfodister 3-5y, por convencin, las secuencias de DNA se escriben con el radical fosforil libre a la izquierda. Las secuencias del lado 5de un nucletido a menudo se denominan cuesta arriba y las del lado 3se denominan cuesta abajo. Adems de las bases comunes descritas anteriormente, pueden surgir algunas bases raras mediante la adicin de grupos metil e hidroxi, como la base hidroximetilcitosina que reemplaza a la citosina en algunos bacterifagos.

4.1.3. Generalmente el DNA es una hlice doble Los primeros experimentos qumicos demostraron que la adenina y la timina, as como la guanina y la citosina, se presentan en cantidades equimolares en el DNA. Con esta informacin y con datos obtenidos por cristalografa de rayos X, Watson y Crick pudieron proponer su modelo tridimensional para la estructura del DNA. Concluyeron que la cadena de polinucletidos es una doble hlice, el dimetro de la cadena es de 2nm, la cadena cambia de direccin cada 3-4nm, la distancia entre bases es de 0.34nm y la hlice se compone de dos cadenas de polinucletidos.(figura 4.1 y 4.2). El esqueleto de las dos cadenas que se enrollan entre s estn formadas por grupos azcarfosfato de polaridad opuesta. Las bases estn dispuestas en ngulos rectos con respecto al esqueleto hacia el centro de la molcula, lo que permite la unin de la guanina con la citosina y de la adenina con la timina mediante enlace hidrgeno. El hecho de que las bases se unan slo en estas combinaciones es una caracterstica del DNA. 4.1.4. Las molculas de DNA varan en longitud y empaquetamiento Las molculas deDNA slo se pueden analizar con ayuda de un microscopio electrnico y se ha encontrado que aparecen de diversas formas en diferentes organismos. El DNA de los procariotas es de forma circular y se dice que estos organismos tienen un solo cromosoma. El contenido de DNA en estas bacterias es bajo como en las clulas de Escherichia coli (3.8X 103 pares de kilobases). Los eucariotas tienen complejidad gentica mayor y grandes cantidades de DNA. Las molculas de DNA lineal tienen la forma de los cromosomas que estn ubicados en el ncleo. Los eucariotas inferiores, como los hongos, tienen poca cantidad de DNA. Por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae tiene 34 pequeos cromosomas con aproximadamente 14 X 103pares de kilobases por clula. La cantidad de DNA tiende a aumentar en los organismos ms complejos, por ejemplo, las clulas del hombre contienen 5.6 X 106 pares de kilobases, pero, en particular, las plantas y los anfibios parecen tener mucho ms DNA. La rana tiene 45 X 106 pares. Los cromosomas de los eucariotas tienen estructuras caractersticas determinadas por las protenas (histonas) asociadas al DNA. Tanto las molculas de DNA circular como las de los cromosomas lineales, se enrollan varias veces sobre s mismas, lo cual reduce la

longitud de la estructura, misma que es estabilizada por las protenas asociadas. En las clulas humanas el DNA se extender hasta 230nm de longitud, pero en el ncleo est empaquetado en un organelo cuyo dimetro es de aproximadamente 5 X 10 -3nm. El empaquetamiento del DNA de los cromosomas eucariticos est asociado con muchas protenas, siendo las ms estudiadas las histonas las cuales son responsables de la estructura de la cromatina (fibras de nucleoprotenas) y en el transcurso de la evolucin se han conservado en gran medida.

Figura 4.1. Asociacin de bases de dos cadenas de DNA( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983). 4.2. LA REPLICACIN DEL DNA ES SEMICONSERVATIVA Cuando una clula se divide en dos, cada una de las hijas contiene el complemento total de informacin gentica (excepto en las divisiones que originan vulos y espermatozoides). El DNA debe replicarse en forma precisa; lo cual se logra mediante la separacin de las dos cadenas, seguidas por la asociacin de los nucletidos de las hebras sencillas con las bases complementarias mediante puentes de hidrogeno ( figura 4.2).

Esto significa la asociacin de la guanina con la citosina y la de la cadena sencilla, los primeros se unen entre s. La sntesis del DNA nuevo la realizan las enzimas conocidas como DNA polimerasas. El DNA se sintetiza en forma continua sobre una cadena del DNA (cadena 3- 5) conocida como cadena principal, empero, la cadena 3-5est mal orientada para la sntesis continua mediante la enzima DNA polimerasa. En esta cadena de DNA, la sntesis ocurre en fragmentos de aproximadamente 100 nucletidos, llamados fragmentos de Okasaki (figura 4.3). La replicacin del DNA significa, por lo tanto, la asociacin de una cadena original con una nueva y se dice es semiconservativa. Hay otras enzimas que participan en la sntesis de DNA. Entre stas estn el cido ribonucleico (RNA), polimerasas y nucleasas, ya que las molculas de acido ribonucleico actan como iniciadoras de la replicacin del DNA, y la DNA ligasa que sirve para unir entre s fragmentos de Okasaki adyacentes. Hay otras enzimas encargadas de relajar el enrollamiento del DNA para permitir la replicacin en las horquillas de replicacin. El proceso de tal actividad es ms complicado en los eucariotas debido a la estructura cromosmica ms compleja. En E. coli, la replicacin del DNA comienza en un sitio especfico del cromosoma llamado Ori C. Este es un tramo de 440 pares de bases (pb) cuya funcin normal da por resultado la replicacin del DNA lejos de este origen en ambas direcciones. El anlisis de otros sitios de iniciacin de replicacin de DNA procaritico han revelado regiones conservadas repetidas de 12 pb con zonas espaciadoras de 16 pb. Probablemente stas permiten la unin de las protenas al DNA en las secuencias conservadas y la iniciacin de la replicacin del DNA. Aunque la replicacin del DNA en los eucariotas se comprende menos, se han hecho algunos adelantos mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiaecomo sistema modelo. A partir de este organismo se han aislado secuencias que permiten replicar pequeas molculas circulares de DNA llamadas plsmidos. Las secuencias se denominan Autonomously Replicating Sequences, ARS, (Secuencias de replicacin autnoma), es posible que funcionen de forma similar a Ori C.

