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Manual de practicas de laboratorio

Manual de practicas de laboratorio

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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

BIOQUIMICA
MANUA L DE PRACTI CAS DE LA BOR ATORIO .
FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 1

CONTENIDO:
• DETERMINACION DE Magnesio • DETERMINACION DE CALCIO TOTAL • DETERMINACIÒN CUANTITATIVA DE FÒSFORO

DETERMINACIÓN DE SODIO Y CLORUROS EN SUERO (TÉCNICA DEL IÓN SELECTIVO)

• ESTUDIO DE LÍQUIDO CEFALORAQUÍDEO • DETERMINACIONES HORMONALES

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PRACTICA NO. 1

Magnesio
FUNDAMENTO: Los iones magnesio reaccionan en medio alcalino con el colorante metalocromo calmadita, para formar un cromóforo, el cual absorbe luz a 520 nm. El calcio es excluido de la reacción al formar un complejo con EGTA. ANTECEDENTES Las determinaciones de magnesio son clínicamente importantes. El magnesio, al igual que el potasio, es el catión intracelular más abundante. El magnesio es una coenzima requerida en el metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteínas. Una disminución en los niveles de magnesio en el organismo, hipomagnesemia, puede causar temblores, irritabilidad muscular y aumento de la presión sanguínea y de la frecuencia cardiaca. Los niveles elevados de magnesio, hipermagnesemia, pueden causar problemas respiratorios, coma y paro cardiaco si dichos niveles no se corrigen. El método de elección para la determinación de magnesio es la espectrofotometría de absorción atómica. Este método no es práctico para los laboratorios clínicos, de manera que en su lugar se utilizan métodos de fijación con un colorante que emplean azul de metiltimol, amarillo de titanio, calmagita y azul de xilidilo-1. Este método emplea azul de xilidilo-1 el cual permite el uso de un solo reactivo de manera rápida y precisa. El Magnesio es el quinto mineral para su abundancia en el organismo y el segundo catión celular. El cuerpo contiene un total de 24 gramos; el 60% se localiza en el esqueleto y el 405 restante en los tejidos blandos. La deficiencia se ve en alcohólicos, pacientes afectos de cirrosis hepática, tras tratamiento diurético y en enfermedades renal. Los síntomas son: - Debilidad muscular - Déficit de Calcio secundario - Confusión, alucinaciones, convulsiones y otro síntomas neurológicos. El exceso de Magnesio es extremadamente raro. Funciones - Estructural, en huesos y dientes. FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 3

- Cofactor de más de 300 enzimas del organismo, las que catalizan las reacciones ATP- dependientes. El Magnesio se liga al ATP, formando un complejo Magnesio- ATP que es el sustrato de enzimas tales como las cinasas. - Interacciona con el Calcio para afectar a la permeabilidad de las membranas excitables y la transmisión neuromuscular. Alimentos fuentes Cereales integrales, frutas secas, lácteos, chocolate, verduras de hoja verdes, pan, soya y banana. Valores normales Los valores normales en adultos miliequivalentes (mEq) por litro. promedio es de 1.25 a 2.5

ESTABILIDAD: Estos reactivos son estables a temperatura ambiente (< 25 ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Se recomienda no exponer a temperaturas elevadas durante tiempos prolongados. OBSERVACIONES: * Todo el material a usar debe estar escrupulosa- mente limpio, utilizando detergentes no iónicos, soluciones de acido clorhídrico al 25 % y agua destilada. * Se recomienda el uso de micropipetas con constricción, a los fines de obtener una mejor reproducibilidad. * Se recomienda separar pipetas y tubos de fotocolorímetro para uso exclusivo de esta determinación. * No deben utilizarse anticoagulantes precipiten el magnesio (EDTA, oxalato). que complejen o

MUESTRA: Suero, plasma heparinizado, orina o LCR. No debe utilizarse plasma preparado utilizando anticoagulantes como EDTA, citrato u oxalato. La orina de 24 horas podrie contener sedimentos que absorben magnesio. Añadir unas gotas de acido clorhidrico concentrado hasta alcanzar un pH entre 3-4 para disolver el sedimento. Diluir la orina 1+4 con agua bidestilada y multiplicar el resultado por 5. REACTIVOS: FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 4

COMPONENTES CONECTRACIONES 1.- Reactivo de color Calmagite 0.2 mmol/L EGTA Dimetilsulfóxido 2.- Tampon Tampon Dietanolamina 1mol/L, pH 12.50 Surfractantes 3.- Patron Magnesio 1.0mmol/L (2.43mg/dl) PREPARACION DE LAS SOLUCIONES: 1.- REACTIVO DE COLOR Listo para usar. Estable hasta conserva entre +15 y +25°C. 2.- TAMPON Listo para usar. Estable hasta conserva entre +15 y +25°C. 3.- PATRON Listo para usar. Estable hasta conserva entre +15 y +25°C. la fecha de caducidad cuando se

la

fecha

de

caducidad

cuando

se

la

fecha

de

caducidad

cuando

se

REACTIVO DE TRABAJO Mezclar volúmenes iguales de reactivo de color 1 y de tampón 2. Usar inmediatamente. PROCEDIMIENTO: Longitud de onda: 520 nm; 546 nm Cubeta: 1 cm de espesor Temperatura: 20-25°C Medición: frente al aire

Pipetear en las cubetas: Reactivo Blanco 1.0 ml Patron 1.0 ml Muestra 1.0 ml 5

React. de

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trabajo Agua destilada Patron Muestra

10 ul 10 ul 10 ul

Mezclar, incubar durante 3 min a temperatura ambiente, leer la absorbancia del patron (Apatron) y de la muestra (Amuestra) frente al reactivo blanco, antes de 30 minutos. CALCULOS:

Concentración de magnesio (mmol/L) =

(Amuestra) (Apatron) x 1.0
(Amuestra) (Apatron)

Concentración de magnesio (mg/dl) VALORES NORMALES: ADULTOS SUERO/PLASMA (1.70-2.70mg/dl) CSF (2.40-3.10 mg/dl) ORINA (50-200 mg/24hrs)

=

x 2.43

0.7-1.1

mmol/l

0.98-1.27 mmol/l 2.1-8.22 mmol24 hrs

RESULTADOS: .063 Concentración de magnesio(mg/dl) =.040 x 2.43 =1.542 mg/dl

ESQUEMAS:

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CONCLUSIONES: Concluyo que el magnesio es el cuarto catión más abundante en el líquido extracelular y el segundo en el intracelular. El 20% del magnesio sérico esta unido a proteínas, su absorción se hace fundamentalmente en yeyuno e íleon, y el balance diario se hace a través de los riñones ya que por vía fecal se elimina el 1 a 2%. Se ha observado un aparente umbral renal para la excresión de magnesio para valores séricos cercanos a los normales, por lo que una pequeña modificación de los niveles séricos, alterará rápidamente la excresión de magnesio. En la práctica clínica la deficiencia de magnesio es más común que el exceso y puede deberse a distintas causas tales como: cetoacidosis diabética, alteraciones intestinales, hiperparatiroidismo, alcholismo, enfermedades renales. Bibliografía: Nutrar prevención y salud plena. Minerales. http://www.nutrar.com/detalle.asp?ID=146 12/01/08 Magnesio.

