El Urocultivo

EL urocultivo se utiliza para diagnosticar bacteriuria, la orina constituye un mtodo excelente para cultivar la mayor parte de microorganismos que infectan el aparato urinario. La combinacin de piuria con bacteriuria considerable sugiere la presencia de una infeccin urinaria. UTILIDAD CLINICA: 1. Cuando los sntomas indican una posible infeccin urinaria como: dolor y sensacin de calor al orinar, as como urgencia frecuente de orinar. 2. Cuando un paciente esta canalizado por largo tiempo, aunque no muestre sntomas de infeccin. 3. En mujeres embarazadas para monitorear cualquier bacteria en la orina que pueda causar algn problema al beb. RECOLECCION DE LA MUESTRA PARA CULTIVO: PRINCIPIO GENERALES: La muestra ideal es la primera de la maana debido a que la cuenta bacteriana es mayor. Se requiere de 3 a 5 ml de orina reciente en un recipiente estril, tambin se puede obtener mediante una sonda uretral, suprapubica o permanencia. Las muestras para urocultivos no se toman de bolsas recolectoras de orina que forman parte del sistema de drenaje a travs de una sonda. Se lleva la orina al laboratorio y se examina lo mas pronto posible, de no ser as, la orina se puede refrigerar hasta 2hrs antes de someterla a cultivo. En caso que el diagnostico sea de citomeglavirus, debern mantenerse a temperatura ambiental, ya que la refrigeracin destruye a los virus. Para establecer bacteriuriua, se toman 2 muestras sucesivas del chorro medio. Las muestras se deben de obtener antes de un tratamiento con antibiticos. El personal de salud instruye al paciente respecto de la tcnica adecuada para recolectar la muestra. La muestra de orina se cubre y el recipiente se rotula y se incluye lo siguiente informacin: Ficha de identificacin, Nombre del medico, Diagnostico probable, Mtodo de recoleccin, Hora en que se obtuvo la muestra, Administracin de lquidos forzados o intravenosos, Administracin de sustancias quimioterapeuticas especificas. TECNICAS PARA OBTENER UNA MUESTRA LIMPIA DE ORINA O DEL CHORRO MEDIO Toma de Muestras en Mujeres: La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello no es posible, seguir las mismas instrucciones en su casa. Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener a la mano lo siguiente: a) jabn desinfectante

b) agua hervida o agua estril c) gasa estril o un pao acabado de lavar d) el recipiente para tomar la muestra. Proceda primero a lavarse las manos y luego sintese en el inodoro, lo ms hacia atrs que pueda. Separe los labios genitales con una mano y mantenga los pliegues separados y proceda a asearse toda la zona genital con el jabn desinfectante. Enjuague con abundante agua estril y luego seque bien con gasa estril o con un pao limpio. Proceda a recoger la orina, destapando previamente el frasco SLO EN EL MOMENTO DE LA MICCIN y sin tocar con los dedos su interior, coloque la tapa con el lado plano hacia abajo. No toque el interior del recipiente o de la tapa. Empiece a orinar la poceta y recoja en el frasco, slo la muestra del chorro del medio es decir, no debe recoger ni la primera, ni la ltima parte del chorro de orina. Tape muy bien el frasco y rotlelo con su nombre. Trigalo al Laboratorio lo ms pronto posible, en un recipiente con hielo, cuidando de que no se bote el contenido. Toma de Muestras en Hombres: La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello no es posible, seguir las mismas instrucciones en su casa. Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener a la mano lo siguiente: a) jabn desinfectante b) agua hervida o agua estril a temperatura ambiente c) gasa estril o un pao acabado de lavar d) el recipiente para tomar la muestra. Lavarse con jabn desinfectante primero las manos y luego la cabeza del pene empezando por la abertura uretral y contine en direccin a usted, como muestra la ilustracin, previa retraccin del prepucio, si no est circuncidado. Luego enjuagar bien con agua estril o previamente hervida (a temperatura ambiente) y secar con gasa estril. Destape el frasco recolector slo en el momento de la miccin y sin tocar con los dedos su parte interna, coloque la tapa con el lado plano hacia abajo. Comience a orinar en la poceta y recoja en el frasco slo la muestra del chorro del medio, es decir, no debe recoger ni la primera ni la ltima parte del chorro de orina. Tapar bien el frasco, rotularlo con su nombre y traerlo al laboratorio lo ms pronto posible, en un recipiente con hielo y cuidando de que no se bote. El examen microbiolgico de una muestra de orina se denomina Urocultivo. ste se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo. A. Examen cuantitativo Mtodo de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminacin, se realiza de la siguiente manera: Se homogeneiza la muestra mediante agitacin.

 Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiolgico, estriles. Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilucin al 1:100. Se deposita 1 ml. de cada dilucin en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vaca un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45. Mediante rotacin suave, se favorece la distribucin homognea de la siembra. Mtodo de Kass Se incuban todas las siembras a 37 durante 24 a 48 horas. Para calcular el nmero de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas stas, basta multiplicar su nmero por la dilucin respectiva para obtener la cuenta total. Mtodo del asa calibrada. Esta estimacin cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de dimetro). Despus de incubar las siembras a 37 durante 24 a 48 horas, se cuenta el nmero de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de orina.

Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera: No hubo desarrollo microbiano. Menos de 10 000 colonias por ml. Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml. Ms de 100 000 colonias por ml. Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con ms de 100 000 colonias por ml., la probabilidad de infeccin es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se logra en tres recuentos sucesivos. Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en

infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstruccin uretral, infecciones crnicas e infecciones por cocos gram positivos. b. Examen cualitativo El estudio cualitativo, que conduce a la identificacin del agente, se realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de Levine o MacConkey. Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patgenas urinarias y permite la identificacin de los microorganismos contaminados. Su contenido en cistena y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carcter invasor de las colonias de Proteus. As se facilita la identificacin de estafilococos, bacilos difteromorfos, lactobacilos y otros agentes que pueden contaminar la orina. La identificacin final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades bioqumicas y caractersticas serolgicas. Esto permite establecer relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de revivida o de reinfeccin. De esto deriva el valor que tiene el conocimiento del biotipo, del serotipo (particularmente en E. coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps. aeruginosa) y del antibitico. ste ltimo se obtiene al comparar el antibiograma de cepas aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo paciente Si existe correspondencia, se concluye que se trata de una misma cepa. * Mtodos rpidos de diagnstico. Existen varios procedimientos prcticos y econmicos para el diagnstico rpido de infecciones urinarias o de bacteriurias significativas. Son tiles para investigar grandes grupos de personas. Estos mtodos pueden ser microscpicos, qumicos o de microcultivo. La coloracin de un frotis de orina no centrifugada mediante el mtodo de Gram constituye un ndice prctico para diferenciar entre infeccin y contaminacin urinarias. En efecto, la observacin de un bacilo gram negativo por campo microscpico puede realizarse cuando la muestra contiene ms de 100 000 bacterias por ml. Sin embargo, la dificultad de encontrar bacterias en frotis de orina por este mtodo, provoca resultados falsos negativos. Menos confiable aun es el hallazgo de 20 o ms bacterias gram negativas por campo microscpico de sedimento urinario, aunque dicho nmero permita sospechar recuentos superiores a 100 000 microorganismos por ml. Los procedimientos qumicos estn basados en propiedades enzimticas de las bacterias, que se pueden poner de manifiesto en la orina. Entre las pruebas se pueden mencionar: catalasa, reduccin de nitratos, reduccin de trifeniltetrazolio e hipoglucosuria. Estos mtodos, aunque rpidos y econmicos, tienen el inconveniente de ser indirectos, basarse en propiedades metablicas de las bacterias y no en su desarrollo y observacin, y producir muchos falsos negativos.

