Producción de fructuosa a

partir de lactosa

Elizabeth Eunice luna alegre

Thalia Antonia umiña pari
Nilo montoya Figueroa
Myrian Alexis Maya Mayta
 introducción

 La fructuosa es usada como un endulzante en la industria alimentaria especialmente en el

área de bebidas calientes, cereales para desayuno y productos horneados, esta Presenta una
dulzura de 1.2 a 1.6 veces mayor que la sacarosa, la producción en masa de fructuosa a
partir del jarabe de maíz fue uno de los primeros procesos enzimáticos a gran escala donde
se hidroliza usando la alfa-amilasa, glucomilasa y pullumanasa como catalizadores. hasta
ahora este proceso es de fermentación es el que se hace a mayor escala por el mundo.
 La producción de jarabes que contienen fructosa también se puede llevar a cabo utilizando
lactosa como materia prima, con la ventaja de este carbohidrato es que sale del suero de
queso, un subproducto de bajo costo que tiene un contenido de lactosa de
aproximadamente el 80%
 La producción de jarabe de lactosa-fructosa a partir de lactosa requiere dos reacciones
enzimáticas secuenciales: primero, la hidrólisis de lactosa en glucosa y galactosa por una
beta-galactosidasa y luego, la isomerización de glucosa en fructosa por una glucosa
isomerasa
 La lactosa-fructosa producida enzimáticamente a partir de lactosa se ha aplicado como
endulzante en helados y yogurt
 La producción de jarabe de lactosa-fructosa se ha llevado a cabo utilizando la forma
soluble de beta-galactosidasa y glucosa isomerasa, la beta-galactosidasa soluble y glucosa
isomerasa inmovilizado que contienen células enteras reticuladas con glutaraldehído y las
formas inmovilizadas de la beta beta-galactosidasa del glucosa isomerasa
 En este caso la beta-galactosidasa se inmoviliza por adsorción de microporos en laminas
de plástico y el glucosa isomerasa inmovilizado fue el catalizador comercial Maxazyme
glucosa isomerasa -Immob donde se queda atrapado en partículas de gelatina y se retícula
con glutaraldehído
 Debido a las diferentes condiciones de reacción de beta-galactosidasa y glucosa isomerasa
la producción de epa se lleva a cabo a partir de operaciones secuenciales
 a excepción del trabajo informado por Abril y Stull de 1989, quienes evaluaron un proceso
en un solo recipiente agregando ambas enzimas al mismo tiempo. Sin embargo, todo el
proceso no se llevó a cabo en un conjunto específico de condiciones de operación; utilizan
primero las condiciones óptimas para beta-galactosidasa que es un ph 7 a 33 grados
centígrados y, después de la hidrólisis de lactosa, las condiciones de reacción se
cambiaron a las óptimas para glucosa isomerasa adheriendo MG2+, cambiando el PH a 7,8
y aumentando la temperatura a 60 grados centígrados
 Considerando que la inmovilización de biocatalizadores este método ofrece la oportunidad
de realizar reacciones una en una favoreciendo la eficiencia y sostenibilidad ambiental del
proceso, el objetivo de este trabajo fue evaluar la co-inmovilización de beta-galactosidasa
y glucosa isomerasa en formato CLEA y la aplicación adicional del catalizador combinado
en la producción de lactosa-fructosa en un solo recipiente de reacción.
 2. Materiales y métodos:

Lactosa monohidrato, orto nitrofenol (o-NP) y orto ni- trofenil-β- D- El galactopiranósido (o-NPG) ,el kit
Glucose-LQ , D- fructosa, D - (+) - galactosa, carbodiimida, etilendiamina, glutaraldehído y todos los
demás productos químicos fueron de calidad analítica. Aspergillus oryzae β- gal ( Concentrado de lactasa
fúngica) ,otros productos químicos, como disolventes, sales inorgánicas y ácidos, eran productos de
grado reactivo y se usaban sin purificación adicional.

