Proteolisis Intracelular Recambio Proteico

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico
Jos Neptuno Rodrguez Lpez

CONTENIDO
1. Recambio Proteico. 1.1. Caractersticas cuantitativas. 1.2. Explicaciones al recambio proteico. 1.3. Seales qumicas para el recambio. 2. Proteasas y Localizacin Celular 2.1. Proteasas intracelulares: Clasificacin. 2.2. Mecanismos de control de las proteasas intracelulares. 3. Protelisis Citoslica. 3.1. Protelisis dependiente de calcio: calpanas. 3.1.1. Aspectos generales. 3.1.2. Estructura de las calpanas. 3.1.3. Activacin de las calpanas por calcio. 3.1.4. Funcin fisiolgica de las calpanas. 3.1.5. Implicacin de las calpanas en procesos patolgicos. 3.2. Protelisis dependiente del sistema ubiquitina/proteosoma 26S. 3.2.1. Ubiquitina. 3.2.2. Enzimologa de la ruta de ubiquitinacin. 3.2.3. El proteosoma. 3.2.4. Regulacin de procesos fisiolgicos. 3.2.5. Patologas asociadas al sistema ubiquitina/proteosoma. 3.3. Protelisis dependiente del proteosoma pero independiente de ubiquitina. 3.3.1. Degradacin de protenas oxidadas por el proteosoma 20S. 3.3.2. Ornitina descarboxilasa (ODC). 3.4. Caspasas y apoptosis. 3.4.1. Muerte celular programada (apoptosis). 3.4.2. Caspasas: Ejecutoras de la apoptosis. 4. Protelisis lisosmica. 4.1. Protelisis selectiva y no selectiva en los lisosomas. 4.2. Catepsinas. 4.2.1. Aspectos generales. 4.2.2. Funciones de las catepsinas lisosmicas en el organismo. 4.2.3. Implicacin de la catepsinas en procesos patolgicos.

