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COPROCULTIVO 2012

COPROCULTIVO 2012

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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA VETERINARIA CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

COPROCULTIVO: DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE INFECCIONES ENTÉRICAS DE ORIGEN BACTERIANO
I.- OBJETIVO GENERAL: Al finalizar la práctica, el estudiante estará en la capacidad de interpretar el resultado de un coprocultivo. II.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1.- Enumerar de acuerdo al orden de frecuencia, y las especies animales involucradas, los agentes productores de infecciones entéricas en las principales especies de animales domésticos. 2.- Evaluar la importancia epidemiológica, clínica y sanitaria que tiene la familia Enterobacteriaceae. 3.- Explicar esquemáticamente los pasos a seguir en el procesamiento de una muestra para lograr un coprocultivo exitoso. 4.- Seleccionar el tipo de muestra a tomar en un paciente con infección entérica y describir el procedimiento (discriminando las principales especies de animales domésticos) para la correcta toma de una muestra de heces para realizar un coprocultivo. 5.- Identificar en los medios de asilamiento selectivos las colonias presuntivas de E. coli, Salmonella y otras bacterias productoras de infecciones entéricas, no enterobacterias. 6.- Mencionar las pruebas a realizar en la identificación microbiológica (diagnóstico presuntivo y definitivo) de las bacterias productoras de infecciones entéricas 7.- Interpretar el resultado de la investigación de leucocitos fecales. 8.- Explicar la importancia del coprocultivo en el diagnóstico de toda infección entérica. III.- CONTENIDOS: DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE INFECCIONES ENTÉRICAS DE ORIGEN BACTERIANO 1.- Agentes etiológicos de las infecciones entéricas: Virus, bacterias y hongos. 2.- Bacterias más frecuentes productoras de diarreas: E. coli, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Vibrios, otros. 3.- Diagnóstico Microbiológico a.- Investigación de leucocitos fecales Procedimiento

Interpretación b.- Coprocultivo Toma de muestra, transporte, siembra en medios selectivos y de enriquecimiento Aislamiento e identificación bioquímica de los principales agentes bacterianos productores de diarreas c.- Identificación serológica de Salmonella y Shigella IV.- ACTIVIDADES DEL DOCENTE: Exposición demostrativa de aproximadamente 30-40 minutos que incluye: 1.- Procedimiento a seguir para realizar un coprocultivo: Toma de muestra, siembra en medios selectivos y de enriquecimiento. 2.- Observar y describir los diferentes tipos de colonias presentes en los medios selectivos: Agar SS, Agar MacConkey, Agar EMB de Levine y Agar XLD 3.- Efectuar la siembra de una colonia previamente seleccionada de los medios selectivos en un medio diferencial de Kliger 4.- Realizar la lectura de las reacciones bioquímicas observadas en un medio de Kliger, caldo urea, lisina descarboxilasa, fenilalanina desaminasa, rojo metilo, voges proskauer, indol y citrato. 5.- Describir la importancia de la identificación serológica a partir de una colonia identificada presuntivamente como: Shigella o Salmonella aislados de un coprocultivo V.- ACTIVIDADES DEL ALUMNO: 1.- Responder las preguntas formuladas en la hoja del ejercicio práctico al final de esta guía. 2.- Esquematizar el procedimiento para la identificación del germen aislado a partir de una muestra de heces 3.- Inspeccionar un tubo con caldo tetrationato inoculado con una muestra de coprocultivo. 4.- Sembrar en Agar MacConkey, Agar SS, Agar EMB de Levine y Agar XLD a partir de un cultivo de enriquecimiento (Caldo tetrationato) inoculado con una muestra de coprocultivo. 5.- Incubar las placas con los medios selectivos sembrados en un ambiente de microaerofília a 37ºC por 24 horas. 6.- Inspeccionar, observar y describir las colonias de Salmonella, Proteus, Klebsiella y E. coli desarrolladas en los medios selectivos sembrados el día anterior. 7.- Observar, a partir de una placa de aislamiento, el repique de una colonia al medio diferencial de Kliger y la siembra de las diferentes pruebas bioquímicas diferenciales: caldo urea, lisina descarboxilasa, fenilalanina desaminasa, rojo metilo, voges proskauer, indol y citrato

