UD10 Cultivos Celulares

Unidad 10
Cultivos celulares
Biología molecular y citogenética
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................... 3
CASO PRÁCTICO DE LA UNIDAD ............................................................................... 4
1. CULTIVOS CELULARES....................................................................................... 5
1.1. Tipos de cultivos celulares............................................................................................. 7
1.2. Aplicaciones de los cultivos celulares ........................................................................... 8
2. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO ...................................................... 10
2.1. La curva de crecimiento del cultivo............................................................................. 11
2.2. Formas de crecimiento..................................................................................................... 12
2.3. Comportamiento vital tras sucesivos pases ................................................................ 14
Recuerda ................................................................................................................................. 17
3. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO ............................................... 18
3.1. El soporte físico ........................................................................................................... 19
3.2. Composición y propiedades del medio de cultivo ...................................................... 23
3.3. La atmósfera gaseosa. Condiciones de incubación ..................................................... 27
Recuerda ................................................................................................................................. 28
4. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR ..................................................... 29
4.1. Disgregación celular ......................................................................................................... 30
4.2. Recuento y viabilidad celular ........................................................................................... 32
4.3. Descongelación de células. Inicio del cultivo (siembra) ................................................... 35
4.4. Mantenimiento del cultivo ............................................................................................... 36
4.5. Conservación de células ................................................................................................... 39
Recuerda ................................................................................................................................. 40
5. CONTAMINACIONES ...................................................................................... 41
5.1. Tipos de contaminantes .............................................................................................. 42
Resumen.................................................................................................................................. 46
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OBJETIVOS
RA2. Realizar cultivos celulares describiendo los pasos del procedimiento.
a) Caracterizar los métodos de cultivo celular que se aplican en los estudios

citogéneticos.
b) Seleccionar los tipos de medios y suplementos en función del cultivo que

hay que realizar.
c) Realizar los procedimientos de puesta en marcha, mantenimiento y

seguimiento del cultivo.
d) Tomar las medidas para la eliminación de la contaminación detectada.
e) Definir los procedimientos de conservación de las células.
f) Trabajar en todo momento en condiciones de esterilidad.
g) Determinar el número y la viabilidad celular en los cultivos en la

propagación del cultivo.
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CASO PRÁCTICO DE LA UNIDAD
Juan Manuel Gavilán ha sufrido un terrible accidente en las fallas, ¡se le quedó
enredada en el pie una traca de petardos y ha tenido quemaduras de 3º grado!
El chico es futbolista, está muy preocupado y se teme que tenga que dejar este
deporte, ya que ha perdido la mayor parte de la piel de su mágico pie.
El doctor Mejías al entrar en la habitación encuentra a Juan Manuel sollozando

y este le cuenta que esté incidente lo dejará sesgado para su deporte favorito.
El doctor Mejías le contesta sin titubeos que si esto le hubiera pasado, no más
lejos de los años 80, sí que hubiera sido un gran problema para él, pero que hoy
en día, debido a los avances en el cultivo de tejidos in vitro no tendrá problema
para recuperarse, ya que tan sólo, con una muestra celular de su piel se podrá
cultivar in vitro y obtener un nuevo tejido que servirá para un implante.
Juan Manuel recupera el ánimo y le da las gracias a su médico, ya que no sabía

que tales avances eran posibles en la medicina moderna.
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1. CULTIVOS CELULARES
Caso práctico
María ha leído en la página de Facebook del Centro de Formación Atlántida CIDEP la noticia de
que se ha realizado el primer trasplante de piel humana con células del paciente en Andalucía,
ha llamado a su amiga Teresa para compartir la noticia.
- María: Teresa, ¿has visto la noticia en el Facebook del centro?
- Teresa: Sí, es increíble. La paciente era una joven de 29 años con el 70 por ciento de superficie
corporal quemada y este trasplante ha permitido su supervivencia.
- Médico: ¿Y cómo lo han hecho?
- Teresa: Mediante cultivos celulares.
Si quieres saber más sobre cultivos celulares en este apartado aprenderás mucho más.
Los cultivos celulares en laboratorio se realizan en medios y condiciones controladas.

Fuente: Editorial Altamar
Además de la biología molecular, uno de los ámbitos de estudio de este libro

son los cultivos celulares en laboratorio, es decir, en medios y condiciones
controladas.
Cultivo celular
Se puede definir el cultivo celular como el conjunto de procedimientos que

hacen posible el mantenimiento de células de organismos pluricelulares in
vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y
genéticas.
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El laboratorio en el que tiene lugar la propagación o crecimiento de células de
organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales y en condiciones
controladas es el laboratorio de cultivos celulares, cuya organización y
funciones se desarrollan en la Unidad Didáctica 1. En esta unidad estudiaremos
la biología y el comportamiento de las células en cultivo, los factores que
intervienen en el cultivo, los procedimientos de cultivo celular y las posibles
fuentes de contaminación. Antes veremos los diferentes tipos de cultivos y
algunas de las aplicaciones para las que se utilizan.
¡Tenlo en cuenta!
El Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los

trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes
biológicos durante el trabajo, en su artículo 2, incluye los cultivos celulares dentro
de los agentes biológicos y define el cultivo celular como «el resultado del
crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares».
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1.1. Tipos de cultivos celulares
Según la definición de cultivos celulares que se ha dado en el apartado anterior,
se pueden diferenciar tres tipos de cultivos:
- CULTIVO DE ÓRGANOS
El cultivo de órganos consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la

interfase entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
En estos cultivos (como pueden ser los cultivos de ganglios, de fragmentos

hepáticos, de piel, médula ósea, etc.), se suelen mantener vivos, durante un
tiempo limitado, los distintos tipos celulares diferenciados presentes en el órgano,
así como la estructura histológica y la arquitectura del órgano.
Estos cultivos no pueden propagarse, ya que la mayor parte de los tipos

celulares no proliferan. Únicamente se produce crecimiento de algunas células
indiferenciadas o embrionarias presentes en los tejidos, fundamentalmente en
la zona periférica, que no conservan la estructura tisular típica del órgano.
Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas

globales a estímulos y sustancias, estudios regenerativos, etc.
Fig. 10.1. Esquema de la obtención de los distintos tipos de cultivo celular a partir de los órganos
de un animal.
- CULTIVO DE EXPLANTES
Las porciones de tejidos vivos o explantes son también susceptibles de cultivo.
El cultivo de explantes consiste en adherir un fragmento de tejido a una

superficie (placa o frasco de cultivo) y nutrirlo con un medio de cultivo.
En estas condiciones, las células periféricas del explante se multiplican y

proliferan, migrando por la superficie del soporte. Es el caso de cultivos de
fragmentos de diferentes tejidos, como pueden ser vellosidades coriónicas,
tejidos epiteliales, etc.
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- CULTIVO DE CÉLULAS
El cultivo de células se realiza a partir de suspensiones celulares, que se

introducen en un recipiente adecuado junto con un medio de cultivo y se
incuban en las condiciones óptimas para que las células proliferen.
El cultivo de células es el tipo de cultivo más habitual y se realiza a partir de

muestras de cualquier tipo de tejido, restos ovulares, líquido amniótico, sangre
periférica, células hematopoyéticas, células madre, etc.
Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células

pueden ser primarios o secundarios:
• Cultivo celular primario. Para obtener un cultivo celular primario, la

suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células de un
tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta manera se obtiene
una mezcla celular compleja formada por los distintos tipos celulares
presentes en el tejido. El cultivo primario se puede realizar a partir de esta
mezcla o seleccionando un tipo celular concreto.
• Cultivo celular secundario. La suspensión celular de partida se obtiene a

partir de un cultivo primario o de otro secundario, mediante un subcultivo
o «pase». También se pueden obtener a partir de una línea celular
mantenida en congelación.
¡Tenlo en cuenta!
Un grupo de células con un mismo origen, estructura o función constituyen un

mismo tipo celular. En el proceso de disgregación de un órgano o tejido se
obtienen diferentes tipos celulares.
1.2. Aplicaciones de los cultivos celulares