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PRACTICA 2 DETERMINACION DE CALCIO TOTAL INTRODUCCION Más del 99 % del calcio corporal existe en los huesos y en la dentadura. El 1 % restantes esta presente en la sangre y en el tejido conjuntivo y sirve como cofactor en la coagulación sanguínea, en metabolismo y fisiología neuromuscular. El calcio en el suero esta presente en tres formas diferentes: 1. 45% unido a proteínas 2. 5% en forma no iónica 3. 50% en forma ionizada. La ionizada es la fracción fisiológicamente importante en términos de función biológica. activa y la mas

Son muchos de los factores que influyen al nivel del calcio: hipercalcemia (nivel elevado de calcio) que se observa en hiperparotiroidismo, hipervitaminosis, sarcoidosis, mieloma y en ciertos canceres oseos. La hipocalcemia (bajos niveles de calcio) se encuentra en hipoparatiroidismo, raquitismo, nefrosis, nefritis, esteatorrea y pancreatitis. Cualquier disminución en el nivel de las proteínas sanguíneas resulta en una disminución del nivel total de calcio en suero. De igual forma cualquier aumento en el nivel de proteínas como el mieloma resulta en un aumento del nivel de calcio. También parece haber una relación reciproca entre el calcio y el fósforo. Los aumentos de fósforo inorgánico en suero están asociados con disminución del calcio en suero. Los primeros procedimientos para la determinación de calcio en suero involucraban precipitación del calcio y determinación subsiguiente del anion del agente precipitado. Más recientemente, los compuestos de calcio han sido determinados con espectrofotometría de absorción atómica, que ha sido recomendado como método de referencia para la determinación de calcio tota. Con el desarrollo de los reactivos quelonios y los indicadores metal cromáticos, la absorción atómica se reemplazo rápidamente por los procedimientos complexo métricos, los cuales pueden medir el calcio directamente en suero. Este macromineral es el mineral con mayor presencia en el organismo y el cuarto componente del cuerpo después del agua, las proteínas y las grasas. El calcio corporal total, se aproxima a los 1200 gramos, lo que es equivalente a decir 1,5 a 2% de nuestro peso corporal. De esto, casi un 99% se concentran en los huesos y dientes el 1% FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 8

restante se distribuye en el torrente intersticiales y las células musculares.

sanguíneo,

los

líquidos

Tanto su carencia como su exceso son perjudiciales para la salud, ya que participa en la coagulación, en la correcta permeabilidad de las membranas y a su vez adquiere fundamental importancia como regulador nervioso y neuromuscular, modulando la contracción muscular (incluida la frecuencia cardíaca), la absorción y secreción intestinal y la liberación de hormonas. Los alimentos con mayor contenido de calcio son los productos lácteos, los frutos secos, las sardinas y las anchoas; ya en menor proporción en legumbres y vegetales verdes oscuros (espinaca, acelga, broccoli). El calcio está vinculado a la presencia de fósforo. La falta o exceso de cualquiera de estos dos macrominerales puede afectar la absorción del otro. A su vez, la absorción del calcio se ve dificultada ante consumos de café, alcohol, falta de Vitamina D, falta de ácido clorhídrico en el estómago, falta de ejercicio y el estrés. Un obvio indicador de carencia de calcio es la osteoporosis. Una de las grandes ventajas que presenta el calcio refiere a su invariabilidad en el tiempo desde el momento en que es envasado hasta el momento de consumo, podemos decir que el contenido de calcio de los alimentos no se altera en ninguna etapa. Funciones: Provee rigidez y fortaleza a huesos, dientes y encías. Ayuda en la regularidad de la frecuencia cardíaca, y en la transmisión de impulsos nerviosos. • Previene enfermedades cardiovasculares, ya que disminuye los niveles de colesterol en sangre. • Previene los calambres en la musculatura corporal, debido a que el músculo utiliza el calcio para realizar sus movimientos y contracciones. • Es fundamental para que la sangre coagule adecuadamente. • Es preventivo ante enfermedades como el cáncer. • Contribuye a reducir la tensión arterial en personas con hipertensión arterial. • Previene la osteoporosis (perdida de masa ósea). • Es activador de diferentes enzimas. • Mantiene la permeabilidad de las membranas celulares. • Es un coadyuvante de la actividad neuromuscular. • Mantiene la piel sana. • Durante el embarazo reduce la incidencia de la preeclampsia (hipertensión gestacional o aumento de la presión arterial con edema y/o protenuria, proteínas en orina, que ocurre después de la 20 semana de gestación). FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 9
• •

Deficiencia de Calcio La ingesta inadecuada, la disminución de la absorción a nivel intestinal como la excreción (en orina) aumentada del calcio conduce a una disminución total del mismo en nuestro organismo. La carencia de calcio está caracterizada por:
• • • • • • • • • • • • •

dolores en las articulaciones hormigueos y calambres musculares un ritmo cardíaco anormal, palpitaciones convulsiones y deterioro cerebral depresión fragilidad en las uñas, uñas quebradizas. alteraciones cutáneas dientes defectuosos aumento del colesterol sanguíneo hipertensión entumecimiento de miembros superiores e inferiores raquitismo osteoporosis

Algunas enfermedades también determinan la falta de calcio en el organismo, como son las alergias, la insuficiencia renal, colitis y diarreas, y trastornos hormonales (mal funcionamiento de la glándula paratiroides). En esos casos puede procederse a la administración de suplementos de calcio, bajo estricta supervisión médica, y su eficacia es mayor cuando los suplementos son tomados en varias tomas a lo largo del día, y antes de acostarse. Las personas que han padecido cálculos renales deberán abstenerse de tomar suplementos.

Factores que favorecen la absorción: o Vitamina D: la forma activa de la vitamina D es determinante en la asimilación de este mineral. Si está presente en las cantidades adecuadas favorece la absorción del calcio. o Bajo consumo de calcio: la cantidad de calcio absorbido por el organismo será menor cuando lo consumimos de una sola vez en grandes cantidades. Es preferible tomarlo en dosis menores durante el día así se favorecerá la absorción. No se recomienda tomar más de 500 mg de calcio de una sola vez. o Bajo nivel sanguíneo de calcio: si el nivel de calcio en sangre baja, se activa una hormona, la paratiroidea que estimula la conversión de la vitamina D en el riñón a su forma activa favoreciendo la absorción intestinal de calcio. o Ejercicio moderado: favorece la asimilación del calcio. o Edad: la absorción del calcio es de alrededor del 60 % en infantes y niños ya que el organismo necesita el calcio para el desarrollo normal de huesos y dientes. 10

