UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA VIROLOGA Y ENFERMEDADES VIRALES DE LOS ANIMALES DOMSTICOS

Dvila Vzquez Carlos Andrs

TITULACIN DE LA INFECTIVIDAD VIRAL Y RESULUCIN DE PROBLEMAS

1.- Introduccin Titular una preparacin de cido, base, anticuerpo, antgeno, significa determinar la cantidad del elemento en cuestin que esa preparacin contiene. Lo mismo se aplica en el caso de las preparaciones virales. Para preparar los sustratos celulares infectados para inmunofluorescencia, ELISA, inmunoperoxidasa o hibridizacin es necesario conocer la cantidad de virus con que se trabaja, es decir el "ttulo" de la suspensin viral. Ya que para que una infeccin viral sea eficiente se debe trabajar con determinada "multiplicidad de infeccin", que se define como la cantidad de virus inoculado por clula del cultivo celular. La obtencin de resultados reproducibles depende del control de todos los elementos que intervienen en el ensayo, y la multiplicidad de infeccin es uno de ellos, que debe definirse para cada procedimiento. En ciertos casos de aislamiento viral resulta ser importante conocer cul es la cantidad de virus aislada.

2.- Conteo de partculas virales Para determinar la cantidad de virus en un material puede recurrirse al conteo directo de partculas virales aplicando tcnicas de microscopa electrnica. Este mtodo es tcnicamente complejo y tiene la grave desventaja de no considerar la actividad biolgica de las partculas virales. Es decir, un virus es una partcula macromolecular que se detecta debido a su actividad biolgica, que se manifiesta cuando la partcula infecta a un husped susceptible. La visualizacin de esa actividad puede consistir en la observacin del efecto citoptico (ECP), o formacin de sincitios o tumores en un cultivo celular, formacin de pstulas en la membrana corioalantoidea o muerte de un embrin de pollo, muerte o enfermedad de un animal de experimentacin. Desde el punto de vista biolgico lo que interesa es la expresin de la actividad biolgica (o infectiva) de la partcula viral, ya que existen partculas virales que por defectos en su material gentico u otro tipo de alteraciones en su estructura no son infectivas, es decir no tienen actividad biolgica. Estas partculas estn presentes en todas las preparaciones virales, en cantidades variables. Para fines diagnsticos propiamente dichos, o para la preparacin de reactivos para diagnstico, lo que interesa cuantificar es la capacidad infectiva del virus, para lo cual no es adecuado el conteo de partculas por microscopa electrnica. Debe observarse el efecto que el virus produce en el husped inoculado. Si se observa un solo ejemplar de husped, el efecto o respuesta es de "todo o nada", es

una respuesta negativa o positiva. Para poder hacer una cuantificacin deben utilizarse varias rplicas del husped elegido (cultivos celulares, animales, huevos embrionados). Cada rplica se denomina unidad de prueba. Cuanto mayor es el nmero de unidades de prueba, ms precisa resulta la determinacin.

3.- Mtodo de Titulacin por el Punto Final Curva Dosis-Respuesta: Si se grafica "Efecto viral" versus "cantidad de virus" se obtiene una curva sigmoidea, "Dosis- Respuesta" clsica. Por esta razn la forma habitual y ms sencilla de expresar ttulos virales es segn el nmero de dosis presentes en la muestra. La "respuesta" se mide como "porcentaje de efecto", siendo el efecto cualquiera de los mencionados anteriormente, segn el virus y el husped. La "Dosis" se expresa como aquella dilucin de la muestra viral. En general se usan diluciones al dcimo, y se trabaja con el log10 de las diluciones. Puede expresarse el ttulo como Dosis Infecciosa Mxima o Dosis Infecciosa Mnima. En los casos en que la infectividad se evidencia por la muerte de animales de laboratorio la denominacin es Dosis Letal Mxima o Mnima respectivamente.

Mtodo de Reed y Mnch: Se basa en la suposicin de que el nmero de unidades de prueba afectadas vara proporcionalmente al log10 de la dilucin, es decir que a diluciones menores (mayor concentracin de virus) el porcentaje de efecto ser mayor que a diluciones mayores (menor concentracin de virus). Adems, se supone que en la zona cercana al 50% de Efecto ste vara linealmente con la dosis. Finalmente resulta de suma importancia no omitir ninguna dilucin intermedia.

Referencia Bibliogrfica: Dubecco, D., Gunsberg, E. (1990). Microbiologa. J.B. Lippincott Company: Filadelfia.