ESPECTROFOTOMETRIA

MOLECULAR UV

CUANTIFICACIÓN DE DNA
REGIÓN ULTRAVIOLETA
• La region UV comprende de 100-400nm, y se divide en tres bandas :
• UVA (315-400 nm)
• UVB (280-315 nm)
• UVC (100-280 nm).

• En espectrofotometría, usualmente se trabaja la region de 180-390nm

AMINOÁCIDOS: BLOQUES ESTRUCTURALES
DE LAS PROTEÍNAS
• Las proteínas están construidas por bloques estructurales llamados aminoácidos
AMINOÁCIDOS APOLARES

Glicina
AMINOÁCIDOS POLARES
AMINOÁCIDOS APOLARES (HIDRÓFOBOS)
• Contienen grupos R hidrocarbonados sin cargas positivas o negativas.

• Puede apreciarse que en esta clase de aminoáciodos están los

aromáticos y los alifáticos

• Alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, y prolina

• Aromáticos: fenilalanina y triptófano.
 AMINOÁCIDOS POLARES
• Son capaces de formar puentes de hidrógeno. Se incluyen: serina, treonina, tirosina, asparagina y glutamina.

• Además de formar puentes de hidrógeno, los grupos hidroxilo participan en la formación del éster de fosfato
(Mx de regulación).

• Los grupos amida de la asparagina y glutamina también forman puentes de hidrógeno que estabilizan las
proteínas
ENLACE PEPTÍDICO, BASE ESTRUCTURAL DE UNA
PROTEÍNA, PROTEÍNAS
 ABSORBANCIA

max ε (M-1 cm-1)

(nm)
Triptofano 278 5600
287 4500
Tirosina 275 1400

Fenilalanina 258 200

ABSORCIÓN UV-VIS DE PROTEÍNAS
•  
•  
ESTIMACIÓN DEL COEFICIENTE DE
ABSORTIVIDAD MOLAR DE UNA PROTEÍNA
•ε 280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)

• n(Trp) = número residuos de triptofano en la secuencia

• n(Tyr) = número residuos de tirosina en la secuencia

• n(SS) = número de enlaces disulfuro en la proteína

ESPECTRO DE
LA RNASA
DNA, ESTRUCTURA GENERAL

Bases nitrogenadas
 Absorción en
el UV lejano
de los ácidos
nucleicos

Cromóforo, responsable
de la absorción, las
bases nitrogenadas
ABSORCIÓNMAXIMA () Y COEFICIENTE DE EXTINCIÓN () PARA LAS BASES PURÍNICAS Y
PIRIMIDÍNICAS
λ Max (nm)

Adenina 260.5 13.4

Adenosina 259.5 14.9
NADH 340 , 259 6.23, 14.4
NAD+ 260 18
Guanina 275 8.1
Guanosina 276 9.0
Citosina 267 6.1
Citidina 271 9.1
Uracilo 259.5 8.2
Uridina 261.1 10.1
Timina 264.5 7.9
Timidina 267 9.7
DNA 258 6.6
RNA 258 7.4
DETERMINACIÓN DE DNA
• A continuación cargue el siguiente enlace
• https://youtu.be/qw2ZaUXgWHU
• Indique qué cuidados deben tenerse antes del análisis
• Explique cuál es el manejo apropiado de las celdas en espectrofotometría
• ¿Qué volumen de agua se agrega a la celda?
• ¿Qué volumen de muestra se agrega a la celda?
PREGUNTAS ADICIONALES
• ¿Qué procedimiento se sugiere para mezclar la muestra con el volumen de agua?
• Indique qué método se seleccionó para la cuantificación
• Explique el procedimiento a seguir para la cuantificación
• Indique cuál es el factor de dilución la concentración de DNA en la dilución leída y en la muestra
original
• Indique cuál es el propósito de leer el radio A260/A280
• ¿Qué valor se tiene de referencia para indicara que se está trabajando con DNA puro?
 SIMULADOR DE ESPECTROS DE ABSORCIÓN
ULTRAVIOLETA DE PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS
• http://biomodel.uah.es/lab/abs/uvProtDNA.htm

Seleccione el color
para trazar el espectro
con cada muestra,
Habilite la opción de
superponer curvas
Proyecte cada
espectro en la
pantalla, y registre las
absorbancias y el
radio A260/A280
 EN BASE AL SIMULADOR LLENE EL
SIGUIENTE CUADRO
Muestra Abs 260 Abs 280 Abs 260/Abs 280

Sólo proteína

Sólo DNA

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4
CUANTIFICACIÓN DE NADPH
• A continuación el enlace al
simulador
• http://biomodel.uah.es/lab/abs/es
pectro.htm
• Coloque en la cubeta 1 agua y
corra el espectro
• Coloque en la cubeta 2 y corra el
espectro.
• Anote la longitud de onda del
máximo de absorbancia
BANCOS DE ESPECTROS, ENLACES
ADICIONALES
• http://www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html
• https://webbook.nist.gov/chemistry/name-ser/