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Factores que afectan la absorción de calcio o La correcta absorción del calcio es fundamental ya que existen factores que la favorecen y otros que la impiden. o La absorción de calcio se refiere a la cantidad de calcio que es absorbida desde el tracto digestivo hacia nuestra circulación sanguínea. Factores que impiden la absorción: o Ejercicio vigoroso: dificulta la absorción de calcio o Edad: la absorción de calcio disminuye durante la adultez en un 15-20%. Por ello las recomendaciones diarias aumentan para compensar. o Fósforo (en exceso): Las bebidas gaseosas con alto contenido en fósforo no resultan beneficiosas. Es de gran preocupación hoy en día que más allá que las gaseosas contengan alto contenido en fósforo, la leche sea reemplazada por las mismas ocasionado la carencia de calcio entre los niños y adolescentes. o Magnesio y fósforo (en exceso): la absorción de estos dos minerales también requieren de vitamina D. por ellos si se consumen en exceso, habrá menor cantidad de vitamina D disponible para que el calcio se absorba. o Zinc: consumido en exceso también obstaculiza la correcta absorción de calcio o Alcohol: reduce la absorción intestinal de calcio. Inhibe ciertas enzimas en el hígado que convierten a la vitamina D en su forma activa reduciendo así la absorción. o Cafeína: el café tomado en alta cantidades puede aumentar la excreción de calcio y dismimuir la absorción. Una taza de café causa una pérdida de calcio de 2-3 mg que es fácilmente compensada agregándole 1 cucharada de leche. El consumo moderado de cafeína (1 taza de café o 2 tazas de te por día) tiene muy pocos efectos negativos siempre y cuando la ingesta de calcio sea la adecuada. o Hierro: Si consumimos calcio junto con hierro, ambos compiten en la absorción, así que el efecto de ambos se ve muy reducido. Conviene no mezclarlos. o Proteínas y sodio: a medida que aumentamos la cantidad de sal y proteinas a nuestra dieta, aumenta la cantidad de calcio que se excreta. o Ácido oxálico: presente en almendras, soja, cacao, espinacas y acelgas, se une al calcio de esos alimentos, y forman un compuesto muy difícil de ser absorbido por el intestino. La absorción de calcio de otros alimentos que sean consumidos en la misma comida no se vera afectada. Estos alimentos que contienen ácido oxálico resultan perjudiciales, siempre y cuando su consumo se realice en cantidades elevadas.

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PRINCIPIO: Cálcio + o- cresolftaleina complexona

MEDIO ALCALINO

Cálcio- cresolftaleina complexona (color púrpura) El calcio reacciona con cpc en un medio alcalino para tomar un color púrpura que absorbe a 570nm (550 – 580nm). la intensidad del color es proporcional a la concentración del calcio. para evitar la interferencia de otros iones metálicos se agregan estabilizadores e intensificadores de color. REACTIVOS: 1. reactivo colorimetrico: o- cresoftalema complexona 0.14mm, 8 – hidroxiquinolona 13.0mm. 2. buffer de calcio diaetilamina 0.63mm cianuro de potasio 2.0 mm , ingredientes no reactivos y estabilizadores. 3. estandar de calcio: carbonato de calcio en acido clorhidrico diluido (10mg/dl). PRECAUCIONES: 1. este reactivo es para diagnostico “in vitro” unicamente. 2. reactivo (a y b) son irritantes para la piel. evite el contacto. 3. el reactivo (b) contiene veneno y no debe ser pipeteado con la boca. PREPARACION DEL REACTIVO: 1. combine volumenes iguales del reactivo a y b mezcle y deje reposra por 10 min. a temperatura ambiente. 2. los reactivos se deben combinar en recipientes plasticos limpios. el agua y los recipientes de vidrio contienen calcio, reaccionan con el reactivo. el equipo de vidrio se enjuagar en acido clorhidrico diluido antes de usarse. ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO: 1. todos los reactivos se deben almacenar refrigerados 2-8 ºc . 2. el reactivo de trabajo combinado (combinado a y b) es estable por 2 semanas refrigerado, y una semana a temperatura ambiente. mantenga los botes hermeticamente cerrados para prevenir evaporacion. DETERIORO: 1. el reactivo debe estar claro. la turbiedad indica deterioro y no debe ser utilizado. 2. el reactivo no da los resultados de control o no llega a la linearidad estipulada. COLECCION Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA: (SUERO) FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 12

1. el suero no hemolizado es la muestra recomendada. 2. no utilice otro anticuagulante que no sea heparina. 3. separe el suero del coagulo tan pronto como sea posible, ya que las celulas rojas absorben el calcio. 4. no se deben utilizar muestras viejas que contienen precipitado. 5. no se deben utilizar tubos con tapones de corcho. 6. el calcio en suero es estable por 24 horas a temperatura ambiente y a 1 semana refrigerado (2 – 8 ºc). (ORINA) 1. colocar orina de 24 horas en un recipiente conteniendo 20 – 30 ml de 6n hcl. 2. usar 1 – 2 ml de hcl 6n en orina al azar. limpio y seco

INTERFERENCIAS: 1. las sustancias que contienen complejos de calcio o calcio no deben entrar en contacto con la muestra en prueb. ejemplo: EDTA, citrato, oxalato, fluoruro. 2. los especimenes de pacientes que han recibido bromosulfoftaleina (bsp) o edta no deben ser utilizados. 3. vea las referencias para obtener una lista de sustancias que afectan la determiancion precisa del calcio. MATERIALES REQUERIDOS: 1. los instrumentos precisos de pipeteo. 2. tubos de ensayo/gradilla 3. espectrofotometro 570nm 4. reloj INSTRUCCIONES GENERALES: El reactivo se puede usar en procedimeintos manual como automatico. PROCEMIENTO MANUAL: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. preparar el reactivo. ver preparacion del reactivo. etiquete los tubos blanco, estandar controles, pacientes, etc. pipetee 1.0ml de reactivo de trabajo a cada tubo. agregue 0.02ml de muestra en los tubos respectivos y mezcle. deje por lo menos 1 minuto a temperatura ambiente. ponga en ceros el espectrofotometro con el blanco a 570nm. lea y anote la absorbancia de todos los tubos. el color final es estable por 20 minutos.

