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II. CROMATOGRAFIA PLANA

CROMATOGRAFA EN PAPEL (PC) La cromatografa en papel (1944, Consden, Gordon y Martin) es una tcnica analtica importante y de gran aplicacin para la separacin e identificacin de microcantidades de substancias. Las especies separadas aparecen como manchas despus de rociar el papel con algn reactivo formador de color apropiado para el caso. Existen varias formas de realizar cromatografa en papel. El mtodo clsico es como sigue (figura 16): a) Se satura un trozo de papel filtro con agua. b) Se coloca una gota de la mezcla a analizar sobre el papel. c) El papel se sumerge en una cuba que contiene un solvente orgnico. d) A medida que el solvente se mueve, va arrastrando y separando los componentes de la mezcla. A esta operacin se le conoce como desarrollo. e) Si es necesario, el papel se roca con un reactivo formador de color que haga aparecer a los distintos componentes de la mezcla. A esto se le llama revelado.

(E) Afinidad

Figura 16. Cromatografa en papel. El solvente orgnico en la cuba es la fase mvil, mientras que el agua con la que se satur el papel es la fase estacionaria. El solvente orgnico asciende por el papel. Cada componente de la mezcla XYZ tiene un coeficiente de reparto diferente entre la fase orgnica y la fase acuosa, por lo que X, Y y Z se separan a medida que el solvente se desplaza por el papel. TAREA 1.
Investigar las variaciones en el desarrollo de las tcnicas en papel (ascendente, descendente, sndwich, etc.)

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CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF) Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la primera forma de Cromatografa de Capa Fina. Egon Stanl (1956) di el nombre de Cromatografa de Capa Fina (TLC, CCF). Este tipo de cromatografa planar, es una tcnica relacionada con la HPLC, pero con su propia especificidad. Aunque estas dos tcnicas son experimentalmente diferentes, el principio de separacin y la naturaleza de las fases es la misma. Debido a la reproducibilidad de las pelculas y las medidas de concentracin, la CCF es ahora un mtodo cuantitativo de anlisis que puede efectuarse en instrumentos modernos. El desarrollo de aplicadores automticos y densitmetros ha llevado a la nano CCF a ser una tcnica simple con alta capacidad Las placas, se recubren con una delgada capa (100-200 m) Comnmente los ensayos en de fase estacionaria, la cohesin de la fase y su enlazamiento al TLC se usan como prueba soporte se asegura introduciendo un ligando orgnico o un mineral preliminar antes de emplear otros tipos de cromatografa cuando se deposita la pelcula. El volumen de la muestra debe ser ms complicados, tales como pequeo (unos pocos nL o L) y se colocan en pequeos puntos de 1HPLC (Cromatografa lquida 3 mm de dimetro. La muestra puede aplicarse manualmente o de alta resolucin). usando un capilar de extremo plano (fig. 17). La aplicacin puede hacerse tambin a manera de una banda horizontal de unos cuantos milmetros depositada por rociado automtico de la muestra. La placa se coloca en una cmara cubierta, que contiene una pequea cantidad de fase mvil, la cual esta en contacto con la placa con la parte donde se coloc la muestra sumergida a una profundidad de unas cuantos milmetros. La fase mvil migra por capilaridad a travs de la fase estacionaria, induciendo a los componentes de la muestra a migrar de manera diferencial. Una vez que el solvente ha recorrido la distancia adecuada (unos cuantos centmetros) la placa se retira de la cmara y la fase mvil se evapora.

Figura 17 Aplicacin automtica empleada en CCF analtica. Aplicador programable ATS-3

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Fundamentos. La separacin de mezclas de molculas mediante CCF se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, se realiza permitiendo En cromatografa de capa fina la fase estacionaria que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione est hidratada, por lo que con un medio de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo se le considera como la medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fase polar. fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. Proceso de Adsorcin La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, Para nano - CCF las son del orden puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es partculas de 4 m y los poros son expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de de 6 nm. enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. Las caractersticas del adsorbente que definen las propiedades de la fase estacionaria son: tamao de partcula, volumen de poro, dimetro de poro, rea superficial, homogeneidad y pureza. La distancia entre los grupos silanol y siloxano determinan el carcter RP = reversed hidrofilico de la fase. Como en HPLC, pueden enlazarse varias cadenas a los = Fase grupos silanol superficiales de las fases de silica. Algunas fases incorporan phase cadenas de alquilos simples (RP-2, RP-8, RP-18) mientras otras incluyen reversa grupos funcionales orgnicos (nitrilos, aminas, o alcoholes) permitiendo que estas fases puedan usarse con cualquier tipo de fase mvil. Los adsorbentes ms utilizados en la CCF son: Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Tierra Silcea Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas PROCEDIMIENTO COMUN PARA CCF 1. Preparacin de la Placa Cromatogrfica Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (ej: Aluminio). Los tamaos de la placa para TLC convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2. Hay placas que contienen un indicador de Fluorescencia : F254 F366. El nmero que aparece como subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado.

