MYCOPLASMAS

Cortez Perez Guillermo

Sánchez González Manuel Alejandro
Mijares Antonio
Mora Rico Naomi HecxeliCortez Perez
INTRODUCCION
Micoplasma
 Organismos procarioticos
(carecen de un nucleo organizadoo y
limitado por una membrana).

 tipo de bacteria atipica que pertenece al

genero mycopasma

 Clase Mollicutes.
 Falta de pared celular rígida.
• Tiempos de generación de 1 a
9hrs.
• Bacterias autorreplicantes más
pequeñas: 0,3 – 0,8 µm.
• Filtrable a través de un tamiz de
0,45µm.
  Los hace resistentes a muchos
antibióticos que actúan sobre la síntesis
de la pared celular bacteriana.
Pared celular
 Pueden adoptan formas variadas, son
capaces de pasar a través de filtros
bacterianos estándar.

 Afectaciones en animales y
plantas,causando diversas enfermedades.

En los humanos, los micoplasmas pueden

estar asociados con infecciones
respiratorias, genitourinarias y articulares.
 La contaminación de cultivos
celulares por micoplasmas se conoce
desde hace décadas, dependiendo
del laboratorio: entre el 10 % al 85 %
de las líneas celulares pueden estar
contaminadas.

Las primeras cepas de micoplasmas

fueron aisladas en el instituto
Pasteur en 1898.
Hasta estos tiempos, 20 de las aproximadamente
190 especies conocidas de micoplasmas, han
sido identificadas como contaminantes
autenticos de cultivos celulares de laboratorio.
Provenientes de fuentes humana, porcina y
bovina.
 Contaminación
La presencia no deseada de estas bacterias en entornos específicos,
como:

• Cultivos celulares

• Productos biotecnológicos

• Sistemas de fermentación.

La contaminación por micoplasma es un importante problema para el

cultivo de celulas de mamiferos utilizadas para la investigación.
Fuentes de contaminación por
micoplasma
 Aislado de tejido original (primario <1%)
 Personal de laboratorio.
 Medios y soluciones no estéril.
 Incubadora
 Nitrógeno líquido
 Partículas y aerosoles en el aire.
 Uso excesivo de antibióticos.
 Sellado inadecuado en los platos de cultivo.
 Material de laboratorio mal esterilizado
 CONSECUENCIAS DE LA CONTAMINACIÓN POR MICOPLASMAS
Dan lugar a una interpretación errónea de los datos obtenidos.

Efectos generales sobre células eucariotas:

 Niveles alterados de la síntesis de proteínas, ARN y ADN.

 Alteración del metabolismo celular.
 Competición por precursores biosintéticos y nutrientes.
 Disminuyen los niveles de aminoácidos y ATP.
 Inducción de aberraciones cromosómicas (alteraciones numéricas y
estructurales).
 Modificación de los antígenos de la membrana plasmática de la célula huésped.
 Cambios en la morfología celular.
 Disminución de la tasa de transfección.
 Cambios en los perfiles de expresión .
 Inducción (o inhibición)de la activación de los
linfocitos.
 Inducción (o supresión) de la expresión de
citosinas.
 Aumento (o disminución) de la propagación del
virus.
 Interferencia con diversos ensayos bioquímicos y
biológicos.
 Influencia en la transducción de señales.
 Alteración de las características de proliferación
(crecimiento, viabilidad).
 Degeneración y perdida total de la célula.
 M. fermentans Especies de
micoplasmas más
Humano M. hominis
comunes que aparecen
M. orale
en cultivos celulares

M. pirum

Porcino M. hyorhinis

M. arginini
Bovino
Acholeplasma laidlawii
Frecuencia de diferentes especies de
micoplasmas en cultivos celulares
Resistencia a antibióticos
Técnicas de
detección de
Micoplasmas
en cultivos
celulares
Detección de micoplasma en cultivos de célula
s de mamíferos contaminados
utilizando microespectroscopia FTIR
Prueba Mycoalert TM y PCR

• Se utilizó el para confirmar que las

células eran infectado con éxito.

• Es una prueba bioquímica selectiva

queexplota la actividad de ciertas
enzimas micoplasmales.
 Preparacion de micoplasma
1. Un cultivo de hibridoma (linfocito d e hibridoma B , R4­6A2 (número A TCC HB­
170)) contaminado por micoplasma fue recolectado.

2.El medio se esterilizó con un filtro de 0,22 μM

para asegurarse de u tilizar cultivo libre de bacterias (los micoplasmas s on más p eque
ños que bacterias comunes, típicamente e ntre 0,1 y 0,8 μm de diámetro,
por lo que una buena parte de ellos deberían p asar a t ravés de la malla).

3.Se realizó una segunda prueba MycoAlert™ para c omprobar n uevamente la positivi
dad.