VOLUMEN ALTERNO: 1. para espectrofotometros que requieran mas de 1 ml. para la lectura, se deben utilizar 3.0ml del reactivo y .05ml de la muestra. orina: 2. use 3ml de reactivo y .05ml de muestra. NOTAS DEL PROCEDIMIENTO: FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 13

1. las muestras con valores sobre 20 mg/dl deben ser diluidas 1:1 con solucion salina, corra de nuevo y el resultado multipliquelo por dos. 2. las muestras lipemicas o hemolizadas requieren un blanco de suero. para prepararlo agregue 0.05ml de muestra 0 3.0ml de agua destilada. mezcle y lea contra agua a 570nm. reste la absorbancia y realice los calculos. 3. la contaminacion con calcio del equipo de vidrio afectan la prueba, utilice equipo de cristal lavado con acido o tubos de plastico. CALIBRACION: Utilice el estandar apropiado. CALCULOS: Abs. desconocido / estandar ( conc. del estandar) =_______ CONTROL DE CALIDAD: La validez de la reaccion debe ser monitoreada por el uso de suero control normal y anormal. con concentraciones de calcio conocidas. el valor asignado a la reaccion se debe confirmar con la aplicacion elegida. si no se obtiene el rango de valores apropiado en la prueba, puede ser indicador de deterioro del reactivo, falla en los instrumentos o errores en el rpocedimiento. VALORES ESPERADOS: 8.5 – 10.5 mg/dl Niños menores de 12 usualmente tienen valores normales elevados que disminuyen con la edad. se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal. acuoso de calcio (10mg/dl) o un calibrador

ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:

CALCULOS Y RESULTADOS: CALCIO TOTAL: 8 mg/dl

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CONCLUSION: He concluido que el examen de sangre para medir el nivel de calcio en la sangre se hace para examinar o controlar enfermedades de los huesos o trastornos de la regulación del calcio (enfermedades renales o de la glándula paratiroides). Una deficiencia de calcio en los líquidos corporales produce una hiperexcitabilidad en los nervios y músculos, y su exceso tiene un efecto opuesto. BIBLIOGRAFIA: (1) Breslau, N.A., Brinkley, L., Hill, K.D. & Pak, C.Y .C. (1998) Relationship of animal–protein rich diet to kidney stone formation and calcium metabolism. J. Clin. End. 66:140-146. (2) Linkswiler, H.M., Zemel, M.B., Hegsted, M. & Schuette, S. (1981). Protein– induced hypercalcuria. Fed. Proc. 40:880-883. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003477.html , http://www.zonadiet.com/nutricion/calcio.htm, http://www.ivu.org/ave/calcio.html

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PRACTICA NO. 3. BIOQUIMICA CLINICA ESPECIALIZADA. DETERMINACIÒN CUANTITATIVA DE FÒSFORO
GENERALIDADES: Efectos del Fósforo sobre la salud Los fosfatos son substancias importantes en el cuerpo de los humanos porque ellas son parte del material de ADN y tienen parte en la distribución de la energía. El fosfato era también añadido a un número de alimentos, como quesos, salsas, jamón. Demasiado fosfato puede causar problemas de salud, como es daño a los riñones y osteoporosis. La disminución de fosfato también puede ocurrir. Estas son causadas por uso extensivo de medicinas. Demasiado poco fosfato puede causar problemas de salud. El Fósforo en su forma pura tiene un color blanco. El fósforo blanco es la forma más peligrosa de fósforo que es conocida. Cuando el fósforo blanco ocurre en la naturaleza este puede ser un peligro serio para nuestra salud. El fósforo blanco es extremadamente venenoso y en muchos casos la exposición a él será fatal. En la mayoría de los casos la gente que muere por fósforo blanco ha sido por tragar accidentalmente veneno de rata. Antes de que la gente muera por exposición al fósforo blanco ellos a menudo experimentan náuseas, convulciones en el estómago y desfallecimiento. El fósforo blanco puede causar quemaduras en la piel, dañar el hígado, corazón y riñones. PRINCIPIO DEL METODO Método directo para la determinación de fósforo inorgánico. El fósforo inorgánico reacciona en medio de ácido como molibdato amònico Formando un complejo fosfomolibdico de color amarillo. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de fósforo inorgánico presente de a muestra ensayada. SIGNIFICADO CLINICO El fósforo, es esencial para la formación de tejido óseo y el metabolismo energético celular. Aproximadamente un 85% se encentra en el hueso y en los dientes. Niveles bajos son atribuidos a las dieta, metástasis de huesos, alteraciones en el hígado, alcoholismo, diarreas y comitos. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio. REACTIVOS: FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 16

Molibdico

PHOSPHORUS CAL

Molibdico amònico 0,40mM Ácido sulfúrico (SO4H2) 210 mM Patrón primario acuoso de Fósforo 5mg/dl

MATERIAL ADICIONAL • • • Espectrofotómetro analizador para lectura a 340nm. Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Equipamiento habitual de laboratorio

MUESTRAS • Suero plasma Libre de hemólisis. El suero o plasma debe separarse lo antes posible de los eritrositos con el fin de evitar la liberación de fósforo de los hematíes. Estabilidad: 7 días a 2-8 ºC. • Orina Recoger la orina en los recipientes 10 mL de ácido clorhídrico (CIH) al 10% (v/v) para evitar la precipitación de fosfatos. Ajustar pH 2 diluir la muestra 1/10 con agua destilada. Mezclar multiplicar el resultado por 10 (factor de dilución). Estabilidad:10 días a 28 ºC. PROCEDIMIENTO 1.-Condiciones del ensayo: Longitud de onda: ………………………………………….340nm Cubeta: …………………………………………..1cm paso de luz Temperatura……………………………………………37/30/25ºC 2.-Ajustar el espectrofotómetro a cero frente 3.-Pipetear en una cubeta: R(mL) Patrón
(LLL)

agua destilada.

(Nola 2,3 )

Blanco 1,0 - - - - -

Patrón 1,0 10 - - -

Muestra 1,0 - - 10

Muestra

(LLL)

4.-Mezclar e incubar 5 minutos. 5.-Leer absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frete al Blanco del reactivo. CALCULOS FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 17

Suero: (A) Muestra X 5 (Conc. Patrón)= mg/dL de fósforo en la muestra (A) Patrón Orina 24 h: (A) Muestra X 5 vol.(dL)orina 24h= mg/24 h de fósforo (A) Patrón Factor de conversión: mg/dL X0.323= mmol/L CONTROLO DE CALIDAD. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados: SPINTROL H Normal y Patológico (Ref. 1002120 y 1002210). Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de la tolerancia, revisar el instrumento, los reactivos y el calibrador. Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias. VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma: Niños 4,0-7,0 mg/dL= 1,29-2.26 mmol/L Adultos 2,5-5,0 mg/dL= 0,80-1.61 mmol/L Orina: Adultos 0,4-1,3 g /24h Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores d referencia. RESULTADOS: PACIENTE 1. FOSFORO: 3.8 mg/dL ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: st.371 p.347

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Se procede a realizar la técnica para posteriormente hacer la lectura de absorbancia del problema y finalizar con los cálculos. CONCLUSIONES: He concluido que el fósforo intervienen en funciones vitales para los seres vivos, por lo que está considerado como un elemento químico esencial. El fósforo, por ejemplo, como molécula de Pi («fosfato inorgánico»), forma parte de las moléculas de ADN y ARN, las células lo utilizan para almacenar y transportar la energía mediante el adenosín trifosfato. Además, la adición y eliminación de grupos fosfato a las proteínas, fosforilación y desfosforilación, respectivamente, es el mecanismo principal para regular la actividad de proteínas intracelulares, y de ese modo el metabolismo de las células eucariotas tales como los espermatozoides. BIBLIOGRAFIA: Enciclopedia médica en español. Fósforo http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002424.htm en la dieta.

