MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

MANUAL DE PRCTICAS

BIOQUIMICA

1 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA Practica no. 1 SOLUBILIDAD DE CARBOHIDRATOS FUNDAMENTO: Loa carbohidratos son en general mas solubles en agua y solventes inorganicos y menos solubles o insolubles en solventes inorganicos. REACTIVOS: -Agua destilada -HCl 5% -NaOH 5% -Etanol -Cloroformo -Carbohidratos Glucosa Fructosa Xilosa TECNICA: Colocar aproximadamente 15 mg de cada uno de los carbohidratos en tubos etiquetados y examine su solubilidad en agua, alcali diluido, acido diluido, etanol y cloroformo aadiendo 2ml de solvente. RESULTADOS: OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS 1.- PRUEA DE BIAL PARA PENTOSAS. FUNDAMENTO: Cuando se calienta pentosas con HCl concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol (3,5-dihidroxitolueno), en presencia de iones ferricos para dar un complejo coloreado. GENERALIDADES: -Explique que es un monosacrido, oligosacarido y un polisacarido. -Clasificacion de los monosacridos en base al numero de atomos de carbono que poseen _Escriba las formulas de una triosa, una terrosa, una pentosa y una hexosa. 2 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

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REACTIVOS: 1.- Reactivo de Bial. Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml. De HCl concentrado. Agregar a esta solucion 20 gotas de FeCl3. Guardar en frasco ambar. 2.- Solucion de carbohidratos: Glucosa: 1g/100ml Xilosa: 1g/100ml TECNICA: 1.- Rotular los tubos de ensaye de 15 x 150 con el nombre del carbohidrato a probar y el nombre de la prueba (Bial). 2.- Pipetear 1ml de la muestra (sol. de carbohidrato) al tubo de ensaye correspondiente, y 2.5 ml de reactivo de Bial. 3.- Colocar en bao de agua hirviente hasta la aparicion de color, y sacar inmediatamente. RESULTADOS: OBSERVACIONES: PRUEBA DE SELIWANOFF FUNMDAMENTO: Las cetosas se deshidratan mas rapidamente que las aldosas dando derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un compuesto coloreado, por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaria la deshidratacin de las aldosas. GENERALIDADES: -Explique que es una aldosa y una cetosa -Escriba la formula de Fisher y de Haworth de una aldosa y una cetosa con nombres. REACTIVOS: 1.- Reactivop de Seliwanoff. Disolver 0.7 g de resorcinol en 100 ml de HCl concentrado. Agregar agitando 100 ml de agua destilada. Guardar en frasco ambar. 2.- Solucion de fructosa y glucosa 1g/100ml cada uno. TECNICA: 1.- Rotular los tubos de endsaye con el nombre del carbohidrato y el nombre de la prueba (Seliwanoff). 2.- Pipetear 2 ml del reactivo de Seliwanoff a cada tubo y aadir 2 gotas del carbohidrato al tubo de ensaye correspondiente. Calentar en un bao de agua hirviente hasta la aparicion de color. 3 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA RESULTADOS: OBSERVACIONES: PRUEBA DE YODO FUNDAMENTO: El yodo forma complejos coloreados de absorcin con los polisacaridos. GENERALIDADES: -Enlace glucosidico , como se forma, estructura quimica de uno. -Describa la estructura quimica de sacarosa, almidon, y glucogeno. REACTIVOS: 1.- Solucion de yodo (mezclar 2 g de KI y 1 g de yodo , disolver esta mezcla en agua destilada, completar a 100 ml). 2.- Solucion de almidon 1g/100ml sacarosa 1g/100ml glucosa 1g/100ml TECNICA: Colocar en una capsula de porcelana 3 gpotas de solucionn problema y 3 gotas de yodo, observe los colores.