La concentracin celular de cada clase de protena es consecuencia del equilibrio entre su sntesis y su degradacin. Aunque parece derrochador, la degradacin y resntesis continua de las protenas, un proceso que recibe el nombre de recambio proteico, tiene varios fines. El primero de todos es la flexibilidad metablica, que se consigue mediante cambios relativamente rpidos de la concentracin de enzimas reguladoras, hormonas peptdicas y molculas receptoras. El recambio proteico protege tambin a las clulas de la acumulacin de protenas anmalas. Finalmente, numerosos procesos fisiolgicos dependen tanto de las reacciones de degradacin oportunas como de las de sntesis. Un ejemplo destacado es el control del ciclo celular eucariota. La progresin de las clulas eucariotas a travs de las fases del ciclo celular est regulada por la sntesis y degradacin oportunas de una clase de protenas que se denominan ciclinas. Las protenas se diferencian de forma significativa en sus velocidades de recambio, que se miden como vida media (tiempo requerido para que se degrade el 50% de una cantidad especfica de una protena). Las protenas que desempean funciones estructurales suelen tener una vida media ms larga. Por ejemplo, algunas protenas del tejido conjuntivo, como los colgenos, suelen tener una vida media que se mide por aos. Por el contrario, la vida media de las enzimas reguladoras suele medirse en minutos. En los ltimos aos se ha realizado un gran avance en la elucidacin de los mecanismos que controlan el recambio proteico. Las protenas se degradan mediante enzimas proteolticas 2+ que se encuentran por toda la clula. Entre ellas, las calpanas activadas por Ca y las catepsinas lisosmicas. Adems, la ubiquitinacin se cree que tiene una funcin fundamental en el recambio proteico. En la ubiquitinacin varias molculas de una protena eucariota pequea de 76 residuos que se denomina ubiquitina se unen covalentemente a algunas protenas destinadas a la degradacin. Una vez que la protena est ubiquitinada, se degrada por un complejo proteoltico que se denomina proteosoma. A pesar de lo que se ha avanzado en los ltimos aos, no se conocen bien los mecanismos que dirigen a las protenas a su destruccin por ubiquitinacin o por otros procesos degradativos. Sin embargo, se piensa que la vida media de una protena est parcialmente determinada por su resto N-terminal, por la existencia de secuencias determinadas (entre ellas las secuencias PEST) o por la presencia de restos de aminocidos oxidados. Estos, y otros aspectos, que recogen los ltimos descubrimientos, sobre la degradacin intracelular de las protenas, se discutirn en este tema.
1. RECAMBIO PROTEICO Las protenas se parecen a los intermedios metablicos de bajo peso molecular, en el sentido de que estn sujetas a una biosntesis y degradacin continua, en un proceso denominado recambio proteico. Para una protena intracelular cuya concentracin total no cambie con el tiempo, la concentracin de estado estacionario se mantiene mediante la sntesis de la protena a una velocidad suficiente para reponer las prdidas producidas por la degradacin de la protena. Muchos de los aminocidos liberados durante el recambio proteico se reutilizan en la sntesis de nuevas protenas. 1.1 Caractersticas cuantitativas Las dimensiones macroscpicas del recambio proteico pueden apreciarse considerando un da de la vida de una persona de 70 kilogramos de peso. Habitualmente esta persona consume 100 g de protenas diarias y, puesto que el balance de nitrgeno est en estado estacionario, excretar una cantidad equivalente de productos nitrogenados terminales. Sin embargo, los estudios de marcaje isotpico indican que se sintetizan unos 400 g de protenas al da y que se degradan 400 g. Aproximadamente tres cuartas partes de los aminocidos liberados se reutilizan en la sntesis proteica, y los dems se degradan y se excreta el nitrgeno. As pues, el conjunto total de aminocidos consiste en 500 g/da, 100 ingeridos y 400 liberados a travs de la degradacin proteica. De este conjunto, 400 g se utilizan en la sntesis proteica y 100 g se catabolizan y se excretan. Las diversas protenas presentan una enorme variabilidad en cuanto a sus tiempos de vida metablica o vida media (tiempo requerido para que se degrade el 50% de una cantidad especfica de una protena), que va de pocos minutos a muchos meses. Se han realizado numerosos experimentos de pulso y caza en animales de laboratorio, que indican que la degradacin proteica sigue una cintica de primer orden. Para una determinada protena, las molculas individuales se degradan de forma aleatoria, de tal modo que una representacin semilogaritmica del istopo que queda en la protena respecto al tiempo es lineal. As, se puede determinar la vida media de una protena. La vida media de algunas protenas se puede visualizar en la Tabla 1. Como cabra esperar, las protenas que se secretan a un medio extracelular, como las enzimas digestivas, las hormonas polipeptdicas y los anticuerpos, tienen un recambio metablico bastante rpido, mientras que las protenas que desempean un papel predominantemente estructural, como el colgeno del tejido conjuntivo, son metablicamente mucho ms estables. Las enzimas que catalizan pasos limitantes de la velocidad de las rutas metablicas tienen tambin una corta vida media. De hecho, para muchas enzimas, la velocidad
TABLA 1. Vida media y localizacin de la degradacin de algunas protenas Localizacin intracelular Vida media (horas) <2 Ncleo Productos de oncogenes Citosol Ornitina descarboxilasa, tirosina aminotransferasa, protena quinasa C Triptfano oxigenasa, protena quinasa dependiente de cAMP Calmodulina, glucoquinasa Lactato deshidrogenasa, aldolasa, dihidrofolato reductasa, citocromo P-670 Hemoglobina, glucgeno fosforilasa, colgeno Mitocondrias cido -aminolevulnico sintetasa Retculo endoplsmico y membrana plasmtica HMG-CoA reductasa
2-8 9-40 41-200 > 200 Ubiquitina Histona H1 Histonas H2A, H2B, H3, H4
-Glutamil transferasa Receptor LDL, citocromo P-450 Citocromo b5, cit b5 reductasa Receptor de acetilcolina
de degradacin constituye un factor de regulacin importante en el control de las concentraciones enzimticas intracelulares. En cambio, las protenas que no constituyen puntos de control metablico tienen un recambio relativamente lento. 1.2 Explicaciones al recambio proteico Como se ha explicado anteriormente, diariamente se hidrolizan cerca de 400 g de protena tisular y se remplazan por protenas de nueva sntesis. Este recambio supone unas necesidades metablicas significativas, puesto que la adicin de cada aminocido a la cadena polipetdica consume una gran cantidad de ATP. Este requerimiento de energa supone de un 15 a un 20% del consumo metablico basal. Entonces por qu deben sufrir estas protenas un recambio si su degradacin no representa un mecanismo de control metablico? No es este recambio una prdida intil de energa? Algunas explicaciones para el recambio proteico se explican a continuacin: (1) Control de calidad: Como todos los dems componentes intracelulares, las protenas pueden sufrir alteraciones, fundamentalmente oxidaciones por especies reactivas de oxgeno (ROS), que afecten a su estructura, conformacin y/o actividad biolgica. Al contrario, que para otros componentes celulares, como los cidos nucleicos, la capacidad de las protenas para reparar el dao causado es limitada. El recambio proteico supone un control de calidad en el que el carcter aleatorio del proceso implica que se degradan y sustituyen protenas tanto normales como modificadas. Sin embargo, algunos estudios recientes indican que el proceso no es aleatorio, ya que las molculas de protena que se han alterado qumicamente son las que se degradan de manera preferente. Un cierto cambio qumico puede marcar a una molcula proteica, haciendo que pase a ser el objetivo
de una enzima proteoltica que identifica especficamente el marcador y que se encargar de degradarla. Aunque queda mucho por averiguar respecto a la degradacin intracelular de las protenas, es mucho lo que se ha descubierto durante la ltima dcada. Se conoce que en las bacterias, las protenas mutantes se degradan con mayor rapidez que las correspondientes protenas de tipo salvaje. Evidentemente la evolucin ha generado protenas cuya conformacin les confiere una mxima estabilidad en el medio intracelular, y la mayor parte de los cambios estructurales reducen esta estabilidad. (2) Regulacin de etapas metablicas: Est explicacin se deduce de la observacin de las vidas medias de las protenas y se ha discutido con anterioridad. Mediante el recambio proteico la concentracin y, en consecuencia, la actividad de una enzima puede ser modificada. Enzimas que juegan un papel clave en la regulacin de vas metablicas tienen vidas medias particularmente cortas. (3) Adaptacin celular: Mediante el recambio de protenas las clulas pueden adaptarse a cambios en las condiciones ambientales. As, por ejemplo, en muchas bacterias la protelisis intensa es uno de los fenmenos metablicos interrelacionados con la esporulacin. Las esporas son una forma termoestable del microorganismo que tiene un metabolismo mnimo y puede permanecer latente durante meses o aos. Cuando las condiciones metablicas inducen la esporulacin de una clula en crecimiento, se produce un amplio recambio proteico, y los aminocidos liberados se utilizan para sintetizar las protenas de la espora. (4) Mecanismos fisiolgicos: Numerosos procesos fisiolgicos dependen tanto de las reacciones de degradacin oportunas como de las de sntesis. Entre
los ejemplos destacados se encuentra el control del ciclo celular eucariota y la presentacin antignica. La progresin de las clulas eucariotas a travs de las fases del ciclo celular est regulada por la sntesis y degradacin oportunas de una clase de protenas que se denominan ciclinas. En la presentacin antignica determinadas clulas del sistema inmunitario (por ejemplo los macrfagos) capturan sustancias anormales o ajenas. La mayora de las molculas que pueden desencadenar una respuesta inmunitaria, que se denominan antgenos, son polipptidos o protenas. El antgeno degradado parcialmente se transfiere a la membrana plasmtica del macrfago donde se utiliza para activar determinados linfocitos T (clulas T) mediante interacciones clula-clula. Las clulas T son los reguladores principales de la respuesta inmunitaria corporal. (5) Procesos patolgicos: En mltiples enfermedades genticas humanas se puede ver la importancia de la degradacin de protenas anmalas. En varias anemias hereditarias, un gen mutante determina la sntesis de molculas anmalas de hemoglobina, que no se pliegan adecuadamente y se destruyen inmediatamente despus de su sntesis. Otras enfermedades podran ser, en parte, resultado de un fracaso de la degradacin intracelular de protenas anmalas. Hay conjunto de protenas mal plegadas que se acumulan en determinadas neuronas del cerebro de sujetos con la enfermedad de Parkinson, la de Huntington o la de Alzheimer. Se estn realizando muchos esfuerzos para averiguar por qu en las neuronas de estos individuos se dejan de degradar las protenas anormales. 1.3 Seales qumicas para el recambio Las tasas de recambio de las distintas protenas vara hasta 1000 veces, mientras que las diferencias de estabilidad de las protenas, medidas segn la desnaturalizacin in vitro, pueden ser mucho menores. En la actualidad se conocen hasta seis caractersticas estructurales a las que se consideran factores determinantes de la tasa de recambio: ubiquitinacin, oxidacin de determinados residuos, secuencias PEST, cajas de destruccin de ciclinas, determinados residuos N-terminales y la presencia del pentapptido KFERQ. (1) Ubiquitinacin: La ubiquitina es una protena pequea (76 aminocidos) que se encuentra en todas las clulas eucariotas y debe su nombre a su amplia distribucin. Pertenece a una clase de protenas que se denominan protenas de agresin o protenas de choque trmico (hsc), ya que su sntesis se acelera o se inicia cuando las clulas son agredidas. La ubiquitina experimenta una reaccin dependiente de ATP con las protenas, que condensa los residuos de glicina C-terminales de la ubiquitina con grupos amino de lisina de la protena a marcar. Estas protenas modificadas se degradan poco despus por
un complejo proteo-ltico (proteosoma 26S) que reconoce al marcador ubiquitina. Este proceso se ha denominado como el beso de la muerte y su mecanismo se describir con ms detalle en otros apartados de este tema. Lo cierto es que todava no est claro qu determina que una protena sea marcada por la ubiquitina, aunque parecen intervenir aspectos estructurales, entre los que se podan encontrar algunos de los que se describen a continuacin. (2) Residuos oxidados: Los residuos de aminocidos oxidados (es decir los residuos que estn alterados por oxidasas o por ataque de ROS) promueven la degradacin proteica. Earl Stadtman y sus colaboradores han demostrado que muchas protenas experimentan una oxidacin en determinados residuos promovida por condiciones que generan ROS. Algunos metales como el Fe2+ es esencial en el proceso y los residuos de lisina, arginina y prolina los ms susceptibles a la oxidacin. Estas modificaciones marcan a estas protenas para su posterior degradacin por las proteasas citoslicas. Un ejemplo reciente es el aislamiento de una proteasa en Escherichia coli y en el hgado de rata, que es capaz de degradar in vitro a la glutamina sintetasa oxidada pero no ataca a la enzima nativa. La acumulacin de protenas con daos oxidativos ms all de la capacidad de la clula para degradarlas y sustituirlas, parece que contribuye de manera importante al envejecimiento celular. (3) Secuencias PEST: Protenas con una vida media menor de 2 horas son ricas en regiones que contienen los aminocidos prolina, glutamato, serina y treonina (P, E, S y T, respectivamente). A estas regiones, de entre 12 y 60 residuos de longitud, se las conoce como secuencias PEST. Son muy pocas las protenas de vida media larga que contienen estas regiones. Parece probable que las regiones PEST formen parte de un esquema de reconocimiento para los sistemas enzimticos que degradan las protenas de vida media corta, que posiblemente incluya el sistema de marcado de la ubiquitina. (4) Ciclinas y cajas de destruccin: Las ciclinas son protenas relacionadas con el control del ciclo celular de eucariotas que han de ser degradadas para que la clula continue desde metafase a anafase. Se trata, pues, de una degradacin muy controlada, dependiente de un paso previo de marcado de la ciclina con ubiquitina. En casi todas las ciclinas se ha localizado una secuencia seal (caja de destruccin) formada por 9 aminocidos (RAALGNISN) que se encuentra presente entre los residuos 13 y 66 de la secuencia proteica. (5) Residuos N-terminales: El residuo N-terminal de una protena es parcialmente responsable de su susceptibilidad a la degradacin. Un residuo Nterminal de Phe, Leu, Tyr, Trp, Lys, Arg, Ile o His esta relacionado con una vida metablica corta,
mientras que las protenas con otros amino terminales tienen una vida ms prolongada. Otros grupos Nterminales producen desestabilizacin de la protena tras su modificacin. La dependencia de la vida media de una protena con su extremo N-terminal se indica en la Tabla 2. Estas observaciones, que se realizaron inicialmente en protenas naturales, se han visto confirmados por experimentos en los que se alter el residuo N-terminal mediante mutagnesis dirigida, lo cual produjo cambios correspondientes de la vida media de las protenas mutantes. En algunos casos, parece ser, que este factor tambin implica al sistema de la ubiquitina.
ms grande dependiente de ATP denominada proteosoma 26S y las proteasas responsables del proceso de apoptosis, las caspasas. Estas enzimas son distintas de las proteasas lisosmicas, denominadas catepsinas, que estn diseadas para actuar en un medio cido. Aunque se est trabajando en definir las funciones especficas de cada una de estas proteasas, parece probable que las protenas extracelulares captadas por la clula y las protenas celulares de larga duracin se degradan en los lisosomas, mientras que en otros compartimentos se produce el recambio proteico selectivo en relacin con la regulacin metablica. Los lisosomas, que se forman por gemacin a partir del complejo de Golgi, son bolsas de enzimas digestivas, que contienen proteasas, nucleasas, lipasas y enzimas de degradacin de hidratos de carbono. Desempean diversas funciones celulares como la secrecin de enzimas digestivas, digestin de orgnulos destinados a la destruccin, digestin de partculas alimentarias o bacterias capturadas mediante fagocitosis, o liberacin intracelular de enzimas seguida de autlisis, digestin y muerte de una clula como parte del proceso morfogentico normal del desarrollo. As, por ejemplo, la membrana que existe entre los dedos de los pies y entre los dedos de las manos en la fase fetal inicial del ser humano se destruye mediante este tipo de muerte celular programada. A diferencia de las enzimas lisosmicas, que generalmente se encuentran secuestradas de forma segura en sus vesculas, toda actividad proteasa libre en el citosol debe de estar bajo un estricto control, de forma que ataque slo a aquellas protenas que es necesario destruir (protenas daadas, mutantes o prescindibles). Adems, aunque la protelisis est termodinmicamente favorecida, gran parte del recambio proteico intracelular requiere una cantidad considerable de ATP. Algunos trabajos recientes indican que el proteosoma tiene una estructura tubular y que es necesaria energa tanto para marcar protenas para la degradacin como para desplazarlas al interior del tubo y a travs del mismo. A continuacin, se pasar a clasificar a las proteasas intracelulares y se describirn los mecanismos generales de regulacin de estas enzimas. Los descubrimientos recientes sobre las protelisis lisosmica y citoslica, por su gran importancia, se describirn en apartados independientes de este tema. 2.1 Proteasas intracelulares: Clasificacin. Desde un punto de vista molecular, la degradacin intracelular de protenas ocurre debido a la existencia de proteasas activas dentro de la clula. Para su clasificacin se ha adoptado un criterio similar al utilizado para la clasificacin de las enzimas extracelulares que participan en procesos como la