8.- Interpretar los resultados de las diversas pruebas bioquímicas sembradas (Kliger, caldo urea, lisina descarboxilasa, fenilalanina desaminasa, rojo metilo, voges proskauer, indol y citrato) 9.- Preparación de un extendido coloreado con Gram a partir de un cultivo de 24 horas sospechoso de Salmonella en medio BHI. 10.- Realizar la prueba de catalasa y oxidasa a una colonia aislada a partir de uno de los medios selectivos o a partir del cultivo puro Salmonella en caldo BHI. VI.- EVALUACION: 1.- Discusión grupal en una sesión práctica VII.- CONSIDERACIONES TEÓRICAS 1.- INTRODUCCIÓN La porción inferior del intestino delgado tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (bacteroides, bacilos gran positivos y estreptocos, microorganismos entéricos Gram negativos y Streptococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patógenas de las heces implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través del uso de medios selectivos, diferenciales y de cultivos de pre-enriquecimiento. El diagnóstico bacteriológico de las infecciones entéricas se realiza de acuerdo a su patogenia. En las infecciones diarreicas se utiliza el coprocultivo, pero una vez que las bacterias invaden el torrente sanguíneo, el diagnóstico debe hacerse además, por el hemocultivo y el estudio serológico (serodiangóstico de Widal) Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud animal y salud pública. Sin embargo, muchas de estas enfermedades no son notificadas, ya sea porque en su mayoría son autolimitadas y no ameritan la consulta al veterinario, o porque no son reportadas oportunamente por el personal de salud (subregistro). Su etiología infecciosa es diversa, pudiendo ser producida por bacterias, virus, parásitos y hongos. 2.- AGENTES ETIOLÓGICOS Las principales causas de los trastornos gastrointestinales agudos incluyen: Virus, las toxinas de diferentes agentes bacterianos gram positivos, bacilos gram negativos invasores, fermentadores lentos de la lactosa y espirales. En las diferentes especies de animales domésticos se han encontrado en muestras procedentes del tracto gastrointestinal, los siguientes patógenos (ver Tablas 1, 2 y 3):

Tabla Nº 1.- INFECCIONES BACTERIANAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL EN LAS PRINCIPALES ESPECIES DE ANIMALES DOMESTICOS ESPECIE ANIMAL ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO BOVINOS Pseudomona sp., Proteus sp. Diarrea inducida por antibióticos Clostridium perfringens tipos B y C Enterotoxemia clostridial Escherichia coli Colibacilosis y colisepticemia Mycobacterium paratuberculosis Paratuberculosis (enf. De Johne) Salmonella spp. Salmonelosis CANINOS Escherichia coli (Endotoxemia) Gastroenteritis hemorrágica canina Clostridium (Enterotoxemia Clostridial) Salmonella sp., Campylobacter jejuni Colitis bacteriana Campylobacter jejuni Campylobacterosis entérica Salmonella sp Enteritis por Salmonella Enteritis en neonatos (Escherichia coli) Escherichia coli Neorickettsia helminthoeca Envenenamiento por salmón FELINOS EQUINOS Enteritis / colitis bacteriana Salmonelosis Enterotoxemia Clostridial Clostridiosis intestinal Septicemia Neonatal Diarrea idiopática Enfermedad del sueño AVES Enteritis necrótica Erisipela del pavo Salmonelosis Infección Arizona en pavos (Inf. Paracolon) Erispela del pavo Pseudotuberculosis en pavo Caida de "dropped wing" en palomas Enteritis ulcerativa (enf. de la codorniz) Enterotoxemia Clostridial (AD) Colibacilosis (Enf. del edema) (AD) Salmonellosis (PD) Ileitis (PD) Disenteria (PD) Adenomatosis intestinal (PD) Espiroquetosis intestinal OVINOS Colibacilosis y colisepticemia Enfermedad de Johne Disenteria del ternero Salmonelosis "Watery mouth" Bacterias Gram negativas Salmonella typhimurium, Salmonella agona, Salmonella cubana, Salmonella cerro serog. B Clostridium perfringens tipo B y C Clostridium perfringens tipo A Actinobacillus equuli, Streptococcus grupo C, Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella spp Rhodococcus equi, Salmonella spp Actinobacillus equuli Clostridium Perfringens tipos A o C Erysipelothrix rhusiopathiae Salmonella gallinarum Salmonella pullorum, Salmonella spp. Salmonella arizonae Erysipelothrix rhusiopathiae Yersinia Pseudotuberculosis Salmonella typhimurium Clostridium colinum Clostridum perfringens tipo C Escherichia coli Salmonella cholerasuis Lawsonia intracellularis Treponema hyodysenteriae Campylobacter mucosalis, Campylobacter hyointestinalis, Campylobacer hyolei Serpulina pilosicoli Escherichia coli Mycobacterium paratuberculosis Clostridium perfringer tipo B Salmonella spp. Asociado con Escherichia coli.