Los cultivos celulares tienen múltiples aplicaciones, tanto en investigación
básica, como en investigación aplicada.
En investigación básica permiten estudiar:
• Cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular: ciclo celular,

rutas metabólicas, flujos intracelulares, diferenciación, transformación,
etc.
• Interacciones celulares: entre células, con la matriz extracelular, con el

medio ambiente.
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En investigación aplicada, son una potente herramienta biotecnológica que se
utiliza en muchas disciplinas, con importantes aplicaciones industriales:
• Inmunología, para producción de anticuerpos monoclonales.
• Virología, para producción de vacunas.
• Farmacología, para producción de fármacos.
• Toxicología, para estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y

mutagénesis.
Dos aplicaciones relativamente modernas y muy interesantes son:
• La ingeniería de tejidos que pretende conseguir la producción in vitro de

tejidos (cultivos histotípicos) y órganos (cultivos organotípicos) funcionales
para su uso en injertos y trasplantes.
• Estudios con células madre o stem cells, enfocados a la terapia celular.
Fig. 10.2. Los cultivos celulares de líquido amniótico, vellosidad corial o sangre periférica son
habituales en los estudios cromosómicos.
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2. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
Caso práctico
María y Teresa continúan revisando la noticia.
- María: Lo que no sé es cómo no se había conseguido antes.
- Teresa: Andalucía realiza el primer trasplante de piel humana con células del paciente.
- María: Dicen que se ha utilizado una nueva fórmula que incluye una sustancia química extraída
de un alga marina no usada hasta ahora en cultivos de piel.
- Teresa: ¿Y cuáles son las formas de crecimiento de los cultivos celulares?
En el siguiente apartado encontrarás respuesta a esta y otras cuestiones.
Las células empiezan a crecer cuando se incuban en condiciones óptimas de temperatura

y humedad.
Una vez que a las células en suspensión se les añade el medio de cultivo, se
introducen en un recipiente adecuado (frasco de cultivo) y se incuban en
condiciones óptimas de temperatura y humedad, las células empiezan a
crecer.
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2.1. La curva de crecimiento del cultivo
La dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración de células

por los días de evolución del cultivo, se representa gráficamente mediante una
curva de crecimiento.
La curva de crecimiento adopta la forma de una curva sigmoide en la que se

diferencian tres fases:
Fase de latencia. Es un tramo recto sin pendiente o con cierta concavidad.

Corresponde a las primeras 24 horas de evolución del cultivo, en las que no se
produce crecimiento y, por lo tanto, el número de células se mantiene
constante o incluso puede disminuir ligeramente.
Fase de crecimiento exponencial. En la curva es el tramo recto con pendiente

elevada. Dura aproximadamente 6-7 días y corresponde a la fase en la que el
número de células aumenta de manera exponencial hasta alcanzar un máximo.
Fase estacionaria. Es un tramo recto de pendiente nula. Sucede a partir de los

6-7 días de evolución del cultivo y es la fase en la que el número de células
permanece constante.
Fig. 10.3. Curva de crecimiento de un cultivo, en la que se observan las fases de latencia,
exponencial y estacionaria. El momento idóneo para realizar un subcultivo es al final de la
fase exponencial.
11
2.2. Formas de crecimiento
El crecimiento de las células en el cultivo puede ser de dos formas: en
monocapa y en suspensión:
- CRECIMIENTO EN MONOCAPA
El crecimiento en monocapa consiste en que las células crecen adheridas sobre

una superficie sólida (plástico o vidrio).
Este tipo de células se dice que son dependientes de anclaje, es decir,

necesitan adherirse a una superficie sólida para poder crecer. Es el método
utilizado para el cultivo de la mayoría de las células.
¡Tenlo en cuenta!
No todos los tipos celulares tienen la misma facilidad para crecer en cultivo. En
general, se puede afirmar que un tipo celular será tanto más fácil de cultivar
cuanto más indiferenciado sea, es decir, cuanto mayor sea la capacidad de
sus células de dividirse o diferenciarse en otras células.
De hecho, muchos tipos celulares pierden características de diferenciación

cuando se cultivan, entre ellas la incapacidad de dividirse, producción de
enzimas, rutas metabólicas, etc. Esta pérdida de propiedades y funcionalidades
puede ser debida a desdiferenciación o a adaptación a las nuevas condiciones
microambientales generadas por el medio y a las condiciones de cultivo, tan
diferentes a las condiciones fisiológicas tisulares.
En el crecimiento en monocapa se pueden distinguir diferentes momentos o

etapas de desarrollo:
1. Adhesión a una superficie. Corresponde al periodo durante el cual las células

se van adhiriendo al soporte. Coincide con el periodo de latencia de la curva
de crecimiento.
2. Proliferación y formación de colonias. Una vez que las células se han pegado
a la pared del frasco de cultivo, empiezan a proliferar, expandiéndose por toda
la superficie y formando colonias celulares. Esta etapa de crecimiento se
corresponde con la fase exponencial de la curva de crecimiento.
3. Inhibición por contacto. Con el paso del tiempo, las células ocupan toda la
superficie disponible y entran en confluencia, estableciendo contactos entre
ellas. En este momento se produce un fenómeno denominado inhibición por
contacto y las células detienen su crecimiento, aunque se mantienen vivas.
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Se inicia la fase estacionaria de la curva de crecimiento. Es en esta fase cuando
la morfología y la fisiología de las células se parecen más a las de las células de
origen.
Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o

«pase» de parte de las células a un nuevo frasco de cultivo. El momento idóneo
para realizarlo es el final de la fase exponencial.
Fig. 10.4. Colonias de células HeLa creciendo sobre una superficie plástica.
Fig. 10.5. Cultivo de fibroblastos en confluencia.
13
- CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN
En el crecimiento en suspensión las células no necesitan pegarse a una

superficie para crecer, por lo que se mantienen dispersas en el seno del medio
de cultivo y proliferando.
Este tipo de crecimiento es típico de células sanguíneas circulantes, células

hematopoyéticas, células madre, algunas líneas tumorales y algunas líneas
celulares transformadas.
También en el crecimiento en suspensión se pueden distinguir diferentes

momentos o etapas de desarrollo:
1. Adaptación al medio de cultivo. Es un período, relativamente corto, en el que

las células se adaptan al medio y las condiciones de cultivo, antes de iniciar la
proliferación. Se corresponde con la fase de latencia de la curva de
crecimiento.
2. Proliferación en suspensión. Una vez adaptadas, las células dispersas en el

medio de cultivo empiezan a proliferar aumentando exponencialmente su
número (fase de crecimiento exponencial).
3. Inhibición por densidad. Llega un momento en el cultivo en el que se alcanza

un número crítico de células en relación con el volumen de medio de cultivo y
los nutrientes que quedan en él. En ese momento se produce el fenómeno de
inhibición por densidad y las células dejan de crecer, aunque se mantienen
vivas.
Esta etapa se corresponde con la fase de latencia de la curva de crecimiento.
Al igual que en los cultivos en monocapa, es necesario hacer un pase para que
el crecimiento se reanude.
2.3. Comportamiento vital tras sucesivos pases