TABLA 2. Dependencia de la vida media de protenas citoslicas de levadura en funcin de la naturaleza de su residuo N-terminal Residuos muy estabilizadores (t1/2 > 20 horas) Ala Pro Cys Ser Gly Thr Met Val
Residuos desestabilizadores por s mismos (t1/2 = entre 2 y 30 minutos) Arg Lys His Phe Ile Trp Leu Tyr
Residuos desestabilizadores tras su modificacin qumica (t1/2 = entre 3 y 30 minutos) Asn Asp Gln Glu
(6) Pentaptido KFERQ: Son secuencias peptdicas que marcan protenas citoslicas para su protelisis lisosomal, siendo esta secuencia una de las seales para que las protenas entren en los lisosomas. Este marcaje de protenas no est relacionado con la ubiquitina, pero existen otras hsc (hsc73 citoslica e intralisosmicas) que reconocen estas secuencias. 2. PROTEASAS Y LOCALIZACIN CELULAR Dado que la mayor parte de las protenas se utilizan intracelularmente, la mayora se recambian dentro de la clula. Las primeras proteasas intracelulares que se caracterizaron fueron las que se encuentran en los lisosomas. Sin embargo, es evidente que las protenas se degradan en todos los compartimentos celulares principales, puesto que hay enzimas proteolticas en todas las partes de la clula. En las clulas eucariotas se ha encontrado al menos cuatro sistemas de protelisis citoslica unas proteasas activadas por el Ca2+ denominadas calpanas, una proteasa neutra de gran tamao (700 kilodaltons) de mltiples subunidades (proteosoma 20S), otra proteasa an
digestin, la coagulacin sangunea y fibrinolisis o el remodelado de tejidos. Si bien, una correcta clasificacin de las proteasas implica su divisin inicial en endo- o exo-proteasas, para una mayor compresin y simplificacin, las proteasas intracelulares se han dividido en cuatro clases atendiendo a su mecanismo de accin (la Tabla 3 recoge una clasificacin completa de las proteasas intracelulares): (1) Sern-proteasas: Esta clase de proteasas catalizan la hidrlisis de los enlaces peptdicos adyacentes a los aminocidos aromticos (actividad tipo quimotripsina), bsicos (tipo tripsina) o cidos (tipo caspasa). Tres residuos de aminocidos son esenciales para el proceso cataltico (His, Asp y Ser o Thr). El mecanismo de accin de la enzima implica un paso rpido de acilacin cuando el extremo carbonilo del enlace peptdico diana se transfiere a la enzima para formar un aducto acil-enzima y el extremo amino del sustrato abandona el centro activo. A continuacin se produce una desacilacin lenta, que libera el extremo carboxilo terminal. El mecanismo de reaccin y el papel de los aminocidos implicados se puede observar en la Figura 1. Las catepsinas A y G son proteasas lisosmicas que pertenecen a esta clase. La catepsina G se trata de una endopeptidasa, mientras que la catepsina A hidroliza a las protenas a partir de su extremo carboxilo terminal (carboxipeptidasa). La catepsina R de origen ribosomal tambin es una sern-proteasa.
TABLE 3: Clases de proteasas intracelulares Clase Sern-proteasas Ejemplos Catepsina A, G y R, Uroquinasa, Proteosoma (Treonn proteasa). Catepsinas B, B2, C, H, I, J, K, L, M, N, O, P, S, T y X. Calpanas I y II. Caspasas Catepsinas D y E. Gelatinasas A y B. Catepsina III. Collagenasas. Insulinasa
Cisten proteasas
Aspartato-proteasas Metaloproteasas
Dentro de esta clase tambin se clasifica al proteosoma (proteosomas 20S y 26S) ya que comparten un mecanismo cataltico similar, pero donde la serina esencial es sustituida por una treonina. Por este motivo, a los proteosomas tambin se les denomina treonn-proteasas. Su mecanismo de accin se discutir con ms detalle en otros apartados del tema. (2) Cisten-proteasas. Poseen en su centro activo una cistena y una histidina formando un par inico, lo que produce un tiol altamente nucleoflico. La presencia de estos dos grupos inicos en el centro activo es consistente con las curvas de dependencia de pH observadas para estas proteasas, con un pKa cido (3,6) atribuido a la ionizacin de la Cys y un pKa bsico (8,5) atribuido al grupo imidazol de la His. Slo la forma con el par inico es activa, actuando la His como un catalizador cido-base y produciendo intermedios tetradricos denominados THI1 y THI2. En la primera reaccin la enzima queda acilada mediante un enlace tioester con el grupo carboxilo de la protena sustrato. Despus se produce una desacilacin y se cierra el ciclo generando la enzima activa. La catepsina B pertenece a esta clase y los residuos activos han sido localizados (His199 y Cys29). Esta catepsina posee dos actividades proteolticas; una dipeptidilcarboxipeptidasa y una endopeptidasa. El mecanismo de accin de las cistenproteasas se detalla en la Figura 2. La mayora de la catepsinas lisosmicas son cisten proteasas (catepsinas B, H, L, S, etc). Las caspasas, protenas implicadas en la apoptosis o muerte celular programada, tambin pertenecen a esta clase de proteasas. Adems, tambin se incluyen en esta clase a las calpanas, proteasas citoslicas dependientes de Ca2+. .
(a)
(b)
FIGURA 1. Catlisis de la hidrlisis del enlace peptdico por una sern-proteasa. La triada cataltica participa en la formacin de un intermedio acilenzima (a) y su subsiguiente ruptura mediante una ruta de desacilacin (b).
FIGURA 2. Mecanismo cataltico de las cisten-proteasas. Estados de ionizacin del par inico Cys-His y mecanismo de acilacin/desacilacin de la enzima. Mecanismo propuesto para la papana y similar al que realizan otras proteasas intracelulares como algunas catepsinas y las calpanas I y II (Storer y Mnard, 1994)
(3) Aspartato-proteasas: Estudios cristalogrficos han demostrado que estas enzimas suelen ser dimricas, aportando cada uno de los monmeros un residuo de asprtico para la catlisis. Estos dos grupos se encuentran geomtricamente prximos formado el centro activo de la enzima. El pKa de los grupos carboxilos de estos asprticos es crucial para la catlisis, as, uno de ellos esta ionizado mientras que el otro permanece desionizado en el rango de pH ptimo de la enzima (pH 2-3). El asprtico desprotonado acta como una base aceptando un protn de una molcula de agua, mientras que el asprtico protonado actua como un cido, donando un protn al oxgeno carbonlico de la protena sustrato. Este mecanismo lleva a la consecuente ruptura del enlace CO-NH y se observa en el esquema de la Figura 3. La catepsinas D y E son proteasas lisosmicas pertenecientes a esta clase de proteasas.
(4) Metaloproteasas: Son un grupo de proteasas que contienen Zn como grupo prosttico. Ademas del Zn otros componentes del centro activo son dos Glu y una His. La catepsina III, una aminopeptidasa citoslica, pertenece a esta clase de proteasas. Otras metaloproteasas que se encuentran implicadas en procesos patolgicos como cncer, reumatismo, etc, son las colagenasas y las gelatinasas, sin embargo no se tratarn en este tema ya que son proteasas que se excretan al medio extracelular. La insulinasa, presente en los lisosomas y en el citosol, es responsable de la inactivacin de insulina y se ha clasificado dentro de esta clase de proteasas. 2.2 Mecanismos de control de las proteasas intracelulares Las proteasas son enzimas altamente peligrosas para la integridad celular, por lo que deben de estar fuertemente reguladas. Una visin global de los mecanismos de control de las proteasas intracelulares se discuten a continuacin (Figuras 4 y 5). Aspectos ms especficos sobre el control de algunas proteasas se tratarn con ms detalle en otras secciones. Los
FIGURA 3. Mecanismo cataltico de las aspartato-proteasas. Mecanismo basado en la actuacin de pepsina. El Asp32 tiene un pKa de 1,4 estando desprotonado al pH ptimo de la enzima y actuando como una base. El Asp215 acta como un cido ya que su pKa es 4,3 y estara protonado.
distintos niveles de intracelulares son:
control
de
las
proteasas
* PROTEASAINHIBIDOR * PROTEASAPROTEOGLICANO *PROTEASA INACTIVA pH
+ PROTEASA-Ca2+ + PROTEASAMEMBRANA + PROTEASACOMPLEJOS - PROTEASA DEGRADADA
(1) Proteasas altamente especficas: Se han descrito unos cuantos ejemplos de proteasas que degradan solamente unos cuantos enlaces peptdicos de una determinada protena sustrato, mientras que el resto de enlaces seran hidrolizados por proteasas menos especficas. Esto no es una explicacin general a la diversidad de la protelisis intracelular, ya que deberan de existir un amplio nmero de proteasas. (2) Regulacin a nivel gentico: La sntesis de algunas proteasas esta fuertemente controlada a nivel de la transcripcin o traduccin gnica, en la estabilidad de su ARNm, etc. (3) Formacin de zimgenos: La formacin de precursores inactivos que son posteriormente activados por pH u otras enzimas proteolticas es un sistema preferencial en el control de las proteasas. Los fenmenos de activacin de zimgenos suponen la ruptura de uno o ms enlaces peptdicos en la porcin N-terminal, as, por ejemplo la procatepsina B es activada mediante su ruptura mltiple catalizada por la catepsina D o L. En otros casos, los zimgenos son activados por simples cambios conformacionales que dejan expuesto su centro activo. As, los zimgenos de las aspartato-proteasas experimentan un cambio conformacional, necesario para su activacin, cuando se exponen a bajo pH. (4) Otras vas de control: Las formas maduras de las proteasas son controladas por (a) pH; (b) modificaciones post-transduccionales (fosforilaciones, glicosilaciones, oxidaciones); (c) por su localizacin (lisosomas, organulos de secrecin, membranas) (d) por interaccin con Ca2+; (e) por unin a activadores o inhibidores, y por ltimo, (f) por degradacin proteoltica de la propia proteasa.
GEN PROTEASA
Transcripcin
PROTEASA ACTIVA
- PROTEASA
OXIDADA
FIGURA 5. Sitios de control de la actividad proteoltica. (*) inactivacin reversible, (-) proteasas degradadas o irreversible inactivadas, (+) proteasa con mayor actividad.
En la Tabla 4 se discuten los mecanismos de control preferenciales de algunas proteasas dependiendo de su modo de accin. 3. PROTELISIS CITOSLICA Como se describi en la seccin anterior, el citoplasma de la clula es un sitio preferencial de protelisis. En la actualidad se conocen cuatro sistemas de degradacin proteica en el citoplasma. Uno de ellos es dependiente de Ca2+ y es llevado a cabo por las calpanas. Los otros dos sistemas dependen de un complejo proteico denominado proteosoma. Si bien estos dos ltimos mecanismos de degradacin se encuentran en continua discusin, se ha determinado que en ciertas clulas existe un complejo proteoltico multifuncional (de aproximadamente 650-720 kDa) que degrada protenas por un sistema independiente de ubiquitina. Este sistema que se conoce como MPC o proteosoma 20S, degradara protenas que has sido daadas pero que no han sido marcadas con la ubiquitina. Otra posibilidad es que el proteosoma 20S se convierta, mediante ATP y la adicin de determinados factores proteicos, en un complejo que degrada especficamente protenas que han sido maracadas con la ubiquitina. A este complejo, de aproximadamente 2.000 kDa, se le denomina proteosoma 26S. Un cuarto sistema de degradacin citoslica incluira a la caspasas. 3.1 Protelisis dependiente de iones calcio: Calpanas
3.1.1 Aspectos generales
ARNm PROTEASA
Traduccin
ZIMGENO
Activacin
Inhibicin
PROTEASA
Activacin posterior
PROTEASA INACTIVA
Oxidacin Protelisis PROTEASA MS
ACTIVA PROTEASA DEGRADADA
FIGURA 4. Visin general del control de las proteasas
Las calpanas (EC 3.4.22.17) son una familia de cisten-proteasas citoslicas relacionadas con el procesamiento de protenas del citoesqueleto, la diferenciacin celular y la apoptosis. El control de la actividad de estas proteasas est determinado por las concentraciones de Ca2+ y por la presencia de calpastatina (que por el momento es el nico inhibidor endgeno conocido). La primera calpana fue descubierta en 1964 y su nombre se debe a su dependencia al Ca2+ y a su analoga con la papana.
TABLA 4. Mecanismos de control de las cuatro clases de proteasas
Mecanismo de Control Sntesis
Sern-proteasas
Cisten-proteasas
Metaloproteasas
Aspartato-ptoteasas
Sntesis puede ser estimulada
Estimulacin de la sntesis es un mecanismo de regulacin principal La mayora son secretadas como zimgenos Glicosilacin para su excrecin
Activacin de Zimgenos
Mecanismo de control principal excepto para catepsina G La uroquinasa es fosforilada
La mayora son activadas durante su procesamiento Glicosilacin marca a estas proteasas para ser llevadas a los lisosomas Importante para las proteasas lisosomales Mecanismo de regulacin principal para calpanas
Catepsina D es activada durante su procesamiento Glicosilacin marca a estas proteasas para dirigirlas a los lisosomas o vesculas de secrecin Importante para las que son secretadas o las lisosmicas Catepsina E se encuentra en las membranas
Modificaciones posttransduccionales
Confinamiento
Importante slo para las que son secretadas Importante para uroquinasa
Importante slo para las que son secretadas Puede ser importante para enzimas de esta clase que participen en metstasis Controla los niveles de actividad Estabiliza a casi todas las proteasas de esta clase No es un importante factor de control Importante Importante
Localizacin en membranas
pH
Usado como control en las lisosmicas Estabiliza a casi todas las proteasas de esta clase
Usado como control en las lisosmicas Estabiliza a casi todas las proteasas de esta clase. Activa a las calpanas Importante en lisosomas y vesculas de secrecin Importante Importante
Controla a catepsina D en los lisosomas No es un importante factor de control
Calcio
Proteoglicanos
Importante en lisosomas y vesculas de secrecin Importante Importante
Importante en lisosomas y vesculas de secrecin Importante Importante
Inhibidores Degradacin
TABLA 5. Propiedades moleculares de las calpanas
-Calpana
Mw Mw subunidad mayor Mw subunidad menor pH ptimo [Ca2+] para 50% actividad (M) [Ca2+] unin de calpastatina (M) pI 110.188 81.890 28.316 7,5 5-50 42 5,36
m-Calpana
108.304 80.006 28.316 7,6 200-1000 400 4,94
protena quinasa C, la cual se conoce que interacciona con Ca2+ y fosfolpidos de membrana. En concreto, se ha propuesto, que una zona acdica (acidic loop) dentro de dIII, podra tener un importante papel en la activacin de calpana por Ca2+. Los dominios dIV y dVI son dominios de unin al Ca2+ (contienen cinco secuencias EF-hand), y son los responsables de la dimerizacin de las dos subunidades. El dominio dV de la subunidad pequea es la parte N-terminal y contiene secuencias formadas por mltiples residuos de Gly, inusualmente largas. Si bien, la resolucin de la estructura cristalina de m-calpana permite explicar porqu la protena es inactiva en ausencia de Ca2+, no explica cual es el mecanismo de activacin por este catin.
3.1.3 Activacin de calpanas por calcio
Las calpanas, que estn fuertemente reguladas por su unin a membranas y actan a pH neutro, han sido encontradas en casi todos los organismos, desde mamferos hasta Drosophila melanogaster, as como en levaduras y bacterias, pero no han sido detectadas en plantas. En la actualidad se han identificado hasta 12 diferentes calpanas en mamferos que se expresan en todas las clulas (como son m- and -calpanas) o en un tejido concreto (como por ejemplo, la calpana p94, expresada en el msculo esqueltico). La m- y calpainas son las mejor caracterizadas y se diferencian en sus afinidades por Ca2+, as -calpana (tambin llamada calpana I) requiere concentraciones micromolares de calcio para su activacin (5-50 M) mientras que m-calpana (calpana II) es slo activada por concentraciones milimolares (0.2-1 mM).
3.1.2 Estructura de las calpanas
Hasta el momento existen muchas dudas sobre el mecanismo de activacin de las calpanas por Ca2+. Lo ms desconcertante es que ambas calpanas (m- y -calpana) son activadas por concentraciones de Ca2+ que nunca se encuentran en condiciones fisiolgicas (aproximadamente menor de 1 M), por lo tanto otros factores deben de hacer que estas protenas requieran menores concentraciones de Ca+2 in vivo. Relacionado con este hecho podra estar el que -calpana es activada una vez unida a lpidos de membrana. As, se especula que una vez unido el Ca2+ al dominio dIV se producira una serie de procesos como (a) translocacin de la enzima a la membrana plasmtica; (b) autolisis de las dos subunidades (Figura 6) y (c) disociacin de las dos subunidades. Estos procesos cambiaran el requerimiento de Ca2+ cataltico a concentraciones fisiolgicas (0.1-1 M), pero tambin sugiere la existencia de otros sitios catalticos de unin al calcio.
Tanto la m- como la -calpana son heterodmeros formados por una subunidad mayor de 78-80 kDa (subunidad cataltica) y una ms pequea de 29 kDa (subunidad reguladora). La subunidad mayor est formada por cuatro dominios (dI-dIV), mientras que la subunidad pequea tiene dos dominios (dV y dVI) (Figura 6). La estructura de la m-calpana humana en ausencia de Ca2+ ha sido resuelta, recientemente, por difraccin de rayos X (Figura 6). El dominio dI es una -hlice anclada en una cavidad de dIV y que contribuye a la estabilidad de la protena. El dominio dII (que ha sido dividido en dos subdominios dIIa y dIIb) contiene una secuencia similar a la detectada en el centro activo de la papaina. Los aminocidos implicados en la catlisis han sido identificados por mutagnesis dirigida (Cys105, His262 y Asn286). Estos residuos permiten el mecanismo de catlisis general cido-base descrito para las cisten-proteasas (Figura 2). El dominio dIII esta formado por ocho lminas y tiene homologa con una regin de la
FIGURA 6. Representacin esquemtica de la m-calpana humana y su estructura en 2+ ausencia de Ca (Khorchid e Ikura, 2002).