4.Luego se extrajo un volumen d el medio no diluido,

utilizado para infectar células D BTRG (Myc+++) y una dilución al 100.

5.Se prepararon v arias veces este medio para formar una población de células poco
contaminadas (Myc+).
 Preparación de Celulas DBTRG (linea celular de glioplastoma de
cebro humano, número ATCC CRL-2020)

 Se sembraron en cultivo T25 de matraces a una densidad de 1x100

celulas /ml
 Cultivados en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS,
GlutaMax 2mM
 Se colocaron en incubadora a 37°C con un 5% de CO2

Fueron infectados con la suspensión de micoplasma (especie bovis

inentificada por prueba PCR y pruebas selectivas).
1. Se transfirieron 100 microlitros de sobrenad
ante aclarado a un pocillo de una placa de
96 pocillos añadiendo 100 µl de reactivo
MycoAlert™ a cada muestra.

2. Después de 5 minutos, la placa se colocó

en un luminómetro (Victor Plate Reader, P
erkin Elmer) para medir la luminiscencia (le
ctura A).

3. Se agregaron 100 µl de sustrato MycoAl

rt™ a cada muestra y después d
de 10 minutos se midió nuevamente
la luminiscencia (lectura B).
 Sin contaminar

Se prepararon
3 cultivos Muy contaminado
Poco contaminado

• Luego, las células se separaron usando

tripsina­EDTA al 0,25% (Gibco) y se
centrifugaron.

• Se recogió el sedimento, se lavó con

tampón PBS y se fijó con 4%.
La relación entre la lectura B y la lectura A se utiliza
para determinar si
un cultivo celular está contaminado por micoplasma.

Si <1, la muestra es negativa para micoplasma

si está entre 1 y 1,2, la muestra está en el límite y la
s células deben mantenerse en cuarentena y volver a a
nalizarse en 24 h.
Si la proporción es superior a 1,2, la muestra es posit
iva para contaminación por micoplasma.
PCR
Se p reparó un extracto total d e 0,1 x 106 células/
punto mediante lisis en 100 μ l de Nonidet­P40 al 9 %, 60 μg/
ml d e proteinasa K y t ratamiento a 60 °C (30 min) 95 ° C durante 1 0
min para l a inactivación de la enzima.

35 c iclos
• 30 s de desnaturalización a 94 ° C,
• 30 s de h ibridación a 6 0 °C
• 60 s d e elongación a 7 2 °C). )

En un volumen de 2 5 μl de tampón d e reacción de A DN p olimerasa.

Analisis de datos FTIR
Con el detector FPA enfriado por L N2 de 6 4 × 64 píxeles
Se tomaron tomas FPA individuales (campo de visión de 1 28 × 128 μm2 )
Objetivo d e 20 × con condensador coincidente en modo de transmisión con
una resolución espectraly una acumulación de 256 escaneos, con un
tiempo de medición d e aproximadamente 6 min.
Se mapeó una gran área de la muestra c on la FPA p ara cubrir muchas c él
ulas con el fin de tener m ás posibilidades de tener células infectadas con m
icoplasma en la serie contaminada.

El a nálisis de los datos se realizó en el software Unscrambler X10.3. E l aná

lisis
estadístico s e realizó s obre los r esultados de PCA mediante la prueba ANO
VA.
 Resultados y
discusion
• Detección por PCR de
contaminación por micoplasma en lisados
de células DBTRG.

• La densitometría de las señales

de los amplicones revela una infección po
r micoplasma tres veces mayor en células
tratadas con sobrenadante contaminado
no diluido.
El análisis de conglomerados
jerárquico (HCA), un métod
o de clasificación no supervi
sado.
Se realizó en los espectros no
rmalizados de segunda deriv
ada y vector de todos los g
rupos u tilizando el
algoritmo de Ward para clasi
ficarlos en conglomerados.

Se divide en cuatro partes

 Conlusión
El microanálisis FTIR pudo diferenciar entre los control y las
células infectadas por micoplasma.
En los Marcadores espectrales e identificaron en las regiones
lipídicas y de huellas dactilares debido a 3015 cambios
moleculares en las células huésped y/o la presencia de
micoplasma.
Las principales diferencias están en el fosfolípido de membrana,
regiones de ésteres, proteínas y ácidos nucleicos que podrían
deberse a los efectos citopáticos del micoplasma en las células
huésped (p. ej., alterar la integridad de la membrana de la célula
huésped y escindir ADN y/o ARN de las células huésped).
Se realizan más investigaciones en progreso para interpretar mejor
estos marcadores espectroscópicos. Los resultados preliminares
mostraron que el microFTIR tiene el potencial se utilizará en el
futuro como técnica de detección complementaria de células
infectadas por micoplasmas y podría resultar muy útil para detectar
si las células se eliminan de los micoplasmas después de un
tratamiento para eliminar la contaminación bacteriana.