UNIVERSIDAD TECNOLGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERIA MICROBIOLOGIA GENERAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS PRESENTES EN LA CONCHA NEGRA (Anadara tuberculosa)

C.R. Cevallos-Navarrete*, A.C. Argello-Noboa, C.A. Prez-Zambrano, A.C. Gallegos-Caldern Laboratorio de Microbiologa General, Universidad Tecnolgica Equinoccial, Occidental y Mariana de Jess, Quito, Ecuador. *fl4meboy@hotmail.com

OBJETIVO Aislar los diferentes tipos de enterobacterias presentes en el alimento, utilizando medios selectivos, e identificar el gnero y especie de las bacterias encontradas, aplicando pruebas bioqumicas.

INTRODUCCIN Enterobacterias Es la forma comn de denominar a las bacterias Gram. negativas. Reciben este nombre porque suelen encontrarse en el intestino de los mamferos. Las especies que poseen flagelos son mviles; el resto, inmviles. La capacidad para fermentar la lactosa y el tiempo empleado en hacerlo sirven para diferenciar los gneros. Los que no realizan la fermentacin son patgenos, los fermentadores, saprofitos. Hay enterobacterias que provocan intoxicaciones alimentarias, como la salmonelosis. Los sntomas son fiebre, diarrea y dolores abdominales. Es una intoxicacin muy rpida. Las epidemias de peste, que fueron muy importantes en la antigedad, tambin son producidas por una enterobacteria. Clasificacin cientfica: Las enterobacterias constituyen la familia Enterobactericeas (Enterobacteriaceae). Se clasifican en cinco tribus: Escherichieas, Klebsielleas, Proteeas, Yersineas y Erwinieas. Cada una comprende diversos gneros. Descripcin del producto: Concha Negra La concha negra (Anadara tuberculosa), es un molusco de 4 a 6 cm de longitud, de color negro y con filamentos en su caparazn semejantes a pelos. Crece en los fondos lodosos de los manglares. La concha negra es consumible, y es uno de los mariscos ms populares en Ecuador. Se recolecta de los manglares, para su venta y distribucin. Las conchas negras, son prohibidas de recolectar en ciertas pocas del ao, debido a sus periodos de

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reproduccin. Tambin debe realizarse un anlisis de presencia de saxitoxinas, para asegurar la seguridad en su consumo.

Importancia de recuento de Enterobacterias en alimentos: Microorganismos indicadores La presencia de determinados microorganismos en los alimentos se puede aprovechar como un indicador potente sobre algunos aspectos fundamentales relacionados con los mismos. Este tipo de microorganismos recibe la denominacin comn de microorganismos indicadores y su investigacin y cuantificacin nos puede aportar informacin sobre la seguridad sanitaria del alimento, su grado de alteracin, su nivel de envejecimiento, la bondad de su proceso de elaboracin, etc.

La presencia de microorganismos que modifican o degradan las caractersticas organolpticas de los productos, aunque no causen intoxicaciones, incapacitan los alimentos para su consumo o disminuyen su vida comercial.

Enterobacterias patgenas La presencia de Enterobacterias patgenas en los alimentos supone un grave riesgo para los consumidores que van a ingerirlos. Debemos garantizar la ausencia de este tipo de microorganismos en los alimentos. Bacillus cereus Clostridium botulinum Clostridium perfringens Escherichia coli Listeria monocytogenes Salmonella Shigella Staphylococcus aureus Yersinia enterocolitica