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PRACTICA # 4 DETERMINACIÓN DE SODIO Y CLORUROS EN SUERO (TÉCNICA DEL IÓN SELECTIVO)
INTRODUCCION: La medición de ion selectivo La medición de ion selectivo es un método para la determinación de las concentraciones de iones disueltos. Entre los ejemplos de cationes y aniones que pueden medirse directamente en las soluciones se encuentran los del potasio, sodio, flúor o cloruro. Mediante procedimientos indirectos, por ejemplo la titulación, es posible determinar los iones de aluminio, níquel o sulfato. La medición con electrodos de ion selectivo es un procedimiento potenciométrico como la medición de pH. En este campo hay dos clases de medición: 1. Electrodo de ion selectivo separado y electrodo de referencia 2. Electrodos combinados de ion selectivo con electrodo de referencia incorporado. Dependiendo del tipo de ión que se desee medir, la membrana del electrodo de referencia puede consistir en una sal difícilmente soluble de ese ión (electrodo de estado sólido), en una membrana de PVC modificada con un intercambiador iónico o un portador de iones (electrodo de matriz), en una membrana de vidrio (electrodo de vidrio) o en una membrana permeable a los gases (electrodo sensible a los gases). La actividad de los iones a ser medidos determina el potencial del electrodo combinado. Al aumentar la actividad de los aniones la tensión se vuelve más negativa y se hace más positiva con los cationes. Un medidor de pH e iones calcula el valor de concentración de la solución a partir de la señal del electrodo combinado. FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 20

Esto tiene múltiples aplicaciones: las concentraciones de fluoruro se determinan según la norma DIN 38405, el contenido de cloruro en asfalto o las concentraciones de nitrato en los zumos de verduras son otros ejemplos de la aplicación de las técnicas de medición por el método de ion selectivo. REACTIVOS: Al parecer los reactivos se encuentran ionómetro. No se necesita un reactivo adicional. COLECCION Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA (SUERO): 7. El 8. No 9. Se 10.No suero no hemolizado es la muestra recomendada. utilice otro anticoagulante que no sea heparina. necesita por lo menos 3 ml. de suero para la muestra. se deben utilizar muestras viejas que contienen precipitado. incluidos en el

MATERIALES REQUERIDOS: 5. Los instrumentos para la extracción del suero. 6. Tubos de ensayo/gradilla CALIBRACION: Utilice el apropiado. CALCULOS: ABS. DESCONOCIDO / ESTANDAR (CONC. DEL ESTANDAR) =__________ CONTROL DE CALIDAD: La validez de la reacción debe ser monitoreada por el uso de suero control normal y anormal. Con concentraciones de calcio conocidas. El valor asignado a la reacción se debe confirmar con la aplicación elegida. Si no se obtiene el rango de valores apropiado en la prueba, puede ser indicador de deterioro del reactivo, falla en los instrumentos o errores en el procedimiento. VALORES ESPERADOS: 8.5 – 10.5 mg/dl Niños menores de 12 usualmente tienen valores normales elevados que disminuyen con la edad. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal. OBSERVACIONES Y ESQUEMAS: FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 21 estándar acuoso de calcio (10mg/dl) o un calibrador

Se introduce una pequeña cantidad de plasma al ionometro para que este por medio de una serie de mecanismos y electrodos específicos realice la cuantificación de de sodio y cloro. CONCLUSIONES: He concluido que por medio de esta técnica se puede cuantificas con mayor rapidez y precisión sodio y cloro en una muestra sanguínea, así como también facilita la carga de trabajo en un laboratorio donde se tengan que procesar varias muestras a la vez, ya que por métodos colorimetricos requieren tiempos mas prolongados, que métodos de ion especifico. BIBLIOGRAFIA: Ionometros. http://wtw.de/media/ES_L_05_ISE_024_029_I.pdf

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PRACTICA # 5 ESTUDIO DE LÍQUIDO CEFALORAQUÍDEO
INTRODUCCION: LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO El líquido cefalorraquídeo o cerebroespinal, conocido como LCR, es un líquido que baña el cerebro y la médula espinal. Circula por los ventrículos cerebrales y el canal medular y se almacena en las cisternas cerebrales. El líquido cefalorraquídeo puede enturbiarse por la presencia de leucocitos o la presencia de pigmentos biliares. Numerosas enfermedades alteran su composición y su estudio es importante y con frecuencia determinante en las infecciones meníngeas, carcinomatosis y hemorragias. También es útil en el estudio de las enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central o periférico.

Función del LCR El líquido cefalorraquídeo tiene tres funciones vitales importantes: 1. Mantener flotante el encéfalo, actuando como colchón o amortiguador, dentro de la sólida bóveda craneal. Por lo tanto, un golpe en la cabeza moviliza en forma simultánea todo el FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 23

encéfalo, lo que hace que ninguna porción de éste, sea contorsionada momentáneamente por el golpe. 2. Servir de vehículo para transportar los nutrientes al cerebro y eliminar los desechos. 3. Fluir entre el cráneo y la medula espinal para compensar los cambios en el volumen de sangre intracraneal, manteniendo una presion. (la cantidad de sangre dentro del cerebro).

Formación del LCR El LCR es producido en un 70% en los plexos coroideos de los cuatro ventrículos cerebrales, sobre todo los laterales y 30% del ependimo a razón de 0.35ml/minuto o 500 cc/24 horas. El drenaje del líquido cefalorraquídeo se lleva a cabo a través de las vellosidades aracnoideas, proyección de las células de la aracnoides sobre los senos vasculares que alberga la duramadre. Estos senos desembocarán directamente en el torrente sanguíneo, en la región más anterior del cerebro está el espacio subaracnoideo de los lóbulos olfatorios; que se continúa con un espacio alrededor de los nervios olfatorios (por lo tanto, queda muy cerca de la mucosa olfatoria y el espácio aéreo de la nariz); desde esta region pasa a nódulos linfáticos. Circulación del LCR La circulación del líquido cefalorraquídeo comienza en los ventrículos laterales, continúa hacia el tercer ventrículo y luego transcurre por el acueducto cerebral hasta el cuarto ventrículo. Desde allí fluye, a través de un conjunto de orificios (uno central y dos laterales), al espacio subaracnoideo, que cubre el sistema nervioso central. Por último, el líquido se incorpora al torrente sanguíneo. Todas las superficies ependimarias de los ventrículos y las membranas aracnoideas secretan cantidades adicionales de líquido y una pequeña FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 24

cantidad proviene del propio encéfalo, a través de los espacios perivasculares que rodean los vasos sanguíneos que ingresan en el encéfalo. El líquido secretado en los ventrículos laterales y en el tercer ventrículo se dirige a lo largo del acueducto de Silvio hasta el cuarto ventrículo, donde se agrega otra pequeña cantidad de líquido. Luego abandona el cuarto ventrículo a través de tres pequeñas aberturas laterales, dos agujeros de Luschka laterales y el agujero de Magendie en línea media, que ingresan en la cisterna magna, un gran depósito de líquido ubicado por detrás del bulbo raquídeo y por debajo del cerebelo. La cisterna magna se continúa con el espacio subaracnoideo que rodea todo el encéfalo y la médula espinal. Luego, casi todo el líquido encefalorraquídeo fluye a través de este espacio hacia el cerebro. Desde los espacios subaracnoideos cerebrales, el líquido fluye en las múltiples vellosidades aracnoideas que se proyectan en el gran seno venoso sagital y otros senos venosos. Por último, se vacía la sangre venosa a través de las superficies de las vellosidades.

