UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES

UNIDAD DE APRENDIZAJE: BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR

PRESENTACIÓN: ELECTROFORESIS DEL ADN

DOCENTE: GEMIMA

EQUIPO:
ANA LAURA CHÁVEZ ARCE
SURISADAHI ARTEAGA
RAMIRO VILLASALMA DAMIÁN
PAOLO FRANCISCO GARCIA LEON

IGUALA DE LA INDEPENDENCIA GRO, DICIEMBRE, 2023

ETAPAS DE LA TÉCNICA
(ELECTROFORESIS)
Obtención de prueba

Las muestras de ADN se cargan en pozos en el

extremo del gel más cercano al electrodo
negativo. Se enciende la fuente de poder y los
fragmentos de ADN migran a través del gel (hacia el
electrodo positivo). Cuando el gel ha corrido, los
fragmentos se separan por tamaño.
Preparación del gel de agarosa

Se debe pesar 1g de agarosa y este se disuelve en 100 mL de buffer TAE

1X o TBE 1X. Caliente la mezcla contenida en un matraz ex profeso, en un
horno de microondas dando pulsos de 30 segundos hasta lograr una mezcla
homogénea.
Equipo: Material:
• Centrifuga eppendorf de • Matraces pequeños.
sobremesa. Microondas o Pipetas de vidrio de 5
placa calefactora. Equipo mL. Probetas.
de electroforesis (cubeta, Micropipetas
soporte, peine, fuente de automáticas y puntas
alimentación). desechables para las
Transiluminador de luz UV. mismas.
Equipo de tratamiento de • Tubos eppenrdorf de
imagen y fotografía 1.5 mL
térmica.
Preparación de la
muestra en el Buffer
La preparación de muestras Buffer o tampón consta de
varios pasos: pesaje de los componentes, disolución de
los componentes, ajuste del pH y reposición al volumen
final. Dado que la proporción del ácido con respecto a la
base en una solución tampón está ligada directamente al
pH final, resulta vital para pesar los componentes con un
elevado grado de exactitud.
Carga de la muestra
Es realizada mediante la
obtención de la muestra líquida
de ácidos nucleicos a analizar;
la obtención de un soporte
sólido individual; la adsorción de
la muestra líquida en el soporte
sólido individual y el depósito
del soporte sólido individual
conteniendo la muestra en un
pocillo del gel de agarosa para
el desarrollo de la electroforesis
de los ácidos nucleicos en el
gel, donde la carga de las
muestras se realiza antes de
sumergir el gel de agarosa en
un tampón de migración.
 Cuando el sistema está encendido y pasa corriente por el
gel, se dice que el gel está corriendo. Conforme corre el gel,
CORRIDA DE GEL los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a
través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos
más grandes. Después de un rato que ha corrido el gel, los
fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del
extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán
cerca de los pozos.
 Teñido del gel
Se visualizan normalmente con colorantes de gel. Utilizando una reacción de unión al
colorante o una reacción química productora de color, las tinciones de gel de proteínas
reaccionan selectivamente con las proteínas para producir un gel teñido.

A pesar de que estas moléculas son macro, aun así son

demasiado pequeñas para ser observadas por el ojo humano,
por lo que para esto, se requiere de la tinción, un grupo de
tinturas que permiten que se visualicen los caminos que estas
partículas toman.
 Visualización con luz ultra violeta y
resultados
Los compuestos tienen que ser “visualizados” después de
la elución, lo que significa convertirlos temporalmente en
algo visible. Los métodos de visualización pueden ser no
destructivos (el compuesto no cambia después del
proceso) o destructivos (el compuesto se convierte en
algo nuevo después del proceso
ELECTROFORESIS EN GEL DE
CAMPO PULSADO
■ El servicio de Electroforesis en Gel de Campos Pulsados
(PFGE) proporciona el equipamiento e infraestructura
necesaria para la caracterización molecular de microorganismos
mediante esta técnica de biología molecular.
■ La sistemática de funcionamiento de la PFGE consiste en
alternar el campo eléctrico entre pares de electrodos
espacialmente distintos, lo que propicia que moléculas de ADN
de tamaño elevado (Mb) se reorienten y se trasladen a
diferentes velocidades a través del gel de agarosa.
■ En el campo de la Seguridad Alimentaria, permite llevar a cabo
la caracterización genética de aislados microbianos, siendo
idóneo para estudios epidemiológicos de patógenos de origen
alimentario.
 DIFERENCIAS CON LA
ELECTROFORESIS
CONVENCIONAL
■ Los geles de agarosa tienen un
poder de resolución mucho
menor que los de poliacrilamida,
porque no permiten separar
moléculas de ADN que difieren
en tamaño menos de unas 50 pb.
■ La electroforesis en gel de
agarosa tiene un límite superior
de unas 40-50 kb en el tamaño
de las moléculas de ADN que
puede separar.
 VENTAJAS ENTRE
AMBOS
■ La popularidad de los geles de poliacrilamida proviene
de varias propiedades fundamentales como claridad
óptica, neutralidad eléctrica y disponibilidad en un
amplio rango de porosidad.
■ Los geles de poliacrilamida son geles químicamente
entrelazados formados por la reacción de acrilamida
con un agente de entrecuramiento bifuncional como el
Bis
 EQUIPO Y
•
•
MATERIALES
MATERIALES
Matraz de 250 mL
• Probeta 100 mL
• Micropipetas
• Microondas
• Camara de electroforesis • REACTIVOS
horizontal
• Guantes de nitrilo • Agarosa
• Balanza analíticá • Ácido Bórico ≥ 99.5%
Ác.
• Acético glacial
• Tris base
• Glicerol
• Xileno cianol
• Azul de bromofenol
■ Buffer: En la electroforesis, es el agente tamponante
que mantiene el pH. Se incluye tanto en el gel como
en el tampón de cubeta.
 ELECTROFORESIS DE
ADN EN GEL
POLIACRILAMIDA