2.2 Determinación de la actividad de la β-galactosidasa

La actividad enzimática de β-gal se ensayó utilizando o-NPG como sustrato y midiendo el o-NP liberado
espectrofotométricamente a 420 nm utilizando un espectrofotómetro termostatizado ,con células agitadas
magnéticamente . Una unidad internacional de actividad β-gal (UI βgal) se definió como la cantidad de
enzima que hidroliza 1 μmol de o-NPG por minuto a partir de una solución de o-NPG 45 mM en tampón
citrato-fosfato 100 mM pH 7 a 25 ° C. El coeficiente de extinción molar de o-NP fue de 2,21 mM −1 min
−1
2.3 Determinación de la actividad de la glucosa isomerasa

La actividad enzimática de GI se analizó utilizando fructosa como sustrato y midiendo la formación de

glucosa se definió como la cantidad de enzima que isomeriza 1 μmol de fructosa por minuto a partir de
una solución de fructosa 1 M en 100 mM

2.4. Determinación del contenido de proteínas de las preparaciones enzimáticas comerciales

El contenido de proteínas de las preparaciones comerciales de β-gal y GI se determinó mediante el

ensayo de Bradford , utilizando albúmina de suero bovino como patrón proteico.

2.5. Aminación de glucosa isomerasa

para la aminación de proteínas . Se preparó una solución de GI a una concentración de 5 mg de
proteína por ml en una solución 250 mM de etilendiamina pH 4,75 y se incubó a 5ºC. Luego, se
añadió carbodiimida para obtener una concentración de 10 mM. La solución se incubó
adicionalmente a 5ºC durante 30 min y luego se dializó contra tampón de fosfato de sodio 50 mM
pH 7,0 tres veces a 10ºC. La cantidad de grupos amino en la superficie de la proteína antes y
después de la aminación química se determinó como se informó anteriormente usando el reactivo
TBN.
2.6. Elaboración y caracterización de combi-CLEAs

Diferentes relaciones de actividad de β-gal y GI y glutaraldehído a proporciones de masa de proteína