TABLA 6. Implicaciones de las calpanas en procesoso patolgicos Enfermedad Paraplegia Dao cerebral Enfermedad de Alzheimer Dao de la columna vertebral Isquemia cardiaca Distrofia muscular Cataratas Trombosis Artritis Mecanismo propuesto Degradacin de las protenas del citoesqueleto dando lugar a muerte neuronal Mecanismo similar al anterior Procesamiento anormal del pptido -amiloideo. Modificacin de unin de tau a microtubulos Degradacin de protenas mielnicas Ruptura de protena miofibrilares causando muerte celular irreversible Ruptura de protena miofibrilares Ruptura del cristalino dando lugar a precipitacin proteica Protelisis de agreguina causando agregacin plaquetaria Ruptura del cartlago y proteoglicanos componentes de la matriz extracelular
La cristalizacin de calpanas en presencia de Ca2+ podra dar respuesta a muchos de las interrogantes que quedan sobre el mecanismo de activacin de estas enzimas. Sin embargo, los trabajos realizados para llevar a cabo esta cristalizacin han sido hasta el momento infructuosos, debido a que el Ca2+ induce a la agregacin de la protena. Mientras tanto, estos sitios de unin han sido identificados gracias a la construccin de una calpana recombinante que contiene slo el dominio cataltico (dIIa-IIb), A esta mini-calpana se le ha denominado como calpana I-II. La Figura 7 muestra (a)
la estructura de esta mini-calpana unida a Ca2+ y la compara con los dominios dIIa-IIb de la m-calpana sin Ca2+. Como puede observarse la unin del Ca2+ a dIIa-IIb produce un cambio conformacional que permite una alineacin ms apropiada de los residuos para la catlisis.
3.1.4 Funcin fisiolgica de las calpanas
Las calpanas hidrolizan una amplia variedad de protenas in vitro, sin embargo, y debido a que sus sustratos endgenos no son bien conocidos, el papel de estas enzimas en los organismos no est muy claro. Se sabe que protenas de corta vida media, que llevan secuencias PEST, son buenos sustratos de estas enzimas. Una de las primeras reacciones descubiertas para las calpanas fue la degradacin de diferentes quinasas como la piruvato quinasa o la fosforilasa B quinasa. Adems, las calpanas hidrolizan protenas miofibrilares y otras protenas del citoesqueleto como protenas de asociacin de microtbulos (MAPs), actina, laminina, tubulina, fodrina y vicentina. Tambin se ha implicado a esta familia de protenas en las reacciones de muerte programada o apoptosis y en la degradacin del receptor de la eritropoyetina.
3.1.5 Implicacin de las calpanas en procesos patolgicos
(b)
Algunos procesos relacionados con la distrofa muscular, como la degradacin del disco Z, troponinas, I y C, y la cadena pesada de la miosina, son activados por altas concentraciones de Ca2+. Esto ha hecho que se implique a la calpanas en esta enfermedad. Otras enfermedades en las que se ha implicado a estas proteasas se pueden observar en la Tabla 6. La implicacin de las calpanas en la enfermedad de Alzheimer ha sido recientemente identificada. El equipo de la Dra. Tsai, del Instituto Medico Howard Hughes y sus colegas en la Facultad de
FIGURA 7. Representacin del dominio dII en (a) mcalpana (en ausencia de calcio) y en (b) I-II calpana (en presencia de calcio) (Khorchid e Ikura, 2002)..
10
Medicina de Harvard, han demostrado que una calpana corta a una protena reguladora denominada p35, que participa en el desarrollo del tejido nervioso. La calpana divide a p35 en dos protenas, p10 y p25. La presencia de p25 en las clulas cerebrales acciona la formacin de algunas de las maraas mortales de protenas que pueden daar o matar a esas clulas. Parece ser que el problema comienza cuando p25 pierde un segmento diana crtico que se encuentra en p35, de esta forma p25 activa a cdk5 (quinasa-5 dependiente de ciclina, que es una enzima que normalmente es activada por p35 y que cataliza la construccin y el mantenimiento del tejido nervioso durante el desarrollo) y le permite moverse libremente a travs del citoplasma celular, hiperfosforilando a otras protenas, especialmente a una protena estabilizadora del citoesqueleto, llamada tau. La protena tau alterada se vuelve menos capaz de asociarse a las protenas del citoesqueleto y se agrega formando los nudos neurofibrilares letales que se observan en las clulas afectadas por la enfermedad de Alzheimer.
3.2 Protelisis dependiente del sistema ubiquitina/proteosoma 26S (UPS) Como ya se ha mencionado en otras partes del tema, la ubiquitinacin funciona como un sistema unificador para la degradacin de muchas protenas, es decir, entre las protenas se presentan distintas seales para la protelisis pero muchas de ellas requieren la unin previa de la ubiquitina para que ocurra el paso final de la degradacin. El sistema de degradacin relacionado con la ubiquitina es un sistema complejo en el que participan mltiples componentes. Una visin general de este proceso se puede observar en la Figura 9. En el proceso participan, adems de la ubiquitina, tres enzimas necesarias para la ubiquitinacin (E1, E2 y E3), enzimas desubiquitanizantes (como hidrolasas), y un complejo proteoltico denominado proteosoma 26S y que est formado por un ncleo central cataltico (proteosoma 20S) y dos subunidades reguladoras (complejos 19S). Adems, en algunas etapas de este proceso se requiere energa en forma de ATP. Durante este apartado analizaremos este sistema con detalle y discutiremos su importancia fisiolgica, as como, su participacin en procesos patolgicos como el cncer o la infeccin por determinados virus.
FIGURA 9. Representacin esquemtica de la ruta de degradacin proteica dependiente de ubiquitina.
3.2.1 Ubiquitina
FIGURA 8. Posible implicacin de las calpanas en la enfermedad de Alzheimer (Patrick y col., 1999).
La ubiquitina es una pequea protena monomrica (8.5 kDa) de 76 aminocidos presente en todas las clulas eucariotas, pero no en procariotas. Esta protena ha sido altamente conservada durante el proceso de evolucin, de tal forma, que la ubiquitina humana y la de levadura slo se diferencian en 3 de los 76 aminocidos. La ubiquitina ha sido aislada y cristalizada a partir de numerosas fuente biolgicas. Todas ellas presentan una estructura comn formada por -hlices y lminas , formando una estructura
11
estable y compacta (Figura 10). El grupo C-terminal de las ubiquitinas siempre es una glicina, siendo este el aminocido de unin a la protena a la que se va a unir. Para ello se establece un enlace isopeptdico entre este grupo C-terminal de la ubiquitina y un grupo -amino de lisina determinado. Las protenas que van a degradarse pueden encontrarse monoubiquitinadas o poliubiquitinadas.
ubiquitinas. La ubiquitina tiene siete residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63) cada uno de los cuales puede, potencialmente, unirse con el resto C-terminal de otra ubiquitina. Actualmente, se sabe que slo los residuos K11, K29, K48 y K63 pueden unirse a otra molcula de ubiquitina, siendo las uniones a K48 las que se han encontrado ms abundantemente. En el proceso de multiubiquitinacin se ha descubierto la participacin de otra enzima, E4 (factor de ensamblaje de las cadenas de ubiquitina). La multiubiquitinacin, esta intensamente relacionada con la degradacin de la protena por el proteosoma, que reconoce las cadena de ubiquitina y atrae a la protena hacia su interior. La monoubiquitinacin est ms relacionada con procesos de regulacin, como la endocitosis, la reparacin de ADN o la regulacin transcripcional. La Figura 11 muestra esquemticamente los procesos descritos en este apartado.
FIGURA 10. Estructura tridimensional de la ubiquitina de eritrocito humano
3.2.2 Enzimologa de la ruta de ubiquitinacin
La modificacin post-transduccional de protenas por la adicin de ubiquitina marca a estas protenas para ser degradadas por el proteosoma. Un asombroso nmero de protenas estn implicadas en la ubiquitinacin y desubiquitinacin de protenas. Ambos procesos son importantes y deben ser controlados tanto temporal como espacialmente.
Ubiquitinacin
El proceso de ubiquitinacin de las protenas se desarrolla en varias etapas. En l participan, fundamentalmente, tres enzimas, E1, E2 y E3. El primer paso es la formacin, dependiente de ATP, de un enlace tioester entre el C-terminal de la ubiquitina y un tiol de cistena en E1 (tambin llamada enzima activadora de ubiquitina). A continuacin, se produce la transferencia de la ubiquitina desde E1 a otro grupo de cistena de E2 (denominada enzima transportadora de ubiquitina). La tercera enzima, E3 (protena ligasa de ubiquitina), facilita, entonces, la transferencia de la ubiquitina activada desde E2 hasta residuos de lisina en las protenas diana. El proceso se puede repetir (multiubiquitinacin) o no (monoubiquitinacin). Si se produce la multiubiquitinacin, entonces, nuevas molculas de ubiquitina se unen a la protena ya marcada. La ubiquitina puede, en este momento, unirse a otros residuos de lisina de la protena diana, y/o unirse a residuos de lisina de una ubiquitina unida anteriormente, formndose as largas colas de
FIGURA 11. Ruta de ubiquitinacin
Control de la ubiquitinacin
Una primera pregunta que surge observando la complejidad de esta ruta es Cmo se consigue
12
regular el proceso de ubiquitinacin? Para conocer como se elige una determinada protena para la ubiquitinacin, parece ser, que hay que profundizar en las enzimas E3. As, se conoce que las clulas poseen solamente una enzima E1, una docena de enzimas E2, pero cientos de enzima E3 con especificidad nica de sustrato. Las enzimas E3 parecen reconocer las secuencias de aminocidos de otras protenas convirtindolas en objetivo de la ubiquitinacin. Ante condiciones fisiolgicas alteradas, pensemos en una infeccin o una falta de nutrientes, las clulas pueden modificar las protenas mediante la adicin de grupos fosfato. Esta fosforilacin puede transformar la actividad de una protena o su capacidad para unirse a las E3. Estas enzimas reconocen tambin las protenas que fracasan en el plegamiento o que estn alteradas, hacindolas pasar a un proceso de limpieza despus de marcarlas para que el proteosoma las reconozca y las destruya. Por lo tanto son las distintas enzimas E3 las que confieren esta alta especificidad al sistema. La protena ligasa de ubiquitina es una protena o complejo enzimtico que debe de unir a ambos E2 y la protena sustrato. Se conocen varios modos de reconcimiento de las protenas sustrato por las distintas E3 (Figura 12). En algunos casos E3 reconoce directamente a regiones determinadas de la protena, como es el caso del residuo N-terminal. En otras ocasiones la protena sustrato debe de ser modificada qumicamente para su reconocimiento, por ejemplo, por fosforilacin post-transduccional. En otros casos, es la protena E3 o alguna subunidad de esta, la que tiene que modificarse para que se produzca el reconocimiento. En otros casos, una protena auxiliar (ancillary protein), como algunos chapero-nes moleculares, participa en el proceso de recono-cimiento. Las ligasas E3 se han clasificado en seis clases, de acuerdo, con su estructura o con la seal que reconocen: (1) E3 (denominada Ubr1 en levaduras) reconoce extremos N-terminales desestabilizadores. Esta E3 posee sitios de unin para residuos N-terminales bsicos e hidrofbicos de gran tamao. (2) Protenas con el dominio HECT. El mayor representante de esta familia es la protena de mamferos E6AP que est involucrada en la degradacin del supresor de tumores p53 en clulas infectadas con el virus del papiloma. (3) El tercer tipo de E3 es un complejo multienzimtico denominado complejo promotor de la anafase o ciclosoma (ACP/ciclosoma), y es de vital importancia para el ciclo celular en clulas eucariotas. (4) Complejos SCF: Est involucrado en el marcaje del inhibidor (IB) del factor nuclear B (NF-B).
La destruccin de este inhibidor permite la expresin de varios genes relacionados con la inmunidad, la inflamacin, la apoptosis y otros procesos celulares.
FIGURA 12. Distintas formas de reconocimiento de las protenas sustratos por las distintas E3. (1) Reconocimiento de residuos especficos de la protena sustrato (por ejemplo, E3 reconoce protenas de su extremo N-terminal); (2) Reconocimiento de un sustrato seguido de su modificacin post-transduccional (p.e. IB o -catenina son marcadas por la ligasa SCF despus de ser fosforiladas); (3) Reconocimiento del sustrato despus de la fosforilacin de E3 (p.e. las ciclinas del ciclo celular son marcadas por el APC/ciclosoma despus de que se haya fosforilado una subunidad de la ligasa); (4) Resconocimiento de un sustrato despus de la unin de una protena de anclaje a E3 (p.e. p53 es marcada por E6-AP despus de que las protenas HPV-E6 o Hsc70 se hayan unido a E3.
(5) Algunas protenas con dominios ring finger (dedos de zinc) tambin parecen servir como E3. Por ejemplo, el proto-oncogen c-CbI estimula la ubiquitinizacin del receptor CSF-1 y endocitosis. Parece ser que estas secuencias tienen un importante papel en la funcin de estas ligasas E3, posiblemente en la formacin de la cadena de poliubiquitina. (6) El supresor de tumores Von Hippel Lindau (VHL) es otra protena E3. Su mutacin da lugar a tumores renales como se discutir ms adelante.
Desubiquitinacin
La ubiquitinacin de protenas es un proceso reversible. Existen al menos 19 protenas en levaduras que catalizan la hidrlisis del enlace peptdico formado entre la Gly76 de la ubiquitina y una protena diana. Pare ser que existen muchas ms en los organismos eucariotas superiores. La liberacin de ubiquitina de las protenas y aductos es un proceso fundamental para el reciclamiento de la ubiquuitina, la degradacin de protenas por el proteosoma y para otros procesos celulares. As, la inhibicin de las enzimas implicadas en desubiquitinacin da lugar a la inhibicin de la protelisis dependiente de ubiquitina. Esto se debe probablemente a dos efectos. Por un lado, la eliminacin de toda la ubiquitina libre en el citosol, y por otro la saturacin del proteosoma por protenas parcialmente digeridas, pero marcadas con
13
ubiquitina. Adems, las enzimas que eliminan la ubiquitina tambin pueden acelerar la degradacin en el proteosoma, ya que pueden generar cadenas de ubiquitina, de una longitud ms apropiada para el reconocimiento por el proteosoma. La deubiquitinacin tambin puede funcionar como un proceso corrector de errores en caso de protenas que se hallan ubiquitinizado inadecuadamente. Existen dos clases de proteasas que tienen actividad desubiquitanizante, las ubiquitina Cterminal hidrolasas (UCH) y las proteasas de procesamiento especfico de ubiquitina (UBP). Las primeras, UCH, podran estar implicadas en el procesamiento de protenas ubiquitinizadas de bajo peso molecular (peptidos), mientras que las UBP quitaran restos de ubiquitina de protenas de alto peso molecular, y disgregaran las cadenas de poliubiquitina. Recientemente, una UCH de levadura (Yuh1) ha sido cristalizada, tratndose de una cistenproteasa.
3.2.3 El proteosoma Aspectos generales
externos actan como puertas de control y alejan as el peligro de que alguna protena extraviada penetre en su cmara de destruccin.
El proteosoma procariota
El destino final de muchas protenas marcadas por la ubiquitina es su destruccin por el proteosoma. Fue descubierto a finales de los aos setenta, y se llam as porque contiene muchas proteasas. Los proteosomas son complejos multicatalticos con una estructura gigantesca. Mientras que una protena de tamao medio tiene entre 40.000 y 80.000 daltons, la mayora de los proteosomas de los organismos superiores pesan ms de dos millones de daltons. A mediados de los aos noventa, un grupo dirigido por
Aunque una ruta de degradacin asociada a ubiquitina no se puede dar en los procariotas, algunas de las propiedades de los proteosomas procariotas son incluidos en esta seccin, ya que muchos de los conocimientos actuales sobre la estructura y propiedades catalticas de los proteosomas eucariotas, han sido obtenidas de la caracterizacin del proteosoma 20S de arqueobacterias. El proteosoma 26S, responsable de la degradacin de protenas ubiquitinadas, solamente ha sido detectado en eucariotas. Sin embargo, el ncleo central proteosomas 20S, es una estructura conservada desde arqueobacterias (del gnero Thermoplasma o Rhodococcus) hasta eucaritas, y estructuras similares se han detectado en bacterias como Escherichia coli (Figura 14). Uno de los proteosomas mejor caracterizado ha sido el proteosoma 20S de Thermoplasma acidophilum (Figura 15). Este tiene forma de barril formado por 14 subunidades y 14 subunidades (7-7-7-7). Todas las subunidades son identicas entre s (codificadas por un mismo gen), al igual que las subunidades . Esto es una diferencia fundamental con el proteosoma eucariotico donde cada subunidad es diferente (ver ms adelante).
FIGURA 14. Ejemplo de protenas relacionadas con el proteosoma 20S en bacterias y arqueobacterias
FIGURA 13. Microscopa electrnica del proteosoma 26S de Drosophila melanogaster
Los proteosomas eucariota y procariota tambin se diferencian en la estructura y composicin de las subunidades catalticas (subunidades ). En procario-
Wolfgang Baumeister y Robert Huber, del Instituto Max Planck de Bioqumica en Martinsried, recurri al microscopio electrnico (Figura 13) y a la difraccin de rayos X para determinar la arquitectura molecular de los proteosomas. Cada uno de ellos est constituido por una partcula central con aspecto de tunel (proteosoma 20S) a la que acompaan una o dos partculas reguladoras menores, situadas en un extremo o en ambos. La unidad central es la regin cataltica del proteosoma, mientras que los anillos
FIGURA 15. Estructura y organizacin del proteosoma 20S de Thermoplasma acidophilum (Baumeister y col, 1998).
14
FIGURA 16. Mecanismo cataltico de la actividad quimotripsina-like del proteosoma 20S
tas cada una de las 14 subunidades posee el mismo sitio cataltico formado por una triada de aminocidos, poco usual (Glu, Lys, Thr), en el extremo Nterminal. El mecanismo de catlisis (denominado quimotripsina-like, ya que rompe enlaces peptdico solamente detrs de residuos hidrofbicos) es similar al de las sern-proteasas, pero donde la funcin de la serina, es ahora, realizado por una treonina (treonnproteasas) (Figura 16). Como veremos, en eucariotas
se han encontrado tres sitios catalticos distintos dentro de un mismo proteosoma.