PORCINOS

Tabla Nº 2.- INFECCIONES VIRALES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL EN LAS PRINCIPALES ESPECIES DE ANIMALES DOMESTICOS ESPECIE ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO ANIMAL Pestivirus (Flaviviridae) Diarrea Viral Bovina (BVD) y enfermedad mucosal Herpesvirus ovino tipo 2 (OHV 2) Fiebre Catarral Maligna Morbillivirus (Paramyxoviridae) Rinderpest (peste bovina) BOVINOS Rotavirus (Reoviridae) Infecciones por Rotavirus Coronavirus (Coronaviridae) Infecciones por Coronavirus Coronavirus (Coronaviridae) Disentería de invierno Coronavirus (Coronaviridae) Infección por Coronavirus canino Herpesvirus canino tipo 1 Inf. Por Herpesvirus canino en cachorros Parvovirus (Parvoviridae) Parvovirosis canina CANINOS Morbilivirus (Paramyxoviridae) Enteritis por Distemper Adenovirus tipo 1 (Adenoviridae) Enteritis por Hepatitis infecciosa canina Parvovirus (Parvoviridae) Enteritis por Parvovirus Coronavirus (Coronaviridae) Enteritis por Coronavirus Lentivirus (Retroviridae) Inmunodeficiencia viral felina Coronavirus (Coronaviridae) Peritonitis infecciosa felina FELINOS Retroviridae Leucemia felina Parvovirus felino Panleucopenia felina EQUINOS Rotavirus Diarrea Rotavirus Aviar (Reoviridae) Infección por Rotavirus AVES Coronavirus (Coronaviridae) Enteritis transmisible del pavo (Cresta azul) Aviadenovirus (Adenoviridae) Enteritis Hemorrágica del pavo Coronavirus Enteritis transmisible (AD) PORCINOS Rotavirus Diarrea (AD) Morbillivirus (Paramyxoviridae) Peste de los pequeños rumiantes OVINOS Morbillivirus (Paramyxoviridae) Peste de los bovinos Rotavirus (Reoviridae) Rotavirosis

Tabla Nº 3.- INFECCIONES FUNGICAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL EN LAS PRINCIPALES ESPECIES DE ANIMALES DOMESTICOS ESPECIE ANIMAL ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO BOVINOS Cryptosporidium parvum Cryptoporidiosis CANINOS Histoplasma capsulatum Histoplasmosis canina FELINOS Histoplasma capsulatum Histoplasmosis felina Aspergillus flavus Enfermedad X del pavo (Aflatoxicosis) AVES Thrush of the crop Candida albicans OVINOS Cryptosporidum sp. Cryptosporidiosis

La importancia epidemiológica y el peso específico de cada una de estos microorganismos (bacterias, virus y hongos) como agentes causales de diarrea, varían dependiendo de la especie animal, edad del paciente, condiciones ambientales como el clima, variaciones estacionales, reservorios, factores epidemiológicos como presencia de brotes epidémicos, saneamiento básico y hábitos y creencias de los productores o dueños de mascotas. Existen dudas en cuanto al conocimiento de la epidemiología de algunos agentes,

en particular sobre sus modos de transmisión y supervivencia en el medio. Se sabe más sobre Salmonella en la cual el mecanismo de transmisión implica la vía fecal y oral, favorecido por la excreción de altas dosis de bacilos que pueden sobrevivir en el ambiente. El hacinamiento que caracteriza a la mayoría de las poblaciones animales en los centros de cría y producción, permite la diseminación y persistencia de cepas patógenas. A pesar de los avances importantes en las investigaciones biomédicas en las últimas décadas, las diarreas continúan siendo la mayor causa de pérdidas económicas en las explotaciones pecuarias y morbilidad y mortalidad entre las mascotas tanto en los países desarrollados como en vías de desarrollo A.- VIRUS Los virus (Pestivirus, Herpesvirus, Morbillivirus, Rotavirus, Coronavirus, Parvovirus, Adenovirus, Lentivirus, Retrovirus, entre otros) son la causa más frecuente de gastroenteritis y diarreas. Estas enfermedades son de presentación clínica y duración muy variada, constituyendo la segunda causa de enfermedad en la comunidad, después de las infecciones respiratorias virales. Son autolimitadas, no ameritan, ni justifican tratamiento con antibióticos y su manejo es sólo con medidas de soporte, tipo hidratación. Su diagnóstico se realiza básicamente mediante. 1.- La epidemiología: Generalmente aparecen por brotes. 2.- La ausencia de polimorfos nucleares en las heces 3.- Estudios serológicos y aislamiento del virus. Estos hacen o permiten el diagnósticoi de certeza, pero resultan costosos. En nuestro campo de trabajo, los agentes virales relacionados con cuadros gastrointestinales más importantes varían dependiendo de la especie animal estudiada (ver tabla Nº 2). Los inmunoensayos han pasado a dominar el diagnóstico virológico de la gastroenteritis aguda en el laboratorio clínico. Actualmente, hay disponible en el mercado una gran variedad de kits (métodos rápidos para diagnóstico) para los diferentes agentes etiológicos virales, los cuales están basados en pruebas de aglutinación, inmunodifusión, ensayos inmunoenzimáticos o con partículas de látex. La sensibilidad entre los diferentes kits puede variar entre 70-95%, y si bien son de alta especificidad, puede haber algun resultado falsopositivo, especialmente cuando se utilizan los kits con partículas de látex. Es por ello, que el clínico debe evaluar con cautela cada examen positivo dentro del contexto clínicoepidemiológico Durante el componente teórico del curso de Microbiología se describirán estos virus, desde el punto de vista práctico nos limitaremos al estudio de las diarreas bacterianas. B.- BACTERIAS Los agentes bacterianos productores de diarrea se pueden clasificar en 4 grandes grupos, de acuerdo a sus mecanismos de patogenicidad. 1.- Bacterias Enterotóxigénicas: Producen diarrea acuosa por la elaboración de una exotoxina. Ejemplo: Vibrio cholerae. Alguna cepas de E. coli (ECET), Aeromonas, son capaces de producir enterotoxinas. 2.- Bacterias productoras de Citotoxinas:

Las citotoxinas pueden llevar a la destrucción de la mucosa. Se describieron por primera vez en S. dysenteriae tipo I. Actualmente se le han descubierto en Clostridium difficile y en ciertos serotipos de E. coli (E. coli enterohemorrágica). Estas citotoxinas juegan un papel importante en la producción de diarrea tipo disentérico por estas bacterias. 3.- Bacterias Enteroagregativas La capacidad de adherencia se ha estudiado bien en las E. coli enteroagregativas (ECEAg), conocidas anteriormente como Enteroadherentes, y E. coli EnteroToxigénicas (ECET) en las cuales se ha demostrado la presencia de pili y fimbrias que median esta capacidad y a los que se han denominado factores de colonización (CFA). Causan diarrea aguda y crónica (> 14 días de duración). La patogénesis esta aún en estudio; sin embargo, en las bacterias implicadas: ECEAg, se ha demostrado su adherencia a la mucosa intestinal y la elbaoración de una enterotoxina y citotoxinas, lo que conduce a daño en la mucosa, secreción de grandes cantidades de moco y diarrea secretora. 4.- Bacterias Enteroinvasivas Provocan diarrea inflamatoria por invasión de la mucosa intestinal: Shigella, Salmonella, Yersinia enterocolítica, algunas cepas de E. coli enteroinvasivas (ECEI) y Campylobacter jejuni Debe considerarse, además de estos cuatro (4) grupos los agentes bacterianos productores de intoxicaciones alimentarias como: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringer tipo A, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, en los cuales el mecanismo patógeno está determinado por la capacidad de estos organismos de producir toxinas en los alimentos que contaminan, de manera que la enfermedad es el resultado de la acción de sus toxinas preformadas y no de las bacterias mismas. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son los componentes principales de la flora intestinal normal, ellos son capaces de causar enteritis (60 – 70% de casos), infecciones del tracto urinario (más del 70% de los casos) y sepsis (poco común). A esta familia pertenecen 25 géneros y más de 110 especies, de las cuales más de 40 especies o grupos son reconocidos como patógenos definidos. Aunque muchas especies pertenecientes a esta familia han sido implicadas como causa de diarrea, sólo los miembros de los géneros Escherichia, Salmonella, Shigella y Yersinia están claramente reconocidos como patógenos entéricos. 3.- DIAGNÓSTICO Es de suma importancia para el clínico y de beneficio para el paciente establecer el diagnóstico certero, mediante el estudio bacteriológico, ello le ayudará a determinar la necesidad o no de un estudio bacteriológico a otros miembros de la unidad de producción o del núcleo familiar de los dueños del paciente; ejemplo: la salmonelosis puede dejar portadores sanos por muchos años, aún de por vida, por lo que pueden convertirse en transmisores de la enfermedad. La mayoría de las infecciones entéricas bacterianas no ameritan tratamientos específico, sino medidas de sostén. Para determinar rápidamente la naturaleza de una enfermedad diarreica se está utilizando actualmente y con alto grado de confiabilidad de prueba de investigación de leucocitos fecales que consiste en determinar el tipo de células inflamatorias presentes en las

heces; esto orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso. Por ejemplo; en la Shigelosis, Salmonelosis y diarreas provocadas por E. coli invasoras, se observa abundantes neutrófilos polimorfonucleares. En la fiebre tifoidea y amibiasis, en cambio predominan células inflamatorias mononucleares. En las diarreas producidas por virus, bacterias enterotoxigénicas o debidas a intoxicaciones alimentarias, no se observan células inflamatorias de ningún tipo, las que tampoco se observan en heces de personas normales.
TABLA Nº 4: ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES Y LEUCOCITOS FECALES ENFERMEDAD Shigelosis Salmonelosis E. coli invasiva Fiebre Tifoidea Amibiasis Colitis Ulcerosa Diarrea Alérgica Diarreas virales, toxigénicas y personas sanas TIPO DE CELULA PREDOMINANTE Polimorfo nucleares Polimorfo nucleares Polimorfo nucleares Mono nucleares Generalmente Mono nucleares Polimorfo nucleares eosinofilos Mono nucleares Generalmente sin células inflamatorias