Figura 4.2. Mediante la replicacin semiconservativa del DNA se generan hlices hijas idnticas dobles. ( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).

Figura 4.3. Sntesis continua y discontinua de dos hebras de DNA durante la replicacin.

4.3 CIDO RIBONUCLEICO (RNA) La expresin de la informacin gentica contenida en el DNA es transmitida por una molcula de RNA mensajero. sta transfiere la informacin del DNA al sitio donde se efecta la sntesis de protenas, los ribosomas.la diferencia entre el RNA y el DNA es que en el RNA la base uridina sta en lugar de la timina, la azcar ribosa reemplaza a la desoxirribosa y, por lo general, es una molcula de una sola hebra, aunque sus bases se pueden asociar mediante puentes de hidrgeno para dar origen a regiones internas de doble hebra. 4.3.1. Transcripcin del DNA El RNA mensajero que transfiere la informacin gentica es transcrito del DNA mediante una enzima RNA polimerasa dependiente del DNA. Para que esto ocurra las cadenas de DNA deben separarse slo una cadena, se usa como molde con las bases de RNA unidas por puentes de hidrgeno con el DNA. La RNA polimerasa dependiente del DNA, cataliza la formacin de enlaces fosfodister entre las unidades nucleotdicas que parten del extremo 5del DNA (figura 4.4). E.coliposee slo una de estas polimerasas, pero los eucariotas tiene por lo menos cuatro clases, que posiblemente reconocen secuencias distintas de unin o iniciacin.

La RNA polimerasa de E. coli, que ha sido objeto de estudios detallados, es un tetrmero (cuatro subunidades). Se necesita un polipptido adicional denominado sigma para la iniciacin exacta; algunas veces, se requiere de un factor, rho, para terminar la transcripcin.

Figura 4.4. Una cadena de RNA se sintetiza ( transcribe) sobre una regin local de hebra sencilla de DNA.( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).

4.3.2. Tipos de RNA El RNA mensajero (mRNA) es slo uno de varios tipos de molculas de RNA que se encuentran en la clula. El tamao del RNA vara entre procariotas y eucariotas. En los primeros, a menudo se codifican varios mensajes en una sola molcula de m RNA, pero en los eucariotas los transcritos primarios, los m RNA, a menudo son mucho ms grandes que el m RNA maduro final, el cual es el resultado del proceso del m RNA. Una caracterstica importante del m RNA es que no slo contiene informacin para protenas especficas, sino tambin otras secuencias laterales que intervienen en el mecanismo de la sntesis de protenas. El RNA ribosomal (r RNA) es el componente estructural principal de los ribosomas, que son el sitio de la sntesis de protenas. En los procariotas hay tres molculas distintas de r RNA, en tanto que en los eucariotas hay cuatro. Hay mltiples copias de las especies de r RNA en el DNA, que junto con las protenas conforman las subunidades grandes y pequeas de los ribosomas.

El RNA de transferencia (r RNA), es el ms pequeo de los RNA, con aproximadamente 80 nucletidos. En una clula existen alrededor de40 a 60 especies diferentes de t RNA. ste se distingue de los otro RNA por contener frecuentemente nucletidos poco comunes. Los t RNA tienen similitudes estructurales considerables; la estructura secundaria incluye configuraciones asociadas internas. Cada t RNA contiene una secuencia caracterstica conocida como anticodn situada en el extremo de un lazo no asociado en un extremo de la molcula. El anticodn se asocia con ciertas secuencias del m RNA. En el extremo 3del t RNA est una secuencia CCA, a la cual se pueden unir aminocidos especficos. Las molculas de t RNA portadoras de aminocidos, junto con el mensaje transcrito en el m RNA, permiten que la informacin gentica se traduzca en los ribosomas en una protena. 4.4. EL CODIGO GENETICO En la descripcin del material hereditario, su replicacin y transcripcin y el sitio de la traduccin, no se hizo mencin de la naturaleza del cdigo gentico en s. La unidad funcional del DNA es el gen y en este contexto el cdigo gentico de ( o clave gentica) un gen individual dirige la sntesis de una protena especifica mediante la transcripcin hacia el m RNA, seguida por la traduccin hacia una protena en los ribosomas. Los genes tambin llevan la informacin para las molculas de RNA. El cdigo en si se determina por una secuencia de tres nucletidos (un triplete) para cada aminocido. Como esto produce 64 combinaciones posibles y hay 20 aminocidos, entonces algunos aminocidos son codificados por ms de un triplete. El triplete que da la clave a un aminocido, como en el m RNA, se conoce como codn. Las posibles combinaciones del cdigo gentico se muestran en la tabla 4.1 para los codones de los 20 aminocidos presentes en las protenas. Adems, se usan tres codones como seales de detencin durante la traduccin, los cuales se denominan codones sin sentido. Los codones son llevados por el m RNA y la informacin complementaria, o anticodn, se encuentra en la hebra transcrita del DNA y tambin en el t RNA. Los