Composicin y organizacin de los proteosomas eucariotas
El proteosoma 26S es un complejo multicataltico que se encuentra en el citosol y en el ncleo de las clulas eucariotas. Consiste de una partcula central formada por 28 subunidades (proteosoma 20S) de 2.100 kDa, formando una estructura tubular con dos anillos
FIGURA 17. Composicin y organizacin de los proteosomas
15
idnticos exteriores (anillos ) y dos idnticos interiores (anillos ) (Figura 17). Cada uno de los dos anillos y estn formados por 7 subunidades diferentes (codificadas por 14 genes distintos), dando lugar a una estructura general 7-7-7-7. Los tres sitios catalticos se encuentran en algunas de las subunidades , en la parte interna del complejo para, as, evitar la degradacin indiscriminada de las protenas intracelulares. Estos tres centros activos promueven la hidrlisis de protenas en la parte Cterminal de residuos hidrofbicos (actividad quimotripsina-like), bsicos (actividad tripsina-like) o cidos (actividad caspasa-like) (Figura 18). La subunidad puede ser constitutiva o inducible, y est ensamblada de manera distinta (con distinta proporcin de estas tres actividades proteolticas) dependiendo de las condiciones fisiolgicas y de los requerimientos celulares. En los tres tipos de actividades proteolticas, parece ser, que la treonina es el residuo cataltico esencial (treonn-proteasas). Los anillos externos, formados por las subunidades , no presentan actividad proteoltica pero sirven de anclaje para una multisubunidad PA700 (19S; 700 kDa) que contiene actividad ATPasa, y que es una subunidad reguladora que se une al extremo superior e inferior del proteosoma 20S para formar el proteosoma 26S. Una vez unidas las subunidades 19S, estas tienen las siguientes funciones: (a) abrir el canal de entrada al interior de la subunidad 20S, ya que este estara cerrado por los restos N-terminales de las subunidades y (b) desplegar las protenas ubiquitinizadas para
cataltico y dando lugar al proteosoma 20S activado. Sin embargo, este proceso es independiente de ATP y contribuye a la degradacin de protenas daadas, pero no ubiquitinadas, y por lo tanto se discutir en otras secciones de este tema.
3.2.4 Regulacin de procesos fisiolgicos
Mediante el control de la estabilidad de protenas cruciales, el sistema ubiquitina-proteosoma 26S regula el desarrollo de las extremidades, la respuesta inminitaria, la divisin celular, la reparacin del ADN y la comunicacin intercelular, entre otros procesos. Los propios ritmos circadianos y la floracin en las plantas podran estar regulados por este sistema. Tambin se conocen algunas ligasas de ubiquitina con funcin supresora de tumores u oncognica, lo que vincula la ubiquitinacin al comienzo del proceso canceroso. En este apartado se describirn algunos ejemplos de procesos fisiolgicos controlados por la ubiquitinacin y, en el siguiente, se abordar su implicacin en procesos patolgicos.
Ciclo celular eucariota
La informacin gentica contenida en el genoma de una clula se transmite fielmente a la clula hija gracias a la precisa duplicacin de sus cromosomas, previa a la divisin celular. Los procesos de sntesis de ADN (fase S) y de mitosis (fase M) se hallan perfectamente coordinados en cada ciclo de divisin celular. El ciclo celular se completa con una fase G1, en la que la clula prepara la maquinaria necesaria para la sntesis de ADN, y una fase G2, que precede a la divisn nuclear y citoquinesis; es esta ltima se corrigen posibles errores replicativos. Los procesos celulares caractersticos de las distintas fases del ciclo, as como las protenas que los lleva a cabo, persisten (estn conservados) en todas las clulas eucariotas.
Figura 18. Representacin esquemtica del proteosoma 20S de levaduras y disposicin de los centros catalticos.
que puedan penetrar en el centro cataltico. Ambos procesos requieren ATP. En otras ocasiones una subunidad reguladora PA28/11S/REG (180 kDa) puede unirse al proteosoma 20S abriendo el canal de entrada al centro
FIGURA 19. Regulacin del ciclo celular. Los procesos bsicos tales como la replicacin del ADN, la mitosis y la citocinesis se ponen en marcha mediante un sistema de control central del ciclo
16
TABLA 7. Ciclinas y Cdks en vertebrados y Saccharomyces cerevisiae Complejo Cdk-ciclina G1-Cdk G1/S-Cdk S-Cdk M-Cdk Vertebrados Ciclina Ciclina D* Ciclina E Ciclina A Ciclina B Cdk Cdk4, Cdk-6 Cdk-2 Cdk-2 Cdk-1** Saccharomyces cerevisiae Ciclina Cln 3 Cln 1, 2 Clb 5, 6 Clb 1, 2, 3, 4 Cdk Cdk-1** Cdk-1 Cdk-1 Cdk-1
*Hay tres ciclinas D en mamferos (ciclinas D1, D2 y D3) **El nombre original de Cdk1 fue Cdk2 en vertebrados y Schizosaccharomyces pombe y Cdc28 en Saccharomyces cerevisiae.
La correcta progresin por las distintas fases del ciclo celular viene regulada por una quinasa dependiente de ciclina, o CDK, complejo enzimtico que consta de una subunidad cataltica y una subunidad activadora denominada ciclina. Los complejos CDK aparecen en todos los organismos eucariotas hasta ahora estudiados, si bien el nmero de sus componentes puede diferir de uno a otro. As, las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe producen una nica subunidad cataltica Cdk1 (tambin conocidas como Cdc28 y Cdc2, respectivamente) activada por diversas ciclinas especficas de cada fase del ciclo. En el caso de clulas de mamfero existe una familia de protenas Cdk relacionadas (Cdk1, 2, 4 y 6) que se asocian, a su vez, con mltiples ciclinas y cuyas combinaciones dan lugar a complejos CDK peculiares de cada fase del ciclo celular. El nombre de las distintas Cdk y ciclinas se observa en la Tabla 7. Existen cuatro clases de ciclinas: (1) Las ciclinas G1/S, las cuales se unen a las Cdks al final de la fase G1 y preparan a la clula para la replicacin del ADN. (2) Las ciclinas S, que se unen a las Cdks durante la fase S y son necesarias para la replicacin del ADN. (3) Las ciclinas M o mitticas, las cuales se unen a Cdk durante G2 y forman el factor promotor de la fase M (MPF), el cual induce a la clula a entrar en mitosis. (4) Las ciclinas G1 que ayudan a pasar el punto de inicio del ciclo. Para que la clula abandone la fase G1 e ingrese a la fase S, es decir, inicie la replicacin del ADN, la ciclina G1 aumenta su concentracin, a partir del punto de inicio, y se une a una Cdk dando lugar al complejo CDK activado llamado factor promotor de la replicacin (RPF) que activa la sntesis de ADN. Cuando la concentracin de ciclina decrece el complejo FPR se desactiva. El proceso de activacin
FIGURA 20. Regulacin del ciclo celular con la participacin de la ciclina G1. Se trata de un modelo de la degradacin de reguladores positivos y negativos para la iniciacin del ciclo celular. (1) Cdk es activada por unin a la ciclina G1; (2) la Cdk de fase G1 activa fosforila sustratos que son necesarios para la iniciacin de la fase S entre ellos al inhibidor de Cdk (CKI CDI). Cuando no es necesaria el complejo Cdk de fase G1 se autofosforila para su destruccin en el proteosoma; (3) Los complejos Cdk de fase G1 y los CDI fosforilados son reconocidos por los complejos SCF, que catalizan la adicin de ubiquitina a estas protenas, marcndolas, as, para su destruccin en el proteosma 26S; (4) Algunos componentes integrantes del complejo SCF son Skp1, Cdc53, una protena de caja F, as como la enzima Cdc34 que es una enzima E2; (5) La hiptesis ms extendida hasta el momento es que las protenas de caja F son las que determinan la especificidad del complejo SCF. Se han Cdc4 descrito hasta tres complejos SCF en levaduras: SCF , Grr1 Met30 y SCF . SCF
de fase S se observa en la Figura 20. En este proceso las E3 (ubiquitin ligasas) identificadas pertenecen a la familia SCF. Superada la fase G2, se activa el inicio de la mitosis. Al final de G2 aumenta la concentracin de cilina mittica y al alcanzar una determinada concentracin de une a una Cdk formando el MPF que se encarga de fosforilar protenas con funciones esenciales durante la mitosis. Cuando la clula ha salido de mitosis se produce una disminucin de esta actividad CDK. En este caso las E3 implicadas pertenecen al grupo de las ACP/ciclosoma (Figura 21)
17
endoplasmtico, donde se unen a molculas recin sintetizadas, que forman el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. A medida que las molculas MHC de clase I pasan por el aparato de Golgi y salen a la superficie, van captando los fragmentos de las protenas vricas. Las clulas T citotxicas, del sistema inmunitario, reconocen como material forneo los trozos del virus unidos a las molculas MHC de clase I en la superficie celular y destruyen la clula infectada.
3.2.5 Patologas humanas asociadas al sistema ubiquitina/proteosoma 26S (UPS)
FIGURA 21. Control del ciclo celular por ciclinas mitticas
Sistema inmunitario
En la presentacin antignica determinadas clulas del sistema inmunitario (por ejemplo los macrfagos) capturan sustancias anormales o ajenas. La mayora de las molculas que pueden desencadenar una respuesta inmunitaria, que se denominan antgenos, son polipptidos o protenas. El antgeno degradado parcialmente se transfiere a la membrana plasmtica del macrfago donde se utiliza para activar determinados linfocitos T (clulas T) mediante interacciones clula-clula. Las clulas T son los reguladores principales de la respuesta inmunitaria corporal. El sistema inmunitario se apoya en los inmunoproteosomas. Estos proteosomas especializados le ayudan a distinguir entre las clulas sanas y las clulas cancerosas. En el ejemplo descrito en la Figura 22, una protena vrica est marcada con ubiquitina para su destruccin por el inmunoproteosoma. Trozos de la protena vrica, que consta de ocho a diez aminocidos, entra entonces en el retculo
Una vez visto como el UPS participa en mltiples e importantes procesos celulares, no es de extraar, que fallos en este sistema den lugar a un gran nmero de patologas. Un resumen de algunas enfermedades en las que estara involucrado este sistema se da en la Tabla 8, y casi todas ellas se deben a la generacin de protenas E3 defectuosas por mutaciones o delecciones en alguno de sus genes. Adems, es interesante destacar como algunos virus secuestran el UPS para su propio beneficio, y as poder propagarse en el organismo.
TABLA 8. Algunas patologas asociadas al complejo ubiquitina/ proteosoma Hipertensin Sndrome de Liddle Sndrome de DiGeorge Cncer Neurodegenerativas Alhzeimer Parkinson Huntington Proteosomas y cncer Enfermedades motrices Sndrome de Angelman Fibrosis qustica Infecciones virales
Se cree, hoy en da, que casi todos los procesos tumorales son debidos a mutaciones genticas en oncogenes y/o en genes supresores de tumores. Los productos de muchos de estos genes estn regulados por el UPS, por lo tanto mutaciones en alguno de los componentes del UPS pueden dar lugar a cambios en la estabilidad de estas protenas y por lo tanto contribuir a la carcinognesis. Adems, algunos supresores de tumores o productos de oncogenes son en s mismos protenas E3. Se conocen 5 genes supresores de tumores cuyos productos interaccionan con el sistema UPS (APC, DCC, TP53, RB1 y VHL) y hasta 9 proto-oncogenes humanos (ABL, FOS, MOS, MYB, MYC, RAF, RAS, REL y SRC). Un caso muy bien caracterizado es el del supresor de tumores Von Hippel Lindau (VHL), una E3 que sufre a menudo una mutacin dando lugar a tumores renales. La funcin de VHL consiste en regular
FIGURA 22. Proteosomas y sistema inmunitario
18
ciertos genes que se expresan en condiciones de bajo oxgeno (hipoxia). La clula normal tiene mecanismos para responder a bajos niveles de oxgeno, as, en condiciones de hipoxia la clula activa al factor de transcripcin HIF-1, el cual se une a una zona especfica del ADN y activa la expresin de una serie de genes inducibles por hipoxia (HRE), y que incluye, entre otros, a la eritropoyetina (EPO) y al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). HIF-1 es un heterodmero compuesto por dos protenas HIF-1 y ARNT. Para que se produzca la activacin de genes antes descrita, estas dos protenas deben de estar dimerizadas. En condiciones de oxgeno normales la subunidad HIF-1 es degradada por el UPS. De hecho, la E3 que transfiere la ubiquitina a HIF-1 es el VHL, la cual es regulada por una ferro-protena y, forma parte de un sistema complejo con varios componentes (Figura 23). En condiciones de hipoxia HIF-1 es estabilizado (por fosforilacin y por otras seales oncognicas) y activo, ya que estas condiciones inhiben la funcin del proteosoma. Recientemente, se ha demostrado que HIF-1 es hidroxilado en un resido de prolina en condiciones normales de oxgeno, y que esta modificacin posttransduccional sera necesaria para su reconocimiento por VHL y su posterior ubiquitinacin. Mutaciones en VHL produciran una expresin continua y exagerada de genes promotores de angiognesis y derivara en procesos cancerosos. En otros casos los cnceres pueden estar inducidos por virus. Por ejemplo el virus del papiloma humano (HPV) provoca verrugas genitales, cncer de tero o cncer de recto. La transformacin hacia el desarrollo tumoral se bloquea, habitualmente, por la p53, una de las protenas supresoras de tumores del organismo. El HPV recurre a una estratagema para evitar el sistema defensivo celular, fabrica una protena (E6) que se enlaza simultneamente a la p53 y a una enzima E3 (E6-AP) (Figura 24). La fatdica unin insta la ubiquitinacin de la p53, que as queda marcada para su destino fatal en el proteosoma. Las
clulas infectadas se convierten ms fcilmente en un cancer incipiente.
FIGURA 24: Mecanismo utilizado por HPV para evitar su destruccin mediada por p53
3.3 Protelisis dependiente del proteosoma pero independiente de ubiquitina Recientes descubrimientos han demostrado que algunas protenas pueden ser degradadas por los proteosomas en rutas independientes de la ubiquitina. Una de estas rutas involucra al proteosoma 20S, que en presencia o no de la particula reguladora 11S puede degradar protenas daadas por oxidacin. El otro caso es ms paradigmtico, ya que, una enzima, la ornitina descarboxilasa puede ser degradada por el proteosoma 26S sin necesidad de ser ubiquitinada.
3.3.1 Degradacin de protenas oxidadas por el proteosoma 20S
La unidad central del proteosoma (proteosoma 20S) puede hidrolizar protenas daadas por oxidacin en un ruta independiente de ATP y de ubiquitina. La forma en que el proteosoma 20S reconoce a estas protenas daadas no est clara pero se piensa que pueden intervenir varios factores: (a) reconocimiento de grupos hidrfobicos que quedan expuestos despus de la modificacin; (b) reconocimiento de marcadores, como residuos de aminocidos oxidados y (3) reconocimiento de cambios conformacionales en la protena daada. Estudios realizados sobre calmodulina y aconitasa oxidadas apoyan estas hiptesis. En algunas ocasiones el proteosoma 20S une una subunidad reguladora 11S, que facilita el reconocimiento de las protenas daadas, y su paso a la parte central del proteosoma para su degradacin.
3.3.2 Ornitina descarboxilasa (ODC)
FIGURA 23. Activacin de genes inducibles por hipoxia (HRE) regulada por el supresor de tumores Von Hippel Lindau (VHL) (Harris, 2002)
La ODC es la primera enzima en la ruta de biosntesis de poliaminas. Estos compuestos participan en
19
mltiples procesos fisiolgicos, estabilizando a los cidos nucleicos y a las protenas y, por lo tanto, su ruta de sntesis debe estar muy regulada. As, el sitio primordial para la regulacin de esta ruta es la ODC que adems es una protena de muy corta vida media. Lo extrao de la degradacin de esta enzima es que se realiza en el proteosoma 26S pero sin necesidad de ser ubiquitinada. Cuando se produce una acumulacin de poliaminas se produce la estimulacin de otra protena, la antizima. Esta protena regula negativamente a la ODC ya que se une a ella y permite su destruccin en el proteosoma 26S. 3.4 Caspasas y apoptosis
3.4.1 Muerte celular programada (apoptosis)
en la apoptosis. En respuesta a seales como las mencionadas, la mitocondria deja de producir eficientemente energa y libera una serie de molculas que, fuera de su contexto, se convierten en desencadenantes de la apoptosis. Una de estas molculas es el citocromo c, protena crucial en la respiracin. Una vez en el citoplasma, el citocromo c desata la va de las caspasas, as llamada por el papel clave que en la misma desempean estas protenas. La mitocondria libera tambin el factor inductor de la apoptosis (AIF), una protena que presenta otra caracterstica en comn con el citocromo c: esto es, capacidad de transferir electrones entre distintas molculas. Sin embargo, a contrario de lo que sucede con el citocromo c, se desconoce la funcin de AIF en la mitocondria, se ignora, adems, el mecanismo por el que AIF induce una respuesta apopttica. Si se sabe, en cambio, que la actividad apopttica de AIF pasa por su transporte al ncleo. Tal actividad es independiente, al menos en parte, de la va de la caspasas.
3.4.2 Caspasas: ejecutoras de la apoptosis Clasificacin y estructura
Todo ser vivo pluricelular debe desembarazarse de las clulas que a lo largo de su vida han ido acumulando mutaciones y errores susceptibles de convertirlas en la amenaza de un cncer. Cualquier desarreglo que afecte a la capacidad de morir de estas clulas puede tener consecuencias letales. A la muerte de una clula se llega por diversas vas. Cuando un tejido resulta daado, por ejemplo en una herida, las clulas de la zona afectada mueren sbitamente perdiendo su integridad y liberando en el entorno su contenido. Este tipo de muerte, llamado necrosis, perjudica a las clulas vecinas y en los animales desata una respuesta inmunitaria, a veces desproporcionada, que conduce a una lesin. Junto a esta muerte celular violenta, existe la requerida por el propio organismo para su desarrollo y bienestar. Debe hallarse sta, pues, sometida a un control ms estricto que el observado en la necrosis. Esta muerte celular controlada no conduce a una expolsin de la clula moribunda, sino a su implosin, habitualmente seguida por su ingestin por clulas del sistema inmunitario, los macrfagos. Se trata de la muerte celular programada o apoptosis. El trmino apoptosis fue acuado en 1972 por John Kerr, Andrew Wyllie y Alastrair Currie, a partir de la palabra griega que designa cada, en analoga con la cada de las hojas y en referencia a su carcter natural. Nos hallamos todava lejos de comprender, en toda su integridad, los mecanismos desencadenantes de la apoptosis. No obstante, se va avanzando. As, se han identificado seales externas, como la privacin de factores de crecimiento, e internas, como la presencia de alteraciones en el ADN, que pueden provocar la respuesta apopttica. Igualmente, se nos muestra con nitidez creciente que el control de esta respuesta pasa por diferentes orgnulos celulares y, muy en particular, por la mitocondria. Las mitocondrias constituyen la factora que produce la energa de la clula. Cualquier desarreglo en su funcionamiento conduce a la desregulacin de los mecanismos celulares, de ah su posicin central