RESULTADOS: OBSERVACIONES: Practica no. 2. IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS II. REACCIN DE TOLLENS. FUNDAMENTO: LA PRUEBA DE T0LLENS ES UNA REACCIN CARACTERSTICA PARA AZUCARES REDUCTORES DANDONOS COMPUESTOS COLOREADOS (NEGROS) CUANDOSE TRATE DE ELLOS. REACTIVOS: GLUCOSA 2% ARABNOSA 2% 4 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA MALT-OSA 2% SACAROSA 2% ALMIDON. REACTIVO DE TOLLENS: MEZCLAR 10 mL DE HC1 CONCENTRADO CON 2 Ml DE FLOROGLUCNOL AL 2% Y LLEVAR CON AGUA DESTILADA HASTA 18 ml. TCNICA: 1.- COLOCAR EN EL TUBO DE ENSAYO CORRESPONDIENTE 0.5MLDE LAS SOLUCIONES A PROBAR (GLUCOSA, ARABINOSA, MALTOSA, SACAROSA, ALMIDON 2.- AGREGAR 1 ML DE REACTIVO DE TQLLENS Y MEZCLAR. 3.- CALENTAR EN UN BAO DE AGUA HIRVIENTE POR 3 A 4MIN. 4.- UN COLOR OSCURO ES UNA PRUEBA POSITIVA. RESULTADOS:

OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: FUNDAMENTO: LA REACCIN DE FEHLING ESTA BASADA EN LA ACCIN REDUCTORA QUE TIENEN LOS AZUCARES SOBRE LOS IONES CPRICOS EN MEDIO ALCALINO REACTIVOS: GLUCOSA 2% ARABINOSA2% MALTOSA 2% SACAROSA 2% FRUCTOSA 2/o ALMIDN 2% AGUA DESTILADA. REACTIVO DE FEHLING: SOLUCIN A: PESAR 34.65 g DE SULFATO DE COBREY DISOLVER EN 300 ml DE AGUA DESTILADA, LLEVAR A 500 ml CON AGUA Y CONSERVAR EN FRASCO CON TAPN DE HULE.

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MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA SOLUCIN B.- PESAR 125 g D KOH Y 173 g DE TARTRATO DE SODO Y POTASIO, Y LLEVAR CON AGUA DESTILADA A 500 ML, CONSERVAR EN FRASCO REVESTIDO DE PARAFINA Y CON TAPN DE HULE. TCNICA: PREPARACIN DEL TESTIGO: 1.- COLOCAR EN UN TUBO DE ENSAYE 2 ml DE AGUA DESTILADA 2.- AGREGAR 0.5 ml DE FEHLING A Y 0.5 ml DE FEHLING B Y MEZCLAR. 3.- CALENTAR EN BAO MARA A EBULLICIN DURANTE 5 MIN. 4.- NO DEBE PRODUCIRSE UN PRECIPITADO ROJO LADRILLO PREPARACIN DE LOS PROBLEMAS: 1.- COLOCAR EN EL TUBO CORRESPONDIENTE 1ml DE LAS SOLUCIONES A PROBAR (GLUCOSA, ARABINOSA, MALTOSA, SACAROSA, FRUCTOSA Y ALMIDN) 2.- AGREGAR 0.5 ml DE FEHLING A Y 0.5 ML DE FEHLING B Y MEZCLAR 3.- CALENTAR EN BAO MARA EN EBULLICIN DURANTE 5 MIN. 4.- UN PRECIPITADO ROJO LADRILLO SERA UNA PRUEBA POSITIVA. RESULTADO: OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES: REACCION DE LA ANTRONA. FUNDAMENTO: LOS ACIDOS CONCENTRADOS ORIGINAN UNA DESIDRATACION DE LOS MONOSACARIDOS PARA RENDIR FURFURALES QUE SON DERIVADOS ALDEHIDICOS DEL FURANO, POR EJEMPLO: LA DGLUCOSA CON ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (HCl) PRODUCE 5 HIDROXI METIL FURFURAL. ESTOS PRODUCTOS SE COMBINAN LUEGO CON ANTRONA PARA DAR UN COMPLEJO COLOREADO.

