Técnicas generales de laboratorio

Denisa Pavel
ESQUEMA TIPOS DE ELECTROFORESIS

1.ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

-Aplicaciones:
● Separación de las proteínas presentes en el suero y otros fluidos biológicos para
obtener el proteinograma.
● Sustituida por la electroforesis en gel de agarosa y por la electroforesis capilar por la
mayor automatización.

2.ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

● Para la separación e identificación de fragmentos de ácidos nucleicos.
● Para la determinación de proteínas en suero → mediante electroforesis horizontal.
● Se usan tampones TAE o TBE→ ácidos nucleicos cargados - y migran hacia el
ánodo.
● Etapas proceso electroforético:
1. Preparación gel de agarosa:
● Tampón:
○ TAE (Tris-acetatato): baja fuerza iónica y baja capacidad
tamponanante.
○ TBE (Tris-borato): alta fuerza iónica y alta capacidad
tamponante.
● Agarosa: % habitual entre el 0'3% y el 4%.
● Tinción: bromuro de etidio.
2. Siembra de las muestras en gel:
● Tampón de carga: sustancias que aumentan la densidad de la
muestra.
● Marcador: colorante que permite visualizar el frente de la
electroforesis. Azul de bromofenol.
3. Separación electroforética: en electroforesis horizontal.
● Voltaje demasiado bajo, baja movilidad de las bandas.
● Voltaje demasiado alto, disminuye la resolución
4. Visualización del gel: bromuro de etidios, estudiar el gel con luz ultravioleta.
● Pueden ser añaidos al generar el gel o bien después de la
electroforesis incubar el gel con una solución del marcador.

3.ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

● El más utilizado para la purificación, análisis y caracterización de proteínas..
● Electroforesis plana vertical aunque también puede ser capilar.
● Gel entre dos cristales en disposición vertical.
● Etapas:
1. Preparación del gel:
● Se suele realizar "in situ"
● La separación depende de la densidad de carga de las moléculas y
de su tamaño.
● Agente iniciador: TEMED
● Catalizador: persulfato amónico.
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
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Denisa Pavel
4. Electroforesis
5. Detección por tinción
a. Azul de coomassie
b. Sales de plata
● Tipos:
○ En condiciones no desnaturalizantes: no afecta a la configuración espacial
de las proteínas.
○ En condiciones desnaturalizantes: SDS que se une a las proteínas
formando complejos cargados - en los que se altera su estructura.

4.ISOELECTROENFOQUE
● Gel de poliacrilamida o gel de agarosa.
● Requiere un voltaje más alto por lo que se usan cubetas o sistemas de refrigeración.

5.INMUNOELECTROFORESIS
● Combinación de una electroforesis en gel de agarosa y la inmunodifusión con un
anticuerpo específico.
● Permite separar sustancias con velocidades de migración idénticas.
● Proceso:
1. Aplicación muestra.
2. Separación en agarosa de las proteínas.
3. Aplicación de un anticuerpo en cada separación.
4. Lavado y tinción.

6.ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
● Dos electroforesis seguidas realizadas en condiciones diferentes.
● La primera separación se realiza con isoelectroenfoque y la segunda con
PAGE-SDS.
● Se consigue separar mezclas complejas de proteínas.

7.ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES

● Fragmentos sometidos a dos campos eléctricos de distinta orientación
perpendiculares entre sí.
● Separación de grandes fragmentos de ADN.

8.ELECTROFORESIS CAPILAR
● Separación en el interior de tubos capilares con diámetros muy pequeños (75 μm) y
de 25cm de longitud y posee un detector.
● Analitos empujados por el efecto electro osmótico, independientemente de su signo.
● No necesita colorantes.