A la izquierda se muestra la primera letra de cada uno de los 64 tripletes, arriba la segunda letra y a la derecha la tercera letra. Los tres tripletes designados como terna son los de terminacin de la cadena. La tabla ilustra claramente de la degeneracin del cdigo se debe en gran medida a la irrelevancia de la base en la tercera porcin. (Tomado de SmithKeary(1977) Genetic structure and funtion. Macmillan.) Codones indicados en la tabla 4.1 muestran que las dos primeras bases tienen el efecto mayor al especificar un aminocido particular, pero que la tercera base puede variar a menudo sin afectar al sentido del codn. Por ejemplo, tanto el codn UUU como el UUC, conducen a la incorporacin del aminocido fenilalanina.

El codn AUG para la metionina casi siempre se usa como codn de iniciacin para que el primer aminocido sea incorporado en un polipptido con una sucesin de tripletes que especifica a los aminocidos hasta que se llegue a un codn sin sentido y se termina la traduccin. 4.4.1 Traduccin de la informacin gentica El codn de iniciacin de la traduccin es AUG, el cual es el nico codn para la metionina, pero hay dos molculas de tRNA que tiene el anticodn para AUB ( es decir, CAU). Uno de estos se usa siempre para la iniciacin en los procariotas (RNAm met). El cual lleva una N-formilmetionina; para insertar la metionina en posiciones internas en los polipeptidos se usa un tRNA diferente (tRNA met). En los eucariotas tambin existen dos molculas de tRNA para la metionina, pero la forma de iniciacin no est formulada. En general el aminocido N-terminal de las protenas maduras no es metionina, lo cual indica que este residuo es separado de la protena despues de la traduccin. El proceso de iniciacin incluye la unin de un tRNA de iniciacin para la metionina con el mRNA, junto con la presencia de cofactores (figura 4.5). a continuacin el complejo se une con la subunidad pequea del ribosoma mediante la asociacin de las bases de la regin 5 del mRNA y el rRNA 18S (en eucariotas) o 16S (en procariotas). La reaccin de iniciacin va seguida por el periodo de elongacin del polipptido. Esto significa que la smoleculas posteriores de tRNA se asocie con los codones subsecuentes. Cuando un codn nuevo se asocia con el tRNA, el residuo de aminocidos se tranfiere al grupo amino del aminocido entrante. Luego, el denominado tRNA previo sin carga se disocia y un tRNA se deja con un polipptido en crecimiento. Esta reaccin se lleva a cabo a una rapidez de unos 100 residuos por segundo. La fase final de la traduccin ocurre cuando se llega a un codn sin sentido y no hay tRNA correspondiente. Luego, el polipptido es hidrolisado lejos del ultimo tRNA; se disocia el mRNA y las subunidades ribosomales. En la prctica es comn encontrar varios ribosomas espaciados en una molecula de mRNA separados por unas 80-100 bases. Esas estructuras se denominan polisomas.

4.5 MUTACIN Una vez que se ha descrito el material hereditario, su cdigo y su traduccin, es ms fcil entender la naturaleza de las mutaciones. Estas se originan debido a perturbaciones en el cdigo gentico y ocasionan cambios en la regulacin o funcionamiento de las protenas. Por ejemplo, un tipo de mutacin simple se origina cuando se altera la secuencia de nucletidos, ocasionando un cambio en el sentido del codn. Hay muchas formas de clasificar la mutacin, estas ilustran los mecanismos y efectos de las mutaciones. El estadio de la mutacin y el marco conceptual para comprender el proceso de la mutagnesis se basan principalmente en el estudio de los procariotas y sus virus. Los eucariontes inferiores, en particular Saccharomyces cerevisiae, tambin ha aportado evidencia moleculares

comparativas que muestran algunas diferencias entre eucariontes y procariontes. Por ejemplo, diferentes sistemas celulares inician mecanismos de reparacin de DNA, que mantiene al DNA, si este se daa. Son tiles dos conceptos acerca del origen de las mutaciones, que son,: que las mutaciones pueden surgir por mala replicacin de DNA, es decir, por errores en la replicacin del DNA, o bien, por una mala reparacin, es decir, por errores durante la reparacin del DNA daado. Parece ser que la replicacin del DNA es mas discriminatoria en los eucariontes, como tambin la reparacin del dao del DNA inducido por agentes mutagnicos. Por lo tanto existe una tendencia de fagos a procariotas y a eucariotas inferiores hacia la presencia de reparacin errnea como fuente de mutacin.