Obtención de LCR Se puede obtener, por punción lumbar, por punción cisternal, o por punción ventricular. La obtención de este líquido es importante debido a que es un importante elemento de diagnóstico de enfermedades neurológicas, como ser síndromes meníngeos, hemorragias subaracnoideas, tumores cerebro-espinales, etc. Para la punción lumbar se utiliza una aguja de aproximadamente 10 cm. con mandril. El paciente puede estar sentado o acostado. La punción se la realiza entre la cuarta y la quinta vertebras lumbares, y tan solo se espera a que comience a gotear este líquido. Además, mientras el paciente se encuentra punzado, es posible medir la presión de este líquido con la utilización de un manómetro. Para la punción cisternal, lo único que debe cambiarse es la posición del paciente, el cual sí o sí debe estar sentado, y además con hiperflexión cervical, ya que la aguja se introduce en el espacio accipito-atloideo. FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 25

Razones por las que se realiza el examen

Este examen se hace para medir las presiones en el líquido cefalorraquídeo y para recoger una muestra de éste con el fin de realizar pruebas adicionales. El LCR se puede utilizar para diagnosticar ciertos trastornos neurológicos, particularmente infecciones (como meningitis) y daño cerebral o daño a la médula espinal.
Valores normales

Los valores normales varían de un laboratorio a otro, pero típicamente fluctúan de la siguiente manera:
• • • • • • •

Presión de 50 a 180 mm H20 Apariencia: transparente, sin color Proteína total en LCR: 15 a 45 mg/100 mL Gamma globulina: 3 a 12% de la proteína total Glucosa en LCR: 50 a 80 mg/100 mL (o aproximadamente 2/3 del nivel de azúcar en la sangre) Conteo de células del LCR: 0 a 5 Glóbulos Blanco, ausencia de Glóbulos Rojos. Cloruro: 110 a 125 mEq por litro

Nota: mg/mL = miligramos por mililitro; mEq/L = miliequivalente por litro
Significado de los resultados anormales

Si el LCR luce turbio, eso podría significar que hay una infección o una acumulación de glóbulos blancos o proteína. Si el LCR luce sanguinolento o rojo, puede ser un signo de sangrado u obstrucción de la médula espinal. Si es marrón, naranja o amarillo, FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 26

puede ser un signo de aumento de la proteína en el LCR o un sangrado previo (hace más de 3 días). El aumento de la presión en el LCR puede deberse al aumento de la presión intracraneal (presión en el cráneo); mientras que la disminución en la presión del LCR puede deberse a un tumor de médula espinal, shock, desmayo o coma diabético. El aumento de la proteína puede deberse a sangre en LCR, diabetes, polineuritis, tumores, lesión y cualquier afección inflamatoria o infecciosa; mientras que la disminución de la proteína es un signo de producción de LCR rápida. El aumento de los niveles de gamma globulina pueden deberse a enfermedades tales como esclerosis múltiple, neurosífilis o síndrome de Guillain-Barré. El aumento de la glucosa es un signo de azúcar elevado en la sangre; mientras que la disminución de la glucosa puede deberse a: hipoglicemia (azúcar bajo en la sangre), infección bacteriana o micótica (como meningitis), tuberculosis o ciertos tipos de meningitis. El aumento de los glóbulos blancos en el LCR puede ser un signo de meningitis, infección aguda, inicio de una enfermedad crónica, tumor, absceso, accidente cerebrovascular, enfermedad desmielinizante (como la esclerosis múltiple). La presencia de glóbulos rojos en la muestra de LCR puede ser un signo de sangrado en dicho líquido o el resultado de una punción lumbar traumática. METODOLOGÍA: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Volumen: Aspecto: Valores de Referencia: Transparente. ANORMALIDADES TURBIDEZ: • Cuando menos 200 leucocitos/µl causan turbidez ligera. • Presencia de Microorganismos. • Medios de contraste. • Grasa epidural.

Color: Valores de Referencia: Incoloro FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 27

ANORMALIDADES

Blanco ó Turbio: • Cuenta alta de Leucocitos. • Aumento en los Valores de Referencia de Proteínas. Xantrocrómico: • Incremento en eritrocitos y presencia de xantocromía que se deben con mayor presencia a hemorragia Subaracnoidea. • Presencia de Bilirrubina. • Presencia de Carotenoides. • Lactantes Prematuros. Obscuros: • Melanosarcoma meníngeo. • Aumento de Proteínas. • Inmadurez hematoencefálica. 7.35 Cambios en el pH sanguíneo. Acidosis en Meningitis purulentas. Hemorragias subaracnidea postcirugías cerebrales.

PH: Valores de Referencia: 7.32 ANORMALIDADES • • •

Red de Fibrina: Valores de Referencia: Negativo. ANORMALIDADES • • • • FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com Aumento de Proteína del LCR (100 mg%). Muestras refrigeradas. Concentraciones de fibrinógeno causado por punciones traumáticas. Ciertos tipos de Meningitis ó 28

Neurosífilis.

CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS. PROTEÍNAS TOTALES: Valores de Referencia: 15 – 45 ml/dl. Metodología: 1. Medir 0.5 ml. de LCR, añadir 1.5 ml. de Ac. Sulfosalicílico al 3%. Mezclar y pbservar la turbidez, dependiendo del grado de turbidez hacer las diluciones requeridas (1:2, 1:4, a 10, 25, 50 o hasta 100 según sea necesario. 2. Medir: LCR Solucióon Salia Ácido Sulfosalicílico PROBLEMA (ml) 2.0 6.0 BLANCO (ml) 2.0 6.0

3. Mezclar y dejar reposar por 10 minutos. 4. Efectuar las lecturas contra su blanco a 440 nm (%T). 5. Si se realizó dilución el resultado se multiplica por ella. Aumenta en: • Normalmente en el neonato y en el adulto de edad avanzada. • Presencia de sangre. • Aumento en la permeabilidad de la barrera hematocefálica: infecciones bacterianas, micóticas, TB, meningitis, Hemorragia intracraneal. • Obstrucción de la circulación del LCR como en casos de tumor. • Aumento e la síntesis de IgG, enfermedades del colágeno, esclerosis múltiple. Disminuye en: • Pérdida de LCR por escape como el desgarre por traumatismos, rinorrea, otorrea, en algunos incrementos de la filtración a través de la aracnoides. • Hipertiroidismo. • Mecanismo desconocido.