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REACTIVOS: 1.- SOLUCION DE ANTRONA 2 GR/LT EN HCl CONCENTRADO. 2.- SOLUCION DE GLUCOSA 1 GR/100 ML 3.- FRUCTOSA 1 GR/1OO ML. TECNICA: 1.- APROXIMADAMENTE A 2 ML DE ANTRONA AGREGUE 5 GOTAS DE LA SOLUCION PROBLEMA, MEZCLAR FUERTEMENTE Y OBSERVAR EL CAMBIO DE COLOR. RESULTADO:

OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: PRACTICA NO. 3. REACCIN DE BENEDICT PARA AZUCARES REDUCTORES Fundamento: Esta prueba se basa en la reaccin de reduccin del cobre de Benedict. La glucosa y otras sustancias reductoras reducen los iones cpricos a iones cuprosos y forman un oxido cuproso rojo. El color azul de Cu++ es negativo para sustancias reductoras. Generalidades: Escriba las frmulas de la glucosa, la sacarosa y un segmento del almidn (en forma de alfa amilasa). Reaccin de Fehling. Consiste en: 1 ml de la solucin problema (Hidrolizado) + 0.5 ml de Fehling A + 0.5 ml de Fehling B 7 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA Calentar 5 minutos en bao de agua hirviente Reactivos: 1. 2. 3. 4. Reactivo de Benedict solucin de almidn 2% solucin de sacarosa 2% Solucin de glucosa a diferentes concentraciones indentificadas como: Glucosa 1, 2,3 y 4.

Tcnica: Pipetee 0.5ml de la solucin problema en un tubo de ensayo de 15 x 150 y agregue 1 ml de reactivo de Benedict, mezclar y colocar en un bao de agua hirviendo por 3 min. Auxliese de la tabla siguiente para determinar la cantidad aproximada de glucosa presente en las soluciones de glucosa 1, 2,3 y 4. color Azul Azul verdoso Verde oliva Azul caf Rojo ladrillo Concentracin aprox. de glucosa (g/100ml) 0 g/100ml (Negativa) 0.3 g/100ml 1.0 g/100 ml 1.5 g/100 ml 2.0 g/100 ml o ms

Hidrlisis de la Sacarosa 5 ml de sacarosa 2% + 6 gotas de HCl concentrado Mezclar y calentar 5 minutos en agua hirviente Enfriar Agregar 15 gotas de NaOH 5% para neutralizar Efectuar una prueba de Fehling al hidrolizado Reaccin de Fehling 1 ml de la solucin problema (Hidrolizado) 8 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA + 0.5 ml de Fehling A + 0.5 ml de Fehling B Calentar 5 minutos en bao de agua hirviente Resultados y Observaciones: Conclusiones: PRACTICA NO. 4 FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS (Sacharomyces cereviceae) FUNDAMENTO: La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras. REACTIVOS: Solucin de glucosa (1 g en 100 ml) Reactivo de benedict. Levadura de panadero seca activa. TCNICA: 1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. Pipetee 10 ml de la solucin de glucosa y aada 0.3 g (la punta de una esptula) de levadura. Mezcle perfectamente hasta que la mezcla sea homognea. Incube a 37 grados. Realice una prueba de Benedict a esa mezcla a los 30 min., y a la hora y media de incubacin. 2.- Para verificar que la solucin de glucosa es un azcar reductor, realice una prueba de Benedict a la solucin de glucosa. 3.- Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningn azcar reductor realice un blanco de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una esptula) de levadura con 10 ml. De agua destilada. Efecte una prueba de Benedict tomando 0.5 mi de esta solucin de levadura. Nota: La prueba de Benedict se efecta de la sig. Manera: Pipetear 0.5 ml. de la solucin problema en un tubo de 15 X 150 Aadir 1 ml. de Reactivo de Benedict. Calentar en bao de agua hirviente durante 3 min. INTERPRETACION:

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MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA 1. Muestra no fermentada: reaccin de Benedict positiva (rojo ladrillo) 2. Muestra fermentada: reaccin de Benedict negativa (azul). RESULTADOS Y OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: PRACTICA NO. 5. DETERMINACIN DE GLUCOSA DEL SUERO POR EL METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA. ANTECEDENTES: La determinacin de la glucosa en fluidos biolgicos asido bien documentadas. La prueba de glucosa pude ser diagnostica mente significativa en diabetes e hipoglucemia. FUNDAMENTO: La glucosa es oxidad por la glucosa oxidasa a cido gluconico hiperoxido de hidrogeno en presencia de peroxidasa reacciona con el hidroxibenzoato y 4aminoantipirina (PAP) para producir un cromgeno de Quinoneimina rojo con un mximo de absorbancia a 505 nm. GLUCOSA OXIDASA B-D-Glucosa + o2 + H2O cido D-gluconico +H2 O 2 Peroxidasa H2O2 + Hidroxibenzoato + 4-Aminoantipirina Cromgeno Quinoneimina Rojo +H 2 La concentracin de glucosa es directamente proporcionar a la absorbancia del cromgeno de Quinoneimina a 505 nm. MATERIAL: 1 tubo de ensaye de 13/100 1pipeta de 20 microlitros 1 pipeta de 5ml. REACTIVOS: Reactivo de color: Una solucin conteniendo despus de reconstitucin 0.5125 mml. / L de 10 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA 4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa, >1000 U/L peroxidasa (Rbano Picante), buffer y preservativo. Estndar de glucosa Una solucin acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos PRECAUCIONES: No pipetee los reactivos con la boca y evite el contacto con la piel y ojos. RECOLECIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA: La muestra de eleccin de be ser plasma preparado de la sangre colecta con anticoagulante fluorado. Otro plasmas y sueros pueden usarse si separados del paquete globular y ensayados rpidamente. El plasma fluorado para anlisis de glucosa e estable a 2-8 C por 5 das. PROCEDIMIENTOS: 1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa 2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estndar o del suero a ensayar 3.-aada 2 ml. De reactivo y mezcla. 4.- incube por 10 minutos a 37C, y determine la absorbancia del estndar (A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo.

CALCULOS Y RESULTADOS La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros Glucosa mg/Dl= A X concentracin del estndar A s A= absorbancia del problema As = absorbancia del estndar ESTANDAR = 90mg. /dL ( ) X (90 ) = ( VALORES ESPERADOS 70-105mg. / dL Estos valores son sugeridos. Se recomienda que cada laboratorio establezca el rango para el rea en que esta localizado. 11 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/ )

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA OBSERVACIONES: RESULTADOS: Absorbancia estndar de la glucosa: A= 0.310 B= 0.315 Abs. Problema Abs. Estndar .323 .312 X 90 = X 90 83 mg/dl = mg/dl

RESULTADOS: CONCLUCIN: PRACTICA NO. 6. CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA. FUNDAMENTO: CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA. Son pruebas que miden la capacidad para metabolizar la glucosa. Las personas que padecen de diabetes mellitus tienen altos niveles de glucosa en la sangre y las pruebas de tolerancia a la glucosa son una de las herramientas para diagnosticarla. Este examen tambin se realiza para diagnosticar diabetes mellitus en estudios investigativos que involucren a los diabticos y en casos en los que se sospeche la presencia de esta enfermedad, a pesar de haber realizado un examen en ayunas de glucosa en sangre, con resultados normales, as como para el diagnstico de hiperinsulinismo (elevacin de los niveles de insulina). Los mtodos ms utilizados ms comnmente para evaluar la tolerancia a una sobrecarga de glucosa pueden ser: 1. Pruebas de tolerancia utilizando una dosis nica oral de glucosa. 2. Pruebas de tolerancia con una dosis intravenosa de glucosa. 12 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