4.5.1 Mutaciones cromosmicas Las mutaciones se pueden clasificar como mutaciones puntuales o mutaciones cromosmicas. Las mutaciones cromosmicas son cambios bruscos ya sea en el numero o estructura de los cromosomas, en tanto que las mutaciones puntuales son cambios pequeos a travs de los nucletidos. El dao al DNA causado por agentes mutagnicos puede ocasionar errores en la transmisin hereditaria de cromosomas completos y, por lo tanto, puede causar la prdida o ganancia de estos. Tambin puede suceder que los cromosomas se rompan, y estos tengan afinidad por otros cromosomas rotos dando lugar a liberaciones cromosmicas. Estas pueden

ocasionar la transferencia de un cromosoma a otro (translocacin); la perdida de material gentico (deleccin); o bien, la inversin de una porcin del cromosoma si ocurren dos rupturas en el mismo cromosoma. 4.5.2 Mutacin por sustitucin de bases Los cambios en la secuencia de nucletidos pueden alterar el sentido del cdigo gentico dando como resultado un aminocido diferente en un polipptido o un polipptido truncado si el cambio es de un codn con sentido a uno sin sentido.Los efectos de tal mutacin, es decir, el fenotipo, dependen del lugar de la mutacin. Es evidente que una mutacin sin sentido que produce una protena truncada, causar la ausencia de la actividad protenica particular, amenos que la mutacin tenga lugar cerca del extremo normal del polipptido. Las mutaciones sin sentido que producen un cambio en un aminocido de un polipptido tendrn un efecto que depende de la posicin del aminocido en la protena. Es claro que los cambios en el lugar activo o en una posicin que afecta la estructura dela protena tendrn mayor efecto. Algunos cambios causaran unja disminucin en la actividad de la protena dando como resultado una mutacin rezumante. Sin embargo, algunas mutaciones por substitucin de bases no producen un cambio en el sentido debido a los codones mltiples de algunos aminocidos. Es obvio que estas no tienen efecto sobre el producto protenico. 4.5.3 Mutacin por cambio en el marco de lectura Estas mutaciones son el resultado de inserciones o delecciones de bases, estas alteran el marco de lectura del DNA y alteran la secuencia de codones posterior. El efecto de la mutacin por cambio en el marco de lectura es dar una protena no funcional, por ejemplo (figura 4.6); ABC ABC ABC ABC ABC Wild-tipo de secuencia ABC ABC AAB BCA CAB BCA CAB BCA Figura 4.6 CAB BCA Insercin Eliminacin

Estas mutaciones pueden ocurrir, por supuesto, con mltiplos de una base. Los mltiplos de tres bases deben ser aadidos o eliminados, as el marco de lectura no se altera, pero los aminocidos se aaden o eliminan en el polipptido final. 4.5.4 Mutacin espontnea e inducida Las mutacin puede surgir ya sea espontneamente o debido a la induccin con un agente mutagnico. La mutacin espontanea puede ocurrir debido ala radiacin de fondo, errores en la replicacin de DNA o inclusive por modificaciones tautomricas de

entonces para precipitar mRNA para la proteina de interes mientras se produce en el ribosoma. As, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describi y se obtiene una copia de cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen secuencias interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la produccin de cDNA es crtica en la representacin de secuencias codificadoras cuando es necasaria la expresion en

los organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y proceso de secuencias no codificadoras.

4.6.4. Mapeo con la nucleasa S1:

El anlisis de la enzima de restriccin permite indicar la posicin de los genes al cortarlos, o bien, sus secuencias laterales efectuarn su expresin cuando se analice la formacin de producto gnico en los fragmentos. Las secuencias laterales intervienen en funciones tales como la regulacin, la unin de la RNA polimerasa y la unin ribosmica. La nucleasa S1 digiere nicamente DNA o RNA de una sola hebra. El mapeo con la mucleasa S1 es una herramienta muy til para ubicar el sito de transcripcin en el DNA. Mediante la hibridacin de una RNA transcriptasa a DNA de una sola hebra, se produce un hibrido resistente a la digestin por la nucleasa S1. As, es posible desnaturalizar el hbrido DNA-RNA y analizar y separar el DNA.

4.6.5 Electroforesis en gel:

En forma rutinaria, las molculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel. El gel es una red compleja de molculas polimricas y distancia que el DNA migra a

Biologa molecular

cada 256 pares de bases. Por lo tanto, es probable ya que un gen tpico de procariotas tiene de 1 a 2 pares de kilobases (1000 bases), que por lo menos algunas endonucleasas de restriccin que reconocen 6 pares de bases, no corten tal secuencia. En los eucariotas los genes pueden ser ms grandes y contener secuencias interpuestas llamadas intrones, que pueden causar complicaciones. 4.6.3 Aislamiento de cDNA

Se puede obtener genes determinados mediante la elaboracin de DNA complementario a un RNA mensajero (mRNA) particular. Este enfoque se utiliza ampliamente en estudios con plantas y mamferos. El mRNA se puede aislar fcilmente debido a su extremo poliadenilado de hasta 200 nucletidos de longitud.

Ingeniera gentica

El RNA crudo se pasa a travs de una columna que contiene secuencias de poli U o poli T unidas a un soporte slido, que une a las secuencias de polo A del mRNA. As, la transcriptasa reversa puede usarse para sintetizar una molcula de DNA de una sola hebra la cual se puede convertir posteriormente a una hebra doble mediante una DNA polimerasa (figura 4.9). El cDNA se puede incorporar en vectores para su amplificacin y anlisis. En ciertos casos los anticuerpos monoclonales se pueden usar para aislar un mRNA solo a partir de los componentes celulares. Los anticuerpos monoclonales se obtienen, se inyectan a un ratn o a un conejo con la protena para la que se requiere el cDNA. El animal se sacrifica posteriormente para obtener las clulas del bazo, las cuales se fusionan con clulas de mieloma. Las clulas denominadas hibridomas producen un anticuerpo muy especfico para la protena blanco (figura 4.10). El anticuerpo se utiliza entonces para precipitar mRNA para la protena de inters mientras se produce en el ribosoma.