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GLUCOSA: Valores de Referencia: 50-75 mg/dl. Metodología: Seguir la técnica anexa en el reactivo que se utiliza en el laboratorio. Aumenta en: • Algunos casos Meningitis aséptica viral. • Aumento falso hiperglucemia sérica Disminuye en: • El 50% de los casos con Meningitis bacteriana. • El 25% de los pacientes con Meningoencefalitis variable en meningitis. • Disminución variable en meningitis (TB, hongos, virus). • Hemorragia subaracnoidea. • Algunos casis de neurosífilis. • Disminución falsa secundaria a hipoglucemia.

de ó con

CLORUROS: Valores de Referencia: 118-128 mEq/l. Metodología: Seguir la técnica anexa en el reactivo que se utiliza en el laboratorio. Aumenta en: • Aumento en la retención renal de Cloruros. • Nefritis con insuficiencia renal e hipercloremia. • Deshidrataciones sin pérdida de electrolitos. Disminuye en: • Neumonías neumocococicas. Estenosis pilórica y duodenal. • Meningitis tuberculosa. Su ascenso a la normalidad puede significar mejoría. • Neurosífilis.

DESHIDROGENASA LÁCTICA (DHL): Valores de Referencia: 1-25 U:I/37°C. Útil para identificar enfermedades del SNC Metodología: Seguir la técnica anexa en el reactivo que se utiliza en el laboratorio. FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 30

Aumenta en: • Padecimientos en los que disminuye el flujo sanguíneo cerebral, disminución de la oxigenación del encéfalo, convulsiones, alcalosis respiratoria, hemorragia intracraneal, hidrocefalia, esclerosis múltiple, meningitis bacteriana. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS. Determinación de VDRL: RECUENTO CELULAR. Valores de Referencia: Células Linfocitos Neutrófilos Células Endoteliales Macrófagos Eosinófilos Eritrocitos Metodología:

Disminuye en: • De poca clínica.

importancia

Valores de Referencia: Negativo

0-5/µl 100% 0% Ocasionales 0% 0% Muy escasos

En una pipeta de Thoma se aspira líquido de Türk hasta la marca y se lleva a la marca 1.1 con LCR. Agitar bien, desechar las primeras gotas y llenar la Cámara de Neubauer, dejar reposar pro 2 minutos. Efectuar el conteo en los 9 cuadros. Número de Leucocitos/mm3 entre 9 y multiplicado por 10. = conteo en los 9 cuadros dividido

Para Líquidos con alto conteo Llenar la pipeta hasta 0.5 con LCR y hasta 11 con liq. De Türk. Contar los cuatro cuadros de los extremos Calculo: el No. de eritrocitos contados se multiplica por 50. De 10-200 células, •

Meningitis viral. 31

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linfocitos. • • • • De 200-500 células, • linfocitos o granulocitos. • • • Más de 500 células, • principalmente granulocitos. principalmente Presencia inmaduras de Células • •

Neurosífilis tardía. Escerosis múltiple. Tumores. Trobosis cerebral. Meningitis tuberculosa. Coriomeningitis. Infecciones en el SNC. Sífilis meningovascular. Meningitis bacteriana aguda. Leucemia meníngea Meningitis carcinomatosa.

EXAMEN MICROSCÓPICO. TINCION DE GRAM: TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN: PREPARACIÓN CON TINTA CHINA: Metodología: Colocar en un tubo de ensayo de 2-4 ml. de LCR, centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos, decantar y hacer preparación con tinta china y extensiones en laminillas, dejar secar al aire y al calor. Para la preparación se coloca una pequeña cantidad de sedimento en un portaobjeto, se mezcla cuidadosamente con una gota de tinta china, se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio con objetivo seco débil y fuerte. En las extensiones de laminillas realizar tinciones de Gram y Ziehl Neelsen. RESULTADOS: Nombre del paciente: Hijo de Gabriela Zavaleta CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Volumen: aproximadamente 2 ml. Aspecto: Incoloro transparente. Color: Incoloro. CARACTERÍSTICAS QUIMICAS Glucosa: 64 mg/dl Deshidrogenasa Láctica: 30.384 ml/dl FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 32 Valores de Referencia: Negativo

ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:

Se procede a ejecutar el procedimiento como lo indica la técnica para glucosa y deshidrogensa láctica para posteriormente realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro y por ultimo se realizan los cálculos pertinentes para obtener los resultados requeridos. CONCLUSIÓN: He concluido que es de suma importancia el análisis de líquidos corporales, es por ello que su análisis se debe realizar como lo indica la técnica, para obtener resultados precisos que le faciliten al medico el diagnostico oportuno en un tiempo corto. BIBLIOGRAFIA: Nathan, BR. Cerebrospinal Fluid and Intracranial Pressure. In: Goetz, CG, ed. Textbook of Clinical Neurology, 2nd ed. Philadelphia, Pa:WB Saunders Company; 2003:511-524.

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DETERMINACIONES HORMONALES
Los análisis básicos para detectar compuestos químicos en materiales biológicos son tres: biológicos, fisicoquímicos y de unión. Los análisis o técnicas de unión se han definido como aquellos que utilizan moléculas que se enlazan específica y reversiblemente a las sustancias que interesen detectar o cuantificar. Estas técnicas se utilizan frecuentemente para cuantificar moléculas que están presentes en fluidos biológicos, en concentración de nanogramos por mililitro (10-9 g/mL) o de picogramos por mililitro (10-12 g/mL). En la actualidad, mediante las técnicas de unión se realizan cotidianamente la detección de hormonas que se encuentran en cantidades muy pequeñas en fluidos biológicos. Son varias las técnicas de unión, algunas de éstas son: los inmunoanálisis, el ensayo de enlace competitivo con proteína transportadora y el ensayo de unión con receptor. La técnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanálisis.

Los inmunoensayos (IE).
Un IE se define como una técnica analítica que usa anticuerpos (Ac), para la determinación selectiva de compuestos presentes en muestras biológicas. Las principales ventajas de los IE consisten en que son altamente selectivos, tienen bajos límites de detección. Por su alta selectividad los IE pueden ser usados en muestras complejas, como orina o sangre, con poca o ninguna preparación de la muestra. Estos métodos son, también, relativamente económicos y una vez puestos a punto fáciles de realizar. Todas estas características hacen que los IE sean los métodos de elección para múltiples aplicaciones endocrinológicas PRINCIPIO Y CLASIFICACIÓN El principio de todas estas pruebas consiste en la combinación de proteínas de alta sensibilidad y especificidad (Ac) con los ligandos (antígenos [Ag]) a dosar. Los IE se pueden clasificar de acuerdo a: 1.- El tipo de marca (sustancia que se incorpora a una molécula a fin de poder identificarla) en:

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Radioinmunomarcados: los dos más frecuentemente usados son el radioinmunoensayo (RIE) de competición y los ensayos inmunoradiométricos (IRMA) que utilizan isópotos radioactivos. Enzimáticos: en este caso la marca es una enzima. Ejemplos de estos ensayos son el enzimoinmunoensayo de competición (EIA), el ensayo inmunoabsorbido a enzimas o enzyme linked immunosobent assay (ELISA), el inmunotest-enzimomonitoreado (EMIT) y los test inmunoenzimométricos (IEMA) De fluorescencia: basados en marcas fluorescentes, por ejemplo el fluoroinmunoensayo (FIA) y el inmunofluorométrico (IFMA).