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La prueba ms comn de tolerancia a la glucosa es la oral. Despus de una noche de ayuno, el paciente ingiere una solucin que contiene una cantidad conocida de glucosa. Se toma una muestra de sangre basal, antes de que el paciente ingiera la solucin de glucosa y de nuevo cada 30 minutos despus hasta por 2 3 horas, segn la solicitud del mdico, para la determinacin de glicemia. Adems, el paciente no puede comer durante el examen y se recomienda informar al mdico acerca del uso de medicamentos que pueden afectar los resultados del examen. Con frecuencia se solicita la medicin de los niveles de insulina (hormona producida por el pncreas que permite introducir la glucosa desde la sangre hasta la cada una de las clulas del cuerpo). Cuando se suministra la glucosa por boca, la absorcin desde el tracto gastrointestinal hacia la sangre contina durante un lapso variable, que depende de la cantidad de glucosa suministrada. La mxima absorcin de glucosa se estima en 0,8 g/kg de peso por hora. La tolerancia a la glucosa suministrada por va oral, mide el balance entre la velocidad de pasaje de la glucosa al fluido extracelular y su separacin por la asimilacin celular y la excrecin urinaria, si la hubiere. Por tanto, la prueba puede influirse no slo por aquellos factores vinculados con la utilizacin de la glucosa, sino tambin por los que influyen en su absorcin. Las pruebas intravenosas de tolerancia a la glucosa son poco comunes. Para realizar este tipo de prueba, al paciente se le inyecta por va venosa una cantidad conocida de glucosa durante tres minutos, previa la medicin de los niveles de insulina en la sangre en el minuto uno y en el tres. INTERPRETACIN En condiciones normales la sangre en ayunas debe tener un nivel de glucosa inferior a 100 mg/dl. Los valores sanguneos normales son: Ayunas: 60 a 100 mg/dl 1 hora: menos de 200 mg/dl 2 horas: menos de 140 mg/dl. Entre 140 y 199 se considera que existe intolerancia a la glucosa y es un grupo que tiene mayor riesgo de desarrollar diabetes. Los niveles por encima de 200 mg/dl indican un diagnstico de diabetes.

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MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA Los criterios utilizados para definir la condicin de anormalidad de una curva de tolerancia ,se basan en el nivel o pico elevado alcanzado por la concentracin sangunea y la falta de retorno al nivel normal, 2 horas despus de la ingestin de glucosa, siendo este ltimo el ms importante. Un valor hipoglucmico (bajo de glicemia) de 3 a 5 horas despus de la ingestin de la glucosa se observ en ciertos pacientes cuya curva de tolerancia era de tipo diabtico, interpretndose un hiperinsulinismo, tpico del estado diabtico.

DIBUJOS: CALCULOS Y RESULTADOS: CONCLUSIONES: PRACTICA NO. 7. DETERMINACIN DE GLUCOSA SERIADA. ANTECEDENTES: La determinacin de la glucosa en fluidos biolgicos asido bien documentadas. La prueba de glucosa pude ser diagnostica mente significativa en diabetes e hipoglucemia. MATERIAL: 4 tubo de ensaye de 13/100 1pipeta de 20 microlitros 1 pipeta de 5ml. REACTIVOS: Reactivo de color: Una solucin conteniendo despus de reconstitucin 0.5125 mml. / L de 4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa, >1000 U/L peroxidasa (Rbano Picante), buffer y preservativo. Estndar de glucosa Una solucin acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos PROCEDIMIENTOS: 1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa 2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estndar o del suero a ensayar 3.-aada 2 ml. De reactivo y mezcla. 4.- incube por 10 minutos a 37C, y determine la absorbancia del estndar (A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo. CALCULOS Y RESULTADOS 14 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros Glucosa mg/Dl= A X concentracin del estndar A s A= absorbancia del problema As = absorbancia del estndar ESTANDAR = 90mg. /dL ( ) X (90 ) = ( VALORES ESPERADOS 70-105mg. / dL RESULTADOS Y OBSERVACIONES: CONCLUCIN: PRACTICA NO.8. Determinacin de protenas totales. Historia del Mtodo La reaccin de color de las molculas de protenas con iones cpricos, es conocida como la reaccin de color de Biuret, y es conocida desde 1878, desde las publicaciones de Riegler en 1914 se han hecho varios intentos para estabilizar los iones cpricos en ractivos alcalino. Kingsley modific el procedimiento en 1939 y en 1942 para incluir el uso de sodio como agente complejo. Este procedimiento fue modificado ms tarde por Weichselbaum y Gornall. El presente mtodo est basado en estas modificaciones. Principio ++ Protena + Cu lcali complejo de color )