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MATERIALES Y MTODOS: 10 conchas negras fueron adquiridas en el mercado de Santa Clara, norte de Quito. La muestra fue transportada, tal como fue despachada por su distribuidor, hasta el laboratorio de microbiologa de la Universidad tecnolgica Equinoccial. La muestra se mantuvo a temperatura ambiente hasta su anlisis, el cual se realiz aproximadamente 2 horas despus de adquirida. Parte 1: Enriquecimiento Se pesaron aspticamente 25 gr de concha negra (incluyendo parte del caparazn externo), y se los coloc en 225 gr. de TSB (Caldo de Soya Triptona), para el enriquecimiento de las enterobacterias. Luego se procedi a incubar a 37oC, por 24 horas. Parte 2: Aislamiento de Enterobacterias Se inocul el caldo en EMB (Eosina Azul de Metileno), por la tcnica de estriado, para aislar colonias de diferentes enterobacterias. Despus, se incub a 37oC durante 24 horas. Parte 3: Purificacin Tras examinar las colonias aisladas sospechosas de enterobacterias, se procedi a inocular de nuevo en EMB, con el fin de obtener una cepa pura de cada una de las bacterias. Las 2 cajas Petri se incubaron a 37oC, por 24 horas. Al cabo de 24 horas, se pudo encontrar las 2 cajas Petri con cepas puras, completamente aisladas. Las primeras, de color rosa-oscuro y consistencia viscosa y las segundas de color verde brillante. De las colonias aisladas, se realiz una tincin gram, y se procedi a observar al microscopio. Parte 4: Identificacin Para la identificacin de las bacterias, es decir, su clasificacin en gnero y especie, se procedi a realizar las pruebas bioqumicas, para saber las caractersticas particulares de sus metabolismos.

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Las pruebas bioqumicas que se utilizaron fueron: el conjunto IMViC (Indol, RojoMetilo, Voges-Proskauer y Citrato), Hidrlisis de rea, TSI (Tres azcares y Hierro), SIM (Sulfuro Indol Motilidad) y LIA (Lisina Hierro). Para realizar estas pruebas, se inoculo la bacteria en cada tubo con el diferente medio usando la tcnica correspondiente. Los tubos de ensayo con los medios inoculados, se incubaron a 37 oC por 24 horas. Transcurrido ese tiempo, se dio lectura a los resultados de las Pruebas bioqumicas. Para realizar algunas pruebas, se debi aadir a los tubos de ensayo con el medio, el correspondiente reactivo revelador. (RM: Rojo metilo; VP: K(OH), Alfa-naftol; Indol: reactivo de Kovacs). Despus de identificar los 2 tipos de bacterias, se inocul la cepa pura de cada una en medio TSB, y se la almacen en la refrigeradora para futuros estudios.

RESULTADOS Y DISCUSIN: Al cabo de las 24 horas de incubado el EMB inoculado con el caldo TSB, principalmente de 2 tipos de microorganismos. Se observ que la mayora de colonias presentaban un color verde brillante, con brillo metlico, por lo que pudimos especular que se trataba de colonias de E. coli, debido a que presentaba los colores y forma de colonias tpicas de esta bacteria en este medio. El resto de colonias tenan un una consistencia viscosa y un color rosa oscuro, lo que indicaba que se trataba de microorganismos glucosa y/o lactosa positivos, es decir, que metabolizan una o las 2 azcares. Tras aislar cada una de las bacterias encontradas, se pudo encontrar las 2 cajas de EMB con cepas puras. Las primeras, de color rosa-oscuro y consistencia viscosa y las segundas de color verde brillante. Al observar la placa de las primeras bacterias a la que se aplic tincin Gram. en el microscopio, se encontr que eran Gram. negativa, y presentaban forma de bacilo. Las segundas bacterias, por su reaccin de coloracin verde-claro y con brillo metlico en el medio EMB, se especul que se trataba de Escherichia coli, por lo que no se realiz la tincin Gram. con esta cepa. Despus de analizar los resultados de las pruebas bioqumicas aplicadas a las 2 diferentes cepas, se pudo apreciar sus caractersticas de metabolismo propias y por tanto, las 2 bacterias fueron clasificadas en gnero y especie. Los resultados de las pruebas bioqumicas se pueden apreciar en las tablas 1 y 2, y en las figuras 1 y 2.