PROCEDIMIENTO PARA LA INVESTIGACIÓN DE LEUCOCITOS FECALES 1.- Colocar una pequeña cantidad de moco o de heces en una lamina y mezclar con 2-3 gotas de azul de metileno al 1%. 2.- Cubrir con una laminilla y esperar 2-3 minutos con el objeto de obtener una buena coloración nuclear. 3.- Observar al microscopio con los objetivos secos (10X y 40X) Aunque este método es útil como diagnóstico presuntivo, el diagnóstico bacteriológico de las infecciones entéricas se hace en base al coprocultivo. COPROCULTIVO: Es el estudio bacteriológico de una muestra adecuada de las heces en medios apropiados para el diagnóstico de bacterias patógenas entéricas productoras de diarreas (Ver esquemas Nº 1 y 2) TOMA DE LA MUESTRA Y SU TRANSPORTE Una muestra adecuada es aquella que ha sido recolectada durante el periodo agudo de la enfermedad, cuando es más fácil comprobar la presencia de pus, moco o sangre y antes de la administración de drogas antimicrobianas. Muestras de heces frescas: Las heces frescas son preferidas a los hisopados rectales, debido al pequeño volumen que se toma en estos, y a la gran cantidad de flora normal presente en las heces, la cual puede desarrollar y producir una sobrepoblación de bacterias que solapan a los verdaderos patógenos.

Una cantidad aproximada de 0,5 a 2 gr de material fecal debe ser tomada, y colocada en recipientes estériles En caso de pasar más de dos horas entre el momento de la toma de la muestra y la siembra, es necesario mantenerla en un medio de conservación y transporte, En este caso puede emplearse una solución tamponada de fosfatos 0,033 molar, mezclada con glicerol a partes iguales, en una proporción de 1 g de heces por 10 ml de solución. El pH de esta solución debe ser aproximadamente de 7,0 ± 0,1. Debe recordarse que algunos enteropatógenos son muy sensibles a los cambios de pH, ya que éste puede descender durante el almacenamiento. Debe notarse la presencia de sangre, moco ó helmintos en la inspección somera inicial de la muestra. Pueden utilizarse técnicas especiales para buscar protozoarios, parásitos y sus huevos. Los frotis teñidos podrán revelar la prevalencia de leucocitos y de Candida albicans, pero no pueden diferenciar bacterias entéricas patógenas de la flora normal. Hisopados rectales: En las aves y pequeños animales, puede ser de utilidad el hisopado rectal para la toma de material para el coprocultivo. Si la muestra se toma con un hisopo estéril, debe tenerse cuidado de introducirlo hasta sobrepasar el esfínter anal, hasta una profundidad de 2-3 cm, y se le imprimen movimientos de rotación, se trata de recoger lo más posible de material mucosanguinolento que se encuentra en las paredes de la cloaca (aves) o de la ampolla rectal (mamíferos). Si no se efectúa la siembra inmediatamente, se introduce el hisopo cargado de material en un “vial” o tubo con tapa de rosca y con una solución preservadora, como: Stuart, Cary-Blair o de Amies (medios de transporte), en los cuales las enterobacterias patógenas conservan su vitalidad durante varios días. Estos medios se distribuyen en tubos o en pequeños “viales”. Para el envío de las muestras, se impregna el hisopo con material tomado por hisopado rectal o con las heces, se introduce hasta el fondo del tubo y se quiebra la parte del aplicador que sobresale del borde del tubo. En estos medios las muestras pueden ser enviadas a temperatura ambiente. EXAMEN DIRECTO: El frotis directo, realizado en microscopio de campo oscuro, podría ayudar a diferenciar el género Campylobacter, pero no ayudaría en la diferenciación de la familia de las Enterobacterias por su morfología similar. La tinción de Gram, debe ser siempre realizada para corroborar la pureza de un aislado, antes de las pruebas bioquímicas o test serológicos. MEDIOS DE CULTIVO En las muestras de heces, las bacterias entéricas patógenas se encuentran siempre asociadas a gran variedad de bacterias comensales, es por ello que para facilitar el aislamiento y la posterior identificación de estas cepas patógenas, se emplean los medios de enriquecimiento, medios selectivos y medios diferenciales que se describen a continuación, los cuales, en su mayoría, se basan en la fermentación de la Lactosa o Sucrosa: Medios de enriquecimiento: Un enriquecimiento en caldo debe ser usado, así como la siembra directa en placas tanto en medios ordinarios como selectivos y diferenciales. Los caldos comúnmente más usados para este propósito y específicamente para aislamiento de Salmonella son: Caldo Selenito de Leifson y Caldo de Mueller Kauffman o Caldo tetrationato. Este último es el más usado, esta compuesto por peptonas, sales biliares, carbonato de calcio y