Biologa molecular

As, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describi y se obtiene una copia de cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen secuencias interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la produccin de cDNA es crtica en la representacin de secuencias codificadoras cuando es necesaria la expresin en los organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y proceso de secuencias no codificadoras. 4.6.4 Mapeo con la nucleasa S1

El anlisis de la enzima de restriccin permite indicar la posicin de los genes al cortarlos, o bien, a sus secuencias laterales efectuaran su expresin cuando se analice la formacin de producto gnico en los fragmentos. Las secuencias laterales intervienen en funciones tales como la regulacin, la unin de la RNA polimerasa y la unin ribosmica.

La nucleasa S1 dirige nicamente DNA O RNA de una sola hebra.El mapeo con la nucleasa S1 es una herramienta muy til para ubicar el sitio de transcripcin en el DNA.

Mediante la hibridacin de una RNA transcripatasa a DNA de una sola hebra, se produce un hibrido resistente a la digestin por la nucleasa S1. As, es posible desnaturalizar el hibrido DNA-RNA y analizar y separar el DNA. 4.6.5 Electroforesis en gel En forma rutinaria, las molculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel.El gel es una red compleja de molculas polimricas y la distancia que le DNA migran a

travs del gel refleja su tamao, el cual se puede estimar usando fragmento de DNA marcador como referencia. La agarosa se usa en le anlisis de molculas de varios cientos hasta 20 000 pares de bases, en tanto que la poliacrilamida se usa para fragmentos de DNA

mas pequeos. El DNA se observa usando luz UV despus de teirlo con bromuro de etidio (figura 4.11).

4.6.6 Hibridacin de cidos nucleicos La homologa entre molculas de cidos nucleicos se puede determinar mediante la unin irreversible del DNA o del RNA a un material que generalmente consiste en filtros de nitrocelulosa, seguida por la hibridacin usando sondas de DNA o RNA marcadas radiactivamente. L a transferencia southern describe el proceso de hibridacin de una sonda de DNA de cadena sencilla con DNA, en tanto que la transferencia northern hibrida al DNA de una sola hebra.Por otra parte, la tcnica complementaria con el RNA que han sido transferidos al papel de nitrocelulosa o a otras membranas ( figura 4.12). 4.6.7 Determinacin de secuencias de bases La secuencia de bases del DNA se puede determinar usando uno de dos mtodos. En uno de ellos, creado por Maxam y Gilbert, se necesita el rompimiento de la hebra en bases especficas, como lo que seobtienemolculas de tamao caracterstico. El segundo mtodo,

mas requiere la sntesis de DNA en presencia de los nucletidos, pero con la adicin de un nucletido anlogo que irrumpe la sntesis (un trifosfato de disoxinuclesido). Ambos mtodos utilizan una cantidad limitante de DNA o reactivo de terminacin, por lo que la frecuencia d estos eventos es aleatoria y ocurre ne cada sitio disponible en el DNA. Las molculas de tamao diferente son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida y se observan mediante auto radiografa del DNA marcado radiactivamente. 4.6.8 vectores para la transferencia de DNA clonado Los fragmentos de DNA de inters se manipulan en pequeas molculas circulares de DNA llamado plsmidos o en virus. La mayor parte de las manipulaciones del DNA requieren la bacteria E. coli, para la transferencia hacia otros organismos husped despus de la amplificacin y el anlisis. Los plsmidos de las molculas de DNA de doble hebra que contienen la informacin de origen de una replicacin y varias protenas, en las bacterias estas protenas a menudo estn asociados a la resistencia, por ejemplo a los antibiticos. En este caso, los plsmidos llevan la informacin de protenas que rompen el antibitico. Los plsmidos se aslan y modifican para su uso en la experimentacin con DNA. Un ejemplo de un plsmido de uso comn es el pBR322 (figura.4.13). El plsmido consta de 4362 pares de bases y lleva genes resistentes a la ampicilina y la tetraciclina. Su mapa de restriccin est perfectamente caracterizado con un sitio para la enzima Bam HI en el gen resistente a la tetraciclina y un sitio Pst I en el gen existente a la ampicilina. El DNA recombinante se puede preparar mediante la ruptura de uno de estos sitios de restriccin. Lo anterior produce extremos cohesivos y se puede asociar, mediante puentes de hidrgeno, un fragmento de DNA de otra fuente obtenido con la misma enzima. Por ltimo, el DNA es unido covalentemente por medio de la enzima DNA ligasa. Si el DNA del plsmido (pBR322) y el de la fuente se cortan con Bam HI y se ligan entonces esto se inactiva al gen de resistencia de la tetraciclina y la introduccin del plsmido recombinante en E. coli da lugar a que la bacteria sea sensible a la tetraciclina y resistente a la ampicilina. las bacterias que no hayan incorporado el plsmido se eliminan exponindolas a ampicilina; entre las colonias resistentes a estos antibiticos, aquellas que son resistentes a la tetraciclina contienen insertos de DNA. los plsmidos que contienen genes de inters tendran que ser aislados de insertos obtenidos

del DNA celular total o de cDNA obtenido a partir de mRNA, stos pueden determinarse si se dispone de una sonda para el gen de inters al realizar la hibridacin de la colonia. El DNA de colonias individuales se hibrida en filtros de nitrocelulosa. O tambin, es posible seleccionar un plsmido si se puede detectar su protena caracterstica, por ejemplo, al rescatar una bacteria mutante por medio del DNA extrao que sustituye a una enzima. Este tipo de eleccin depende de la expresin de los genes en el husped extrao, la cual no siempre se efecta, especialmente cuando se trata de genes eucariticos incorporados a bacterias. Esto se debe a que los mecanismos de expresin difieren, y tambin a que los genes eucariticos pueden contener secuencias interpuestas denominadas "intrones". 4.6.9 Bacterifagos Los bacterifagos (fagos) son virus bacterianos que se usan como vectores. Ellos infectan ciertas capas de bacterias y presentan algunas ventajas sobre los plsmidos. La