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Prueba Bioqumica Produccin de Indol Rojo-Metilo Voges-Proskauer Citrato de Simmons Produccin de H2S Hidrlisis de Urea Descarboxilacin de Lisina Motilidad Produccin de Gas Produccin de cido: -Glucosa -Sacarosa -Lactosa

Klebsiella planticola + + + + + + + + +

1ra Bacteria aislada + + + + + + +

IMViC

Tabla 1. Comparacin de resultados de pruebas bioqumicas entre la 1ra bacteria aislada y los resultados para Klebsiella planticola

Fig. 1. Pruebas bioqumicas de la 1ra bacteria aislada

Se compar los resultados obtenidos de la primera bacteria aislada con la bacteria del manual que presentaba las caractersticas similares, en este caso fue la Klebsiella planticola. Los resultados casi indican que se trata en realidad de esta bacteria, a excepcin de la prueba de Voges-Proskauer. Esta prueba fue repetida 2 veces, sin embargo expuso el mismo resultado que no coincida con lo estipulado para la especie. Se decidi pasar por alto esta variacin, por 2 razones importantes: La variacin en el resultado de esta prueba, puede ser atribuida a los cambios que puede sufrir el

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microorganismo en el medio donde se desarrolla. A dems, a excepcin del resultado en el Voges-Proskauer, se observ en los dems medios de cultivo la forma tpica de colonia correspondiente al gnero Klebsiella sp.

Prueba Bioqumica Produccin de Indol Rojo-Metilo Voges-Proskauer Citrato de Simmons

Escherichia coli + + -

2da Bacteria aislada + + -

IMViC

Tabla 2. Comparacin de resultados del conjunto de pruebas IMViC entre la 2ra bacteria aislada y los resultados para Escherichia coli

Fig. 2. Pruebas bioqumicas del conjunto IMViC para la 2da bacteria aislada

Para la segunda bacteria aislada, solo se realiz el conjunto de pruebas IMViC, ya que todas las caractersticas observadas, indicaban que se trataba de Escherichia coli, lo cual se pudo ratificar con el conjunto de pruebas, ya que se observ coincidencia en todas las 4.

CONCLUSIONES Los resultados del anlisis de Enterobacterias, despus haber sido aisladas y sometidas a la diferentes pruebas bioqumicas, se lleg a clasificar 2 tipos diferentes de ellas: Klebsiella plantcola y Escherichia coli. La E. coli es un microorganismo patgeno, y su presencia en el alimento indica un posible riesgo de intoxicacin para la persona que lo ingiera.

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La recoleccin de conchas es una actividad artesanal, por ende, no suele cumplir con las normas de control de calidad. Por ello, el consumidor final debera tomar precauciones al adquirir el producto y al procesarlo para ser ingerido. La Klebsiella planticola es una enterobacteria que se desarrolla principalmente en las plantas de mangle. La concha negra habita en las races de los manglares lo cual podra explicar la presencia del microorganismo en el alimento. Este microorganismo, no tiene caractersticas patgenas, sin embargo, se debera tomar medidas de limpieza para reducirlo lo mas posible antes de que el producto sea ingerido.

BIBLIOGRAFA
1. International Commission for Microbiological Specifications in Foods. Ecologa microbiana de los alimentos. Productos alimenticios. Zaragoza: Editorial Acribia, 1985; vol 2: 528-30. 2. Proyecto NC-92. Determinacin cuantitativa de Enterobacterias totales en alimentos. 1992. 3. Farmer JJ, Kelly TM. Enterobacteriaceae. En Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadony HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology. 5 ed. Washington, DC: American Society of Microbiology 1991;360-83. 4. Lic. Virginia Leyva Castillo. Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, 10300, Cuba. 5. Annimo. 2008-06-27. Caractersticas de Andara tuberculosa. www.marn.gob.sv/uploaded/content/article/1586257920.pdf+concha+negra/+molusco&hl =es&ct=clnk&cd=4&gl=ec.