tiosulfato de sodio. Antes de sembrar la muestra (1gr. De heces para cada 10 cc de medio) se le añaden 0,2 ml de solución Yodo-yodurada; esta sustancia actúa sobre el tiosulfato transformándolo en tetrationato de sodio, el cual inhibe el crecimiento de las bacterias Grampositivas y limita el crecimiento de casi la totalidad de las enterobacterias, incluyendo Shigella y E. coli siendo muy efectivo para el enriquecimiento de Salmonella. Luego de sembrado, se incuba a 37ºC por 6 a 24 horas, y posteriormente se toma una asada de estos caldos enriquecidos, y se siembran en medios selectivos diferenciales, tales como Bismuto Sulfito Agar (BSA), SalmonellaShigella Agar (SSA) y Agar MacConkey incubándolos a 37ºC durante 24 ± 12 horas. El pre-enriquecimiento de las cepas de Yersinia requiere, previo a la siembra de los medios selectivos, de un almacenamiento por 2 semanas en caldo para Yersinia a 4 ºC. Los caldos comúnmente más usados para enriquecimiento selectivo y específicamente para aislamiento de Campylobacter son: Caldo Bolton, Caldo Preston, Caldo Exeter, Caldo Park y Sanders y CCDB (caldo con deoxicolato, cefoperazona y carbón) Medios Selectivos: Poco selectivos: Agar Desoxicolato, Agar Desoxicolato Lactosa, Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB de Levine), Agar Eosina Azul de Metileno modificado, Agar Endo, Agar MacConkey, Agar tergitol 7. Agar Desoxicolato: Es un medio altamente selectivo para aislamiento de entéricos patógenos como Salmonella y Shigella. El desoxicolato sódico inhibe o suprime considerablemente el crecimiento de coliformes y gram positivos. Sin embargo en ocasiones crecen coliformes, y cuando se encuentran en grandes cantidades producen ácido a partir de la lactosa, se precipitan la sal biliar, y dan un medio rojo que se hace difícil la detección de patógenos. Si la lactosa presente se fermenta por los coliformes, provoca una acidificación del medio alrededor de las colonias. Este cambio de pH hace que el indicador rojo neutro cambie a rojo y, que la bilis precipite. La reducción del citrato férrico-amónico a sulfuro de hierro, por microorganismos que producen H2S, está dada por el ennegrecimiento de la parte central de la colonia. Agar Desoxicolato Lactosa: - Medio agar DCLS (dexicolato-citrato-lactosa-sacarosa): Los compuestos principales son el tiosulfato sódico, el desoxicolato sódico y el citrato. Sirve para aislar Salmonella, Shigella (transparente rosáceas) y Vibrio (colonias rojas) Agar Endo: Sus compuestos principales son la lactosa y la fucsina básica. Sirve para el aislamienteo de coliformes (colonias incoloras de bacterias gram- lactosa-) y de enterobacterias (rosas o rosadas lactosa +) Agar Eosina Azul de Metileno o Agar de Levine: (Selectivo y diferencial). Es poco selectivo; se utiliza en el aislamiento de E. coli enteropatógenas, Salmonella y Shigella. Entre sus componentes se encuentran eosina y azul de metileno. En él la E. coli forma colonias con centro negruzco y reflejo metálico verdoso; la Salmonella forma colonias pequeñas e incoloras. Las especies de los géneros Klebsiella y Enterobacter forman colonias mucosas, de color morado claro, con o sin reflejo metálico. Agar MacConkey: Medio selectivo y diferencial, que contiene sales biliares además de lactosa. Los gérmenes del grupo coliforme dan colonias de color rojo debido a la fermentación de la lactosa, mientras que Salmonella y Shigella forman colonias incoloras.

Moderadamente selectivos: Agar Hektoen Entérico (HE), Agar Salmonella-Shigella (SSA), Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Agar Hektoen Entérico (HE): Agar Salmonella-Shigella SS: Es un medio de aislamiento, selectivo para Salmonella y Shigella, por contener sales biliares que favorecen el desarrollo de estos gérmenes Gramnegativos patógenos e inhiben el crecimiento de los gérmenes Grampositivos. Es además un medio diferencial porque contiene lactosa permitiendo la diferenciación de gérmenes fermentadores o no del carbohidrato; lo cual se determina por el viraje del indicador de pH, rojo neutro (amarillo, alcalino y rojo, ácido). Las colonias de Salmonella y Shigella, gérmenes no fermentadores de lactosa, son incoloras y translúcidas; en cambio, aquellos gérmenes fermentadores de lactosa (E.coli, Enterobacter) forman colonias de color rosado a rojo. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD): Los compuestos principales son la L-lisina, el rojo fenol, el tiosulfato sódico, el citrato de hierro y azúcares (lactosa, glucosa y xilosa). Sirve para aislar enterobacterias patógenas. Para hacer la lectura hay que seguir los siguientes criterios: La descarboxilación de la lisina: colonias rojas característico de Shigella, la Fermentación de azúcares: Colonias amarillas tipos de Escherichia, Citrobacter, Serratia, Proteus, Enterobacter y Klebsiella. La Producción de SH2 (debido a tiosulfato sódico y citrato férrico): colonias negras típico en Salmonella SH2 +, Arizona, Proteus y Edwardsiella. Altamente selectivos: Agar Sulfito de Bismuto (BSA), Agar Bilis Verde Brillante (BVBA), Agar Yersinia de Schiemann (Agar CIN - Cefsulodin-Irgasan-novobiocin). Agar Wilson Blair o Agar Sulfito de Bismuto: Es un medio muy selectivo para el aislamiento de Salmonella typhi y de algunas otras especies de este género. El Verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente a los gérmenes de acompañamiento. Las colonias de Salmonella H2S-positivas presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. La reducción de los iones bismuto a bismuto metálico produce brillo metálico alrededor de las correspondientes colonias. En este medio las colonias de Salmonella typhi se observan de color negro o gris oscuro con brillo metálico; otras especies del género Salmonella y Arizona pueden producir colonias negras o verde oscuro. Agar Bilis Verde Brillante (BVBA): Compuesta de bilis de buey, peptona, lactosa y verde brillante, sirve para el aislamiento e identificación de coliformes en la leche y otros alimentos (la bilis y el verde inhiben el crecimiento de las gram + y alguna – y la lactosa positiva produce gas). Agar Yersinia de Schiemann (Agar CIN - Cefsulodin-Irgasan-novobiocin): En el caso de sospechar de especies bacterianas del género Yersinia se pueden aislar en Agar Yersinia (Agar CIN), o en SSA, incubados a 25 ºC, previo el almacenamiento por 2 semanas en caldo para Yersinia a 4 ºC. Agar Skyrrow: Si se sospecha de Campylobacter, se aíslan en el medio Campybap, o en el de Skyrrow, incubados a 40-42ºC en CO2 al 10% con reducción en la tensión de O2. Agar tiosulfato-citrato-sacarosa con sales biliares (TCBS): Si se sospecha de Vibrio, estos se aíslan en Agar tiosulfato-citrato-sacarosa con sales biliares (TCBS) previo enriquecimiento en agua de peptona alcalina (pH 8,5) con adición de 1% de NaCl, pudiendo ser utilizada igualmente como medio de transporte. La muestra se inoculará