caracterstica principal es que pueden contener fragmentos de DNA recombinante, lo cual reduce el nmero de aislados necesarios para representar a los genes de los eucariotas superiores. El fago lambda, como sus derivados, se usa mucho, y hasta un tercio de su DNA se puede reemplazar con DNA extrao. El DNA circular de una sola hebra, el cual se puede obtener del fago M13, y sus derivados, tambin se usan frecuentemente en el mtodo didesoxi (Sanger) para e anlisis de a secuencia de DNA. En el fago lambda hay secuencias especficas de DNA denominadas sitios cos que permiten el empaquetamiento del DNA. Dichos sitios se han clonado en plsmidos para producir csmidos. Estos vectores contienen diferentes sitios de restriccin y marcadores de resistencia a antibiticos. Los csmidos pueden llevar fragmentos de DNA grandes de 30 a 45 kilobases cuando el DNA est empaquetado en forma similar al DNA del fago lambda. Los csmidos tiene el potencial para llevar molculas de DNA grandes. 4.6.10 virus Los virus eucariticos se usan como vectores de clonacin, este es el caso del virus SV40 usado con algunas clulas de mamferos. 4.6.11 Sistemas husped para DNA recombinante Las manipulaciones de DNA recombinante se efectan en bacterias (E. coli), pero en ocasiones los genes pueden ser transferidos de nuevo a otros huspedes. En algunos casos,

se han creado vectores de va colateral que pueden funcionar en dos tipos de husped. Un ejemplo se encuentra en la levadura Saccharomyces cerevisiae, en la cual una parte del plsmido pBR322 y otra parte del plsmido denominado 2 um (de la levadura), se entrelazan con un gen de levaduras. Esto puede funcionar en E. coli con la seleccin de bacterias que llevan plsmidos en base a la resistencia de los antibiticos y en la levaduras por la presencia de genes para los cuales la clula de levadura husped es defectuosa. Esto permite que las clulas de la levadura que llevan el plsmido sean seleccionadas, ya que ste deja que ellas crezcan. Existen plsmidos vectores para otras bacterias y levaduras, as como para algas, plantas y clulas de mamfero. Estos vectores son de importancia prctica, ya que muchos organismos proporcionan caractersticas novedosas que se optimizan mejor in situ, en vez de tratar de llevarlas a un sistema extrao (heterlogo). Otra caracterstica de E. coli, es que no se utiliza en ninguna fermentacin industrial tradicional. Las bacterias que se acostumbran utilizar son: Bacillus sp. Para la produccin de enzimas, actinomicetos para la produccin de antibiticos o corineformes para la obtencin de aminocidos. Existen sistemas de vectores para Bacillus subtilis, que incluyen vectores de va colateral E. coli-B. sublitis y otros semejantes para Stretomyces. El inters en las ltimas especies se debe a que con ellas se produce la mayor variedad de antibiticos. Se espera mejorar los rendimientos de estos antibiticos y modificarlos. Las especies de Pseudomonas tambin son recomendables como huspedes para los plsmidos recombinantes. Estos organismos son de inters debido a su capacidad para degradar muchos contaminantes de la atmsfera. 4.6.12 Huspedes eucariticos Ha surgido inters en cuanto a los sistemas de gran clonacin de levaduras tanto para la produccin de compuestos de importancia comercial como para el mejoramiento de la utilizacin de sustratos. Las tcnicas tambin han demostrado ser muy valiosas en el uso de levadura como un sistema modelo para el anlisis de de clulas eucariticas. En cuanto a la aplicacin prctica, se ha puesto mucho inters en el uso de la levadura como husped en la produccin de compuestos valiosos por medio de la ingeniera gentica, debido a la experiencia acumulada por la fermentacin de levaduras. Se han obtenido varios tipos de vectores para levaduras, los cuales tambin se replican en E. coli (figura 4.14). Las manipulaciones del DNA se hacen en E. coli, donde la seleccin

se basa en la resistencia de antibiticos. Los plsmidos tienen sitios diana nicos para varias enzimas de restriccin, as como marcadores elegibles para las levaduras, los cuales pueden rescatar por complementacin clulas huspedes mutantes. Los plsmidos episomales de levaduras (YEp), contienen una parte del plsmido 2um de la levadura unida aun plsmido bacteriano y al marcador elegible para la levadura (figura 4.13). En una clula haya aproximadamente 50 a 100 copias del plsmido 2um; los vectores hbridos tambin estn presentes como plsmidos en copias mltiples que son mantenidos bajo seleccin. Los vectores de este tipo tienen una alta eficiencia de transformacin.