total (1,67, 3,33 y 0.83), obteniendo cinco biocatalizadores diferentes listados en tabla. Las
condiciones de precipitación se mantuvieron durante 45 min a 10 ° C. A continuación, se añadió una
solución de glutaraldehído (a una determinada relación en masa glutaraldehído / proteína) para la
reticulación de las enzimas. Se dejó reaccionar la mezcla durante 1 hora y, finalmente, se recuperaron
los biocatalizadores por centrifugación (10000 rpm; 15 min, 10ºC) y se lavaron con tampón fosfato
potásico 100 mM pH 7,0. El rendimiento de inmovilización (IY) y el actividad específica (una sp) de
los catalizadores se determinaron.
2.7 Síntesis de fructosa a partir de lactosa en operaciones de lotes repetidos
Para evaluar la reutilización del catalizador, se realizó la síntesis de fructosa en modo de operación por
lotes repetidos a 45 ° C, pH 7,0 y 10% (p / p) de concentración de lactosa. Cada lote se llevó a cabo
durante 10 h, y luego el catalizador se recuperó por centrifugación y se lavó tres veces con tampón
citrato-fosfato 100 mM, pH 7,0, antes de usarlo en el siguiente lote.
 RESULTADOS Y DISCUCIONES:
 3.1. Caracterización de β-gal = BETA GALACTOSIDASA y GI= GLUCOSA ISOMERAzA
 Se caracterizo por el termino de proteína total y su concentración de proteína
 3.2. Preparación de combi-CLEA
 Se evaluó diferentes concentraciones de sulfato de amonio para la preparación de gl y b-gal a partir de
relaciones actividades enzimáticas.
 Se requirió una mayor concentración de sulfato de amonio para la preparación de b-gal que para gi y esta
diferencia puede expresarse por la comparación de aminoácidos bastantes diferentes de las enzimas fue lo
que dijo (galm amrhein y hubbuch del 2017)
 3.3. Efecto de la relación de actividad GI a β-gal y la relación de masa glutaraldehído a proteína total en la
preparación de combi-CLEA
 Dado que la cantidad usada en la enzima para la preparación de combi-clea afecta las propiedades finales del
biocatalizador .
 El efecto de variar el ig.La relación de actividad β-gal se estudió en combinación con rendimiento de inmovilización (IY)
de CLEA, esta actividad específica (un sp) y masa de catalizador obtenida. Primero, tres IG diferentes a a las relaciones de
actividad β-gal. Y esto mantiene una constante relación de masa de glutaraldehído a proteína total.
 3.4. Estabilidad térmica de combi-CLEA
Se evaluó a tres temperaturas en condiciones no reactivas el gi en
combie–clea y se mantuvo completamente estable durante 35 a 55ºc .
Gl es una enzima termoestables que generalmente opera a temperaturas
de 60º con mas cuando esta inmovilizada esto fue lo que acoto
(bhosale, rao y deshpande) pero en si en general todos los combie-
clean seleccionados tenias una estabilidad similar.
3.5. Rendimiento de combi-CLEA en la
producción de LFS
 Se evaluó el rendimiento de los combi-CLEA preparados en la producción de LFS. Los
biocatalizadores evaluados fueron los combi-CLEAs A,B y C, que se prepararon utilizando
diferentes UI iniciales GI/ IU β-gal y un metro exceso/ metro prot de 1,67.
 las tasas de hidrólisis fueron más altas que las tasas de isomerización, y los valores más
altos se obtuvieron con combi-CLEAs C, lo que se esperaba debido a sus actividades
específicas más altas. Además, se determinó la composición de la LFS obtenida después de
30 h de reacción con cada biocatalizador , no mostrando diferencias significativas entre
ellos.
3.6. Efecto de la temperatura en la producción
de LFS
 La temperatura es una variable importante ya que ejerce efectos opuestos sobre la
actividad y la productividad, por lo que se evaluó su impacto en la producción de EPA con
combi-CLEAs C.
 A pesar de que la estabilidad de β-gal fue muy sensible a la temperatura en condiciones no
reactivas y un valor de vida media de.Se obtuvo 0.53 h a 55 ° C, la productividad
específica más alta de fructosa (q 90) se obtuvo a esta temperatura.
 Este resultado se explica por una mayor actividad a mayor temperatura y una
protecciónefecto del sustrato y productos
 Como era de esperar, el equilibrio glucosa-fructosa se acercó más rápidamente a la
temperatura más alta de 55 ° C,
 la tasa de producción de fructosa aumentó casi 10 veces cuando la temperatura se elevó de 35 a 55 ° C, lo
que explica la reducción significativa en el tiempo para acercarse al equilibrio. En el caso de la tasa de
hidrólisis, su aumento fue solo triple. La A sp de combi-CLEA en el momento en que se hidrolizó el 90%
de la lactosa mostró un aumento de 2,5 veces cuando se elevó la temperatura de 35 a 55 ° C. La
composición de azúcar de la LFS producida no se vio afectada significativamente por la temperatura de
reacción
 Dado que los combi-CLEA producidos son catalizadores bi-enzimáticos, se requiere un equilibrio óptimo
entre la estabilidad y la productividad específica de GI y β-gal, siendo ambos parámetros dependientes de
la temperatura. Por ello, a pesar de la mayor productividad específica a 55 ° C, la temperatura seleccionada
para realizar la producción de LFS con la combi- CLEA fue de 45 ° C.
3.7. Estabilidad operativa de combi-CLEA

 La conversión de lactosa fue cercana al 90% en todos los lotes, con una conversión de
glucosa-fructosa cercana al 45%, lo que representa aproximadamente el 90% de la
conversión de equilibrio. Los resultados muestran que los combi-CLEA se pueden utilizar
al menos para cinco lotes secuenciales (equivalentes a 50 h de funcionamiento) sin pérdida
de calidad del producto. El contenido de fructosa en la LFS fue de alrededor del 22% del
total de carbohidratos en todos los lotes.
4. Conclusiones

 Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se informa sobre el diseño de un
catalizador combinado β-gal / GI y su aplicación exitosa a la producción de LFS en un solo
recipiente. La aminación química de la superficie GI es crucial para la preparación de los
combi-CLEA de β-gal y GI. La falta de grupos amina en la superficie de GI se ha superado
con la modificación química de los grupos carboxílicos que permiten la reticulación
adecuada de las moléculas de la enzima.
 Resultó en un biocatalizador con buena consistencia mecánica, alta actividad expresada de
ambas enzimas, ylas tasas de reacción más altas de hidrólisis e isomerización entre los
Lotes importantes sin inactivación enzimática, obteniendo una calidad constante.
 El producto obtenido de la hidrólisis de lactosa y más adelante de la glucosa en fructosa
puede considerarse como un atractivo edulcorante para la industria alimentaria y
representa una opcion interesante para mejorar la lactosa del permeado de suero.