Los sucesivos pases a partir del cultivo primario dan origen a una línea celular
primaria o a una línea celular continua:
Línea celular primaria
La línea celular primaria es aquella obtenida a partir de un tejido u órgano

mediante un cultivo primario y que se mantiene en cultivo mediante pases
seriados durante un tiempo limitado.
14
La población celular aumenta en cada pase (se multiplica el número de frascos
de cultivo) y, normalmente, a partir del tercer pase se estabiliza. Esto significa
que las células se hacen uniformes y homogéneas, manteniéndose las
características morfológicas y fisiológicas estables durante las sucesivas
generaciones. Cuando el cultivo primario se realiza a partir de una mezcla
celular compleja, el tipo celular con mayor tasa de crecimiento acaba
desplazando a los demás, es decir, impidiendo el crecimiento de las células con
tasas de crecimiento menores.
Senescencia
La fase de senescencia es la etapa vital en la que las células van perdiendo

su capacidad de dividirse y el cultivo acaba muriendo.
Las líneas celulares primarias tienen una vida finita, es decir, se mantienen en
crecimiento durante un número determinado de generaciones o pases,
característico de cada tipo celular (suele oscilar entre 20 y 100) y después entran
en la denominada fase de senescencia. Esto es debido a que con las sucesivas
divisiones los telómeros se acortan y las células van acumulando anomalías
genéticas y perdiendo funciones. Se puede conservar una línea celular primaria
congelando células antes de alcanzar la senescencia y, a ser posible, en los
primeros pases. En cualquier caso hay que anotar siempre el número de pase
del que proceden las células congeladas, para saber en todo momento
aproximadamente cuántos pases les quedan antes de que el cultivo muera.
Líneas celulares continuas
Las líneas celulares continuas son aquellas que se obtienen a partir de un

cultivo primario y que se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante
pases seriados.
Estas líneas aparecen espontáneamente en algunos cultivos, que se mantienen

durante más pases de los esperados. Esto es debido a la aparición en el cultivo
de células inmortales, capaces de originar líneas estables y permanentes.
Aparecen como consecuencia de un fenómeno de transformación de las
células normales, relacionado con la pérdida de los mecanismos de control
celular. Las células transformadas tienen unas características especiales:
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• Crecen indefinidamente en cultivo (son inmortales).
• Pierden la dependencia del anclaje para crecer, por lo que pueden

crecer en suspensión.
• Pierden la inhibición por contacto.
• Pueden invadir tejidos y producir tumores.
• Acumulan anomalías genéticas. Normalmente son aneuploides, con

múltiples aberraciones cromosómicas.
La aparición de líneas celulares continuas se puede también inducir por:
• Métodos físicos: irradiación del cultivo.
• Métodos químicos. Tratamiento con productos químicos carcinogénicos.
• Métodos biológicos (infección vírica, transfección de ADN).
Fig. 10.6. Comportamiento en el tiempo de una línea celular primaria obtenida por cultivo
primario. Al cabo de un número limitado de pases entra en senescencia y acaba muriendo.
Algunas células pueden experimentar una transformación y originar una línea celular continua.
Fuente: Editorial Altamar.
16
Recuerda
17
3. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO
Caso práctico
Teresa se ha estudiado el tema 10 del módulo de biología molecular y se lo está contando a
María. Ha visto que los factores que intervienen en los cultivos son el soporte físico en el que
van a crecer las células, la composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo, la
atmósfera gaseosa y las condiciones de incubación.
- Teresa: María, ya me he estudiado el tema. Estoy analizando la noticia del trasplante de piel.
Según los factores que intervienen en los cultivos los factores clave del cultivo de células
tisulares creo que han el medio de agarosa y las condiciones de incubación.
- María: Me encanta que la ciencia avance y quién sabe, quizá algún día cuando terminemos el
módulo podremos participar en la investigación de cultivos celulares.
Si como María y Teresa quieres ser un/una experto/a en cultivos celulares, en este apartado
conocerás los factores que intervienen en los cultivos.
El cultivo de células implica un conjunto de operaciones complejas.
El cultivo de células implica extraerlas de su entorno tisular fisiológico,

introducirlas en el interior de un recipiente adecuado que las aísla del exterior,
inmersas o bañadas por un medio de cultivo artificial y, finalmente, colocar este
conjunto en el interior de un incubador que proporciona unas condiciones
ambientales adecuadas.
El cultivo de células implica un conjunto de operaciones complejas que veremos

en el apartado siguiente, pero para que el proceso se desarrolle
adecuadamente es necesario controlar una serie de factores o condiciones:
• El soporte físico en el que van a crecer las células.
• La composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo.
• La atmósfera gaseosa.
• Las condiciones de incubación.
18
3.1. El soporte físico
La mayor parte de las células en cultivo crecen en monocapa adheridas a la
superficie del recipiente en el que se efectúa el cultivo. Por ello, a la hora de
planificar un cultivo hay que tener en cuenta tres aspectos relativos a los
recipientes: el material o sustrato con el que están fabricados, su diseño o forma
y los posibles tratamientos de la superficie.
- Materiales para cultivo
El material con que se fabrican recipientes destinados a cultivos celulares debe

permitir la adhesión de las células, ser fácilmente esterilizable y tener una mínima
calidad óptica para poder visualizar el cultivo con un microscopio invertido.
Los más utilizados son el vidrio y los plásticos, pero hay otros materiales para
situaciones particulares:
• Vidrio. Es reutilizable, fácil de limpiar y de esterilizar por calor en autoclave.

Además, tiene muy buena calidad óptica para observaciones
microscópicas.
• Plástico desechable. Actualmente es el material más utilizado por su bajo

coste, su facilidad de esterilización por irradiación y su buena calidad
óptica, además de por el ahorro de personal y tiempo de trabajo que
supone no tener que reutilizarlo. Además, al reducirse el número de tareas
y manipulaciones, es menor el riesgo de contaminación.
• Matrices tridimensionales. Se consiguen con materiales que forman

estructuras tridimension.
• Microesferas de sephadex o poliacrilamida. Las células pueden crecer

adheridas a estas microesferas, que se mantienen en suspensión en el
seno del medio de cultivo. De esta manera se cultivan células
dependientes de anclaje como si fuese un cultivo en suspensión,
aumentándose notablemente la superficie de crecimiento disponible.
Las microesferas pueden fabricarse también con plástico desechable.
• Metales. Para algunas aplicaciones muy concretas, como el cultivo de

células de la glía, se pueden utilizar sustratos metálicos específicos de
paladio o acero.
- Documento 10.1. Placa Transwell
Un tipo especial de placa multipocillo es la denominada placa Transwell,

dotada con cámaras individuales que encajan en los pocillos y cuyo fondo
consiste en una membrana plástica porosa.
19
Cuando la cámara se inserta en el pocillo, el conjunto presenta un
compartimento inferior y otro superior separados por la membrana porosa,
donde van a crecer las células. Estas placas son especialmente útiles para el
cultivo de células epiteliales polarizadas y para estudios de migración e invasión.
Fig. 10.8. Fotografía y esquema de un modelo de cámara Transwell para cultivos celulares.
- Características y tipos de recipientes de cultivo
Existe una amplia variedad de recipientes para cultivo. El parámetro más

importante que los caracteriza es la superficie útil de cultivo, porque con base
en ese valor se calcula la cantidad de células que se siembran y se prevé el
número aproximado final de células cuando se alcanza la confluencia. (Doc
10.2.).
Documento 10.2. Características de cultivo de los recipientes más utilizados en cultivos celulares.
20
Entre los recipientes para cultivo más habituales están los siguientes:
- Placas multipocillo
Son placas con un número variable de pocillos (entre 6 y 96) con fondo
habitualmente plano, cubiertas por una tapa no hermética. El diámetro de los
pocillos oscila entre 8 y 35 mm y la superficie de cultivo entre 0,5 y 10 cm2 por
pocillo. Son útiles para realizar experimentos puntuales simultáneos con distintas
líneas celulares o diferentes condiciones de cultivo. No son aconsejables para el
mantenimiento de líneas celulares por su mala estanqueidad y porque
presentan mayor riesgo de contaminación.
Fig. 10.7. Distintos modelos de placas multipocillos para cultivos celulares.
- Placas de Petri
Son las clásicas placas de cultivo circulares con tapa, en tamaños que oscilan
entre 3,5 y 10 cm de diámetro, y que corresponden a superficies de cultivo entre
10 y 78 cm2. Tienen las mismas utilidades y limitaciones que las placas
multipocillo.
Fig. 10.9. Distintos modelos de placas de Petri para cultivos celulares.
21
- Frascos o botellas roux
Son frascos planos con tapón de rosca disponibles en muchos tamaños. Se