2.- La concentración de sus reactivos en: • • IE de competición: en los cuales los Ac son usados en una concentración limitada con un antígeno (Ag) marcado. Inmunométricos: en los cuales los Ac están marcados y en exceso.

El radioinmunoanálisis (RIA)
El RIA, como un ejemplo de los ensayos de unión, también se le ha denominado ensayo de saturación, análisis de desplazamiento, análisis de enlace insaturado, análisis de fracción no enlazada, radioensayo de dilución, análisis competitivo, radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiométrico. Todos los ensayos de unión, se caracterizan por estar constituidos por tres componentes básicos, la molécula enlazadora (ligador o unidor), la molécula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador). La molécula ligadora debe ser capaz de unirse únicamente con aquella que interesa medir. Es decir debe ser específica. Además la unión tiene que ser suficientemente estable, propiedad que se le denomina afinidad. Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de molécula a pesar de existir varias moléculas estereoquímicamente semejantes.

CINETICA DEL INMUNOANALISIS.
Se tomará como modelo de la cinética de los ensayos de unión al RIA que utiliza anticuerpos que se comportan como si presentaran un sitio de unión. El análisis consiste en colocar conjuntamente el anticuerpo (Ac), el antígeno (Ag) y trazador (Ag*) en tubos de ensayo bajo condiciones fisicoquímicas controladas, como son: temperatura, volumen, acidez y concentración, para que el Ac se una con el Ag y con el Ag*. Se forma así el complejo de unión Ag:Ac, como se muestra a continuación: Ag + 2 Ac + Ag* < > Ag:Ac + Ag*:Ac Formado el complejo, se procede a mantener constantes la cantidad de Ac y Ag*, pero variará la cantidad de Ag FUENTE: www.quimicoupagu.blogspot.com 35

REACTIVOS
Se necesitan 3 reactivos específicos para realizar un IE. Para el caso del RIE es un Ag marcado, el Ag en concentración conocida (estándar de referencia) y un Ac específico capaz de reaccionar contra dicho Ag. También es necesario tener un método de separación entre la fracción unida al Ac y el Ag libre marcado. MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE LA FRACCIÓN LIBRE DE LA UNIDA El clásico método inmunológico para separar la fracción unida al Ac del Ag libre consistía en la precipitación espontánea de los complejos Ag-Ac. No obstante, con el uso generalizado de los RIE de alta sensibilidad se requiere que la concentración molar de los reactivos sea tan baja que la precipitación espontánea no se produce y los complejos Ag-Ac permanecen solubles. Se han usado una amplia variedad de métodos para la separación: precipitación de complejo Ac-Ag con un segundo Ac dirigido contra el complejo (Método del doble Ac) o bien con proteína A (compuesto en suspensión que se une a la porción Fc de las inmunoglobulinas), uso de solventes orgánicos o la precipitación salina para precipitar los complejos, adsorción de complejos al material de fase sólida y adsorción del Ag libre a material de fase sólida tal como celulosa, carbón activado, silicatos, o resinas de intercambio. El método del doble Ac es el de elección en el desarrollo de nuevos procedimientos del RIE. No obstante, el costo del segundo Ac puede convertirlo en excesivamente caro cuando miles de muestras deben a ser analizadas. El método acuoso de polietilenglicol para la precipitación de los complejos puede ser usado luego de que un ensayo haya sido validado con la metodología del doble Ac. La adsorción o la formación de complejos Ac-Ag en una fase sólida es un método generalmente aplicado en los kits comerciales ya que brinda una alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad; no obstante, presenta la limitación de su costo.

ENSAYOS INMUNORADIOMÉTRICOS
Como alternativa para los ensayos de saturación de equilibrio donde se produce una competición entre el ligando marcado y el no marcado por un limitado número de sitios de unión, quedando algo del ligando “desconocido” sin reaccionar (no unido), existe otra técnica en la cual todo el Ag desconocido reacciona con un exceso de Ac marcado.

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Esta última técnica se llama inmunométrica. En teoría como todo el Ag desconocido ha formado complejos con el Ac marcado, el Ag es directamente detectable con este método, por eso se obtiene mayor sensibilidad que con los métodos convencionales de equilibrio. INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS Probablemente el desarrollo más significativo en IE en los últimos años ha sido la sustitución de los radioisótopos por enzimas. En diferentes variaciones de esta técnica tanto el Ag, el Ac primario, o incluso el segundo Ac pueden ser marcados enzimáticamente. En los enzimoinmunoensayos (EIE) homogéneos, no es necesaria una separación física de la fracción unida de la libre. También el Ag marcado con la enzima y el Ag no marcado (analito) compiten por un número limitado de sitios de unión al Ac. El marcador enzimático puede estar inactivo o contrariamente tornarse activo cuando se une al Ac. El cambio en la actividad enzimática, evidenciado por la adición de un sustrato cromogénico y expresado en variaciones de absorbancia a una determinada longitud de onda (Ä Abs), es función del marcador enzimático unido. Una segunda categoría de los EIE esta representada por el ELISA, donde los inmunoreactantes están inmovilizados en soportes de fase sólida y tanto el Ag, el Ac primario, el segundo Ac pueden estar marcados con la enzima. Los EIE tienen la ventaja de poder ser realizados en forma inmediata en un laboratorio convencional químico, ya que no requieren personal especialmente entrenado, precauciones del manejo de radioactivos ni equipos caros de detección. No obstante, los EIE no tienen la misma aplicabilidad para medir moléculas grandes como la de las hormonas polipeptídicas. Uno de los principales problemas potenciales el impedimento estérico en los sitios de unión a la enzima cuando moléculas grandes se unen a las enzimas. La sensibilidad de los EIE puede no ser suficiente para medir concentraciones extremadamente bajas en las cuales algunas hormonas polipeptídicas circulan; además la medición de la actividad enzimática está sujeta a factores medioambientales (pH, temperatura, etc.) en adición a la interferencia de estos a la reacción Ag-Ac.

FLUOROINMUNOENSAYO
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El fluoroinmunoensayo (FIA) emplea los mismos principios comunes descriptos, usando un marcador fluorescente sobre la molécula marcadora (Ag, Ac, o segundo Ac). Los ensayos pueden ser competitivos o no y después de la separación de la fracción unida de la libre la cuantificación se realiza con técnicas fluorométricas. Se incluyen también en esta categoría los ensayos inmunofluorométricos (IFMA) y los IE basados en la polarización fluorescente.

BIBLIOGRAFIA: Iovine, E; Selva, A.A. El Laboratorio en la Clínica. 3ra. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires 1985

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