Figura 4.14 Cuatro plsmidos de levaduras. Un plsmido integrante contiene un marcador que las levaduras eligen peo ningn origen de la replicacin para ellas. Estos plsmidos sern estables solamente si se integran en los cromosomas de las levaduras. Un plsmido episomal contiene un marcador elegible para las levaduras y un segmento de DNA del crculo 2u. El DNA de este crculo contiene el origen de replicacin y tambin los genes "rep", los cuales mantienen estable al plsmido extra cromosmico a un nmero de copias relativamente bajo. Un plsmido replicante contiene un segmento de DNA (la secuencia ARS) que le permite replicarse de manera autnoma en clulas de levaduras; sin embargo, la secuencia ARS que contienen plsmidos no son estables ya que no existe un mecanismo para mantener tales plsmidos extracromosmicos a alto nmero de copias durante la mitosis. Su estabilidad se logra al aadir una secuencia CEN, un segmento de DNA de uno de los centrmeros de levadura que se unen al huso durante la mitosis. La secuencia CEN asegura la segregacin estable del plsmido extracromosmico durante la mitosis. (Tomado de Watson, J. D. Tooze, J. y Kurtz, D. T. (1983) Recombinante DNA: A short course. Scientific American Books.)

Tambin se han obtenido los plsmidos constitutivos de las levaduras (YIp), los cuales tambin carecen de secuencias del plsmido 2um pero contienen secuencias para el rescate de mutantes en las levaduras mutantes, as como para la seleccin y replicacin 4en E. coli. Debido a que no tienen un origen de replicacin transforman las clulas de las levaduras mediante integracin en el DNA cromosomal, y realizan la transformacin a una rapidez que es varias rdenes de magnitud menor que la de los plsmidos YEp. En contraste, la transformacin mediante vectores YIp es estable, y por lo general, el nmero de vectores en las clulas transformadas es 1. Se han obtenido plsmidos replicantes de levaduras (YRp), que contienen secuencias de estas, lo cual les confiere la capacidad de replicarse de manera autnoma. En otros aspectos, estos vectores son semejantes a los vectores YIp. el nmero de copias de los vectores YRp en clulas transformadoras es bajo (aproximadamente 10) y son inestables. Los cromosomas contienen una regin denominada centrmero, la cual es importante en la distribucin efectiva de los cromosomas con las clulas hijas en la divisin celular. Los plsmidos centromricos de las levaduras. vCp contienen centrmeros, as como secuencias, que permiten la replicacin en las levaduras y en E. coli. El nmero de copias de estos plsmidos circulares es bajo y son estables aunque no tanto como los cromosomas lineales naturales. 4.6.13 Vectores de expresin Las secuencias de nucletidos ubicadas a cada lado de las secuencias codificantes de los genes, contienen estructuras importantes para la expresin y regulacin de ste. en la regin 5' de las clulas eucariticas y procariticas estn las secuencias de DNA que enlazan las protenas. Estas incluyen a la secuencia de Pribnow, o bien, TATAAT de los procariotas, donde empieza la transcripcin, la cual va precedida por la secuencia TTGACA, que es el sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa. Las regiones 5' se conocen como promotores y la posicin de estos elementos es crucial para la expresin del gen. En los eucariotas opera un sistema similar que consiste en una secuencia TATAAA de GolbergHogness a unos 25 pb hacia arriba del sitio de iniciacin, con un segundo elemento CAAT ubicado a unos 80 pb hacia arriba que tambin puede ser importante. En los procariotas, la secuencia AGAGGU, conocida como secuencias de Shine-Delgarno, es importante en la colocacin correcta del mRNA en los ribosomas.

Las secuencias hacia abajo del gen tambin son importantes para la expresin. en los procariotas, la terminacin de la transcripcin ocurre en secuencias especficas que pueden formar una estructura secundaria rizada. En los eucariotas es importante una secuencia AAUAA, ya que se aade un extremo poli-A de aproximadamente 100 a 200 residuos, sin embargo, se tiene que saber ms acerca de las seales de terminacin. La importancia de las regiones 3' (hacia abajo) y en particular, la regiones 5' (hacia arriba) de los genes, ha dado como resultado la incorporacin de taleselementos en los denominados vectores de expresin. La regin 5' hacia arriba contiene elementos que dan por resultado la expresin caracterstica de los genes. Estas regiones han sido tomadas de genes altamente expresados y se han usado para expresar otras protenas incluyendo protenas de importancia comercial. En las levaduras, stas han sido usadas, por ejemplo, con el promotor de la 3-fosfoglicerato cinasa para expresar el interferon alfa del hombre (figura 4.14). Las concentraciones de las protenas no son tan altas como lo seran si estuviese presente en el vector el gen PGR de las levaduras, debido a que la carga de la clula de producir grandes cantidades tales de protenas que, entre otras cosas, pueden efectuar la viabilidad. Idealmente. La secuencia promotora usada debe ser controlable de modo que la sntesis de protena en concentracin alta se accione en el momento adecuado. Este tipo de regulacin se puede obtener usando, por ejemplo, promotores de protenas de choque trmico, o bien, como se ha logrado en las levaduras, un promotor de fosfatasa cida, el cual funciona a 28 C pero no a 35C. Esto permite obtener suficiente biomasa antes de pasar a la sntesis del producto 4.6.14 Vectores de secrecin Otra caracterstica de aplicacin potencial es el uso de vectores de secrecin que permiten exportar el producto y su recoleccin a partir de caldo de fermentacin ms que de la masa celular. Esto tiene aplicacin posible en sistemas celulares inmovilizados. Estos vectores de secrecin se pueden desarrollar en muchos sistemas. En las levaduras, se basan en todas la protenas secretadas conocidas e incorporan la terminal amino principal de tales protenas que se requiere para el proceso previo a la secrecin. La hormona sexual de levaduras, denominada factor alfa, se ha utilizado para lograr la secrecin, pero para ser que las levaduras tambin pueden reconocer y procesar seales de secrecin colocadas en genes de