caracterizan por su superficie de crecimiento; los más habituales son los de 25 y
75 cm2, aunque los hay hasta de 225 cm2. Son idóneos para todo tipo de cultivo
en monocapa y en suspensión, y para el mantenimiento de líneas celulares. En
este tipo de frascos se pueden realizar cultivos cerrados, enroscando totalmente
el tapón, o abiertos enroscando parcialmente el tapón. Estos últimos permiten
el intercambio gaseoso con la atmósfera del incubador, al tiempo que se
previene la contaminación.
Un tipo especial de frasco de cultivo es aquel en el que la superficie de

crecimiento es un portaobjetos del mismo material que el resto del frasco. Una
vez finalizado el cultivo, se retira el medio de cultivo y el resto del frasco se
despega de la superficie de crecimiento, de manera que esta se puede
manejar como un portaobjetos convencional, fijando y tiñendo la monocapa
de células que ha crecido sobre él con tinciones convencionales, técnicas de
inmunocitoquímica o técnicas de hibridación in situ.
Fig. 10.10. Distintos modelos de frascos roux para cultivos celulares.
Botellas para incubadores tipo roller
Son botellas cilíndricas, de distintos tamaños, con una gran superficie de

crecimiento, específicas para incubarlas sobre rodillos que las hacen girar
lentamente, de manera que las células pueden crecer en toda la superficie
interior de la botella.
22
Fig. 10.11. Dos modelos de frascos de cultivo en los que las células crecen directamente sobre un
portaobjetos.
Con la finalidad de posibilitar o mejorar la adhesión de las células dependientes

de anclaje a las superficies de cultivo, estas se pueden tratar con proteínas de
matriz extracelular, como colágeno, laminina, fibronectina, vitronectina, etc.
También se han ensayado en cultivos particulares otras proteínas naturales o
sintéticas, como la gelatina y la polilisina.
El tratamiento puede realizarse antes del cultivo, inundando el recipiente de

cultivo con una solución estéril de la proteína, o bien añadiéndola al medio de
cultivo como un componente más.
3.2. Composición y propiedades del medio de cultivo
Medios de cultivo
Los medios de cultivo son medios nutritivos que sustituyen al medio natural en
el que se encuentra la célula fisiológicamente.
Son mezclas complejas que deben:
- Aportar a la célula nutrientes
… para su mantenimiento como organismo vivo, así como todo tipo de

sustancias necesarias para el completo desarrollo metabólico que permita a la
célula proliferar.
- Reunir una serie de características fisicoquímicas
… las cuales:
• Generen condiciones microambientales adecuadas para el desarrollo

celular.
• Permitan acumular temporalmente productos de desecho del

metabolismo celular.
23
- Composición del medio de cultivo
La composición básica de los medios de cultivo celular incluye los siguientes

elementos:
- Sales minerales
La base de un medio de cultivo es una solución salina equilibrada en la que se

disuelven el resto de los componentes. Entre las sales minerales que forman parte
habitual de los medios de cultivo están el cloruro sódico, cloruro potásico,
cloruro cálcico, cloruro magnésico, fosfatos sódicos y bicarbonato sódico. La
concentración de bicarbonato sódico es especialmente importante por su
papel en la regulación del pH en conjunción con la concentración de CO2
ambiental.
- Tampón
El medio de cultivo debe estar tamponado ya que las células son muy sensibles
a los cambios de pH. El tampón más utilizado ha sido el bicarbonato, pero en la
actualidad se aconseja el uso del tampón HEPES en concentraciones 10-20 mM,
por su gran poder tamponador en el rango de pH óptimo para el crecimiento
celular (7,2-7,6).
- Glucosa. Aminoácidos. Vitaminas
La glucosa se incluye en los medios de cultivo como fuente de energía, como

componente único o junto con otros hidratos de carbono. El medio de cultivo
debe contener, como mínimo, todos los aminoácidos esenciales, dependiendo
de las necesidades de las células que se quiere cultivar. (Doc 10.3). La
composición en vitaminas varía mucho de un medio a otro y depende de la
concentración de suero que se utilice. Las vitaminas son necesarias porque
influyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia de las células.
- Suplementos orgánicos de bajo peso molecular. Indicador de pH
En la categoría de suplementos se incluyen ácidos grasos esenciales y otros

lípidos, nucleósidos, piruvatos, etc. Por otro lado, dado que el pH del medio es
un parámetro fundamental para la supervivencia del cultivo, en la composición
del medio se incluye un indicador de pH que registre cambios mínimos en el
rango de pH óptimo para el crecimiento. El más utilizado es el rojo fenol, que es
púrpura a pH 7,8, rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0 y amarillo a pH 6,5.
- Hormonas y factores de crecimiento
Esta categoría incluye multitud de componentes esenciales para el crecimiento

de las células pero cuya proporción en el medio de cultivo es muy difícil de
estandarizar. Por ello, la mayor parte de los medios de cultivo básicos, conocidos
como medios no definidos, solucionan este problema suplementando el cultivo
con suero animal en proporción variable (2%-50%, siendo lo más habitual 10%).
(Doc 10.4.).
24
- Antibióticos y antifúngicos
La suplementación del medio de cultivo con antibióticos y antifúngicos es

esencial para prevenir la contaminación por bacterias, levaduras y hongos. Se
pueden utilizar solos o en combinación, pero hay que controlar muy bien la
concentración final para evitar dañar las células.
Los antibióticos más utilizados son:
• Gentamicina a una concentración de 50 µg/ml.
• Combinación de penicilina/estreptomicina a concentraciones de 100

U/ml y 100 µg/ml, respectivamente.
El antifúngico más utilizado es la anfotericina B a una concentración de 2-5

µg/ml.
Documento 10.3. Aminoácidos esenciales
Los aminoácidos esenciales son aquellos que los organismos no pueden

sintetizar por sí mismos, por lo que han de ingerirlos en la dieta. Hay nueve
aminoácidos esenciales: fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina, lisina,
metionina, treonina, triptófano y valina. Los medios para cultivo celular tienen
que incluir en su composición estos aminoácidos para que la célula pueda
sintetizar proteínas. Algunos medios, más completos, añaden otros aminoácidos
que son esenciales solo para algunos tipos celulares, como arginina, cisteína y
tirosina.
Documento 10.4. Medios de cultivo celular no definidos
Los medios no definidos son medios básicos que hay que suplementar con suero
animal para completar su formulación. Los medios no definidos más habituales
y sus aplicaciones son los siguientes:
• Medio basal de Eagle (BME), para el crecimiento de fibroblastos de ratón.

Solo contiene los aminoácidos esenciales.
• Medio mínimo esencial de Eagle (MEM), uno de los más utilizados para
todo tipo de cultivos. Tiene más aminoácidos que el BME y a mayor
concentración.
• Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Multiplica por cuatro la

concentración de aminoácidos y vitaminas del medio BME. Muy útil para
cultivo de hibridomas.
• RPMI 1640, diseñado para el cultivo de linfoblastos, células linfoides

estimuladas y células leucémicas. Con suplementos específicos, tiene
amplias aplicaciones.
• Medio F-10 de Ham. Contiene hierro y oligoelementos. Con los

suplementos adecuados se utiliza para cultivo de células humanas,
incluidos los cultivos de células amnióticas.
25
Documento 10.5. Descomplementación del suero animal para cultivos celulares
Antes de añadir el suero animal a un medio de cultivo celular hay que inactivar
todas las proteínas del complemento, es decir, hay que descomplementarlo.
Para ello:
1. Se descongela una botella de suero en un baño a 37 ºC y a continuación se

sube la temperatura hasta 56 ºC.
2. El suero se mantiene a 56 ºC durante 45 minutos.
3. Transcurrido este tiempo, se saca del baño, se deja enfriar, se alicuota (15-50
ml) y se guarda congelado a –20 ºC.
Para complementar un medio de cultivo celular se usa una alícuota recién

descongelada.
¡Tenlo en cuenta!
El principal inconveniente de la utilización de sueros animales en los medios de

cultivo es que su composición varía entre lotes, lo que hace imposible su
estandarización. Para evitar este inconveniente y poder estandarizar protocolos
experimentales y de producción, se intenta formular los llamados medios
definidos libres de suero, reemplazando este por sus principales componentes.
Esta estrategia es muy útil para diseñar medios selectivos que favorezcan el
crecimiento de un tipo celular concreto, incluyendo en la composición factores
de crecimiento específicos y evitando sustancias potenciadoras de los tipos
celulares no deseados.
- Características fisicoquímicas del medio de cultivo
En el medio de cultivo hay que controlar las siguientes características

fisicoquímicas:
pH
Las células en cultivo suelen crecer en un margen de pH relativamente estrecho.

