UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA E.A.P.

FARMACIA Y BIOQUMICA

Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos FijosIdentificacin de Residuos 1 y 4

Departamento Acadmico de Farmacologa, Bromatologa y Toxicologa
Asignatura de Toxicologa y Qumica Legal

Quinto Ao Semestre 2013-I

Profesor Responsable: Q.F. Jos Llahuilla Quea Integrantes: Cano Mori, Csar Eduardo Chvez Carbajal, Lucero Gamarra Domnguez, Eliane Prez Guerrero, Fiorella Quispe Ibarra Anthony 08040003 08040103 08040007 08040106 08040024
Horario de Laboratorio: Martes10:00 am 2:00 pm

Departamento Acadmico de Farmacologa, Bromatologa y Toxicologa

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Introduccin
La toxicologa forense ayuda al establecimiento de la relacin causa-efecto entre la exposicin de un medicamento o sustancia qumica y los efectos txicos o mortales que puedan causar esa exposicin, las primeras investigaciones en toxicologa forense datan del ao 1850 en donde el Conde Hiplito de Bocarm, asesina a su cuado administrndole nicotina; para demostrar la causa de esta muerte Stass crea un mtodo de aislamiento y extraccin de txicos orgnicos fijos.1 A raz de estos avances qumicos y muchos otros, la Toxicologa Forense adquiere un gran desarrollo que se va consolidando a medida que sus resultados analticos pueden ser confirmados mediante la variada tecnologa instrumental, cada vez ms especfica y sensible. Hoy en da las drogas de abuso han pasado a ser de un problema global que afecta a muchos pases, obligando a las naciones a intensificar sus esfuerzos por el control y regulacin de algunas drogas3, es por ello que como futuros investigadores en el presente informe vamos a identificar los principales metaboltos producto de la biotransformacin de sustancias txicas presentes en los fluidos y tejidos corporal. Para la identificacin de estas sustancias previamente es necesario realizar una extraccin en un disolvente orgnico ya sea en medio cido o alcalino de modo que nos permita extraer la mayor cantidad y pureza2 de estos txicos. Dentro de estos compuestos vamos a poder encontrar sustancias como las benzodiacepinas, carbamacepina, fenotiazinas, anfetaminas, antidepresivos tricclicos, alcaloides, plaguicidas organofosforados, barbitricos, salicilatos y otros analgsicos antipirticos que hayan sido empleados como sustancias de abuso por el paciente.

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Objetivos
Identificar los compuestos orgnicos fijos presentes en una muestra biolgica de orina mediante reacciones especficas. Determinar la presencia de salicilatos, fenotiazidicos y benzodiacepinas presentes en una muestra biolgica de orina.

Conocer las propiedades, mecanismos de accin y las consecuencias de sus efectos lesivos.

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Determinacin de Txicos orgnicos fijos Identificacin de Residuo 1 y 4

1. Marco terico 1.1. Salicilatos
Son sustancias hoy en da ampliamente empleadas por sus propiedades antiinflamatoria y analgsica, por ello se expenden de forma libre en muchos establecimientos farmacuticos en sus presentaciones de salicilatos, acido acetil saliclico, salicilato de sodio o salicilato de dietilamina.5 Los salicilatos poseen como ncleo fundamental el cido saliclico (cido ortohidroxibenzoico) un potente irritante que solo puede usarse por va tpica; sin embargo para su utilizacin y mejor absorcin se han sustituido grupos carboxilos e hidroxilos dando como resultado la conocida aspirina, paracetamol, salicilato de metilo, entre otros.4

Mecanismo de accin y toxicidad Absorcin: GI, Drmica. Metabolismo: Heptico (depuracin 3.9L/h) Unin a Protena : 50-80% Volumen de distribucin: 0.15L/kg Excreta: Orina depende ph alcalino

Efectos txicos SNC: hiperventilacin, alcalosis respiratoria, deshidratacin. S.RESPIRAT: edema pulmonar. S.HEMATO: alteracin factor de coagulacin, hemorragia. GI:nauseas, emesis, dolor abdominal,

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Dosis txica

Manifestaciones Clnicas

D.TERAPUTICA:4060mg/Kg/da D. AGUDA: 150200mg/Kg/da D.SEVERA:300-500mg/Kg

Nauseas Deshidratacin Hipertemia Letarco Convulsiones

1.2. Fenotiazinas
Las fenotiazinas son un grupo de frmacos que se emplean principalmente en el tratamiento de la psicosis, se caracterizan por presentar un anillo tricclico en el cual estn ligados dos anillos de benceno por un tomo de nitrgeno y azufre.6 A partir de esta base se han podido sintetizar ms de 30 fenotiazinas con diferentes acciones farmacolgicas; uno de los primeros frmacos sintetizados fue la Clorpromazina indicado para estados de ansiedad, psicosis y agitaciones.