La protena en suero forma un complejo coloreado violeta cuando reacciona con iones cpricos en solucin alcalina, la intensidad del color violeta es proporcional a la cantidad de protena presente cuando se compara contra una solucin de concentracin conocida de protena. Reactivo Hidrxido de sodio 600 mM; sulfato de cobre 12mM. Tartrato de sodio potasio 32 Mm; Yoduro de potasio 30Mm; ingredientes no reactivos. El reactivo esta listo para su uso El reactivo se guarda a temperatura ambiente 15 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA El reactivo debe ser una solucin azul plido. La presencia de turbidez o de un precipitado negro indica deterioro del reactivo y no debe ser usado. Material Reactivo de protena total Pipetas automatizadas Cronmetro Tubos de ensaye Espectrofotmetro

Procedimiento (Manual) Etiquetar los tubos para blanco, estndar, paciente, etc. Pipetee 1.0 ml del reactivo de trabajo a cada tubo. Aadir 20 Ul de la muestra a los tubos respectivos, mezclar por inversin, Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Ajustar el espectrofotmetro a cero con el blanco a 540 nm. Leer y anotar las absorbancias de todos los tubos. Calibracin Use estndar acuoso de protena (8g/dL) o suero calibrador. Se debe calibrar de acuerdo a las instrucciones de calibracin del instrumento. Si el resultado de los controles se encuentra en el rango, la prueba debe ser recalibrada. Clculos Abs = Absorbancia Abs (Paciente) -------------------Abs (Estndar)

* concentracin del estndar = concentracin de protena g/dl. g/dL

Valores esperados 6.2 8.5 g/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. RESULTADOS Y OBSERVACIONES: 16 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

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CONCLUCIN:

PRACTICA NO. 9. PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINA OBJETIVO Cuantificacin de las protenas totales y albmina en el suero. FUNDAMENTO Proteina: La protena presente en la muestra reacciona con los iones cobre (II) en medio alcalino, originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra. Albumina: La determinacin colorimetrica de albumina humana en suero se realiza en un medio amortiguado, lo cual permite su union por puentes de hidrogeno a colorantes o indicadores como el verde de bromocresol, tiene la propiedad de enlazarse especficamente con la albmina produciendo un cambio de color de intensidad proporcional a su concentracin. GENERALIDADES Las protenas sricas estn separadas aproximadamente en albminas y globulinas; en otras palabras, la protena total = albmina + globulina. La albmina es la protena de mayor concentracin en el suero que sirve para trasportar muchas molculas pequeas, pero tambin juega un papel decisivo en el mantenimiento de la presin onctica de la sangre, es decir, impedir que el lquido se filtre a los tejidos. Las globulinas se dividen a grandes rasgos en globulinas alfa-1, alfa-2, beta y gammaglobulinas, las cuales se pueden separar y cuantificar en el laboratorio mediante la electroforesis y la densitometra. La fraccin alfa-1 incluye la alfa-1 antitripsina (ver Alpha-1 antitripsina ) y la globulina fijadora de tiroxina (ver T3, T4, RT3U ). La fraccin alfa-2 contiene la haptoglobina, ceruloplasmina, HDL y alfa-2 macroglobulina. En general, los niveles de protenas alfa-1 y alfa-2 aumentan en presencia de inflamacin. La fraccin beta incluye la transferrina (ver hierro srico ), el plasmingeno (ver anlisis del factor VIII ) y las beta lipoprotenas (ver LDL). La fraccin gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (inmunoglobulinas M, G y A). 17 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA Valores Normales