■ Comúnmente denominada
electroforesis en
poliacrilamida (PAGE) es
una de las técnicas más
ampliamente usada para
caracterizar mezclas
complejas de proteínas.
■ La electroforesis en
poliacrilamida es un método
conveniente, rápido y
económico a nivel de
muestra pues se requieren
sólo cantidades del orden de
microgramos de proteína.
■ Preparación de las muestras:
Mezclar con el buffer de carga SB 2x (1:1) y
hervir a 95º durante al menos 5mins, junto con
el estándar.
Mientras, quitar el peine del gel con mucho
cuidado y lavar los pocillos con buffer de
electroforesis con el fin de eliminar las
partículas no polimerizadas .
INMUNOTRANSFEREN
CIA
■ Mientras corre la electroforesis se preparan los
componentes del sándwich: Se sumergen en
solución Transfer 6 trozos de papel de filtro grueso
del tamaño del gel que se va a transferir, así como
un trozo de papel de nitrocelulosa del mismo
tamaño.
REVELADO
DE GEL
■ Teñir el gel durante 1 h con sc de
trabajo de coomassie en agitación.
Descartar esta solución y añadir sc.
desteñidora en agitación.
Cambiarla con frecuencia hasta que
el gel no tenga fondo azul. Esta
solución se puede reciclar
pasándola por carbono activo.
■ Poner el gel en sc. Preservadora 10
mins con agitación y conservarlo
en agua.
INMUNOBLOTTING

■ Incubar el papel de nitrocelulosa con solución

de bloqueo durante 20-30 min con agitación.
■ Diluir el primer anticuerpo en solución de
bloqueo. Añadir al papel de nitrocelulosa e
incubar toda la noche en un agitador de placas.
■ Lavar 3 veces 10 min cada vez con solución de
lavado.
■ Diluir el segundo anticuerpo y añadirlo a la
membrana. Incubar de 4 a 6 horas.
■ Lavar 3 veces 10 min cada vez con solución de
lavado.
■ Añadir solución de imunofijación hasta el
desarrollo de las bandas. Parar la reacción con
agua.
MATERIALES Y REACTIVOS

■ Materiales • Reactivos • 2-mercaptoetanol

■ Muestra biológica • Nitrógeno líquido • Tris HCl
• Inhibidores de • Tris Base
■ Mortero de cerámica proteasas y fosfatasas • Coomassie
■ Guantes • Fenol  Ácido acético
• Acetona • KCl
■ Micropipetas • Metanol • PVPP
■ Gradillas • Acetato de amonio. • HCl
• acrilamida • EDTA
■ Tubos de 1.5 mL • bis-acrilamida • Sacarosa
■ Tubos de 15 mL Tubos de 50 Ml • SDS • Urea
• Persulfato de amonio • Tiourea
■ Centrífuga Cámara de electroforesis
• Sulfato de amonio • Chaps
■ Fuente de poder • TBP
■ • DTT
Escáner
• Temed
 MÉTODOS Y
APLICACIONES
■ La aplicación de la electroforesis en la investigación
biomédica es muy diversa, desde cuestiones muy
básicas como analizar la calidad de una extracción de
ácidos nucleicos o proteínas o como un paso previo
para la purificación u otros métodos empleados en
biología molecular o bioquímica para el análisis de
muestras de pacientes para el diagnóstico de
enfermedades, análisis de ascendencia, reconocimiento
de cadáveres, pruebas de paternidad, etc.
■ Para el análisis de proteínas,
la electroforesis en gel puede
proporcionar información
sobre el peso molecular, la
carga, las subunidades o la
pureza de una preparación.
Es relativamente simple de
usar y es altamente
reproducible. El uso más
común es el análisis
cualitativo de mezclas
complejas de proteínas. Los
geles de poliacrilamida se
forman por la
copolimerización de la
acrilamida y la bis-
acrilamida.