Placas de agar McConkey y de agar CLED, donde ha crecido un Escherichia Coli en cultivo puro, con un recuento superior a 100.000 UFC/ml. (cultivo sembrado con asa calibrada de 1/1000). SIGNIFICADO CLINICO: Los siguientes microorganismos en titulacin suficiente se consideran patgenos: Escherichia coli, Enterococcos, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella, Enterobacter, algunas especie de Serratia, Mycobacterium tuberculosis, Especies de Proteus, Pseudomona aeruginosa, Estreptococco hemolitico genralmente del gurpo B, Candida albicans y otras levaduras. INTERFERENCIAS: Pacientes que estn recibiendo lquidos forzados, la orina esta tan diluida que la cuenta de los colonias disminuye por debajo de los 105/mililitro. La contaminacin bacteriana puede provenir de: vello peri anal, bacterias localizadas debajo del prepucio, bacterias de las secreciones vaginales, de la vulva o de la porcion distal de la uretra, bacterias provenbientyes de las manos, pies o ropa. 1- Siembra La siembra debe realizarse de la orina sin centrifugar con un ansa calibrada, lo que permitir obtener una estimacin semicuantitativa del desarrollo microbiano. Existen numerosos medios de cultivo para sembrar una muestra de orina. La eleccin del medio de cultivo debe contemplar la relacin costo-beneficio, de modo de elegir la opcin que permita la recuperacin de la mayora de los patgenos con el menor costo posible. Para tal fin, el microbilogo debe tener en cuenta cierta informacin bsica: i. El 70-80% de los urocultivos enviados al laboratorio resultan "negativos". ii. El 85-90% de las IU son producidas por enterobacterias. iii. De los grmenes gram-positivos, los que se aislan con mayor frecuencia son enterococos y estafilococos. iv. El medio CLDE permite el desarrollo de bacilos gram-negativos, estafilococos y enterococos. Los medios de Levine, EMB o MacConkey permiten nicamente la recuperacin de bacilos gram-negativos. La mayora de los grmenes (incluyendo estreptococos y corinebacterias) desarrollan en agar sangre, pero este medio no permite la recuperacin de Haemophilus spp., ni neisserias patgenas (gonococos y muchas cepas de meningococos). El agar chocolate posibilita la recuperacin de todos los microorganismos mencionados anteriormente. Teniendo en cuenta estos conceptos, el microbilogo tiene varias opciones para la siembra racional de la orina. Siembra de acuerdo a la observacin previa del sedimento. Este procedimiento ofrece la ventaja de cultivar el microorganismo en el medio ms apropiado, tanto para su desarrollo, como para su caracterizacin macroscpica (aspecto de la colonia, fermentacin de lactosa, tipo de hemlisis, etc), por lo que posibilita orientar con mayor certeza el esquema inicial de identificacin. La desventaja es que demanda ms tiempo que la siembra "a ciegas".

Uno podra entonces establecer el siguiente esquema de siembra de acuerdo al sedimento: i. Sedimento normal y ausencia de grmenes: media placa de CLDE. ii. Sedimento patolgico y ausencia de grmenes: media placa de agar sangre o chocolate y media de CLDE, Levine o MacConkey. iii. Presencia de bacilos, independientemente del sedimento: placa entera de CLDE, Levine o MacConkey. iv. Presencia de cocos, independientemente del sedimento: placa entera de agar sangre o agar chocolate. b. Siembra "a ciegas". Esta opcin es ms prctica y sencilla que la anterior. Sin embargo, tiene la desventaja de la demora potencial en la recuperacin o identificacin del microorganismo. En la Argentina y en Europa el medio ms utilizado es el CLDE. Se puede sembrar media placa, pero esto muchas veces entorpece la obtencin de colonias aisladas o la visualizacin de mezcla de grmenes. Se debe recordar adems, que en este medio no desarrollan varias especies que pueden causar IU (corinebacterias, estreptococos y otros), por lo que un sedimento patolgico sin recuperacin de grmenes, o cualquier otro elemento que sugiera IU, debe promover la resiembra de la orina en agar sangre o agar chocolate, antes de asumir la muestra como "negativa". En los EEUU se prefiere realizar la siembra inicial en agar MacConkey y agar sangre. c. Segn patologa de base. Si se tiene oportunidad de conocer la patologa de base del paciente mediante una buena comunicacin con el mdico tratante, o de la solicitud expresa por escrito en forma rutinaria al recibir la muestra, se puede establecer alguna discriminacin en los medios a emplear. Los urocultivos de pacientes urpatas, con malformaciones, tumores, instrumentacin o traumatismos de las vas urinarias merecen la utilizacin de 2 medios (CLDE y agar chocolate). Para el resto de pacientes, alcanzara slo con la siembra de una placa de CLDE. 2- Incubacin a. Atmsfera. Dado que la mayora de los patgenos urinarios son facultativos, no se utiliza rutinariamente la siembra en medios para grmenes anaerobios ni se realiza la incubacin en anaerobiosis. Estas condiciones se utilizan en la situacin puntual en que se sospecha la presencia de anaerobios (muy infrecuente). En este caso, la muestra debe recolectarse por puncin suprapbica y remitirse rpidamente la jeringa sin burbujas al laboratorio. Si se incluyen placas de agar chocolate o sangre en el esquema de siembra, se recomienda incubarlas en atmsfera enriquecida con CO2 al 5-7% (lata con vela). Las placas de CLDE, Levine o MacConkey se incuban en atmsfera ambiental. b. Temperatura. Excepto en casos muy especiales de sospecha de algn tipo de micosis, la incubacin debe realizarse a 35 2 C. c. Tiempo. Si bien existen trabajos recientes que recomiendan un tiempo de incubacin de 24h y hasta de 12-16h, nosotros preferimos adoptar una posicin conservadora con las placas de agar sangre y chocolate y aconsejamos no descartarlas antes de las 48h de incubacin, especialmente cuando se trata de pacientes urpatas con sospecha de infecciones micticas, o bajo tratamiento antibitico. 3-Interpretacin e informe a. Cultivo monomicrobiano. Como se ha dicho, la interpretacin del cultivo debe realizarse conjuntamente con la valoracin de otros datos (ver tablas 1 y 2). En este sentido, resulta til recordar cuales son las posibilidades de xito al asumir la presencia de una IU cuando se relaciona el recuento de colonias con los sntomas.