Las caspasas han sido clasificadas en tres grupos atendiendo a sus implicaciones fisiolgicas: (1) Activadoras de citoquininas (Clase I): Si bien las caspasas son esenciales para la apoptosis, algunas de ellas estn exclusivamente implicadas en la activacin de citoquininas. Entre estas se encuentran las caspasas -1, -4, -5 y -14. (2) Iniciadoras de la ruta de apoptosis (Clase II): como su nombre indica, inician la ruta de activacin de las caspasas e incluye a las caspasas-2, -8, -9 y -10. (3) Efectoras de la apoptosis (Clase III): son las encargadas de llevar a cabo la destruccin proteica asociada a la destruccin celular programada y pertenecen a esta clase las caspasas-3, -6 y -7.
FIGURA 25. Clasificacin y estructura de las caspasas (A) Filogenia y funcin de las 13 caspasas identificadas hasta el momento. (B) Estructura cristalina de caspasa-3. (C) Activacin de caspasas.
20
Las caspasas comparten similitudes en la secuencia de aminocidos, estructura y especificidad por el sustrato. Todas ellas son expresadas como proenzimas (30 a 50 kDa) que contienen tres dominios: un domino N-terminal, una subunidad grande (aproximadamente 20 kDa) y una pequea (aproximadamente 10 kDa) (Figura 25). Su activacin requiere el procesamiento proteoltico entre los dominios seguido por la asociacin de las subunidades grande y pequea para formar un heterodmero. La estructura cristalina de dos de las caspasas activas (caspasa-1 y -3) muestra que, en ambos casos, dos heterodmeros se asocian para formar un tetrmero, con dos sitios catalticos que parecen funcionar independientemente. Dentro de cada dominio cataltico las unidades grandes y pequeas estn ntimamente asociadas, contribuyendo ambas con los residuos necesarios para la unin al sustrato y la catlisis. Dos caractersticas de la estructura de las proenzimas, son de central importancia para el mecanismo de accin de estas proteasas. Primero, el dominio N-terminal, que es altamente variable en secuencia y longitud, esta involucrado en la regulacin de la activacin de estas enzimas. Segundo, todos los dominios derivan de la proenzima por ruptura en el sitio consenso de las caspasas, implicando que estas enzimas pueden ser activadas tanto autocatalticamente como por una cascada de enzimas con especificidad celular. Todas las caspasas son cisten-proteasas con una especificidad inusual, el requerimiento de un residuo de cido asprtico en la posicin anterior al sitio de corte. Adems, se requiere el reconocimiento de cuatro aminocidos en la zona N-terminal del sitio de corte. El tetrapeptido de reconocimiento difiere significativamente entre las caspasas, explicando, as, la diversidad de sus funciones biolgicas. Su especificidad es an ms estricta, esto es, no todas las protenas que contienen la secuencia ptima de tetrapptidos son rotas, debe de existir a la vez un reconocimiento de la estructura terciaria de la protena sustrato. La estricta especificidad de las caspasas es consistente con la observacin de que la apoptosis no va acompaada de una digestin indiscriminada de protenas, sino que un selecto conjunto de protenas son digeridas de forma coordinada, normalmente en un sitio nico, resultando en su prdida o cambio de funcin.
Mecanismos de destruccin celular
que podran resultar de la liberacin del contenido intracelular. Estos cambios ocurren en una secuencia predecible y reproducible, que puede completarse entre 30 y 60 minutos. El cmo las caspasas contribuyen a este proceso no est completamente aclarado. Se conocen hasta 40 sustratos de caspasas, pero la relacin entre su ruptura y la apoptosis slo se conoce para unos cuantos. Sin embargo, esos pocos ejemplos sugieren que las caspasas son las responsables de los cambios celulares que ocurren durante la apoptosis y permiten dar una idea del mecanismo empleado (Figura 26). Una de las funciones de las caspasas es inactivar protenas que protegen a las clulas vivas de la apoptosis. Un ejemplo claro lo constituye la ruptura de ICAD, un inhibidor de una nucleasa responsable de la fragmentacin del ADN (CAD, desoxyrribonucleasa activada por caspasa). En clulas no apoptticas, las CAD estn presentes como un complejo inactivo (CAD-ICAD). Durante la apotosis, el inhibidor ICAD es digerido por las caspasas liberando CAD que funciona como una nucleasa. Las caspasas contribuyen a la apoptosis a travs del desensamble de la estrutura celular, como lo demuestra la destruccin de la lmina nuclear, una estructura rgida que tapiza internamente la membrana nuclear y est implicada en la organizacin de la
Los eventos apoptticos incluyen fragmentacin del ADN, condensacin de cromatina, encogimiento celular y desensamble de las clulas en vesculas rodeadas de membrana (cuerpos apoptticos). In vivo, este proceso culmina con la captura de estos cuerpos por clulas vecinas, previniendo las complicaciones
FIGURA 26. Procesos propuestos para la induccin de apoptosis por las caspasas.
21
cromatina. La lmina est formada por polmeros de protenas filamentosas intermedias denominadas lamininas. Durante la apoptosis estas son degradadas en un sitio nico por las caspasas, causando el colapso de la lmina y contribuyendo a la condensacin de la cromatina. Las caspasas indirectamente tambin modifican estructuras por ruptura de protenas involucradas en la regulacin del citoesqueleto, incluyendo a la gelsolina, la quinasa de adhesin focal y la quinasa 2 activada por p21. La disociacin de dominios reguladores y efectores es un carcter distintivo de la funcin de las caspasas. Por ejemplo, las caspasas desactivan o desrregulan las protenas involucradas en la reparacin del ADN (tales como la ADN-PKCs), del splicing del ARNm (tal como U1-70K) y de la replicacin del ADN (como el factor de replicacin C). Un examen de stos y otros sustratos de las caspasas sugieren que estas enzimas participan en la apoptosis en una forma que recuerda a una bien planeada y ejecutada operacin militar. Las caspasas cortan el contacto con las clulas vecinas, reorganizan el citoesqueleto, apagan la replicacin y reparacin del ADN, interrumpen el splicing del ARNm, destruyen en ADN, rompen la estructura nuclear, inducen a la clula a exhibir seales que la marcan para ser fagocitadas y desintegran las clulas en cuerpos apoptticos.
Mecanismos de regulacin de las caspasas
c y dATP. Existen varios modelos, basados en evidencias indirectas, sobre los mecanismos de activacin. El modelo de induccin por proximidad o de oligomerizacin, esta basado en varias observaciones: las procaspasas tienen baja actividad y requieren de dimerizacin para su activacin, adems, las procaspasas sobreexpresadas en la clula y entrecruzadas artificialmente se tornan activas. El modelo argumentan que las caspasas estn en estado de latencia en las clulas, debido a que se encuentran en estado monomrico a bajas concentraciones. Los cofactores actan llevando a dos o ms precursores de caspasas a un estado de estrecha proximidad, permitindole realizar una activacin autoproteoltica intermolecular. El modelo de autocatlisis facilitada postula que los precursores de caspasas estn presentes en la clula con una conformacin o en un complejo que previene la autocatlisis. Los cofactores facilitan la activacin por cambios conformacionales del precursor tanto directamente como por eliminacin de un inhibidor. La diferente compartimentacin de las caspasas y sus cofactores podra ser otra manera de regulacin. El citocromo c mitocondrial debe de abandonar la mitocondria para activar a la caspasa-9.
Aunque quedan muchos aspectos que solucionar sobre la regulacin de las caspasas, y en consecuencia de la apoptosis, parece ser que la complegidad de su regulacin podra rivalizar con la de los sistemas del complemento y de la coagulacin. Activacin de caspasas efectoras: Existen numerosas evidencias genticas y bioqumicas que apoyan un mecanismo en cascada para las caspasas efectoras (Figura 27). Segn esto, una seal proapopttica culminara en la activacin de un iniciador de caspasas que activara a las caspasas efectoras. Diferentes iniciadores de caspasas actan mediando distinto conjunto de seales. Por ejemplo, la caspasa-8 est asociada con apoptosis por receptores de muerte celular, mientras que la caspasa-9 est involucrada en la muerte celular inducida por agentes citotxicos. Este modelo explica porqu distintas seales apoptticas inducen los mismos cambios bioqumicas y morfolgicos. Activacin de caspasas iniciadoras: Las evidencias disponibles indican que la activacin de las caspasas iniciadoras requiere de la unin de cofactores especficos. Esta unin es disparada por una seal proapopttica. Por ejemplo, la activacin de caspasa-9 requiere de la unin del cofactor APAF-1, citocromo
FIGURA 27: Cascada de activacin de caspasas en clulas apoptticas y molelo de regulacin.
Regulacin por inhibidores: La identificacin de inhibidores de caspasas ha provenido, fundamentalmente, de trabajos con virus que atenan la respuesta a la infeccin de la clula husped. Se han descrito tres clases diferentes de inhibidores virales: CrmA, p35 y una familia de protenas inhibidoras de apoptosis (IAP).
Las caspasas como dianas en el tratamiento de enfermedades
Hay dos tipos opuestos de enfermedades que involucran una desrregulacin de la apoptosis. Estn
22
aquellas en las que la apoptosis es excesiva, causando dao a los tejidos normales (por ejemplo, podemos incluir en este grupo a las enfermedades neurodegenerativas, enfermedades de respuesta a injertos y enfermedades autoinmunes) y aquellas en las que la apoptosis es prevenida, permitiendo el crecimiento de los tejidos malignos (cncer). En concordancia con esto, las dos estrategias a seguir sern: inhibicin de las caspasas o induccin de la apoptosis va activacin de las caspasas. 4. PROTELISIS LISOSMICA 4.1 Protelisis selectiva y no selectiva en los lisosomas Durante muchos aos, todos los procesos intracelulares de degradacin selectiva de protenas se atribuyeron a los sistemas citoslicos. Por otro lado, a los lisosomas, orgnulos celulares dotados de una potente maquinaria enzimtica, se les asign la degradacin general, no selectiva. Sin embargo, no dejan de aparecer pruebas que apoyan la existencia de mecanismos de degradacin especfica de ciertas protenas en los lisosomas. Entre las mltiples protenas que pueden ser objeto de degradacin en los lisosomas se encuentran las protenas de la membrana celular y las protenas extracelulares. Estas protenas, una vez internalizadas por los endosomas (estructuras vesiculares del interior celular), sufren una completa degradacin tras la fusin de estos orgnulos con lisosomas en un proceso de heterofagia. Una fusin similar se produce entre los lisosomas y las vesculas de secrecin, que contienen protenas sintetizadas en el interior celular y cuyo destino ltimo reside en el medio extracelular. Este proceso degradativo de crinofagia es el responsable de la regulacin de los niveles de secrecin celular de protenas. El otro grupo amplio de sustratos lisosmicos los constituyen las protenas citoslicas. Se sirven de diversos mecanismos de transporte para arribar al interior de los lisosomas. Por ejemplo, los lisosomas engloban porciones de citosol, a veces orgnulos completos, en un proceso de de macroautofagia o de microautofagia, segn el tamao de la porcin citoslica englobada. La autofagia lisosmica se caracteriza principalmente por su falta de selectividad. Una vez en el interior del lisosoma, las protenas englobadas se degradan de forma conjunta. Corresponde a la microautofagia, siempre activa, mantener los niveles basales de protelisis intracelular; a la macroautofagia, que se activa preferentemente en las primeras fases de privacin de nutrientes, aporta a las clulas los aminocidos necesarios para la sntesis de protenas esenciales. Adems de estos dos procesos no selectivos de degradacin de protenas citoslicas en los lisosomas,
se ha confirmado la existencia de un transporte directo de ciertas protenas citoslicas, a travs de la membrana lisosmica. En este proceso, muy similar al transporte de protenas a otros orgnulos celulares (mitocndrias, retculo endoplasmtico, vacuolas, etc), intervienen factores citoslicos, componentes de membrana y protenas intralisosmicas. Aunque no se ha identificado todava el estmulo que activa esta va degradativa directa, si que se conoce la existencia de una seal marcadora en la secuencia de aminocidos de la protena sustrato (el pentapptido Lys-Phe-Glu-Arg-Gln KFERQ), responsable de la interaccin con el factor citoslico implicado en esta va, la protena de choque trmico de 73kDa (hsc73). Esta hsc73 mantiene a la protena sustrato en una conformacin adecuada para favorecer su unin con la membrana lisosmica y su posterior transporte a travs de la misma (Figura 28).
FIGURA 28. Degradacin selectivas de protenas citoslicas por el lisosoma. La zona amarilla en la protena representa al pentaptido KFERQ (Cuervo, 1997)
Recientemente, se ha identificado el primer componente de este sistema de transporte, una glicoprotena integral de la membrana lisosmica de 96 kDa (lgp96), cuya regin C-terminal aparece expuesta en la superficie del lisosoma y sirve de punto de anclaje para las protenas sustrato. Tras la unin a la membrana del lisosoma, las protenas viajan al interior en un proceso de transporte que requiere la presencia en la matriz lisosmica de una protena de choque trmico de 73 kDa, variante de la forma citoslica. Por comparacin con otros transportadores celulares, la hsc73 lisosmica podra actuar como fuerza motriz que, tras anclarse a la porcin de protena que alcanza en un primer momento la matriz lisosmica, empujara al resto de la protena hacia el interior. Una vez en la matriz y tras disociarse de la
23
TABLA 9. Algunas de las proteasas lisosmicas mejor caracterizadas Nombre y clasificacin Catepsina B (cisten-proteasa) Catepsina L (cisten-proteasa) Catepsina H (cisten-proteasa) Catepsina D (aspartato-proteasa) Mw relativo 24.000 pH ptimo 5 Caractersticas de la actividad Presenta actividad endopeptidasa o carboxipeptidasa dependiendo del sustrato empleado. Se inhibe por agentes oxidantes de tioles Actividad endopeptidasa, preferencia por residuos hidrofbicos. Se inhibe por reactivos de tioles. Actividad endopeptidasa o aminopeptidasa dependiendo del sustrato empleado. Se inhibe por reactivos de tioles Mecanismo de accin similar a la pepsina Se inhibe por pepstatina
24.000 28.000
5 5
42.000
3,5
hsc73 lisosmica, la protena se sometera a su completa degradacin. Es de destacar, que aunque esta va selectiva de degradacin lisosmica de protenas citoslicas, puede operar en condiciones basales, se activa sobre todo en situaciones de ayuno prolongado. En tales condiciones extremas, y tras una primera fase de activacin de la autofagia, la clula parece necesitar un proceso degradativo ms selectivo, en el que solo se sacrifican las protenas que no son vitales en estas circunstancias en beneficio de la sntesis de protenas imprescindibles para el funcionamiento celular. Entre los sustratos que se sometern a una degradacin especfica est el propio proteosoma. Se ha propuesto as que, en condiciones extremas celulares, esta va lisosmica, al intervenir en la degradacin de otras proteasas intracelulares, podra controlar tambin la actividad de otros sistemas degradativos. La descripcin de estas vas degradativas selectivas lisosmicas est contribuyendo a modificar la vieja imagen de los lisosomas como sacos de proteasas, para atribuirles funciones reguladoras en diversos procesos fisiolgicos. Por otra parte, se pone de manifiesto la existencia de un equilibrio dinmico entre los distintos sistemas degradativos intracelulares, regulado por sus mltiples interacciones, que asegura as un control estricto de este proceso fundamental, que es la degradacin proteica. 4.2 Catepsinas
4.2.1 Aspectos generales
catepsinas son cisten-proteasas pero existen excepciones (Tabla 9). Su concentracin en las lisosomas es muy alta (10-40 mg/mL) de ah su necesidad de ser secuestradas en vesculas. La catepsina B es, sin duda, la catepsina mejor caracterizada. Ha sido aislada de diferentes tejidos de mamferos, y sus propiedades no varan en gran medida entre diferentes especies. Recientemente, se ha aislado en la levadura. La primera estructura cristalina para una catepsina B fue resuelta en 1991. La enzima est glicosilada en un residuo de asparragina (Asn113, para la numeracin de la catepsina B humana). Su secuencia se conoce para la enzima de ratn, hgado bovino e hgado humano (254 aminocidos). El peso molecular de la forma glicosilada es de 29 kDa. Una ruptura en Asn47 produce dos pptidos, uno ligero de 5 kDa y otro pesado de 24 kDa, que permanecen unidos por un puente disulfuro. El centro activo de la enzima est en la cadena ligera (Cys29). La catepsina B se expresa como un zimgeno de 39 kDa el cual es procesado en el aparato de Golgi antes de ser enviada al lisosoma. Hay evidencias de que esta activacin del zimgeno es un proceso de autocatlisis en que catepsina B activa a procatepsina B.
4.2.2 Funcin de las catepsinas lisosmicas en el organismo
El nombre catepsina fue introducido en 1929 por Willsttter y Bamann para una proteasa que actuaba a pH cido pero que difera de la pepsina. El termino actual de catepsina es usado para proteasas intracelulares (mayoritariamente localizadas en los lisosomas) las cuales son activas a pH cido (el pH del lisosoma est alrededor de 5). La mayora de las
Aunque existen muchas evidencias de que las catepsinas juegan un papel primordial en un gran nmero de procesos fisiolgicos (ms del 70% de la protelisis intacelular es debida a las proteasas lisosomales), no ha podido ser establecido, con toda seguridad, la funcin exacta para una catepsina en concreto. Adems de su actividad protelitica especfica y no especfica comentada anteriormente, las catepsinas podran tener importancia en procesos de activacin. As, la catepsina B activa la proalbumina a albumina, la prorenina a renina y el tripsingeno a tripsina. Otra funcin de las catepsinas,
24
especialmente para catepsinas B, L y K, es la degradacin de colgeno en los osteoclastos y la activacin de colagenasas. Las catepsinas B, L y H tambin degradan a las histonas y la B al fibringeno. Existen tambin evidencias de que podran estar implicadas en la reproduccin, en la diferenciacin celular y en la proliferacin. Por ltimo, tambin se piensan que podran estar implicadas en la respuesta inmune en procesos de presentacin de antgenos.
4.2.3 Implicacin de las catepsinas en procesos patolgicos
en la destruccin de la laminina, componente proteico de la ECM: (4) Tambin hay indicaciones de que las catepsinas podran estar relacionadas con otras patologas como la enfermedad de Alzheimer, el infarto de miocardio y la osteoporosis.
BIBLIOGRAFA Recambio proteico