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2. Aplicacin de la muestra La muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en: banda o puntos. La tcnica de aplicacin en banda, tiene la ventaja de presentar una alta reproducibilidad para la cuantificacin de la muestra depositada, esencial en el anlisis cuantitativo. 3. Desarrollo de la Placa Es un proceso mediante el cual son transportados a travs de la fase estacionaria por la fase mvil. Este proceso se efecta en el interior de una cmara de desarrollo. Existen varios tipos de cmaras, Normal, Doble Compartimiento, Sndwich, Horizontal, entre otras. 4. Deteccin Visualizacin Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de mtodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Estos mtodos pueden ser qumicos o fsicos En los Qumicos ya sea por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes. Los mtodos Fsicos (pticos).generalmente utilizan radiacin UV. Como ejemplos de estos mtodos, los fabricantes, ofrecen placas con una sal fluorescente de cinc, adicionada a la fase estacionaria. Cuando la placa se irradia con una lmpara de mercurio, aparecen puntos negros sobre un fondo fluorescente, indicando la posicin de los compuestos. Otro mtodo universal de revelado, consiste en calentar la placa despus de rociarla con cido sulfrico, carbonizando los compuestos y hacindolos visibles. Tambin pueden usarse reactivos como el cido fosfomolbdico (general) o la ninhidrina en alcohol, (especfico para aminocidos).

Figura 18. Cmara vertical y placa de CCF. Apariencia tpica de una placa de CCF despus del desarrollo.

CROMATOGRAFA EN DOS DIMENSIONES.

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El uso de placas de CCF o de papel de geometra cuadrada permite desarrollar cromatografa bidimensional, usando dos fases mviles distintas. La segunda migracin se realiza despus de rotar la placa (o el papel) un cuarto de vuelta (fig. 19) Una aplicacin tpica de esta tcnica, es en la separacin de aminocidos, aunque no se acostumbra usarlo para el anlisis cuantitativo.

El uso de diferentes fases mviles se recomienda para una mejor separacin.

Conclusin: x es probablemente a, pero la impureza no es b, o c.

Figura 19. Principio de CCF bidimensional. A) aplicacin de 3 estndares (a, b y c) y una muestra (x). B) migracin con el primer solvente. C) secado y rotacin del la placa. D) Migracin con el segundo solvente.

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PARMETROS DE RETENCIN Y SEPARACIN En CCF y en cromatografa en papel, cada componente es definido por su valor de R f (factor de retardo) el cual corresponde a la migracin relativa en comparacin al solvente: Rf = distancia recorrida por el soluto = distancia recorrida por el solvente x x0

Figura 20. Definicin del factor de retardo. Anlisis Cualitativo Existen diferentes criterios para identificar compuestos separados por las tcnicas de cromatografa planar, siendo algunos de ellos:

Medida de Rf Comparacin Visual de Color/Intensidad Propiedades UV/IR/MS/NMR

Anlisis Cuantitativo

Semi-cuantitativo: Consiste en la comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie de manchas patrones de concentracin conocida Cuantitativo: puede hacerse de manera indirecta directa (densitometra, espectrofotometra) Densitometra

El densitmetro es un instrumento que determina de manera indirecta la luz absorbida por una superficie. La luz absorbida es la diferencia entre la luz reflejada y la luz incidente. El densitmetro no mide densidades de manera directa; mide la luz reflejada y la compara con la luz incidente.

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Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs de la sustancia. Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la sustancia.

El densitmetro produce un pseudo-cromatograma, que contiene picos con reas que pueden ser medidas.

Espectrofotometra

Fluorescencia Desactivacin de la Fluorescencia

Aplicaciones generales: Determinar el grado de pureza de un compuesto Comparar muestras Realizar el seguimiento de una reaccin Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna.

TAREA 2. Buscar ejemplos de aplicaciones particulares de cromatografa en papel y en capa fina.