Tabla 4. Correlacin entre el recuento bacteriano y la presencia de sntomas para la documentacin de infeccin urinaria en adultos Posibilidad (%) de IU con sntomas:* Recuento (ufc/ml)* Ausentes Presentes 80 (1 5 muestra) 95 Mujeres >10 95 (1 muestra) 4 5 5 95 Mujeres 10 - 10 3 <5 70 Mujeres 10 3 5 ND 95 Hombres 10 - >10 * Cultivo monomicrobiano ** IU, Infeccin urinaria: ND, no determinado. La tabla 4 es un resumen de las conclusiones de los trabajos de mayor relevancia en lo que respecta a los criterios de interpretacin de un urocultivo monomicrobiano tomado por chorro medio (flora nica o predominio del 90% de un germen en una mezcla) en pacientes adultos. Si bien esta tabla resulta ilustrativa, es muy probable que el microbilogo no cuente con los datos de los sntomas del paciente en la mayora de los casos. Afortunadamente, en ciertos grupos de pacientes, existe una correlacin aceptable entre los sntomas y la presencia de reaccin inflamatoria en el sedimento de orina. Por lo tanto, el microbilogo podra inferir la presencia de sntomas en base al sedimento de orina, slo a los fines de adoptar un criterio de informe, y asumir para s el trmino de bacteriuria significativa (BS) en lugar del de infeccin urinaria. De este modo, se puede reformular la tabla 4 y adoptar un criterio de informe en base a la propuesta de la tabla 5. Tabla 5. Criterios de informe de un cultivo de orina monomicrobiano en pacientes adultos Criterio de informe segn leucocituria en el Recuento (ufc/ml) sedimento (Nro/cpo 400X) >5 <5 5 BS BSp Mujeres >10 4 5 BS NM Mujeres 10 - 10 3 BS NEG Mujeres 10 5 BS BSp Hombres >10 3 4 BS NEG Hombres 10 - >10

BS, bacteriuria significativa. Informar especie y antibiograma. BSp, probable bacteriuria significativa, informar especie, antibiograma y consignar, a modo de observacin, que llama la atencin la escasa reaccin inflamatoria. NM, solicitar nueva muestra. NEG, informar ausencia de desarrollo microbiano En dicha tabla, la mencin de BS sugiere que el informe debera incluir el recuento, el nombre de la especie y el antibiograma. El hecho de informar al mdico estos tres elementos, expresa claramente que para el microbilogo, desde el punto de vista del laboratorio, el hallazgo es significativo. Es necesario enfatizar, que los criterios de informe son difciles de unificar y que algunos casos particulares pueden escapar a la propuesta de la tabla 5. Esta propuesta puede extenderse a las muestras tomadas por sonda. Sin embargo, debe recordarse que virtualmente cualquier recuento es significativo cuando se trata de bacilos gram-negativos aislados de una puncin suprapbica. Para los cocos grampositivos, especialmente estafilococos, se habla de recuentos mayores de 103, puesto que stos podran ser contaminantes adquiridos de piel durante el procedimiento de la puncin. En el caso de los pacientes peditricos, resulta imperioso establecer los criterios de interpretacin en base al tipo de muestra y al sexo. Tabla 6. Criterios de interpretacin del urocultivo segn el tipo de muestra en pacientes peditricos Posibilidad de IU en muestra de**: Recuento (ufc/ml)* >5 <5 Chorro Medio 5 BSp (1 muestra) BS Mujeres >10 BS (2 muestras) 4 5 NM BSp Mujeres 10 - 10 3 4 NS NM Mujeres 10 - 10 3 NS NS Mujeres 10 5 BS BS Hombres >10 4 5 BS BSp Hombres 10 - >10 3 4 NM NM Hombres 10 - >10 3 NS NS Hombres <10 * Cultivo monomicrobiano ** BSp, probable bacteriuria significativa, BS, bacteriuria significativa; NS, no significativo; NM; pedir nueva muestra Como se muestra en la tabla 6, las posibilidades de padecer IU varan en este sentido. Con respecto a la puncin suprapbica, se sugiere el mismo criterio que para los adultos (ver arriba).