Si bien para una visin amplia de la degradacin de protenas, de este y otros apartados, habra que consultar determinadas revisiones y artculos que se recomendarn a continuacin, una visin general de este tema se puede obtener en los siguientes libros de texto:
El control anmalo de las catepsinas da lugar a diversos procesos patolgicos, entre los que se encuentran: (1) Procesos inflamatorios y traumticos: Los macrfagos y granulocitos neutrfilos que median en la respuesta inmune, excretan vesculas de degradacin en la, que por supuesto, se incluyen enzimas lisosomales. Normalmente, estas catepsinas se encuentran controladas por inhibidores extracelulares y por el pH neutro del entorno. Sin embargo, en condiciones anormales, puede haber un desajuste entre las concentraciones de las proteasas y sus inhibidores, as como, disminuciones de pH en el microentorno, lo que producira una activacin de las catepsinas. Algunos ejemplos, muestran que la catepsina B se encuentra en gran concentracin en los fluidos articulares en pacientes con artritis reumatoide, y la catepsina L parece ser la responsable de la degradacin del cartlago en artritis seas. Tambin hay evidencias de la implicacin de la catepsina B en la formacin de los enfisemas pulmonares y en enfermedades inflamatorias crnicas. (2) Distrofia muscular: Esta enfermedad hereditaria se caracteriza por la prdida muscular progresiva y es causada por la deleccin en un gen que codifica la protena distrofina. Esta protena est asociada a la membrana plasmtica de las clulas musculares. La degradacin muscular excesiva es producida por defectos en la membrana plasmtica, lo que da lugar a un aumento en la permeabilidad al calcio en estas clulas y el aumento de la degradacin intracelular de protenas. La migracin de macrfagos, para destruir las clulas musculares defectuosas, produciran un aumento en los niveles de las catepsinas B, H, y L, que ayudaran a degradar protenas de la membrana citoslica. Estas, junto con las calpanas, seran las responsables de los sntomas observados en esta enfermedad muscular degenerativa. (3) Progresin de tumores, metstasis: La progresin de un tumor primario para metastatizar otros tejido, depende de la hidrlisis del tejido conectivo de la matriz extracelular (ECM). Catepsina B y L se han encontrado en elevadas concentraciones en tumores malgnos y estn relacionadas junto con la colagenasa
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M, Roberts, K. y Walter, P. (2002) Molecular biology of the cell, 4 ed., Garland Science, New York. Excelente libro en general, que trata la protelisis celular en su Captulo 6. Pero sin duda, la mejor parte de este libro, respecto a la protelisis intracelular, es la que trata sobre el control del ciclo celular por las ciclinas y su control por el sistema ubiquitina/ proteosoma en el Captulo 17. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Zipursky, L. y Darnell, J. (2003) Molecular Cell Biology, 5 ed. W.H. Freeman & Co., New York. Libro recin editado (tambin se puede consultar la 4 ed) con videos y tutoriales sobre el control del ciclo celular por el sistema Cdk-ciclina-proteosoma. Interesante. Mathews, C.K. y Van Holde, K.E. (1998) Bioqumica, 2 ed. McGraw-Hill Interamericana de Espaa, Madrid. Es sin duda el libro de texto que mejor recoge la digestin de protenas. Hace referencia a este tema en dos captulos (Captulos 20 y 28). Adems, la localizacin del tema estara de acuerdo con nuestra localizacin en el programa de la asignatura.
Sobre aspectos generales de la protelisis intracelular tambin se puede consultar las siguientes revisiones y artculos de investigacin:
Atix, D., Combaret, L., Pouch, M.N. y Taillandier, D. (2002) Cellular control of ubiquitinproteasome-dependent proteolysis. J. Anim. Sci. 80: E56-E63. Una excelente y reciente revisin que recoge algunos de los aspectos sobre las seales qumicas para el recambio. Goldberg, A.L., Elledge, S.J. y Harper, J.W. (2001) Proteosomas. Investigacin y Ciencia 294, 22-27. Revisin general y actualizada sobre los proteosomas, realizada por alguno de sus descubridores. Da una visin global del tema de la protelisis con bonitas imgenes y una discusin
25
sobre los aspectos fisiolgicos de la protelisis intracelular. Grisola, S., Knecht, E. y Hernndez-Yago, J. (1981) Protelisis intracelular. Investigacin y Ciencia 57, 122-137. Un artculo antiguo pero interesante sobre la protelisis intracelular. En l se dan conceptos como la vida media de las protenas y la forma de medir estos parmetros, sin embargo, resulta un poco anticuado respecto a los sistemas de protelisis. Interesante de leer para tener una visin histrica del tema. Lpez-Otn, C. (2000) Proteasas y cncer. Investigacin y Ciencia 284, 68-75. Artculo sobre la implicacin de los distintos tipos de proteasas en procesos cancergenos. Proteasas y localizacin celular
Aspectos relacionados con el mecanismo de accin de las proteasas se pueden obtener en casi todos los libros de texto de bioqumica. Alguno de los recomendados, incluyendo un libro monogrfico sobre proteasas, son los siguientes:
dos de este tema, y que estudia todos los aspectos relacionados con esta clase de enzimas. Storer, A.C. y Mnard, R. (1994) Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244, 486-500. Excelente revisin sobre el mecanismo de accin de las cisten-proteasas. Tang, J. (1998) Pepsin A. en Handbook of Proteolytic Enzymes (Barret, A.J., Rawlings, N.D. y Woessner, J.F.; eds) pp. 805-814, Academic Press, Londres. Excelente captulo que recoge los aspectos estructurales y mecanicsticos de las aspartato-proteasas.
Adems, tambin se aconseja visitar las siguientes pginas web para profundizar en la clasificacin y modos de accin de las proteasas http://65.219.84.5/prowl/aainfo/proteases/proteases.htm http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/index.html http://biochem.wustl.edu/~protease/ser_pro_overview.html http://cgat.ukm.my/protease/classification.html
Mathews, C.K. y Van Holde, K.E. (1998) Bioqumica, 2 ed. McGraw-Hill Interamericana de Espaa, Madrid. En su Captulo 11 describe con todo detalle los mecanismos de catlisis de la quimotripsina, una sern-proteasa, y de la carboxipeptidasa A, una metalo-proteasa. Herrera, E. (1991) Bioqumica: Aspectos estructurales y vas metablicas. 2 ed. McGraw-Hill Interamericana de Espaa, Madrid. En su Captulo 29 hace una buena revisin sobre las clases de proteasas, su mecanismo de accin y mecanismos de regulacin. McKee, T. y McKee, J.R. (2003) Bioqumica: La base molecular de la vida. 3 ed. McGraw-Hill Inter.americana de Espaa, Madrid. En su Captulo 6, dedicado a las enzimas, descibe el proceso de activacin de zimogenos y el mecanismo de accin de algunas proteasas. Beynon, R.J. y Bond, J.S. (1989) Proteolytic enzymes: a practical approach. IRL Press, Oxford. Libro monogrfico sobre las proteasas. Interesante su lectura aunque en algunos aspectos ya se encuentra un poco anticuado.
Sobre los mecanismos de accin y regulacin de las proteasas tambin se puede consultar las siguientes revisiones y artculos de investigacin:
Protelisis citoslica
Las siguientes revisiones y artculos de investigacin sobre las calpanas son de gran inters.
Khan, A.R. y James, M.N.G. (1998) Molecular mechanism for the conversion of zimogens to active proteolytic enzymes. Protein Sci. 7: 815836. Una revisin sobre los mecanismos de activacin de zimgenos. De lectura recomendada. Otto, H. y Schirmeister, T. (1997) Cystein Proteases and their inhibitors. Chem. Rev. 97: 133-171. Excelente revisin, mencionada en varios aparta-
Goll, D.E., Thompson, V.F., Li, H., Wei, W y Cong, J. (2002) The calpain system. Physiol. Rev. 83: 731-801. Revisin completa y actualizada sobre estas proteasas dependientes de calico. Se recogen aspectos estructurales, fisiolgicos y patolgicos de este sistema enzimtico. Hosfield, C.M., Elce, J.S., Davies, P.L. y Jia, Z. (1999) Crystal structure of calpain reveals the structural basis for Ca2+-dependent activity and a novel mode of enzyme activation. EMBO J. 18: 6880-6889. Estudio cristalogrfico sobre las calpanas donde se discuten los mecanismos de activacin por calcio. Khorchid, A. y Ikura, M. (2002) How calpain is activated by calcium. Nat. Struct. Biol. 9: 239-241. Artculo corto de fcil lectura y que desvela la presencia de nuevos sitios de unin a calcio en las calpanas. Otto, H. y Schirmeister, T. (1997) Cystein Proteases and their inhibitors. Chem. Rev. 97: 133-171. Excelente revisin, mencionada en varios apartados de este tema, y que dedica varias pginas a revelar los ltimos conocimientos sobre las calpanas, incluido un apartado sobre su implicacin en diversas enfermedades. Patrick, G.N., Zukerberg, L., Nikolic, M., de la Monte, S., Dikkes, P. y Tsai, L. (1999) Conversion of p35 to p25 deregulates Cdk5 activity and promotes neurodegeneration. Nature 402: 615-622. Identificacin de clapnas en rutas de neurodegeneracin asociadas al Alzheimer. Artculo con una gran difusin.
26
Tidball, J. y Spencer, M.J. (2000) Calpains and muscular dystrophies. Int. J. Biochem. Cell Biol. 32: 1-5. Revisin que recoge la implicacin de las calpanas en la distrofia muscular y propone nuevas terapias para esta enfermedad.
La siguiente bibliografa est referida a la degradacin proteica por el proteosoma. La bibliografa encontrada sobre este tema es muy numerosa, aqu se incluyen algunas revisiones de gran inters, artculos monogrficos, e incluso, un libro dedicado al sistema ubiquitinaproteosoma.
Baumeister, W., Walz, J., Zuhl y Seemuler, E. (1998) The proteasome: paradigm of a selfcompartmentalizing protease. Cell 92: 367-380. Excelente revisin de lectura obligada. Recoge los aspectos estructurales, y de regulacin de la ruta del proteosoma. Ciechanover, A. (1998) The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell life. EMBO J. 17: 7151-7160. Excelente revisin sobre el proteosoma y la ruta de ubiquitinacin, de uno de los autores ms reconocidos sobre el tema. Se discuten los distintos tipos de enzimas E3 y su interaccin con las protenas sustrato. DeMartino, G. y Slaughter, C.A. (1999) The proteaseme regulated by multiple mechanism. J. Biol. Chem. 274: 22123-22126. Revisin corta sobre los mecanismos de control y regulacin de los proteosomas. Goldberg, A.L., Elledge, S.J. y Harper, J.W. (2001) Proteosomas. Investigacin y Ciencia 294, 22-27. Revisin general y actualizada sobre los proteosomas, realizada por alguno de sus descubridores. Da una visin global del tema de la protelisis con bonitas imgenes y una discusin sobre los aspectos fisiolgicos de la protelisis intracelular. Grune, T., Reinheckel, T. y Davies, K.J. (1997) Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. FASEB J. 11: 526-534. Demostracin de una ruta de degradacin de protenas independiente de la ubiquitina. Explicacin de los factores estructurales necesarios para el reconocimiento y la catlisis. Harris, A.L. (2002) Hypoxia: a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. 2: 38-47. Una revisin en la que se explica la regulacin de los genes inducibles por hipoxia, por el supresor de tumores VHL. Hartmann-Petersen, R., Seeger, M. Y Gordon, C. (2003) Transferring substrates to the 26S proteasome. Trends Biochem. Sci. 28: 26-31. Revisin sobre los procesos que tienen lugar en la cavidad reguladora del proteosoma para introducir los sustratos a la cavidad proteoltica. Huffman, H.A., Sadeghi, M., Seemuller, E., Baumeister, W. y Dunn, M.F. (2003) Proteasome-
cytochrome c interactions: A model system for investigation of proteasome host-guest interacttions. Biochemistry 42: 8679-8686. Estudios del mecanismo cintico del proteosoma 20S de Thermoplasma acidophilum. Johnston, S.C., Riddle, S.M., Cohen, R.E. y Hill, C.P. (1999) Structural basis for the specificity of ubiquitin C-terminal hydrolases. EMBO J. 18: 3877-3887. Estudio structural de una enzima que participa en desubiquitinacin. Kisselev, A.F., Songyang, Z. Y Goldberg, A.L. (2000) Why does threonine and not serine, function as the active site nucleophile in proteasomes? J. Biol. Chem. 275: 14831-14837. Artculo sobre el mecanismo de catlisis del proteosoma. Koepp, D.M., Harper, J.W. y Elledge, S.J. (1999) How the cyclin became a cyclin: regulated proteolysis in the cell cycle. Cell 97: 431-434. Regulacin del ciclo celular por el proteosoma. McNaught, K., Olanow, C.W., Haliwell, B., Isacson, O. y Jenner, P. (2001) Failure of the ubiquitinproteasome system in Parkinsons disease. Nat. Rev. 2: 589-594. Implicaciones del proteosoma en la enfermedad de Parkinson. Pajonk, F. y McBride, W.H. (2001) The proteasome in cancer biology and treatment. Radiation Res. Una revisin completa sobre la implicacin de los proteosomas en el cncer. Sacristan, M. y Bueno, A. (2002) Salida de mitosis: Inactivacin de CDK y replicacin del genoma. Investigacin y Ciencia 312: 31-32. Articulo breve sobre la regulacin del ciclo celular incluyendo a las Cdk, las ciclinas y el proteosoma. Sweder, K. y Madura, K. (2002) Regulation of repair by the 26S proteasome. J. Biomed. Biotech. 2: 94105. Implicacin del proteosoma 26S en la reparacin del ADN. Verma, R. y Deshaies, R.J. (2000) A proteasome howdunit: the case of the missing signal. Cell 101, 341-344. Revisin corta que intenta explicar el extrao caso de la ODC. Walz, J., Erdmann, A., Kania, M., Typke, D., Koster, A.J. y Baumeister, W. (1998) 26S proteasome structure revealed by three-dimensional electron microscopy. J. Struct. Biol. 121: 19-29: A pesar de su modernidad, un clsico en la bibliografa del proteosoma. Magnificas fotografas sobre la estructura de este complejo proteico. Whitby, F.G., Masters, E.I., Kramer, L., Knowlton, J.R., Yao, Y., Wang, C.C. y Hill, C.P. (2000) Structural basis for the activation of 20S proteasomes by 11S regulators. Nature 408: 115120. Artculo corto que estudia los aspectos estructurales de la degradacin de protenas por el
27
proteosoma, en una ruta independiente de ubiquitina. Zwickl, P, y Baumeister, W. Eds. (2002) The proteasome-ubiquitin protein degradation pathway. Springer Verlag, Un excelente libro sobre la ruta ubiquitina-proteosoma. Incluye ocho captulos escritos por las mximas autoridades en el tema y que va desde aspectos estructurales, catalticos o de regulacin hasta sus funciones fisiolgicas y patolgicas.
A continuacin se describen algunos artculos relacionados con las caspasas y la apoptosis.
dos de este tema. Trata de una forma muy completa a las catepsinas en varios aspectos, incluido su implicacin patolgica.
Cohen, G.M. (1997) Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem. J. 326: 1-16. Otra excelente revisin, aconsejable de leer despus de la revisin de Thornberry y Lazebnik para aspectos ms concretos de las caspasas. Ortiz-Lombarda M. y Mat-Prez, M.J. (2003) Apoptosis: mecanismos moleculares. Investigacin y ciencia 321: 38-39. Lectura corta sobre la apoptosis, recomendable para hacerse una idea general del proceso. Thornberry, N.A. y Lazebnik, Y. (1998) Caspases: Enemies within. Science 281: 1312-1316. Excelente revisin, no muy larga, que recoge casi todos los aspectos conocidos de las caspasas, como clasificacin estructura, activacin, participacin en apoptosis, control en enfermedades. Sin duda una lectura obligada sobre estas enzimas. Wolf B.B. y Green D.R. (1999) Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases. J Biol Chem 274: 20049-20052. Mecanismos de actuacin de las caspasas en la apoptosis. Protelisis lisosmica
La siguiente bibliografa recoge algunos aspectos relacionados con la protelisis lisosmica y las catepsinas.
Bohley, P. y Seglen, P.O. (1992) Proteases and proteolysis in the lysosome. Experentia 48, 151157. Artculo describiendo los procesos de protelisis en los lisosomas y la implicacin de las catepsinas. Cuervo, A.M. (1997) Lisosomas: Algo ms que vertederos celulares. Investigacin y Ciencia :3233. Lectura corta sobre la degradacin selectiva y no selectva en los lisosomas. De lectura obligada para una visin rpida y general del tema. Cuervo, A.M. y Dice, J.F. (1998) How do intracellular proteolytic system change with age? Front. Biosci. 3, 25-43. Revisin de como los sistemas enzimticos involucrados en la protelisis son afectados por la edad. Otto, H. y Schirmeister, T. (1997) Cystein Proteases and their inhibitors. Chem. Rev. 97: 133-171. Excelente revisin, mencionada en varios aparta-
28

