Informe de

laboratorio
Fecha: 25/08/2020
Prácticas 2, 3, 4 y 5
Datos alumno
Nombre: Bonilla Brillyth, Penagos Sofía, Puentes Sara & Quiroga Lesly

1. Preguntas

• Explique el significado de los términos magnificación, resolución y apertura

numérica. ¿Cuál es su importancia en microscopía?
• Magnificación: Se refiere al grado de ampliación de un objeto. Las magnificaciones más usadas
suelen ser de 2x, 4x, 10x, 20x, 40x 100x y hasta 800x (FarmaBionics,2014).
• Resolución: Capacidad que tiene de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí,
mientras más cerca están esos puntos del objeto, más nítidos serán los detalles (Narvaez,.D.
2015).
• Apertura numérica: Es una medida del diámetro de la luz que puede recoger el objetivo. Cuantos
más rayos procedentes del objeto entren en el lente para formar la imagen mejor será la calidad
(Universidad de Alicante.2016 ).
La importancia de estos en la microscopía ya que brindan una imagen más detallada y correcta
de objetos, cosas o seres que no son perceptibles ante el ojo humano.

• Complete la siguiente tabla

LENTE Magnificación Poder de resolución Distancia de trabajo
Magnificación objetivo: 4x.
4X Magnificación ocular: 10x.
2,3 17-20mm
Magnificación total:40x
Escaneo (Miley, 2014)

Magnificación objetivo: 10x.

10X Magnificación ocular: 10x. 0,9 4-8mm
Magnificación total:100x
Bajo poder (Miley, 2014)

Magnificación objetivo: 40x.

Magnificación ocular: 10x.
40X Magnificación total:400x
0,35 0,5-0,7mm
Alto poder (Miley, 2014)

Magnificación objetivo: 100x.

100X Magnificación ocular: 10x.
0,18 0,35mm
Magnificación total:100x
Inmersión (Miley, 2014)

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• ¿Cómo varían el poder de resolución y la distancia de trabajo de acuerdo a la

magnificación de cada lente?
De acuerdo a la magnificación de cada lente la resolución y la distancia de trabajo son
inversamente proporcionales es decir si el lente es 4x el poder de resolución es de 2,3 y la
distancia de trabajo 17-20 mm por el contrario si el lente es 100x el poder de resolución es de
0,18 y la distancia de trabajo de 0,35 mm, es decir que disminuyen.

• Usted se encuentra observando muestras bajo el lente de inmersión en el laboratorio

y tiene dificultades porque se observa el campo oscuro y la muestra no está bien
definida. ¿Qué partes del microscopio podrían estar implicadas en este problema
y por qué? ¿Cómo corregiría este inconveniente?
Para entenderlo es necesario aclarar que el diafragma tiene como función regular el paso de la luz emitida por la
fuente de luz (foco) hacia la muestra. La dispersión de la muestra es importante porque si esta llega a ser
demasiado densa no habrá paso adecuado de luz a través de ella, lo que hará que se vea todo oscuro; de ahí la
importancia de hacer una buena siembra de la muestra en las láminas o porta objetos. (Beltran.2020)

Por otro lado, los objetos tienen como función magnificar visualmente la muestra, pero es de suma importancia
seleccionar correctamente la medida del objetivo de acuerdo a la muestra, porque de no ser así la luz procedente
de la muestra no emitirá una imagen real, lo que puede hacer ver la muestra borrosa. Se recomienda que cuando
se usen objetivos de 100x, se use aceite de inmersión, este es un líquido que se aplica sobre la muestra, la cual
ayuda a concentrar la refracción de luz y que esta no quede viajando en el aire lo que va a dar como resultado
una imagen más clara. (Megías M, Molist P.2019)

• ¿Para qué sirve ver muestras en preparaciones en fresco? ¿Por qué es necesario
someter las muestras a tinciones?
Las muestras para microscopio preparadas en fresco sirven para ver microorganismos vivos como protozoos,
además de otros elementos como leucocitos, células, eritrocitos, cristales. Etc

Es importante someter las muestras a tinción porque es una procedimiento útil para la identificación de bacterias,
esta técnica permite hacer una clasificación entre bacterias gram positivas y negativas, la razón por la que se
diferencian estos tipos de microorganismos es porque tienen pared celular; esto permite que de acuerdo a su
clasificación interactúen con azul de metileno o fucsina de gram. El azul de metileno permite visualizar la bacterias
gram positivas ya que este las tiñe de un color violeta o lila, mientras que para identificar las gram negativas se hace
observando la decoloracion que presentan despues de lavado el azul de metileno y se revelan usando la fucsina
de gram que tiñe a las bacterias gram negativas de color rosa.( Forbes B, Sahm D, Weissfeld A.2007)