Protena total: 6,4 a 8,3 g/dl Albumina: 3-5 gr / 100ml

METODOLOGIA: BIURET VERDE DE BROMOCRESOL REACTIVOS Verde de bromocresol (BCG) 0.15 g/L. Buffer pH 4.56- 4.76; Surfactante, ingredientes no reactivos y estabilizadores. Reactivo de proteinas (biuret) Patron para proteinas totales. Patron para albumina. El reactivo esta listo para usarse El reactivo es estable a la fecha de caducidad, guardado a temperatura ambiente. El reactivo debe ser una solucin verde-amarilla, clara. Si presentan turbidez o precipitado el reactivo es insatisfactorio y debe ser descartado. PRECAUCIONES: Los reactivos causan irritacion. Evite el contacto con piel, ojos y ropa. En caso de contacto, lavese con abundante agua. CONSERVACIN Almacenados a temperatura ambiente, los reactivos son estables hasta su fecha de caducidad. INSTRUMENTOS Use un espectrofotometro o fotocolorimetro calibrado a 540 y 630nm y un bao capaz de mantener la temperatura a 37C. MUESTRA Suero unicamente MATERIAL Pipetas automatizadas Tubos de ensayo Cronometr Espectrofotmetro para leer a 630 nm

PROCEDIMIENTO 18 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA Protenas: 1.- Pipetear en tubos de ensaye: Reactivo proteinas Suero patron BLANCO de 2.5ml ESTANDAR 2.5ml 0.05ml 0.05ml MUESTRA 2.5ml

2.- Agitar bien y dejar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3.- Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la muestras frente al Blanco a 540 nm. El color es estable durante al menos 2 horas. Albmina Etiquete los tubos para blanco, control, estndar, paciente, etc. Pipetee 1.0 mL del reactivo de trabajo en cada tubo. Aada 10L de la muestra a los tubos respectivos y mezclar. Incube por un minuto. Ajuste el espectrofotmetro a cero con el blanco a 630 nm. Lea y anote las absorbancia de todos los tubos. BLANCO ESTANDAR MUESTRA Reactivo de 2.5ml 2.5ml 2.5ml albumina Suero patron Suero problema OBSERVACIONES Y RESULTADOS: CONCLUCIN: Cuestionario. 1.- Cul es la protena plasmtica ms abundante? 2.- donde es sintetizada la albmina? 3.- Cuntas cadenas polipetida y cuantos aminoacidos constituyen la albmina? 19 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/ 0.01ml 0.01ml

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA 4.- funciones de la albmina? 5.- Qu se produce cuando la concentracin de albmina disminuye en sangre de manera importante disminuyendo la presin osmtica con la consecuente extravasacin del H2O? 6.- Qu entiende por hipoalbuminemia? 7.- diga 2 patologas que produzcan hipoalbuminemia? 8.- Qu entiende por hiperalbuminemia? 9.- diga un estado patolgico en el que se presenta hiperalbuminemia? PRACTICA NO. 10. TRIGLICERIDOS GPO (LIQUIDO) PRINCIPIO: Trigliceridos Glicerol + ATP lipasa GK glicerol + acidos grasos gliceroL-1-fosfato + ADP GPO DAP + H2O2

