 Doc. Ing. Edgar Fernández U.

 LENTES Y DESVIACION
DE LA LUZ
- Refracción
- Índice de refracción
n=c/v
Donde:
n= Índice de refracción
C= Velocidad de la luz en el vacío
V= Velocidad de la luz en el medio
 MATERIAL INDICE DE REFRACCIÓN

VACÍO 1

AIRE 1,00029

AGUA ( A 20oc) 1,333

HIELO 1,31

DIAMAMTE 2,417

GLICERINA 1,473
LENTES CONVEXAS
 PUNTO FOCAL (F)
 DISTANCIA FOCAL (f)
 Ojo humano

No enfoca a menos de 25 cm

Con una lupa si puede

Unidad Abreviatur Valor
a
1 centímetro cm 10-2 mt
1 milímetro mm 10-3 mt

1 micrómetro µm 10-6 mt

1 nanómetro Nm 10-9 mt

1 Angstrom A 10-10 mt

1 picómetro pm 10-12 mt
 1𝑐𝑚 1𝑚𝑡 1𝑚𝑖𝑐𝑟𝑎
1𝑚𝑚 ∗ ∗ ∗ −6 = 1000 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑎𝑠 (µ𝑐)
10𝑚𝑚 100𝑐𝑚 10 𝑚𝑡
 Zacharias Hansen (1590)
 Hans Lipershey
 GALILEO Galiley (1609)
 Cornellius Drebel (1619)
 Antony Van Leewenhoek (1632-1723)200X
 Jeremias Sisson (1776) 1er Revolver
 Cherubin Deorleans (XVII)1er M. Binocular
 Clasificación:
Microscopio simple
Microscopio Compuesto
 Microscopio compuesto
Según sistema de iluminación:
- M. óptico Luz visible 1500X
- M. Luz ultravioleta Mejor resolución
- M. Luz polarizadaPetrografico
- M. Fluorescencia(Xenón, Mercurio)
Sust. Luz propia
- M. ElectrónicoHaz de
electrones5000 mas potente
 Forma imagen oscura sobre fondo claro
 Requiere muestra coloreada
 SISTEMAS DEL MICROSCOPIO
-Sistema óptico
-Sistema de iluminación
-Sistema mecánico
 SISTEMA OPTICO

- Oculares : 5X, 10x, 15x, 20x

-Objetivos: Secos y Húmedos
 OBJETIVO SECO * OBJETIVO
HUMEDO
 OBJETIVO DE INMERSION
 Tabla 4-1.-Códigos de color en los objetivos microscópicos

Código de color de inmersión Medio de inmersión

Negro
Aceite

Naranja Glicerol
Blanco Agua
Rojo Especial o multiuso
   

Código de color de aumento Aumento

Negro 1x, 2.5x

Marrón 2x, 2.5x
Rojo 4x, 5x
Amarillo 10x
Verde 16x, 20x
Azul turquesa
25x, 32x

Azul celeste 40x, 50x

Azul cobalto 60x, 63x

100x, 250x, 200xTabla 4-1.-Códigos de color en los objetivos

Blanco, crema
microscópicos
 S. iluminación
- Bombilla
- Reostato
- Condensador
- Diafragma
RECORRIDO DE LA LUZ DESDE LA FUENTE
 Sistema mecánico
- Brazo
- Pie
- Tornillo macro

- y micrométrico

- Platina
-Pinzas y sus tornillos
- Revolver
- Resolución.- Cap. de la lente de
distinguir entre objetos muy
próximos.
d= 0.5* / n*sen 
Donde:
= Long. de onda de la luz
n*sen =Apertura numérica
opt=450 a 500 nm
 Resolución total del microscopio

dtotal=  / (Anobj+Ancond)
Propiedad De inspección Bajo aumento Gran aumento De inmersión
Aumento 4X 10X 40-45X 90-100X
Abertura num. 0,10 0,25 0,55-0,65 1,25-1,14
Dist. Focal (f) 40mm 16mm 4mm 1,8-2,0mm
Dist. de trabajo 17-20mm 4-8mm 0,5-0,7mm 0,1mm
Poder de resol.* 2,3µm 0,9µm 0,35µm 0,18µm

* Poder de resolución aproximado con luz de 450 nm (azul)

 Capacidad de una lente de ampliar una imagen
 CAPACIDAD DE AMPLIFICACIÓN TOTAL
DEL MICROSCOPIO
 Campo oscuro
- Diafragma de campo oscuro
- Muestra iluminada en fondo
oscuro
- No necesita tinción de la
muestra.
- Se pueden ver m.o. vivos
- Se pueden estudiar
estructuras internas de m.o.
eucariotas grandes.
 Contraste de fases
- Convierte diferencias pequeñas en el índice de
refracción y la densidad celular en variaciones de
intensidad de la luz.
- No requiere tinción de la muestra

- Se pueden ver m.o. vivos

- Imagen iluminada sobre fondo oscuro.