Mecanismo de accin y toxicidad Absorcin: GI, Parenteral. Metabolismo: Heptico . Efecto anticolinrgico produce taquicardia, y el bloqueo alfa-adrenrgico causa hipotensin ortosttica. Concentracin plasmtica mxima: 24h Unin a Protena : 80% Volumen de distribucin: 20 L/kg Excreta: Orina y bilis Vida media: 20-40h

Efectos txicos SNC: depresin. S.CARDIO: alteracin en la repolarizacin, conduccin auriculoventricular, S.DRMICO: hipersensisbilidad, reacciones cutneas. S.METABLICO: hipercolesterolemia.

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Dosis txica

Manifestaciones Clnicas Miosis Hipotensin Arritmia Depresin respiratoria Agitaciones Hiper- Hiportemia Letarco Convulsiones

D.LETAL: 150mg/Kg

1.3. Benzodiacepinas
Estn compuestas por un anillo de benceno unido a un anillo de diazepina de siete miembros, sin embargo presentan una sustitucin a nivel del carbono 5. Son tranquilizantes menores empleados con fines teraputicos en el tratamiento psiquitrico; sin embargo hoy en da tambin se emplean con fines delictivos junto con otros depresores del sistema nerviosos como el alcohol llevando al paciente a un estado de coma. Sus efectos ms relevantes son la sedacin, hipnosis, disminucin de la ansiedad, relajacin muscular, amnesia y actividad anticonvulsiva.7

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Mecanismo de accin y toxicidad Absorcin: GI Metabolismo: Heptico . Mecanismo de accin: potencian la accin inhibitoria del neurotransmisor (GABA), favoreciendo el ingreso de iones de cloro a la clula, lo cual genera hiperpolarizacin celular y disminuye la excitabilidad neuronal. Concentracin plasmtica mxima: 2- 3h Unin a Protena : 80-90% Volumen de distribucin: 1-3.5 L/kg Excreta:Renal Vida media: 10h

Efectos txicos

SNC: depresin. S.RESPIRATORIO: complicaciones

Dosis txica

Manifestaciones Clnicas
Ataxia Letargia Somnolencia Midriasis Bradicardia Taquicardia Hipotensin Hipotermia

D.LETAL: 2000mg/Kg

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2. Parte experimental 2.1. Reactivos, materiales y equipos

MATERIALES

REACTIVOS

Tetracloruro de fierro Cl3Fe 5% cido clorhdrico HCl 10% Rvo de Trinder Rvo F.P.N. Rvo Dragendorf Nitrito de sodio NO2Na 0.1% Sulfamato de amonio 1% Nnaftiletilendia mino clorhidrato 0.1%

Capsula de porcelana Tubo de ensayo de vidrio Bao maria Placa cromatogrfic a de silicagel Cmara cromatogrfic a Capilar Pipeta de vidrio de 1, 5 y 10 ml Propiteta de plstico o bombilla

EQUIPOS
Cmara extractora de gases de laboratorio Espectrofot metro

2.2. Tcnica operatoria 2.2.1. Identificacin de Salicilatos (R1) A. Reacciones Generales

Fundamento Se basa en la formacin de un complejo coloreado de tetrafenolhierro, por la presencia de hierro (III) y el anillo fenlico de los salicilatos. La formacin de una coloracin roja, azul o prpura indica una reaccin positiva frente a la presencia de fenoles.

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Mtodo operatorio
Gts R1 (Disuelto en etanol) Gts Cl3Fe 5% Coloracin azul, roja, prpura.

Si la reaccin es positiva Agregar HCl 10%

Desaparece el color.