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• ¿Por qué se usan con mayor frecuencia en microbiología las tinciones básicas
que las tinciones ácidas? Describa al menos dos ejemplos de cada una de estas
tinciones.
Los colorantes básicos reaccionan con elementos que contienen cargas eléctricas negativas (anión) que constituyen las células y los tejidos.
Mientras que los colorantes ácidos reaccionan con elementos que contienen cargas eléctrica positivas (catión) que también están contenidos
en las células y los tejidos, específicamente en grupos amino ionizados de las proteínas.
Cuando hablamos de los microorganismos específicamente de los procariotas estos, en su gran mayoría tiene un pH interno relativamente
neutro (pH:7) y una superficies celular cargada negativamente, razón por la que los colorantes básicos son más eficaces. (Ross M, Pawlina
W.2007)
Un ejemplo de ellas es la Tinción de Wright, considerada un tipo de tinción policromática porque tiene la capacidad de teñir objetos ácidos
o básicos, es muy implementada en microbiología para la detección de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo se compone de
eosina y azul de metileno, la eosina está cargada negativamente lo que la permite interaccionar con componentes celulares de carga positiva
como el citoplasma, dando como resultado una tinción rosada- naranja; cuando tiñe núcleos celulares se tiñe de un color morado.
Otro ejemplo es la Tinción de Ziehl-Neelsen(Tinción básica). Esta es una técnica común usada para el diagnóstico de tuberculosis. Una
tinción positiva es aquella en la que se detectan bacilos ácido-alcohol resistentes, los cuales se tiñen de color rojo fucsia. Esto debido a que
las paredes de estas células contienen ácidos micólicos que reacciona con el carbol-fucsina ( componente de la tinción), dando lugar a la
solubilidad de los compuestos de la pared celular y con esto dando paso a la adhesión del colorante que tiene afinidad con lo ácidos micólicos
presentes en la pared de estas estructuras celulares. (López L,* Hernández D,* Colín C,* Ortega S,* Cerón G,* Cendejas R. 2014)

• ¿Qué factores podrían interferir para obtener resultados erróneos en la tinción de

Gram (ver gram positivos como gram negativos y viceversa)? ¿Cómo lo solucionaría?
Uno de los errores que puede afectar los resultados es el número de células bacterianas iniciales ya que la concentración debe ser 10 a la 4 o de
10 a la 5 para ser visibles en el portaobjetos, sin embargo en ocasiones la concentración de la colonia puede ser menor o mayor, por lo tanto se
recomienda ser muy precisos con el asa.

Otro error es la identificación errónea de Gram-negativos como Gram-positivos y viceversa, es más común categorizar a bacterias Gram-positivas
como Gram-negativas, ya que las gram-positivas pueden perder su capacidad de retener el violeta cristal y teñir Gram negativamente debido al
daño de la pared celular de las bacterias por la fijación excesiva de calor de frotis o mediante el uso de una solución de yodo que es demasiado
vieja. Lo ideal sería tener precaución en los tiempos de fijación con el mechero y asegurarse de tener una adecuada solución de yodo. Otro
problema común se relaciona con la decoloración del frotis del portaobjetos. La clave de la técnica se relaciona con la cantidad de tiempo que
el disolvente se aplica durante el paso de 'decoloración', durante una exposición demasiado prolongada se elimina la tinción de ambos grupos
de bacterias, es por ello que la decoloración no debe ser prolongada. (Sandle, 2020) Finalmente la edad de cultivo es un inconveniente en este
tipo de tinciones, ya que los microorganismos más antiguos tienden a perder características morfológicas. Puede que usar microorganismos más
jóvenes o una tinción adicional de contraste de fondo o la apertura del diafragma, solucione gran parte del inconveniente.