El pH óptimo para la mayoría de las células es de 7,4 (rango 7,2-7,6), aunque
algunos tipos concretos pueden crecer mejor a otros pH. Como ya se ha
mencionado, el pH del medio se fija con tampones y se controla con un
indicador de pH, de manera que un cambio en el color del medio producido
por un viraje del indicador en un cultivo en crecimiento sería razón suficiente
para cambiar el medio de cultivo.
26
Osmolaridad
Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto

de las células que se cultivan. En general, las células en cultivo toleran valores
de osmolaridad en el rango de 260-320 mOsm/kg.
Viscosidad
La viscosidad no suele ser un parámetro limitante para el crecimiento de las

células. Depende principalmente de la concentración de suero que se use. Una
viscosidad ligeramente elevada tiene efecto protector durante la tripsinización
y agitación del cultivo. Cuando se usan medios libres de suero, se pueden añadir
sustancias inertes que aumentan ligeramente la viscosidad, como la
carboximetil-celulosa o la polivinilpirrolidona.
Tensión superficial
La tensión superficial debe mantenerse baja y no suele ser problema en los

cultivos tradicionales. Únicamente en ciertos cultivos especiales en suspensión
en los que se burbujea CO2 puede producirse espuma en el cultivo. Para evitarlo
se añaden agentes antiespumantes.
3.3. La atmósfera gaseosa. Condiciones de incubación
Atmósfera gaseosa
La atmósfera gaseosa es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos;

sus dos componentes más importantes son el oxígeno y el CO2.
Los componentes de la atmósfera del cultivo son controlados y suministrados por

el incubador.
• Oxígeno. Todas las células requieren oxígeno para vivir. En general, la

concentración de oxígeno atmosférico es suficiente para cubrir las
necesidades de cualquier cultivo celular. Solo algunos cultivos de
órganos requieren una mayor concentración de oxígeno (hasta un 95%)
por la mala difusión de este elemento al interior del órgano.
• CO2. El CO2 tiene un papel muy importante en los cultivos celulares puesto
que la fracción disuelta en el medio está en equilibrio con el ion
bicarbonato. Este equilibrio se rige por las siguientes ecuaciones
químicas:
o CO2 + H2O D H2CO3 D HCO3- + H+
o HCO3- + Na+ D NaHCO3
27
En consecuencia, los niveles de CO2 pueden influir en el pH del medio cuando
este está tamponado con un tampón bicarbonato y, en cualquier caso, en la
concentración de bicarbonato cuando se utiliza otro sistema tampón.
Por esta razón cada medio de cultivo tiene una concentración recomendada
de CO2 en la fase gaseosa, en función de la cantidad de bicarbonato sódico
que contiene. La concentración más habitual es del 5%, con un rango entre 2%
y 8%. Los incubadores llevan acopladas botellas de CO2 y un dispositivo que
permite controlar la concentración de este componente en la atmósfera de
incubación.
El incubador es también el responsable de mantener las condiciones

ambientales óptimas para el crecimiento de las células, controlando dos
parámetros: temperatura y humedad:
• Temperatura. La temperatura influye en gran medida en la tasa de

crecimiento de las células. La temperatura óptima de crecimiento suele
ser la misma a la que están sometidas fisiológicamente en los organismos
de procedencia. Así, las células de mamíferos crecen bien a 37 ºC, pero
la temperatura óptima para las células de insectos es de 28 ºC.
• Humedad. La humedad ambiental es también un parámetro importante

para el buen crecimiento de las células. Debe ser suficientemente
elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo, lo que
produciría aumento de la concentración de los componentes y de la
osmolaridad, y variaciones de pH.
Los incubadores actuales tienen dispositivos que inyectan agua estéril para
conseguir humedades relativas alrededor del 95%.
Recuerda
28
4. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR
Caso práctico
A María y Teresa sólo les queda conocer el procedimiento de cultivo celular.
- María: Teresa, ¿qué procedimiento hay que seguir para el cultivo celular?
- Teresa: Disgregación celular, recuento y viabilidad celular, descongelación de células, siembra,

mantenimiento del cultivo y conservación.
- María: Parece un proceso laborioso.
- Teresa: Sí, y además es muy importante evitar la contaminación.
En este apartado aprenderás el procedimiento de cultivo celular.
En los laboratorios de cultivos celulares se realizan múltiples procedimientos.
Fuente: Pixabay
En los laboratorios de cultivos celulares se realizan múltiples procedimientos,

desde la obtención de las células a partir de tejidos, hasta la conservación y
almacenamiento de líneas celulares establecidas, pasando por el
mantenimiento de los cultivos, la realización de pases, estudios de viabilidad
celular, etc.
A continuación vamos a estudiar todos estos procesos en el orden cronológico

en que se producen.
¡Tenlo en cuenta!
En cualquiera de estos procedimientos se deberán mantener, en la medida de

lo posible, las condiciones de esterilidad para prevenir contaminaciones.
29
4.1. Disgregación celular
Cuando se quieren cultivar células procedentes de un órgano o tejido, el primer
paso consiste en obtener el tipo celular que nos interesa en suspensión. Para lo
cual hay que separar las células entre sí y de la matriz extracelular en la que se
encuentran inmersas.
- Métodos de disgregación celular
Esta disgregación celular se puede realizar por métodos mecánicos o

enzimáticos, aunque lo normal es una combinación de ambos:
Métodos mecánicos
Los métodos mecánicos se basan en cortar, picar e incluso triturar suavemente

fragmentos de órgano o tejido colocados en una placa de Petri con tampón o
medio de cultivo, en el que se recogen las células disgregadas tras filtrarlo para
retirar los restos de tejido.
Un método mecánico muy útil es el cribado de células. Consta de los siguientes

pasos:
1. Se colocan los trozos de órgano o tejido, previamente picados, sobre una

criba de nailon o metálica, con un diámetro de poro suficientemente grande
para permitir el paso de las células.
2. Se aplasta suavemente la masa de tejido.
3. La criba se acopla a un tubo falcon con el diámetro adecuado, o se coloca

sobre una placa de Petri.
4. Se lava con tampón o medio de cultivo, de manera que sobre la criba

permanecen los restos de tejido aplastado. Las células que se han separado del
tejido pasan al tubo o placa suspendidas en el tampón o medio de cultivo.
Métodos enzimáticos
Los métodos enzimáticos se basan en el tratamiento del tejido con enzimas

proteolíticas que digieren las proteínas de la matriz extracelular, liberando las
células englobadas en ella.
Entre las proteasas más utilizadas están la tripsina, la colagenasa, la dispasa, la

papaína, la elastasa y la pronasa. Las soluciones enzimáticas se pueden
combinar con EDTA, que al retirar los cationes de Ca2+ que estabilizan las
uniones entre las proteínas de matriz y las células, favorece su disgregación.
(Doc 10.6.).
30
- Documento 10.6. Disgregación celular con tripsina
Un protocolo genérico de disgregación celular con tripsina sigue estos pasos:
1. Colocar el tejido que se va a disgregar en una placa de Petri con PBS frío y
picar lo más posible con hojas de bisturí.
2. Pasar el tejido picado a un tubo de 15 ml y añadir 3 ml de una solución de

tripsina al 0,25% con EDTA 1 mM.
3. Incubar a 37 ºC durante 30-60 minutos, dependiendo del grosor de los