Proteolisis Intracelular Recambio Proteico

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Proteolisis Intracelular Recambio Proteico

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

distintos niveles de intracelulares son:

* PROTEASAINHIBIDOR * PROTEASAPROTEOGLICANO *PROTEASA INACTIVA pH

+ PROTEASA-Ca2+ + PROTEASAMEMBRANA + PROTEASACOMPLEJOS - PROTEASA DEGRADADA

Oxidacin Protelisis PROTEASA MS

ACTIVA PROTEASA DEGRADADA

FIGURA 4. Visin general del control de las proteasas

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

TABLA 4. Mecanismos de control de las cuatro clases de proteasas

Mecanismo de Control Sntesis

Sntesis puede ser estimulada

Sntesis puede ser estimulada

Sntesis puede ser estimulada

Mecanismo de control principal excepto para catepsina G La uroquinasa es fosforilada

Controla a catepsina D en los lisosomas No es un importante factor de control

Importante en lisosomas y vesculas de secrecin Importante Importante

Importante en lisosomas y vesculas de secrecin Importante Importante

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

TABLA 5. Propiedades moleculares de las calpanas

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

FIGURA 9. Representacin esquemtica de la ruta de degradacin proteica dependiente de ubiquitina.

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

FIGURA 10. Estructura tridimensional de la ubiquitina de eritrocito humano

3.2.2 Enzimologa de la ruta de ubiquitinacin

FIGURA 11. Ruta de ubiquitinacin

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

FIGURA 13. Microscopa electrnica del proteosoma 26S de Drosophila melanogaster

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

FIGURA 16. Mecanismo cataltico de la actividad quimotripsina-like del proteosoma 20S

se han encontrado tres sitios catalticos distintos dentro de un mismo proteosoma.

FIGURA 17. Composicin y organizacin de los proteosomas

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez

Protelisis Intracelular: Recambio Proteico

Jos Neptuno Rodrguez Lpez