Desarrollo de un sistema de PCR multiplex para la detección

simultánea del virus del síndrome de la mancha blanca y la

infección por parvovirus hepatopancreático

Materia
Acuacultura

Alumno
Biól. Refugio Riquelmer Lugo Gamboa

Marzo de 2021
Introducción

El virus del síndrome de la mancha blanca, pertenece al género Whispovirus de la

familia Nimaviridae. El WSSV comprende una nucleocápside envuelta en forma de
bastón que encierra un genoma de ADN bicatenario circular grande de
aproximadamente 293-300 kb.
Se detectó por primera vez en Taiwán y China. La enfermedad comúnmente resulta en
una mortalidad del 80 al 100% dentro de una semana.
El HPV se informó por primera vez en F. chinensis en Corea en 1985, y se ha
observado infección tanto en F. chinensis como en L. vannamei.
El HPV es un virus icosaédrico no envuelto que pertenece a la familia Parvoviridae en el
grupo Densovirus. El virus contiene un genoma de ADN monocatenario de
aproximadamente 6 kb que codifica tres proteínas: la proteína no estructural 2 (NS2), la
proteína no estructural 1 (NS1) y las proteínas estructurales.
Métodos de diagnostico para HPV y WSSV

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)
PCR en tiempo real
LAMP combinada con tiras cromatográficas de flujo lateral (LFCS)
Hibridación in situ
Pruebas inmunocromatográficas específicas (TIC)
 Colección de muestras

Se recolectaron muestras de L. vannamei de 17 granjas de cultivo ubicadas en la costa

oeste de la península de Corea. 6 granjas estaban ubicadas en Hongsung-Gun,
provincia de Chungnam. 11 en Sinsan-Gun, provincia de Cheonnam
30 individuos de apariencia saludable fueron capturados de las granjas en a mitad de
la temporada de cosecha.
Se compraron veinte F. chinensis vivas en un mercado pesquero en Hongsung-Gun.
Se seleccionaron al azar diez individuos de cada muestra y se mantuvieron por
separado en tubos cónicos de 50 mL a 80 ° C hasta el aislamiento del ácido nucleico.
Extracción de ADN

Se homogeneizaron aproximadamente 20 mg de pleópodos de

muestras congeladas en 500 μL de tampón de extracción que
contenía NaCl 0,1 M, Tris-HCl 20 mM, EDTA y SDS al 0,5%.
El ADN se extrajo directamente del homogeneizado usando 500 µl de
una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) y luego
se precipitó con 0,1 volúmenes de NaOAc 3 M (pH 5,3) y dos
volúmenes de etanol absoluto.
Los sedimentos se lavaron con etanol al 70% y los sedimentos
secados al aire se resuspendieron en 100 µl de tampón TE.
Diseño de primers
Se realizó una alineación de múltiples secuencias de ADN utilizando ClustalW2 (EBI)
para localizar una secuencia conservada en diferentes cepas de WSSV o HPV.

Secuencias en Gen-Bank:

DQ902658, AY324881, EU414753, AY249442 y AY249443 WSSVF / WSSVR

WSSV
HPV JN082231, AY008257, EU588991, EU247528, DQ002873, DQ458781,
FJ265774 y GU371276
HPV1414F / HPV1750R

Como control positivo interno, se diseñaron cebadores específicos para el gen de la β-

actina del camarón utilizando las secuencias JQ241179 (P. monodon), DQ205426 (F.
chinensis) y AF300705 (L. vannamei).
PCR multiplex para detección de WSSV y HPV

La mezcla de reacción de 20 ul contenía:

40 ng de ADN total extraído de camarones infectados
1 U de ADN polimerasa Prime Taq (GeNet Bio, Cheonan, Corea)
0,5 mM de dNTP
4 mM MgCl2
Tampón de reacción 2X (Prime Taq premezcla 2X ; GeNet Bio)
Junto con diferentes proporciones (7,5 pmol de cebadores de HPV y 2,5 pmol de
WSSV y cebadores de b-actina) de los tres conjuntos de cebadores, de modo que las
cantidades de productos de PCR en la PCR multiplex fueran similares a las de las PCR
separadas.
Resultados

Para la detección simultánea de WSSV y HPV de diferentes hospedadores y orígenes

geográficos, se diseñaron conjuntos de cebadores de regiones conservadas en ambos
virus. Además, se diseñó un conjunto de cebadores de control interno basado en una
comparación de secuencias de los genes de b-actina de los tres huéspedes de WSSV y
HPV.
 Diseño de imprimación

PCR con cebadores

se diseñó un conjunto de cebadores específicos de WSSV
mediante la alineación de secuencias L. vannamei
del gen de la b-actina de las especies PCR multiplex HPV
de camarón más cultivadas, L. F. chinensis
vannamei, P. monodon y F. chinensis, P. monodon
que mostró una identidad de
secuencia de nucleótidos del 79,7 al
98,3%.
El conjunto de cebadores amplificó un
fragmento de ADN de 139 pb,
correspondiente a los nucleótidos
190–328 del gen de la b-actina de L.
vannamei (AF300705)..
 Test de optimización y sensibilidad

gen PV: WSSV: b-actina

Las condiciones de la reacción de PCR múltiple se optimizaron HPV
en términos de temperatura de hibridación y relación de PCR con la misma cantidad
cebadores. de cebadores para WSSV
b-actina
En primer lugar, se determinó la temperatura de hibridación
óptima para cada conjunto de cebadores utilizando ADN total
extraído de L. vannamei libre de virus e infectado por WSSV o
HPV.
El segundo factor considerado en la PCR multiplex es la
relación de cebadores. La proporción óptima se determinó
como 3: 1: 1 (cebador de HPV de 7,5 pmoles en una reacción
de 20 ul).
La sensibilidad de la PCR multiplex se determinó utilizando plásmidos
recombinantes purificados que contenían los genes diana de HPV y WSSV. El
ADN plasmídico se diluyó diez veces en serie y se utilizó como molde de ADN
para la PCR multiplex. La electroforesis en gel de agarosa determinó que el
límite de detección era 21,4 copias (0,079 pg) de WSSV y 19,0 (0,0678 pg) de
HPV
 Pruebas de campo de la coinfección por WSSV y VPH

Diez individuos de cada

muestra de L. vannamei
recolectada de 17 granjas
de cultivo y un grupo de F.
chinensis salvaje fueron
analizados para la
coinfección por WSSV y
HPV
Todas las granjas de cultivo estaban infectadas con
WSSV o HPV. Por lo tanto, 12 de las 17 granjas de L.
vannamei estaban coinfectadas con WSSV y HPV.
Aunque ninguna granja de cultivo estuvo libre de virus,
los individuos de algunas granjas dieron negativo para
ambos virus, 25 de un total de 270 (14,7%) L. vannamei
fueron negativos para ambos virus.
De un total de 170 individuos de L. vannamei, 71
(41,8%) estaban coinfectados con WSSV y HPV, 68
(40,0%) estaban infectados individualmente con WSSV
y 6 (3,5%) estaban infectados solo con HPV
Referencia bibliográfica

Jeeva, S., Kim, NI, Jang, IK y Choi, TJ (2014). Desarrollo de un sistema de PCR
multiplex para la detección simultánea del virus del síndrome de la mancha blanca y la
infección por parvovirus hepatopancreático. Investigación en acuicultura , 45 (6), 1073-
1083