fragmentos de tejido.
4. Añadir 7 ml de medio MEM con 10% de suero fetal y antibióticos.
5. Pipetear enérgicamente con pipeta pasteur 20-30 veces.
6. Dejar reposar para que se forme un pellet.
7. Eliminar el sobrenadante.
8. Añadir 10 ml de medio y resuspender el pellet suavemente por inversión.
9. Centrifugar a 900 rpm y descartar el sobrenadante.
10. Resuspender las células en medio de cultivo nuevo.
* Los pasos 2 a 7 se pueden repetir si la digestión del tejido no ha sido completa.
** Todo el material y las soluciones empleadas deben ser estériles.
- Selección de células
Tras la disgregación de un tejido se obtiene una mezcla compleja de células en

suspensión que se puede utilizar directamente para iniciar un cultivo primario.
Pero otras veces interesa seleccionar un tipo celular concreto para cultivarlo.
La selección de células se basa en:
Propiedades específicas de las células
Las células se pueden separar por su distinta adhesión a sustratos, tanto

naturales (endotelios, colágeno) como artificiales (lana de vidrio, plástico). La
suspensión celular se hace pasar por columnas o filtros con estos sustratos, de
manera que las células de interés quedan retenidas en ellos. Posteriormente se
eluyen con un tampón adecuado que disminuya la adhesión.
Métodos inmunológicos de selección de células
Se basan en el uso de anticuerpos específicos que reconocen las células de

interés anclados a un soporte sólido. Hay varias posibilidades:
• Recubrir los pocillos de una placa mutipocillos con el anticuerpo

específico. La mezcla de células se incuba en los pocillos, de manera que
31
las células de interés quedan retenidas sobre la superficie de los pocillos
y el resto de las células se eliminan mediante lavados.
• Recubrir esferas de material inerte de cierto tamaño con el anticuerpo.

Estas esferas se introducen en la suspensión con la mezcla de células, de
manera que las células de interés quedan retenidas sobre la superficie de
las esferas. La solución se filtra después con un filtro que retiene las esferas
pero no el resto de las células.
• Recubrir esferas magnéticas con el anticuerpo. En este caso, las células

ancladas a las esferas magnéticas se retienen con un imán y el resto de
las células se elimina con lavados.
En los tres casos, las células se separan del soporte sólido cambiando el pH o
digiriendo los anticuerpos con enzimas.
¡Tenlo en cuenta!
Un método automatizado de selección de células consiste en marcar las células

de interés con un anticuerpo fluorescente y separarlas del resto mediante un
citómetro de flujo con capacidad cell sorting.
4.2. Recuento y viabilidad celular
Una vez obtenida la suspensión celular de partida, para iniciar el cultivo celular
es imperativo conocer su densidad celular, es decir, el número de células por
ml.
Esto es debido a que el cultivo se inicia con un número concreto de células,

dependiendo de la superficie del recipiente que se vaya a utilizar. Además, hay
que comprobar la viabilidad de esas células, es decir, confirmar que están vivas.
Ambos procesos se realizan simultáneamente diluyendo las células con un
colorante vital y contándolas en una cámara de recuento.
Colorante vital
El colorante vital permite distinguir las células vivas de las muertas.
El colorante más habitual es el azul tripán, un coloide de color azul que

penetra en el interior de las células que tienen la membrana rota, pero que no
atraviesa las células con las membranas intactas. En consecuencia, cuando se
32
observa al microscopio una población de células teñida con azul tripán, se ven
dos tipos de células:
• Células de color azul, que se han teñido porque tienen rota su

membrana citoplásmica. Estas células se consideran no viables.
• Células blancas, en las que el colorante no ha podido penetrar porque
su membrana citoplásmica está intacta. Se considera que estas células
están vivas y son viables para un cultivo.
Colorante vital
El colorante vital permite distinguir las células vivas de las muertas.
Este procedimiento se lleva a cabo en la cámara de contaje celular o

hemocitómetro. La más utilizada es la cámara de Neubauer. (Doc 10.7.).
- Documento 10.7. La cámara de Neubauer
Es un portaobjetos especial, de un grosor muy superior a un portaobjetos

convencional, que tiene en el centro una depresión central, hundida
exactamente 0,1 mm con respecto a la superficie del portaobjetos, aislada del
resto de este por dos surcos laterales y dividida en dos por un surco horizontal
central.
Cada una de las depresiones arriba y abajo del surco central es una cámara
de contaje que tiene grabada una cuadrícula consistente en un cuadrado de
3 × 3 mm con una serie de subdivisiones internas en cuadrados más pequeños
de distintos tamaños. Para los recuentos de células en cultivos celulares se
utilizan los cuatro cuadrados de 1 × 1 mm (1 mm2) situados en las esquinas de
la cámara que, a su vez, están subdivididos en 16 cuadrados.
Fig. 10.12. Cámara de Neubauer.
33
Fig. 10.13. Cuadrícula de una cámara de Neubauer con las medidas principales. La altura entre
el cubrecámaras y la cámara es exactamente de 0,1 mm, por lo que el volumen que puede
contener un cuadrado de esquina es de 1 mm ∙ 1 mm ∙ 0,1 mm = 0,1 mm3
El procedimiento de contaje sigue los pasos siguientes:
1. Una vez homogeneizada la suspensión mediante inversión suave del tubo, se

diluye una alícuota de ella (por ejemplo, 20 µl) al 50% con una disolución de azul
tripán al 0,4% en PBS.
2. Se monta la cámara de Neubauer, colocando un cubrecámaras encima. El

cubrecámaras queda a una altura exacta de 0,1 mm de la cámara.
3. A continuación se cargan 10 µl de la suspensión teñida en cada cámara. El

volumen de suspensión situado encima de un cuadrado de esquina es de: 1 mm
∙ 1 mm ∙ 0,1 mm = 0,1 mm3.
4. Se deja reposar unos minutos para que las células sedimenten y se visualiza la
cámara con un microscopio óptico convencional.
34
5. Se cuentan las células blancas (viables) y azules (no viables) presentes en las
cuatro esquinas de 0,1 mm3 y se realizan los siguientes cálculos:
• Densidad celular en la suspensión: (células totales/ml) = (A + B) · 2 · 10 4 /

4
• Densidad celular viable: (células viables/ml) = A · 2 · 104 / 4
• Densidad celular no viable: (células no viables/ml) = B · 2 · 104 / 4
Siendo A, el número de células blancas contadas en las cuatro esquinas y B, el

número de células azules contadas en las cuatro esquinas).
Fig. 10.15. Para hacer un recuento celular, una vez cargada la cámara se cuentan las células
presentes en los cuatro cuadrados de 1 mm2 situados en las esquinas de la cámara (cuadrados
amarillos 1-4).
¡Tenlo en cuenta!
Si la densidad celular es muy elevada y no se puede hacer bien el recuento, se

puede hacer una dilución previa en PBS 1/10-1/100. Este factor de dilución se
deberá tener en cuenta a la hora de hacer los cálculos.
4.3. Descongelación de células. Inicio del cultivo (siembra)

Se realiza en varios pasos:
1.Incubar el vial que contiene las células congeladas en un baño a 37 ºC.
2. Limpiar la superficie externa del vial con etanol al 70% para prevenir
contaminaciones.
3. Transferir el contenido del vial a un tubo falcon de 15 ml y añadir 10 ml de

medio de cultivo completo precalentado a 37 ºC.
4. Centrifugar 4-5 minutos a 700-800 rpm.
35
5. Eliminar el sobrenadante, con lo que se elimina el DMSO.
6. Añadir 4-5 ml de medio de cultivo completo nuevo. La suspensión celular está

lista para iniciar el cultivo.
Por supuesto, todas las manipulaciones deben realizarse en condiciones de

esterilidad en la medida de lo posible.
¡Tenlo en cuenta!
Una vez descongeladas hay que procurar que las células estén el menor tiempo
posible en contacto con el medio que se usó para congelarlas. Esto es debido
a que los medios de congelación tienen DMSO, que es muy toxico para las
células.
Partiendo de una suspensión celular obtenida por disgregación, selección o

descongelación, el cultivo se inicia sembrando un número determinado de
células. Este procedimiento implica:
1. Elegir el tipo de recipiente que se va a utilizar para el cultivo.
2. En virtud del recipiente, establecer el número de células que se van a sembrar

inicialmente.
3. Hacer recuento de células viables en la suspensión.
4. Transferir un volumen de suspensión que contenga el número de células

deseado a un tubo falcon y lavarlas con medio de cultivo completo
precalentado a 37 ºC.
5. Diluir las células con el volumen adecuado de medio de cultivo completo e

introducirlas en el recipiente de cultivo.
6. Colocar el recipiente de cultivo en un incubador a la temperatura adecuada