interferon de eucariotas superiores. La levadura que ms se usa y estudia aqu es la Saccharomyces cerevisiae, sin embargo, recientemente se han creado sistemas de transformacin para otras levaduras como Schizosaccharomyces pombe, Klyveromyces lactis, Klyveromyces fragalis, Hansenula polymorpha. Algunas de estas especies pueden ser ms adecuadas en la expresin de ciertos genes o bien, pueden serlo usando substratos ms baratos. Por ejemplo Hansenula polymorpha puede crecer en metanol y Klyveromyces con lactosa (suero) como fuentes de carbono. En comparacin con las levaduras, hubo un menor avance de los sistemas de clonacin gnicos en hongos filamentosos. La transformacin se ha logrado con varios hongos filamentosos y es de inters en cuanto a la secrecin de producto en alta concentracin. En las plantas, tambin se han obtenido sistemas de clonacin de genes. Se han construido plsmidos que se replican autnomamente para la alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardii. Este sistema promete la produccin por medio de un crecimiento fotosinttico. En estos ltimos dos aos hubo un avance rpido en los sistemas de clonacin en las plantas superiores. Este problema se solucion al investigar vectores posibles basados en virus y plsmidos vegetales. La solucin que se basa en los plsmidos Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, inductora de tumores vegetales parte de este plsmido y se incorpora en el DNA vegetal; el DNA extrao incorporado en esta parte de este plsmido usando enzimas de restriccin y la DNA ligasa se incorporan junto con el DNA Ti. Esto ha abierto amplias posibilidades para el mejoramiento de los vegetales, no obstante, el plsmido Ti solo se puede insertar de manera natural en un nmero limitado de especies vegetales, las cuales no incluyen algunos de los cultivos ms importantes. Los sistemas de vectores para estas especies an se encuentran en investigacin y entre sus posibles aplicaciones se encuentran la manipulacin de vas biosintticas, la incorporacin de resistencia a herbicidas y el mejoramiento del valor nutricional de las cosechas. Se puede introducir DNa extrao en el DNA de las clulas de mamfero mediante la microinyeccin directa en el embrin. La obtencin de sistemas de clonacin de genes en cultivos de clulas de mamfero es de la mayor importancia ya que pueden ser la base de procesos de fermentacin comerciales.

Las clulas transformantes pueden ser detectadas con facilidad luego de la incubacin con DNA total si existe una forma de seleccionarlas. La deteccin de transformantes se bas inicialmente en la complementacin de clulas deficientes en una funcin determinada, con el gen activo correspondiente. La contrasformacin de un gen deseable unido a un marcador seleccionable, por ejemplo, de resistencia a antibiticos, puede superar este problema y permitir la integracin en los cromosomas. En la actualidad se cuenta con vectores virales para clulas de mamfero, la mayora se basa en el virus circular SV40. Se han obtenido derivados que contienen un replicn de E. coli unido al suyo que contiene la expresin en el cual se pueden insertar y expresar los genes extraos. Estos vectores de va colateral pueden usar de nuevo E coli para manipulaciones de DNA con transferencia de lneas de clulas mono, en las cuales se efecta el anlisis de su expresin o efecto. La funcin episomal de este y otros vectores virales limita el nmero de huspedes, pero se puede usar para la integracin cromosmica de las clulas. RESUMEN 1). La tecnologa de la ingeniera gentica depende de la fragmentacin del DNA mediante las enzimas de restriccin y de su unin en combinaciones distintas como los vectores. 2). Los genes se clonan mediante el aislamiento de vectores que llevan genes normales, capaces de rescatar o "complementar" clulas defectuosas. En forma alternativa, es posible aislar el mRNA y producir una copia de DNA usando transcriptasa inversa. 3). El anlisis de DNA se puede realizar mediante el examen del mapa de los sitios de la enzima de restriccin usando electroforesis en gel para separa fragmentos de DNA de diferente tamao, examinando la homologa entre secuencias de nucletidos mediante la hibridacin de una sonda de DNA, marcada radiactivamente con DNA unido a filtros; analizando la secuencia con base en la interrupcin de las hebras de DNA en posicin de bases conocidas y determinndolas por diferencias de tamao en geles de poliacrilamida. 4). Los vectores se usan para mover en DNA de una clula a otra por el proceso se transformacin. 5). La seleccin de transformantes puede efectuarse por la recuperacin del plsmido o por resistencia a una toxina celular. 6). Existen sistemas de clonacin para bacterias, levaduras, hongos filamentosos, algas, plantas superiores y clulas de mamferos. Para la explotacin biotecnolgica de la

ingeniera gentica es importante el refinamiento de la tcnica para ampliar la variedad de huspedes, el control de la expresin de genes y el nmero y la estabilidad de los plsmidos. BIBLIOGRAFA Glover, D. M. (1984) Gene Cloning The Mechanics of DNA Manipulation. Chaptman and Hall. London. Old, R. and Primrose, S. B. (1985) Principles of Gene Manipulation (Trird Edition).Blackwell Scientific Publication, Oxford and Palo alto. Oliver, S. G. and Ward. J. M (1985) A dictionary ok Genetic Engineering. Cambridge University Press. Cambridge. Watson, J. D. Tooze, J. and Kurtz, D. T. (1983) Recombinant DNA: A short course. Scientific American; Books.