en un volumen no inferior a 20 ml de agua de peptona alcalina con 1% de NaCl. Si la muestra requiere ser transportada o si el tiempo transcurrido entre su recogida y procesamiento es superior al establecido, se puede utilizar el medio de Cary-Blair porque la solución de glicerol tamponado no es adecuada, debido a que el glicerol es tóxico para las especies del género Vibrio. AISLAMIENTO Comprende la siembra directa y la siembra previo enriquecimiento. La técnica para la siembra directa es la siguiente: Se coloca una pequeña gota de heces líquidas o en el caso de heces sólidas, una suspensión de heces en suero fisiológico, sobre la superficie de una placa de Agar SS, Agar MacConkey, Agar EMB de Levine; con asa de platino se extiende el material por agotamiento sobre toda la superficie del medio. Si la muestra de heces o de material tomado por hisopado rectal llega al laboratorio en medio de Cary-Blair o de Amies, se extrae el hisopo con una pinza y se pasa a un tubo con 1 cc de suero fisiológico estéril en el cual, por agitación, se suspende el material. Con esta suspensión se realizan las siembras directas en los medios selectivos. La siembra del medio de enriquecimiento se efectúa emulsionando 1 gr de heces (unos 2 ml de suspensión o el hisopo del tubo con medio de transporte), en el tubo de Caldo Tetrationato; y se lleva a la incubadora por 18-24 horas. Luego se siembra en placas con medios selectivos, incubándose por 18-24 horas a 35-37 ºC. IDENTIFICACION DE LAS CEPAS AISLADAS Las colonias sospechosas se identifican mediante el estudio de propiedades bioquímicas (identificación bioquímica) (ver tablas Nº 6 y 7) y de constitución antigénica (identificación serológica) (Ver tabla Nº 8). Identificación Bioquímica: Cada tipo de colonia sospechosa de ser un germen Gramnegativo patógeno se siembra en medios de diferenciación como: 1.- Medio Kliger Permite apreciar las siguientes propiedades: a.- La fermentación de la glucosa se reconoce por acidificación del taco, que vira al amarillo (el indicador de pH es el rojo de Fenol que vira: amarillo en ambiente ácido y rojo en ambiente alcalino) b.- La fermentación de la lactosa se reconoce por acidificación y viraje al amarillo del bisel. c.- La producción de gas en la fermentación de los carbohidratos; se observa por la formación de burbujas de gas que rompen el medio, o si la producción de gas es muy abundante, levantan el taco del fondo del tubo. d.- La producción de hidrógeno sulfurado (H 2S) que se reconoce por el ennegrecimiento del medio debido a la formación del sulfuro de hierro, especialmente en el punto de unión del bisel con el taco. Cuando la cepa sembrada produce gran cantidad de H2S, se ennegrece todo el taco y parte del bisel, enmascarando un eventual viraje provocado por la fermentación de la glucosa. El medio de Kliger se siembra por punción en el taco y estrías en el bisel y la lectura se efectúa a las 18-24 horas de incubación.