(normalmente 37 ºC), con la proporción de CO2 requerida (del 5%,
habitualmente) y 95% de humedad.
4.4. Mantenimiento del cultivo
El mantenimiento de los cultivos consiste en diferentes operaciones para el

control de su viabilidad y crecimiento. Las operaciones más habituales son:
- El control periódico microscópico
Los cultivos se controlan microscópicamente con la periodicidad que se estime

oportuna (normalmente entre 1 y 3 días), para lo cual se retiran del incubador
(si son cultivos ventilados hay que cerrarlos) y se examinan con un microscopio
invertido para observar la apariencia y el crecimiento de las células.
36
- El cambio de medio
La operación de mantenimiento más frecuente es el cambio de medio de

cultivo, para renovar los nutrientes consumidos por las células y retirar los
productos de desecho generados por el metabolismo celular.
El cambio de medio se suele realizar cada 2-3 días y, en cualquier caso, siempre
que se observe un cambio de color del medio (viraje del indicador de pH).
El cambio de medio nunca es total, sino que se cambian sólo 2/3 de su volumen.
De esta manera se consigue que posibles sustancias beneficiosas para el cultivo
producidas y secretadas por las células se mantengan en él.
• En los cultivos en monocapa el cambio de medio consiste en retirar con

pipeta 2/3 de medio de cultivo y sustituirlo por medio nuevo.
• En los cultivos en suspensión, se centrifuga a 700-800 rpm el cultivo, se

retiran 2/3 del volumen del medio y se sustituye por medio nuevo.
Una vez cambiado el medio se reanuda la incubación en condiciones

adecuadas.
¡Tenlo en cuenta!
Todas las manipulaciones de cambio de medio se deben realizar en cabinas de

clase II.
- Los subcultivos o pases
Tras un cierto tiempo de cultivo (6-7 días), los cultivos en monocapa se

encuentran en situación de confluencia y los cultivos en suspensión alcanzan
una densidad crítica. En ambos casos el crecimiento se detiene y hay que
realizar un subcultivo o pase.
Cultivos en suspensión
En los cultivos en suspensión, se realiza un recuento de viables y se calcula el

factor de dilución necesario para que la densidad celular sea la adecuada
para reiniciar el crecimiento.
Por ejemplo, supongamos que la dilución adecuada es 1/5. En ese caso se

preparan 5 recipientes con 4/5 de medio nuevo y se añade a cada uno 1/5 del
cultivo viejo. Los 5 subcultivos se pasan al incubador para reiniciar el crecimiento
celular. De esta forma se va expandiendo la población celular.
Otra posibilidad es ir escalando el tamaño del recipiente de cultivo, de manera

que cada pase se realiza en un recipiente mayor que el anterior.
37
Cultivos en monocapa
En los cultivos en monocapa es necesario despegar las células de la superficie

del recipiente para poder hacer el pase. Esto se puede hacer por métodos
mecánicos, con un rascador, pero el procedimiento más habitual es la
tripsinización.
⇒ La tripsinización es el procedimiento de despegado de una monocapa de

células de la superficie del recipiente mediante una solución de tripsina/EDTA.
La tripsina digiere las proteínas responsables de la adhesión a la superficie y el

EDTA retira del medio los iones de Ca2+, que estabilizan la interacción célula-
sustrato. Como en el caso anterior, el resultado final del pase es la expansión del
cultivo (Doc 10.8.).
- Documento 10.8. Tripsinización de una monocapa de células y subcultivo
Un protocolo genérico para despegar una monocapa de células, consiste en:
1. Retirar todo el medio de cultivo.
2. Lavar la monocapa con una solución PBS + 0,004% de EDTA.
3. Incubar la monocapa con una solución de tripsina 0,05% / EDTA 0,016%.
4. Añadir un volumen 4-5 veces mayor que el de la solución de tripsina de medio

de cultivo nuevo completo (con suero). El suero contiene un inhibidor de tripsina,
con lo que se detiene la tripsinización.
5. Pipetear varias veces el medio de cultivo por toda la placa con fuerza
suficiente para terminar de despegar y separar las células. Al final se debe
obtener una suspensión celular sin agregados.
6. Lavar las células en suspensión con medio de cultivo nuevo.
7. Hacer un recuento de viables.
8. Calcular el factor de dilución necesario para subcultivar en recipientes

nuevos.
9. Preparar tantos recipientes estériles como sea necesario con la cantidad de

medio nuevo adecuada al factor de dilución calculado.
10. Repartir las células lavadas en los recipientes nuevos en la proporción

adecuada.
11. Llevar los subcultivos al incubador.
38
4.5. Conservación de células
Las líneas celulares continuas o inmortales se pueden mantener en el tiempo
mediante pases seriados. Sin embargo, esta estrategia consume recursos y
tiempo. Por esta razón, el método habitual de conservación de líneas celulares
es la congelación.
Para llevarla a cabo se procede como si se fuese a realizar un pase:
• Cuando se ha obtenido una suspensión de células, se lavan con medio

de cultivo y se hace un recuento de viables.
• Se retira el medio de cultivo por centrifugación y se sustituye por un

volumen adecuado de suero animal con un 10% de DMSO. Una densidad
celular final en el medio de congelación aceptable es alrededor de 106
células/ml.
• Esta suspensión se alicuota en criotubos (aproximadamente

1ml/criotubo) y se procede a congelación progresiva:
o –20 ºC durante 24 h.
o –80 ºC durante 24 h más.
o en nitrógeno líquido indefinidamente.
El método habitual de conservación de líneas celulares es la congelación.
39
Recuerda
40
5. CONTAMINACIONES
Caso práctico
- María: Oye Teresa, ¿existe alguna causa por la que un cultivo se vea alterado?
- Teresa: Claro que sí María, lo vimos en la clase anterior. Un cultivo se puede contaminar y
estropearse.
- María: ¿Y en qué consisten esas contaminaciones? No lo recuerdo bien.
- Teresa: María, sobre todo un cultivo se contamina cuando hay presencia de microorganismos
no deseados. Estos miscroorganismos se pueden agrupar en: bacterias, levaduras y hongos,
micoplasmas y virus.
- María: ¡Entendido! Muchas gracias Teresa.
- Teresa: De nada, si quieres saber más, en este apartado lo puedes estudiar.
Fig. 5.9. Ejemplos de microarrays o biochips.
Las contaminaciones en los cultivos celulares se refieren principalmente a la

alteración del cultivo por la presencia de microorganismos no deseados y que
son omnipresentes en el ambiente. Estos contaminantes, según la mayor
frecuencia en la que se presentan se pueden agrupar en: bacterias, levaduras
y hongos, micoplasmas y virus.
¡Tenlo en cuenta!
Hemos insistido, a lo largo de la unidad, en la importancia de ejecutar todos los

procedimientos adecuadamente y en las máximas condiciones de esterilidad
para reducir el riesgo de contaminaciones.
41
5.1. Tipos de contaminantes
Los contaminantes, según la mayor frecuencia en la que se presentan, se
pueden agrupar en:
- Bacterias, levaduras y hongos
Las bacterias y las levaduras son los contaminantes más habituales en cultivos
a corto plazo, mientras que los hongos son el contaminante más habitual en
cultivos a largo plazo.
Estos contaminantes crecen perfectamente en los medios de cultivo para