GliceroL-1-fosfato + O2

H2O2 + 4-AA + 4-clorofenol POD quinoneimina + HCl + 2 H2O Los trigliceridos en suero son hidrolizados a glicerol y cidos grasos libres por accin de la lipasa. En presencia de ATP y glicerol cinasa (GK) el glicerol se convierte a glicerol-1-fosfato. El glicerol-1-fosfato es despues oxidado por la enzima glicerol-fosfato oxidasa (GPO) para obtener peroxido de hidrogeno. La condensacion del peroxido con 4-clorofenol y 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa (POD) produce una quinineimina de color rojo seco el cual se absorbe a o cerca de 500 nm. La intensidad del complejo coloreado formado es directamente proporcional a la cantidad de trigliceridos en la muestra. REACTIVOS: Buffer de Good (pH 7.3-7.5) 50 mM, 4-clorofenol, ATP 0.5 mM, sal de magnesio 12 mM, 4-aminofenazona 0.3 mM, glicerol cinasa (microbial) > 250 U/L, glicerolfosfato oxidasa (microbial) > 200,000 U/L, surfactantes, estabilizadores y preservativos, incluido azida de sodio (0.1 %). MATERIAL: 20 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA Reactivo de trigliceridos GPO Pipetas automatizadas Tubos de ensayo Cronometro Bloque termico Espectrofotometro capaz de leer a 500 nm Estandar o calibrador de trigliceridos

PROCEDIMIENTO MANUAL: 1. Identificar los tubos: blanco, estandar control, etc. 2. Pipetear 1 mL de reactivo en cada tubo. 3. Agregar 10 uL de suero a sus respectivos tubos. Mezclar suavemente. 4. Incubar todos los tubos por 5 minutos. 5. Ajustar el espectrofotometro a 0 con el blanco (500-520 nm) 6. Leer y anotar absorbancias. El color final es estable por 60 minutos. VALORES ESPERADOS: 44-148 mg/dL. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CALCULOS: NOTA.- Los trigliceridos se expresan en mg/dL o mmol/L mg/dL= Abs. (desconocido)/ Abs. (estandar) x concentracion std trigliceridos mg/dL. Para convertir el valor a mmol/L, se debe multiplicar el resultado por 0.0113. OBSERVACIONES Y RESULTADOS: CONCLUCIN: PRACTICA NO. 11. COLESTEROL PRINCIPIO. col. esterasa steres de colesterol. Col. oxidasa Colesterol + H2O colesterol 3-one + H2O2 colesterol + ac. Grasos

21 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA H2O2 + 4-AAP + fenol POD quinoneimina + 4H2O

La intensidad de color rojo es directamente proporcional al colesterol total en la muestra cuando se lee a 500 nm. REACTIVOS 4-AAP. 3 mM: colesterol estearasa - 150 u/l ; colesterol oxidasa 150U/l: fenol 15 mM; buffer fosfato pH 6.8; estabilizadores no reactivos y preservativos. El reactivo esta listo para usarse. No se debe utilizarse si esta turbio. INTERFERENCIA Algunas drogas y sustancia pueden afectar la determinacin de colesterol. Material Reactivo de colesterol Pipetas automatizadas Tubo de ensayo Cronometro Bloque trmico Espectrofotmetro capaz de leer a 500 nm. PROCEDIMIENTO (MANUAL) 1. identificar los tubos: blanco, estndar. Control, etc. 2. pipetear 1 ml de reactivo en cada tubo. Precalentar a 37C por lo menos por 5 min. 3. agregar 10 UL de suero a sus respectivos tubos. 4. incubar los tubos por 5 min. 5. ajustar el espectrofotmetro a 500 nm. 6. leer y anotar la absorbancia. VALORES OBSERVADOS Colesterol deseable 200 mg/dl Colesterol alto 240mg/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CALCULOS ABS= ABSORVANCIA Mg / dl = abs. (Desconocido) Abs. (Estndar) 22 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/ * Concentracin de colesterol mg/ dl

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA

OBSERVACIONES Y RESULTADOS: CONCLUCIN:

23 FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/