• Explique el fundamento de la tinción diferencial ácido-alcohol resistente y para

qué se utiliza.
La tinción ácido-resistente es característica del género Mycobacterium y se debe a la presencia de los lípidos
presentes en la superficie de sus células, conocidos como ácidos micólicos, los cuales son un grupo de lípidos
hidroxilados y ramificados complejos, que se encuentran unidos covalentemente al peptidoglicano de la pared
celular formando un complejo que proporciona a la superficie celular una consistencia parecida a la cera e
hidrófoba. (Brock, 2014)
Debido a dicha superficie cérea, la tinción de Gram no es efectiva para este tipo de bacterias, por lo tanto se usa
la tinción ácido-alcohol resistente en la cual se emplea el colorante rojo fuscina y fenol. Por medio de
calentamiento lento el colorante es introducido al citoplasma y el fenol favorece la penetración del colorante en
los lípidos, posterior es necesario lavar y decolorar con ácido y alcohol y teñir con azul de metileno. Los
organismos con células ácido-resistentes aparecen rojas, y aquellos que no son ácido resistentes se tiñen de azul,
ya que carecen de material lipídico y por lo tanto se decoloran rápidamente (Aryl, 2018).

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• Especifique, para la tinción de Gram, la tinción de Ziehl-Neelsen y la tinción de

Schaeffer-Fulton, cuál es el colorante primario, el agente de decoloración y la
tinción de contraste. Determine el propósito de usar cada uno de estos.

Tinción de Propósito del

Tinción de Tinción de Ziehl
Schaeffer reactivo en la
Gram Neelsen
Fulton tinción
Cristal violeta Verde de Carbol fucsina Teñir todas las
Colorante malaquita células por su
primario interior

Lugol - Ácido carbólico Para fijar los

colores en las
Mordiente células

Alcohol-acetona Agua Alcohol ácido Para enjuagar

Agente el tinte
decolorante primario

Safranina o Safranina Azul de metileno Teñir las bacterias

Tinte fucsina de Gram o verde de que no pudieron
secundario malaquita retener el
colorante primario

• ¿Por qué es necesario evitar que la muestra entre en contacto por un tiempo
prolongado con el alcohol-cetona? ¿Por qué se puede dañar la tinción y obtener
resultados incorrectos?

Es necesario que para la muestra no se prolongue el contacto con el alcohol-cetona, ya que durante
la decoloración se correría el riesgo de que las bacterias Gram positivas se tiñan del color
característico de las Gram negativas, obteniéndose así un error en los resultados arrojados para
cada bacteria. La tinción se daña debido a que durante el lavado con el alcohol-cetona las células
de las bacterias Gram positivas se van deshidratando, cerrando así los poros, y cuando hay exceso
del alcohol-cetona, el colorante sale de la pared de peptidoglicano, haciendo que la célula se
decolore, por tanto, este sería un resultado incorrecto.

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2. Diagrama de flujo resumiendo el procedimiento a realizar especificado en la
práctica.

Preparación de Frotis

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 Tinción simple

Poner el frotis sobre la rejilla

Dejar los
tintes durante
1 min

Cubrir el frotis con azul de metileno o cristal violeta

Lavar el tinte con un chorro suave de agua

No frotar la
lámina con el
papel

Para secar poner cuidadosamente la toalla de papel sobre esta

OBSERVAR LAS MUESTRA ENE L MICROSCOPIO

Poner la lámina porta objetos en la platina

Hace uso del tornillo

para encontrar la
muestra al observa Situar la platina en el nivel más bajo El objetivo
por el cular debe estar en
10X

Cerrar hasta el punto medio el diafragma y mirara a través del lente ocular

Al identificar la muestra por el lente

1 gota de aceite en la
preparación

Calibrar la
cantidad de luz Evitar que el
lente de 40X
toque la gota
de aceite
Poner el objeto a 100x sobre la muestra

Observar

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 Tinción Gram

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 Método de Schaeffer-Fulton para endosporas

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 Microbiología General. Principios Básicos de Laboratorio

3. Resultados

1. Dibuje con lápices de colores los resultados de la tinción simple y la tinción de Gram.
Reporte morfología, tipo de agrupaciones y los resultados de la tinción de Gram para
cada microorganismo observado bajo el microscopio.

Tabla 2.1 (a).

Microorganismo
Micrococcus
Tinción Escherichia coli Bacillus subtilis Sarcina sp.
luteus

Azul de
metileno
o cristal
violeta
Science Prof Online, 2014 Science Prof Online, 2014 (Körinfo, 2009) (Abbey, 2020)

Gram

(Anbu, Saranraj & Padma,

(Baban, 2017) (Oddó & Díaz, 2019) (Aaronson, 2018)
2017)
Morfología: Bacilos Morfología: Bacilos Morfología: Cocos Morfología: Cocos
Agrupación: Diplo Agrupación: Estrepto Agrupación: Sarcina Agrupación: Tétradas
Gram: Negativos Gram: Positivos Gram: Positivos Gram: Positivos

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Tabla 2.1 (b).