b. Cultivo polimicrobiano. Cuando se habla de cultivo polimicrobiano de orina, se hace referencia a la presencia de 2 o ms grmenes, habitualmente dos, en recuentos mayores de 105 UFC/ml y en proporciones similares. El predominio de un germen en una muestra en una proporcin del 90% debe asumirse como monomicrobiano. La IU mixta, producida por 2 o ms grmenes, es extremadamente infrecuente (<0,3%) en pacientes ambulatorios no sondados. El microbilogo debe saber que el informe de una IU mixta infiere inexorablemente la presencia de un factor urolgico predisponente. Por otra parte, esta infeccin es ms prevalente en los pacientes internados sondados y en algunos enfermos con determinadas patologas que afectan el tracto urinario. Por lo tanto, toda IU polimicrobiana, debera documentarse con, por lo menos, 2 muestras. La ausencia de reaccin inflamatoria siempre debera despertar la sospecha de una probable contaminacin. Resumiendo, la IU polimicrobiana significativa puede ser asumida como tal, con bajo margen de error, si se documenta una mezcla con ms de 105 UFC/ml de 2 o ms grmenes en igual proporcin, en 2 muestras de orina correctamente recolectadas, las cuales deberan mostrar adems un sedimento francamente patolgico. 4- Identificacin Escapa al objetivo de esta entrega la recomendacin de guas para la identificacin bacteriana. El microbilogo debe adaptar su esquema de trabajo de acuerdo a sus necesidades, pero sin caer en la simplificacin extrema ni en la improvisacin. En la bibliografa se recomiendan algunos textos para la dise la tabla 7. identificacin bacteriana. 5- Antibiograma Una vez que se ha determinado que un cultivo es significativo, el microbilogo debe realizar el antibiograma. Para tal fin, resulta suficiente en la mayora de los casos, el ensayo de difusin con discos en agar (mtodo de Kirby-Bauer). Si bien los detalles tcnicos de este mtodo pueden encontrarse en una variedad de libros de texto, por lo que no sern discutidos en esta entrega, la eleccin de los discos no es una prctica sencilla. Tabla 7. Antibiticos sugeridos para ensayar con fines teraputicos en infecciones urinarias Antibitico a ensayar (x) en : DROGA Enterobacteria BNNF Estafilococo Enterococo A I PEN x* AMP x x ^ x AMS x x x@ x OXA x* CTN x x ^ TMS x x x NIT x x x x NOR x x x x x CIP ^ ^ ^ ^ ^ CTX x

CAZ IMI GEN AMK PIP VAN

x x x x x

x x x x x x

x&

PEN, penicilina; AMP, ampicilina; AMS, aminopenicilina-sulbactama; OXA, oxacilina; CTN, cefalotina; TMS, cotrimoxazol; NIT nitrofurantona; NOR, norfloxacina; CIP, ciprofloxacina; CTX, cefotaxima o ceftriaxona; CAZ, ceftacidima; IMI, imipenem; GEN, gentamicina; AMK, amicacina; PIP, piperacilina; VAN, vancomicina. A, ambulatorio; I, internado, BNNF, principalmente Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii Probar PEN para informar AMP y OXA para informar OXA y CTN, @ slo en A. baumannii, & con disco de alta carga, slo en internados. ^ Informar AMP, CTN, y CIP de acuerdo a los resultados de PEN, OXA y NOR, respectivamente. La tabla 7 muestra una lista de antibiticos sugeridos para ensayar slo con fines teraputicos. Por lo tanto, la tabla no incluye ciertas drogas tiles para la vigilancia de algunos mecanismos de resistencia de importancia clnica, ni para la bsqueda de resistencia asociada, ni para la sospecha de determinadas especies por el antibiotipo. El microbilogo debe recordar que lo importante es ensayar e informar los antibiticos de eleccin para el tratamiento de la IU y los que sean apropiados para las distintas especies (no informar un antibitico frente a una especie que es naturalmente resistente al mismo). Finalmente, se debe considerar el precio y la toxicidad de la droga. Es decir, tratar de informar la droga ms barata y menos txica, cuando esto sea posible. En base a estas consideraciones se

Tincin de Gram
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quienladesarrollen1844. La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM. Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min. con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de su pared. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las gram positivas como las gram negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.