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Escala biológica:
Los organismos más grandes: Homo sapiens, ballena azul. Vegetal sequoias.
Hongos pueden ser microscópicos pero también hay estructuras macroscópicas.
Cianofíceas, algas procariotas: 300‐400 micras
Hepatocito‐40 micras; eritrocito‐6‐7 micras
Bacterias: 1‐2 micras de largo, 0.5 micas de ancho
Virus: <0.3 micras: Organismos vivos siempre de una célula viva. El más grande es la 
viruela de las vacas (0.3 micras) 

1 micra son 1000 nm
1mm son 1000 micras y 1 x106 nm
Un micrómetro= 10‐6 metros.
Un nanómetro = 10‐9 metros.
Angstrom= una décima parte de un nanómetro. Sirve para cuantificar dimensiones 
atómicas.
Los complejos macromoleculares: ribosomas, microtúbulos y microfilamentos oscilan 
entre 5‐25nm.
Células y sus organelos: en micrometros. Ej. Núcleo tiene 5‐10 micra, mitochondria tiene 
2 micras de largo. Cel eucariota de 10 a 30 micras.

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Christ Church Library, Special Collections Oxford OX1 1DP 

Robert Hooke was clearly a man of prodigious energy, capable of cherishing a love of 
classical scholarship alongside architecture, fine drawing, music, original research into 
chemistry, medicine, engineering, astronomy, and, of course, microscopy. 
Micrographia was therefore a pioneer work in what we would now call ‘the public 
understanding of science’, taking a whole string of Hooke’s brilliant and original scientific 
researches and placing them in the public arena. It was an approach to the ‘new science’ 
of experimentation which derived from the inspirational writings of Sir Francis Bacon 
(1560‐1626), and was now firmly embedded in the policy of the newly‐founded Oxford‐
inspired Royal Society of London. .
In Micrographia Hooke presents the first scientific studies of insects made with the 
microscope. These include the subsequently iconic flea, showing in detail a body 
covered with interlocking, flexible armoured plates, the legs, and the head, as well as 
spiders. In both of these cases, however, Hooke is especially interested in the natural 
engineering of insect anatomy: their body structures, leg mechanisms, and muscles. And 
this approach continues in his description and drawing of the blue fly.

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Anton van Leeuwenhoek (24 de octubre de 1632 – 26 de agosto de 1723), considerado como 
el padre de la microbiología. Nació en Delft, Países Bajos.
Trabajo en una tienda de telas y tejidos y gracias a esto conoció por primera vez 
un microscopio simple, conformado por una pequeña lupa instalada en un soporte, empleado 
por los negociantes de tela para comprobar la calidad del tejido. A partir de ese momento nació 
su interés por el funcionamiento de este aparato.
Comenzó a indagar y a experimentar en sus tiempos libres, analizaba pequeños objetos, además 
realizó mejoras a los tejidos, experimentando con diversas lupas para adquirir y comerciar telas 
de mayor calidad. Tras numerosos estudios y vidrios pulidos, elaborados con sus propias manos, 
desarrolló un método de fijación para lentes biconvexas, que se catapulto como el mayor avance 
de los microscopios hasta la actualidad. Vemos que sus avances con el vidrio no solo le sirvieron 
para trabajar con las telas y los hilos, ser un curioso y excelente trabajador, sino que por ellos 
empezó sus investigaciones y grandes descubrimientos que cambiaron el rumbo de la biología.
Fue el primero en observar las bacterias y los protozoos. Sus investigaciones en los animales 
inferiores refutaron la hipótesis de la generación espontánea y sus observaciones sentaron las 
bases de la bacteriología y la protozoología. Además, descubrió los glóbulos rojos, pudo 
observar gracias al microscopio, los vasos capilares por los que transita la sangre de las venas a 
las arterias, reafirmando la teoría de Harvey. También estudio el sistema capilar y detalló con 
claridad los ciclos vitales de los insectos. Anton van Leeuwenhoek fue con toda seguridad, la 
primera persona en observar bacterias, incluso sin ser consciente de ello. Gracias a estas 
investigaciones es reconocido como el padre de la microbiología.
En 1680 debido a sus aportes científicos, demostró que la levadura estaba compuesta de 
minúsculas partículas globulares. En consecuencia, Anton van Leeuwenhoek es elegido para 
formar parte de la Sociedad Real de Londres. Años después la Academia de las ciencias de París 
lo invito a ser miembro de esta institución. Durante estas décadas su carrera investigativa fue 
creciendo y sus estudios cada vez eran más completos y complejos. Revistió tanta importancia 
que recibió a ilustres visitantes, entre los que se destacan Pedro I de Rusia, Federico II de Prusia 
o James II de Inglaterra, quienes se presentaron ante él para observar, a través de sus 
microscopios, sus hallazgos.