células, pero mucho más rápido que ellas, por lo que ocasionan la muerte del
cultivo en muy poco tiempo. La fuente de contaminación, normalmente, es
ambiental o por malas prácticas de laboratorio. El uso de antibióticos y
antifúngicos en los medios de cultivo, a veces no es suficiente para prevenir
esta contaminación. Por ello es fundamental:
• Trabajar siempre en condiciones estrictas de asepsia y en cabinas de

seguridad biológica de clase II.
• Tener especial cuidado en los procedimientos que supongan manipular
los recipientes de cultivo fuera de un ambiente estéril como, por
ejemplo, la observación de los cultivos en el microscopio invertido.
• Limpiar la superficie externa de todos los viales y recipientes que se
introduzcan en la cabina de bioseguridad para realizar algún
procedimiento con etanol al 70%.
• Esto es especialmente importante en el caso de recipientes que se han
incubado en un baño a 37 ºC para atemperar su contenido, puesto que
el agua de los baños se contamina con mucha facilidad.
• Cuando se trabaja con incubadores sin control de humedad, que
tienen bandejas con agua en el suelo, esta debe cambiarse
regularmente y las bandejas se deben desinfectar periódicamente.
• En el caso de que se descubra un cultivo contaminado, se debe
separar rápidamente del resto y eliminar por algún procedimiento que
incluya esterilización. Previamente se puede tomar alguna muestra para
analizar el tipo de contaminación.
42
Detalle de cultivo de bacteria Serratia marcescens en placa de Petri
Fuente: Procomún
Detalle de colonias de levaduras de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) creciendo en placa

de Petri
Fuente: Procomún
Hifas de hongo
Fuente: Procomún
43
- MICOPLASMAS
Los micoplasmas son microorganismos procariotas sin pared que pueden

infectar cultivos y producir su muerte o una alteración en el crecimiento de las
células.
En muchas ocasiones, la contaminación procede de las propias líneas

celulares continuas, que se suministran ya contaminadas, o de los sueros
animales.
La detección no siempre es fácil, pero la observación de gránulos oscuros en

el citoplasma de las células puede hacer sospechar la contaminación. Para
confirmarlo se pueden teñir las células con orceína o con DAPI o realizar una
PCR con cebadores específicos.
Para evitar que la contaminación por micoplasmas se extienda, lo mejor es

eliminar y esterilizar cualquier cultivo positivo en cuanto se lo detecta.
Si el cultivo es importante, se puede intentar conservarlo tratándolo con

antibióticos, como kanamicina o quinolonas, o con suero inmune
antimicoplasmas.
En cualquier caso, el cultivo contaminado debe aislarse de los demás.
Masas bacterianas.
Fuente: Procomún
- VIRUS
La infección por virus, aunque infrecuente, es grave. La fuente principal de

contaminación viral solían ser los sueros animales, aunque en la actualidad
están muy controlados.
La detección se basa en la observación del efecto citopático, característico

de cada virus. Ante la sospecha de infección viral, la mejor solución es eliminar
el cultivo y esterilizarlo mediante irradiación.
44
Virus.
Fuente: Pixabay
45
Resumen
Cultivo celular
Se puede definir el cultivo celular como el conjunto de procedimientos que

hacen posible el mantenimiento de células de organismos pluricelulares in vitro,
preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Tipos de cultivos celulares:
• Cultivo de órganos.
• Cultivo de explantes.
• Cultivo de células.
La curva de crecimiento del cultivo
La dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración de células

por los días de evolución del cultivo, se representa gráficamente mediante una
curva de crecimiento.
Formas de crecimiento de las células en cultivo:
• En monocapa.
• En suspensión.
Línea celular primaria
La línea celular primaria es aquella obtenida a partir de un tejido u órgano

mediante un cultivo primario y que se mantiene en cultivo mediante pases
seriados durante un tiempo limitado.
Líneas celulares continuas
Las líneas celulares continuas son aquellas que se obtienen a partir de un cultivo
primario y que se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases
seriados.
Factores que intervienen en el cultivo
• El soporte físico en el que van a crecer las células.
• La composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo.
• La atmósfera gaseosa.
• Las condiciones de incubación.
46
Procedimientos de cultivo celular
• Disgregación celular.
• Recuento y viabilidad celular.
• Descongelación de células. Inicio del cultivo (siembra).
• Mantenimiento del cultivo.
• Conservación de células.
Contaminación de cultivos celulares
• Por bacterias, levaduras y hongos.
• Micoplasmas.
• Por virus.
47
48

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Unidad 10

a) Caracterizar los métodos de cultivo celular que se aplican en los estudios

b) Seleccionar los tipos de medios y suplementos en función del cultivo que

c) Realizar los procedimientos de puesta en marcha, mantenimiento y

d) Tomar las medidas para la eliminación de la contaminación detectada.

e) Definir los procedimientos de conservación de las células.

f) Trabajar en todo momento en condiciones de esterilidad.

g) Determinar el número y la viabilidad celular en los cultivos en la

El doctor Mejías al entrar en la habitación encuentra a Juan Manuel sollozando

Juan Manuel recupera el ánimo y le da las gracias a su médico, ya que no sabía

- María: Teresa, ¿has visto la noticia en el Facebook del centro?

- Médico: ¿Y cómo lo han hecho?

- Teresa: Mediante cultivos celulares.

Los cultivos celulares en laboratorio se realizan en medios y condiciones controladas.

Además de la biología molecular, uno de los ámbitos de estudio de este libro

Se puede definir el cultivo celular como el conjunto de procedimientos que

El Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los

El cultivo de órganos consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la

En estos cultivos (como pueden ser los cultivos de ganglios, de fragmentos

Estos cultivos no pueden propagarse, ya que la mayor parte de los tipos

Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas

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Las porciones de tejidos vivos o explantes son también susceptibles de cultivo.

El cultivo de explantes consiste en adherir un fragmento de tejido a una

En estas condiciones, las células periféricas del explante se multiplican y

El cultivo de células se realiza a partir de suspensiones celulares, que se

El cultivo de células es el tipo de cultivo más habitual y se realiza a partir de

Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células

• Cultivo celular primario. Para obtener un cultivo celular primario, la

• Cultivo celular secundario. La suspensión celular de partida se obtiene a

Un grupo de células con un mismo origen, estructura o función constituyen un

1.2. Aplicaciones de los cultivos celulares

En investigación básica permiten estudiar:

• Cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular: ciclo celular,

• Interacciones celulares: entre células, con la matriz extracelular, con el

• Inmunología, para producción de anticuerpos monoclonales.

• Virología, para producción de vacunas.

• Farmacología, para producción de fármacos.

• Toxicología, para estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y

Dos aplicaciones relativamente modernas y muy interesantes son:

• La ingeniería de tejidos que pretende conseguir la producción in vitro de

• Estudios con células madre o stem cells, enfocados a la terapia celular.

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- María: Lo que no sé es cómo no se había conseguido antes.

- Teresa: ¿Y cuáles son las formas de crecimiento de los cultivos celulares?

En el siguiente apartado encontrarás respuesta a esta y otras cuestiones.

Las células empiezan a crecer cuando se incuban en condiciones óptimas de temperatura

Fuente: Editorial Altamar

La dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración de células

La curva de crecimiento adopta la forma de una curva sigmoide en la que se

Fase de latencia. Es un tramo recto sin pendiente o con cierta concavidad.

Fase de crecimiento exponencial. En la curva es el tramo recto con pendiente

Fase estacionaria. Es un tramo recto de pendiente nula. Sucede a partir de los

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El crecimiento en monocapa consiste en que las células crecen adheridas sobre

Este tipo de células se dice que son dependientes de anclaje, es decir,

De hecho, muchos tipos celulares pierden características de diferenciación

En el crecimiento en monocapa se pueden distinguir diferentes momentos o

1. Adhesión a una superficie. Corresponde al periodo durante el cual las células

Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o

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Fig. 10.5. Cultivo de fibroblastos en confluencia.

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