Reaccin Qumica FeCl3 + 3 C7H6O3 = Fe (C7H6O3)3 + Cl3

Mecanismo de accin

Resultado

Reactivo
Cl3Fe HCl

Positivo/Negativo
++ ++

Coloracin
Prpura Amarillo

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B. Cuantificacin
Fundamento El reactivo de Trinder [HgCl2-Fe(NO3)3] produce un color prpura, aconsejable para la determinacin cuantitativa de salicilatos por espectrofotometra U.V. siendo caracterstico a una absorcin cuya longitud de onda es 540 nm Mtodo operatorio MP
5ml Rvo Trinder 1ml HCl 1ml MP o St (5mg cido saliclico)

ST

Leer a 540nm por espectrofotometra

Reaccin Qumica FeCl3 + 3 C7H6O3 = Fe (C7H6O3)3 + Cl3

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Mecanismo de accin

Resultado

Absorbancia
MP ST 0.549 0.508

5mg AAS X = 0.05mg AAS

100ml 1ml

0.508 A ST 0.549 AMP

0.05mg AAS X= 0.0540mg AAS

0.0540mg AAS X

2ml ORINA 100

X=2.7mg%

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2.2.2. Identificacin de Fenotiaznicos (R4) A. Reaccin de caracterizacin

Fundamento Se basa en la formacin de un compuesto coloreado verde oscuro o azul-verde que indica la presencia de compuestos fenlico como el cido fenilpiruvico (metaboltos) o de cidos relacionados. El color puede aclararse lentamente pasando al amarillo. Mtodo operatorio
Gts R4(diluido en etanol) Evaporar II gts Cl3Fe al 5% Agrega gt de HCl al 10%

El color azul-verde no debe desaparecer.

Reaccin Qumica

Mecanismo de accin

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Resultado

Reactivo
Cl3Fe HCl 10%

Positivo/Negativo
++ ++

Coloracin
Azul No desaparece

B. Reaccin especfica
Fundamento Forrest F.M y Forrest F.L, en 1960, propusieron un mtodo de determinacin cualitativa basado en el uso de FeCl3, HClO3 y HNO3 (el reactivo FPN, de fierro, perclrico y ntrico), el cual produce un radical libre con coloracin variable (azul, azul violceo). Mtodo operatorio III Gts del Rvo FPN 5 mlCl3Fe 5% 45ml NO3H C 50ml Ac. Perclrico

Gts R4 (diluido en etanol) Evaporar

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Mecanismo de accin

Resultado

Reactivo
FPN

Positivo/Negativo
+

Coloracin
Rojo violceo

2.2.3. Identificacin de Benzodiacepinas (R4) A. Reaccin general ( Dragendorff)

Fundamento Se basa en la identificacin de alcaloides, siendo especfico para compuestos nitrogenados presentes en la benzodiacepinas que por accin del Reactivo de Dragendorff (yoduro de potasio y bismuto) han de formar un compuesto rojo ladrillo caracterstico.

Mtodo operatorio

III Gts R4 Evaporar III Gts Rvo Dragendorff

Formacin de precipitado rojo ladrillo

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Resultado

Reactivo
Dragendorff

Positivo/Negativo
+++

Coloracin
Rojo ladrillo

B. Reaccin especfica
Fundamento Se fundamenta en el empleo del reactivo de Bratton- Marshall (Nitrito de sodio, sulfamato de amonio y N- (1- Naftil) etilendiamina.) para la determinacin de benzodiacepinas por diazotizacin. Este reactivo fue propuesto originalmente por sus creadores para la determinacin de sulfonamidas en orina, en donde previamente la orina deba ser sometida a una hidrlisis cida con HCl para la produccin de una benzofenona, con el medio cido proporcionado previamente, el nitrito de sodio se convierte a cido nitroso y se lleva a cabo la reaccin de diazotizacin Mtodo operatorio Gts R4 5ml HCl 6N Bao en glicerina A temperatura de 124C Por 30min Enfriar
1ml NO2Na 0.1% 1ml Sulfamato de amonio 1% 1ml Nnaftiletilendiam ino clorhidrato

Azul, rojo violceo

0.1%
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Reaccin Qumica

Mecanismo de accin

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Resultado

Reactivo
Nnaftiletilendiamino

Positivo/Negat Coloracin ivo

+++ Rojo violceo

2.2.4. Screenig en Cromatografa de capa fina

Fundamento La cromatografa en capa fina es la separacin de dos o ms molculas presentes en una mezcla en base al principio de reparto entre dos fases. Sirve para hacer una determinacin en serie de los metaboltos que queremos evaluar, aunque tienen la ventaja de ser rpidos y de rutina, puede que en algunos casos no sean tan especficos como los mtodos anteriormente descritos. Mtodo operatorio Soporte: Silicagel G