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En esta imagen resumimos estos conceptos
En la parte superior la palabra magnificación está aumentada diez veces.
La dos con buena resolución.
Una imagen con buena resolución comparada con otra con poca
resolución. Las dos con los mismos aumentos. Esta imagen de poca
resolución no podemos aumentarla

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Limite de resolución: aquella distancia mínima a que 2 objetos los puede separar, 
discriminar 2 cosas separadas. 
Ej. 2 puntos separados por 1mm se puede ver a vsta desnuda, a 0.5mm se puede 
diferencias, a 0.25mm es muy complicado.
Moyor PR, menor LR. Tratar de bajar el LR.
AN= gravada en los objetivos
n= índice de refracción= 1 en el aire.
= ángulo de mayor incidencia de la luz.
A mayor aumentos mayor AN, menor LM, mayor PR.

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Objetivo x100: inmersión.
A estos grandes aumentos la dispersión de la luz genera una imagen borrosa. Para 
reducir esta radiación lumínica reemplazamos el aire con un líquido con un índice de 
refracción más grande. (n=1 en el aire; n=>1 en líquido).
No utilizamos agua porque los objetivos no están diseñados para utilizar este líquido. Lo 
que realmente empleamos es aceite de cedro (aceite de inmersión). Tb se utiliza aceite 
sintético porque no huele como el de cedro y es más barato.
Es importante limpiar los objetivos tras el uso del aceite de inmersión ya que el aceite 
polimeriza y se plastifica estropeando los objetivos.
Anisol ‐huele, puede irritar la vista. 
Bromo naftaleno ‐posee una presión de vapor elevada, se evapora y es cancerígeno.
Ioduro de metilo ‐presión de vapor elevada, se utiliza como pesticida, tb tiene 
naturaleza mutagénica por lo que está prohibido.

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Objetivos en seca: x4, x10, x40
Objetivo en aceite de inmersión: x100.

Los oculares tradicionales son los de x10.
En el cas de tractar‐se d’un microscopi binocular haurem d’utilitzar un factor de 
correcció, que es troba anotat en l’espai que separa els dos oculars:
X Objectiu  x  X Ocular  x  Factor de Correcció = X Total
En la majoria de microscopis actuals aquest factor és igual a la unitat i, 
quan això passi, no trobarem cap anotació.
Ej.
Objectiu 40x
Ocular 10x                    Augment total 400x

AN: apertura numérica. Posee un valor fijo. Viene especificado en los objetivos.

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Color‐longitud de onda: Luz visible 360‐780nm
Filtro azul celeste: para que el LR se reduzca, trabajar en la gama de los azules (luz UV)
Azul/violeta‐360nm (luz UV)
Rojo‐780nm (infrarrojos)
Lámparas Tungsteno (antes): mucho calor, consumo (100 watts). Hoy se han sustituido 
por lámparas halógenas (10 watts) ya que tienen la misma potencia y la misma 
intensidad lumínica.
Las lámparas produce calor y pueden afectar a las muestras asi que hay alguna fuentes 
de iluminación externa. Ej. Fibra óptica: la luz sigue el eje del filamento, mínima pérdida. 
Es una luz fría que no genera calor.

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.MICROSCOPIO INVERTIDO Como su nombre lo indica, un microscopio invertido tiene 
una disposición inversa en sus componentes respecto a un microscopio convencional. La 
luz y el condensador están mirando hacia abajo y se encuentran en la plataforma, y los 
objetivos están debajo apuntando hacia arriba. Este equipo permite observar 
organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa, lo cual es muy útil en el 
seguimiento del estado de crecimiento, comportamiento o desarrollo del cultivo.

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Utiliza azul de metileno y sus productos de oxidación como colorantes básicos,
combinándolos con la eosina como colorante ácido.
De este modo, obtenemos una tinción diferencial, es decir, una tinción que es
capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares según se tiñan
éstas con el colorante ácido, con el básico o con la mezcla de ambos.
Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por
Giemsa.