2.- Medio de Urea – Indol 3.- Medio de manitol-motilidad 4.- Caldo MRVP 5.- Medio de citrato Existen métodos rápidos para el diagnóstico bacteriológico, que realizan la identificación bioquímica, tales como: API, ATB-PLUS, MICRO-ID y VITEK. Identificación serológica: Una vez aislada la cepa sospechosa de Salmonella, Shigella o E. coli e identificada mediante las pruebas bioquímicas preliminares, se procede a su identificación serológica para confirmar el diagnóstico. En la identificación serológica, por lo general se utiliza la aglutinación rápida sobre lámina. Para ellos, se toma una pequeña porción de la cepa sospechosa con el asa de platino, se coloca en una lámina porta-objeto y se diluye con una gota del antisuero conocida. En caso de ser la prueba positiva se produce una aglutinación debido a que los anticuerpos específicos presentes en el antisuero se fijan a los antígenos de la superficie bacteriana y se produce la reacción. Si la concentración de bacterias es suficiente, se produce aglutinación, formando agregados visibles.
Tabla Nº 5. Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales de los microorganismos entéricos pertenecientes a la Familia Enterobacteriaceae Microorganismo EMB Levine SSA MacConkey XLD Colonias grandes Poco crecimiento Colonias rojas Azul oscuro con Colonias grandes E. coli Colonias rojas o Rodeadas por brillo verde metálico, amarillas y grasas rosadas precipitado de bilis brillantes Colonias grandes, Enterobacter Ligero crecimiento, Colonias mucoides, Colonias mucoides, mucoides, azul Klebsiella colonias rosadas rosadas amarillas oscuras Colonias rojas y Colonias grandes, Colonias incoloras Proteus Colonias incoloras amarillas con centro incoloras con centro oscuro oscuro Colonias rojas y Colonias grandes, Colonias incoloras Salmonella Colonias incoloras amarillas con centro incoloras con centro oscuro oscuro Colonias grandes, Shigella Colonias incoloras Colonias incoloras Colonias Rojas incoloras

Tabla Nº 6. Características bioquímicas de los principales géneros de la Familia Enterobacteriaceae Escherichia Klebsiella Citrobacter Salmonella Proteus Yersinia Prueba Shigella Enterobacter H2S ± + ± Indol ± ± ± + ± VP + Citrato + + + ± ONPG ± + + Fenil Alanina + Ureasa ± ± + Lisina ± + ± -

Esquema Nº 1: Aislamiento de bacterias patógenas de la Familia Enterobacteriaceae a partir de una muestra de heces Suspensión fecal o hisopado rectal Agar MacConkey o Agar EMB de Levine Incubar 37ºC 24 horas Agar SS Incubar 37ºC 24 horas Caldo Tetrationato Incubar 37ºC 12-16 horas Agar Sultifo de Bismuto Subcultivar Tomar colonias para aislar: E. coli, Shigella y Salmonella Tomar colonias Shigella y Salmonella Tomar colonias Salmonella typhi u otras Salmonella Agar sulfito de Bismuto Incubar 37ºC 48 horas Tomar colonias para Salmonella Agar SS Incubar 37ºC 24 horas Tomar colonias para Salmonella Caldo Selenito o caldo Tetrationato

Tomar colonias para aislar: Yersinia enterocolítica

Tomado de: Manual for Laboratory Investigation of Acute Enteric Infections. CDC.

Tabla Nº 7: Pruebas Bioquímicas claves para el reconocimiento de Salmonella. GRUPO BACTERIANO PRUEBAS BIOQUIMICAS CLAVES ENTEROBACTERIAS Utilizan glucosa Reducen nitratos a nitritos Oxidasa negativos GÉNERO Salmonella Móviles Producen H2S Lactosa negativos Ureasa negativos Indol negativos

Tabla Nº 8: Estructuras y antígenos relacionados con el reconocimiento de tipos específicos de Salmonella. Antígeno Estructura asociada Clasificación Tipos específicos Somático (O) LPS En serogrupos A, B, C, D, E, etc Varios, determina Flagelar (H) Flagelo En serotipos nombre especifico Cápsula (sólo en Capsular Vi Asociado a serotipo Typhi o Dublin algunas Salmonellas)

ACTIVIDADES PRÁCTICAS 1.- Mencione la importancia del coprocultivo en el diagnóstico de las diarreas

2.- Asista a la demostración de la técnica a seguir en la toma de una muestra para coprocultivo 3.- Enumere los pasos a seguir en el procesamiento de un coprocultivo

4.- Observe y dibuje los diferentes tipos de colonias en los medios de aislamiento: Salmonella-Shigella agar, Agar MacConkey, Agar EMB de Levine y Agar XLD.

5.- Pruebas de Identificación 5.1.- Dibuje e interprete los resultados obtenidos en una prueba de Kliger

BIBLIOGRAFÍA Brooks GF, Butel JN, Ornston NL, Jawetz E. Melnick J. Adelberg E. 1992. Microbiología Médica. Ed. El Manual Moderno. S.A. de C.V. México D.F. Murray, P, Kobayashi, G. Pfaller, M. and Rosenthal, K. 1997. Microbiología Médica. Segunda edición. Harcourt Brace de España, S.A. Madrid, España. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 1996. Microbiology. 3ª edition, WCB Publishers. Tortora GJ, Funke RB, Case CL. 1993. Introducción a la Microbiología 3era Ed. Acribia, S.A. España.

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