- Provee hasta 1000 aumentos

 MICROSCOPIO OPTICO
- 100 nm-100 micrómetros (micoplasmas,
bacterias, mohos, levaduras, eritrocitos, células
epiteliales,etc)
 MICROSCOPIO ELECTRONICO

- 0.1 nm- 100 micrómetros(Todo lo anterior más

virus, proteínas, aminoácidos, átomos, etc.)
 INSTRUCCIONES
DE OPERACIÓN
1. Encender el
equipo.
2. Regular la
intensidad luminosa
con reóstato.
3. Alejar la platina de
los lentes objetivos al
máximo.
4. Seleccionar el
objetivo de menor
potencia (4X) lente de
inspeccion
5. Coloque la muestra en
la platina y llevela al
camino de haz de luz
usando los tornillos para
pinzas.
6. Mirando por el ocular
derecho lleve a foco
usando el tornillo
macrometrico.
7. Con el tornillo
micrometrico realice la
afinacion de la imagen.
8. Ahora mire por el
ocular izquierdo si esta
desafinado corrija el
foco del izquierdo con la
rosca del ocular.
8. Una vez enfocado suba
gradualmente la potencia
de las lentes hasta lograr
identificar la muestra.
Nota.- En cada aumento
la imagen se distorciona,
afinar solamente usando
el tornillo micrometrico.
 Procedimientos de
observación
- Observación en
húmedo (Cámara de
Neubauer o
hemocitómetro)
- Observación en seco o
películas secas y
coloreadas
 SITUACIONES DE USO
 Estudio del movimiento

 Estudio de la
reproducción
 Conteo microbiano
CAMARA DE NEUBAUER
Área del cuadro = 1mm2
Profundidad=0,1mm
 EJEMPLO:
#Cel totales= 43
Cuadros contados=5
Media de células= 8,8
Aplicando fórmula:

#Cel/ml=8,8*250000=2200000
2200000 Cel/ml
 Estudio de su
morfologia (Formas
individuales,
grupales)
 Estudio de
reacciones frente a
colorantes.
 Coloraciones simples
 Coloraciones diferenciales
 METODOS
 Frotis.- Muestreo aseptico
 Fijación.- Conservan y fijan en su posición e
inactivan enzimas. Mata al m.o.
 FIJACIÓN FÍSICA  FIJACIÓN QUÍMICA
- Calentamiento suave - Se utilizan fijadores
- Conserva la morfología químicos
externa (Alcohol,Formaldehido,
- Afecta la estructura glutaraldehído, Cloruro de
interna mercurio, etc.)
- Conserva bien las
estructuras internas
Clasificación:
-Colorantes básicos o catiónicos(+)
Azul de metileno, safranina, verde malaquita, Fucsina básica, Violeta
cristal (Violeta de genciana).
- Colorantes ácidos o aniónicos(-)
Eosina, rosa de bengala y fucsina ácida.
- Colorantes liposolubles

(ej. Negro Sudan)

TINCIONES SIMPLES Se usa un solo colorante
 Coloraciones diferenciales: Más de un colorante.
 Tinción de Gram (Diferencial)

-Pasos.
1. Realizar el frotis
2. Realizar fijación
3. Violeta cristal 30 seg
4. Enjuagar con agua 2 seg
5. Aplicar Lugol por 1 min
6. Enjuagar con agua
7. Lavar con alcohol al 95% por 10-30 seg
8. Enjuagar con agua
9. Aplicar safranina por 30-60 seg.
10. Enjuagar con agua.
tinción gram positiva tinción gram negativa
 METODO DE ZIEHL-NEELSEN
1. Realizar el Frotis
2. Realizar la fijación.
3. Calentar una mezcla de fucsina básica y fenol
(fucsina fenicada)
4. Verter la muestra sobre la mezcla (t=5min)
5. Lavar con alcohol al 95%
6. Lavar con agua.
7. Solución de contraste (V. Genciana) t= 5 min.
8. Enjuagar con agua
 Método de Shaefer Foulton
1. Frotis
2. Fijación
3. Teñir con verde malaquita a emisiones de vapor por 8-10
min.
4. Lavar con agua destilada
5. Fucsina básica por 3 min.
6. Lavar secar y observar con obj. de inmersión.
Tinción de esporas
 PROCEDIMIENTO
1. Colocar 2 gotas de azul de lactofenol sobre el portaobjetos.
2. Cortar un trozo de cinta scoch y pegarla en el extremo del
asa esteril
3. Pasar suavemente la cinta sobre la colonia
4. Depositar la cinta sobre el portaobjetos.
5. Añadir una gota de colorante sobre la cinta.
6. Colocar el cubreojbetos.
7. Observar al microscopio.
Conidiosporas Esporangiosporas