Microorganismo

Tinción Staphylococcus aureus Streptococcus sp. Shigella sp.

Azul de
metileno
o cristal
violeta

Gram

Morfología: Morfología: Morfología:

Cocos Cocos Bacilos
Agrupación: Agrupación: Agrupación: Sin
Estafilococos Diplococos agrupación
Gram: Positivas Gram: Positivas Gram: Negativas

• ¿Por qué considera útil hacer tinciones simples en microbiología?

Es útil realizar tinciones simples debido a que mediante esta técnica se pueden conocer las distintas
morfologías y/o forma de cada una de los microorganismos a tratar. En la tinción simple con azul
de metileno se puede mejorar la imagen observada para cada microorganismo debido a que el
color azul tiñe cada célula, contrastando así con el entorno que la rodea.

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 Microbiología General. Principios Básicos de Laboratorio

• ¿Qué características de los microorganismos empleados en la práctica permitieron

que se tiñeran como gram positivos o gram negativos? ¿Sus resultados coinciden
con lo revisado en la literatura?
La distinta tinción de estos dos grupos de bacterias se basa en las profundas diferencias que presentan sus paredes celulares,
por un lado la pared celular de las Gram-negativas está compuesta por varias capas incluyendo la membrana externa, ya que
estas además del peptidoglicano, poseen una capa adicional en su pared que está compuesta de lipopolisacárido (Brock, 2003),
al teñir los microorganismos con el tinte primario es decir con cristal violeta las bacterias gram-negativas pierden el color del
tinte luego de un lavado con alcohol, ya que este reactivo deshace la membrana externa al reaccionar con el lipopolisacárido,
mientras que las bacterias gram-positivas no se decoloran y conservan el color del tinte, que es un púrpura oscuro, debido a que
su pared está formada fundamentalmente por peptidoglicano y es mucho más ancha.

2. Dibuje con lápices de colores los resultados de la tinción de Gram de

controles y responda las preguntas.
tres de los
Tabla 2.2.

¿Cuántos tipos de células

¿Su control de tinción de
observa en su control?
Control tinción de Gram le indica que la tinción
Compare su morfología y
Gram fue hecha correctamente?
establezca a qué dominio
Explique su respuesta.
pertenecen.
Si porque se logra identificar Todas son células de tipo
correctamente el tipo de bacterias. procariota. Y pertenecen al
dominio de las bacterias.
La teñida de color fucsia
corresponden a bacterias Gram En cuanto a la morfología en la
negativas y las teñidas de color primera imagen se observan
purpura son bacterias Gram Streptococcaceae, son bacterias
positivas anaerobias, en forma esférica o de
coco, se agrupan foemando
cadenas de dos (diploides) o más
cadenas.
En la segunda se observan
bacterias en forma de bacilos.
Y en la tercera imagen se observan
en forma de cocobacilos,
ocasionalmente aparecen en
cadenas cortas.

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3. Dibuje con lápices de colores los resultados de la tinción de Schaeffer-Fulton y
responda las preguntas.

Tabla 2.3.
Explique brevemente el
Tinción de ¿Por qué es tan difícil teñir una
proceso de esporogénesis en
Schaeffer-Fulton endospora?
Bacillus sp.
Fase I: Los dos cromosomas se unen Las endosporas presentan una
y forman un filamento. resistencia a ser teñidas ya que
tienen unas cubiertas exclusivas las
Fase II: Se produce una división
celular formando un preespora cuales las vuelven resistentes a
factores ambientales adversos y
Fase III: Formación del protoplasto extremos. Son precisamente estas
de la espora cubiertas las que le dan a la espora la
Fase IV: Formación de la corteza: El característica de difícil tinción.
PG de la célula madre se dispone en (Danival, 2020)
las dos membranas de la preespora

Fase V: Síntesis del peptidoglicano

Fase VI: Maduración de preespora a

endospora a endospora y síntesis de
ácidos solubles por parte de esta
última.

Fase VII: Autolisis de la célula madre

y liberación de la espora.

(Briceño,2020)

• ¿Cómo se diferencian a nivel fisiológico los géneros formadores de esporas Bacillus

y Clostridium?

Los bacillus y clostridium son tienen forma de barra, son gram positivas y producen esporas Sin
embargo lo que las diferencian es que los bacillus requieren oxígeno, es decir, son aerobios,
además los bacillus pueden vivir en ambientes extremófilos; mientras que los clostridium son
anaeróbicos, es decir, no requieren oxígeno para vivir.

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 4 . Referencias bibliográficas
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