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 Fig.  * Examples of Diagnostic Transmission Electron Microscopy (TEM) Cases 
https://www.va.gov/DIAGNOSTICEM/Diagnostic_Electron_Microscopy_Review_Case_Examples.asp
PULMONARY BLASTOMYCOSIS IN AN AIDS PATIENT
A 42‐year‐old, African‐American man presented with a two month history of weight loss and fever for two 
weeks. Presumptive diagnoses of human immunodeficiency virus infection (HIV) and acquired 
immunodeficiency syndrome were made on the basis of a CD4 lymphocyte count of 23 lymphocytes/ml. 
Chest X‐ray revealed right paratracheal adenopathy and a miliary pattern. The etiology of the patient's 
pulmonary infection was not known, but tuberculosis was an important consideration. Over five days, the 
pulmonary infection progressed and was complicated by acute respiratory distress syndrome (ARDS), 
septic shock, and death despite vigorous antibiotic and supportive therapy. Serologic tests for HIV 
infection were reported as positive after the patient's demise. The etiology of the patient's pulmonary 
infection, ARDS, and sepsis was not known until autopsy study revealed enumerable yeast‐like cells of 
Blastomyces dermatitidis in the extensively consolidated lungs and in disseminated foci of infection in 
most other major organs. Diffuse alveolar damage was closely associated with the pulmonary 
blastomycosis. Electron microscopic study of the yeast‐like cells (Figures *) of B. dermatitidis in the 
autopsy lung obtained and fixed five days after the patient's death revealed excellent preservation of 
viable organisms. The yeast‐like cells of Blastomyces dermatitidis typically have multiple (3‐5) nuclei and a 
cell wall with alternating light and dark layers.
Fig a https://www.leica‐microsystems.com/science‐lab/correlative‐in‐resin‐super‐resolution‐and‐electron‐
microscopy‐using‐standard‐fluorescent‐proteins/
CORRELATIVE IN‐RESIN SUPER‐RESOLUTION AND ELECTRON MICROSCOPY USING STANDARD 
FLUORESCENT PROTEINS
We introduce a method for correlative in‐resin super‐resolution fluorescence and electron microscopy 
(EM) of biological structures in mammalian culture cells. Cryo‐fixed resin embedded samples offer 
superior structural preservation, performing in‐resin super‐resolution, however, remains a challenge. We 
identified key aspects of the sample preparation procedure of high pressure freezing, freeze substitution 
and resin embedding that are critical for preserving fluorescence and photo‐switching of standard 
fluorescent proteins, such as mGFP, mVenus and mRuby2. This enabled us to combine single molecule 
localization microscopy with transmission electron microscopy imaging of standard fluorescent proteins in 
cryo‐fixed resin embedded cells. We achieved a structural resolution of 40–50 nm (~17 nm average single 
molecule localization accuracy) in the fluorescence images without the use of chemical fixation or special 
fluorophores. Using this approach enabled the correlation of fluorescently labeled structures to the 
ultrastructure in the same cell at the nanometer level and superior structural preservation.

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https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/search_result.html?keywor
d=negative%20staining negative staining
Negative staining is one of electron staining techniques. This technique
leaves heavy metals at the gaps in a specimen and on the supporting film
at the surrounding regions of the specimen. Negative staining enables
enhancement of the TEM image contrast.
An aqueous solution of viruses or purified proteins, etc. is dropped onto a
supporting film, and then excessive water is removed from the specimen
with a filter paper. Immediately after the removal of excessive water, a
staining solution containing heavy metals (uranium acetate,
phosphotungstic acid, etc.) is dropped onto the specimen. Then, water is
removed from the specimen with a filter paper to dry the specimen, leaving
the heavy materials at the gaps and on the supporting film at the
surrounding regions of the specimen. As a result, these regions appear
dark due to strong scattering of incident electrons, and the morphology of
the specimen is elucidated. Since the specimen itself is not stained, this
technique is termed "negative" staining.

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https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/pdf/la_cryofracture_def.pdf

Maïté Paternostre –I2BC, CEA -Saclay (France)

La mezcla Pt/C se hace incidir primeramente en ángulo para favorecer la
formación del relieve, luego la mezcla se hace incidir de forma rotacional
para favorecer los detalles. Finalmente se hace incidir C
perpendicularment (90º) para formar una pel·lícula sólida que permita
manipular la muestra

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https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/pdf/la_cryofracture_def.pdf

Maïté Paternostre –I2BC, CEA -Saclay (France)

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El MER es el más popular de los microscopios debido a las imágenes en
3 dimensiones, en volumen, que obtenemos.
Podemos introducir muestras de gran volumen al contrario del MET que
siempre trabajamos con lámina delgada y verla con una profundidad de
campo de varios mm.
En definitiva, veremos una imagen como s la viéramos con nuestros ojos
pero con una resolución de 3 nm, por ello la fácil interpretación

Lo que nos indica que es un herramienta muy útil en la industria

microelectrónica.

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The formation of an image requires a scanning system to construct the
image point-by-point and line-by-line.
The scanning system uses two pairs of electromagnetic deflection coils
(scan coils) that scan the beam along a line then displace the line position
to the next scan so that a rectangular raster is generated both on the
specimen and on the viewing screen.
In order to produce contrast in the image the signal intensity from the
beam-specimen interaction must be measured from point-to-point across
the specimen surface. Signals generated from the specimen are collected
by an electron detector, converted to photons via a scintillator, amplified
in a photomultiplier, and converted to electrical signals and used to
modulate the intensity of the image on the viewing screen.

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Non-destructive electron microscopy imaging and analysis of biological
samples with graphene coating
Jong Bo Park et al 2016 2D Mater. 3 045004

Schematic illustration of various biological objects in different scales and coating

methods for EM analysis. (a) and (b), Conventional coating methods of non-
conducting biological samples. Soft biological samples such as cells and bacteria
require
complicated coating processes including aldehyde fixation, osmium tetroxide
fixation, dehydration, critical point drying, staining, metal coating, etc. Hard-
surfaced biological samples such as insects and plants are usually coated with
Au, Pt by vacuum sputtering. The metal coating is simple, but it disables high-
resolution imaging and analysis. (c) Simple coating process using graphene
floating on water surface. The ambient drying process allows the conformal
coating of graphene on sample surface.

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