Sistema de solvente

Compuesto en estudio
Salicilatos Fenotiazinicos Benzodiacepnico

Sistema de solvente
Metanol Agua Metanol Agua Trietanolamina

Proporcin
5ml 5ml 5ml 5ml 0.03ml

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Reveladores

Compuesto en estudio
Salicilatos Fenotiazinicos Benzodiacepnico

Revelador
Reactivo de Trinder Reactivo de FPN Reactivo de Dragendorff

Se realiza la siembra hasta 15 veces de las muestras problemas y los estndares con ayuda de un capilar pequeo. El punto de siembra debe estar por encima del nivel de la fase mvil.

Introducir las placas o soportes de silicagel G cromatogrfica para realizada la corrida.

en la cmara

Se procede a secar con cuidado las placas y se revela, tienen que colocarse en distintos roceadores para evitar mezclas.

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Resultado

Rf: Mide la retencin de un componente. Rf= Distancia de la muestra desde el origen Distancia del eluyente desde el origen

Rx: Mide la relacin entre el estndar Rx= Distancia recorrida por el compuesto de referencia Distancia recorrida por el eluyente

Sustancia Salicilatos Fenotiazinicos Benzodiacepinas

Rf 0.46 0.52 0.70

Rx 0.53 0.50 0.66

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3.

Discusin de resultados
Para la identificacin de txicos orgnico fijos como los salicilatos, fenotiazinas y benzodiacepinas se emplearon mtodos qumicos de reacciones cualitativas y cuantitativas colorimtricas que fueron especficas para cada uno de estos compuestos, los resultados fueron positivos; sin embargo las cantidades encontradas en los residuos R1 Y R4 fueron mnimos segn los valores obtenidos al confirmar con los calores limites. Para una mejor identificacin de estos compuestos se realiz una determinacin por cromatografa en capa fina empleando slica gel-G que permiti comparar nuestras muestras problema frente a un compuesto estndar; para ello se emplearon diferentes reactivos como el Rvo de Trinder, Rvo FPN y Rvo de Dragendorff los cuales fueron potenciados al agregar nitrato de sodio en el proceso de revelado.

4.

Conclusiones

Se determin la presencia de salicilatos, benzodiacepinas y fenotiazinas en los residuos R1 y2 de una muestra biolgica de orina mediante reacciones especficas colorimtricas. Las concentraciones encontradas de salicilatos no sobrepasa el lmite tolerado, por lo tanto no podran causar grandes consecuencias de efectos lesivos a corto plazo. La presencia de benzodiacepinas y fenotiazinas podra causar efectos lesivos si se encuentran a altas concentraciones en el organismo.

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5.

Bibliografa
1. Drogas en pelo: sus alcances y limitaciones I" Perkins de Piacentino, A. M.; Locani, O. A.; Lorenzo, J. L. LABORATORIO DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL. Cuerpo Mdico Forense, Corte Suprema de Justicia de la Nacin Argentina. Repetto, Manuel; Repetto, Guillermo. Toxicolgica fundamental. 4a ed. Sevilla: Editorial Diaz de Santos; 2009. Pg. 526 Osvaldo Romo Pizarro. Medicina legal: elementos de ciencias forenses. 1 edicin. Santiago de Chile. 2000. Pg. 5 Lorenzo F.P. Moreno G.I Hernndez J.C. Farmacologa: Bsica y Clnica. 18 edicin. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana. 2008. Pg. 532 Secretaria de salud del Gobierno del estado de Veracruz. Gua de diagnostico y tratamiento intoxicacin por salicilato. 2012. Disponible en [www.ssaver.gob.mx./cilver] Mencas R.E. Mayero F.L. Manual de toxicologa bsica. 1 edicin. Madrid: Editorial Daz de santos. 2000. Pg. 123- 124 Rozo U.R. Alvarado B.J. Gua de Prctica clnica Toxicologa. 1 edicin. Volumen II, Tomo IV. Bogot: Editorial Mdica Latinoamericana. 2004. Pg 76-78.

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