DIFRACCIÓN DE RAYOS X

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA 3D

Curso: Bioquímica
Integrantes:
Luis E. Palencia Anaya
Juan D. Alvarino Morales
 NATURALEZA DE LOS RX

 La unidad de medida λ en la región de los RX es

el angstrom (Å), igual a 10^-10 m.

 Los rayos x usados en difracción tienen

longitudes de onda en el rango 0.5-2.5 Å
mientras que la longitud de onda de la luz
visible está en el orden de 6000 Å.

 La energía de los rayos X oscila entre los 0.1 y

100 keV, para la difracción de rayos X se utilizan
rayos de relativamente alta energía (10 keV) que
corresponden a longitudes de onda de 0.1nm.
Wilhelm Conrad
Röntgen
NATURALEZA DE LOS RAYOS X

Los rayos x emitidos consisten en

una mezcla de diferentes
longitudes de onda y la variación
de intensidad con λ depende del
voltaje de la fuente.

Cuando el voltaje de la fuente de RX

supera cierto valor crítico, aparecen
picos(se denominan líneas
características) estrechos y agudos a
ciertas longitudes de onda superpuestos
sobre el espectro continuo.
NATURALEZA DE LOS RAYOS X
FENÓMENO DE LA DIFRACCIÓN

 Fenómeno característico de
las ondas
 Desviación de éstas al
encontrar un obstáculo o
atravesar una rendija
 Ocurre en todo tipo de ondas
(sonoras, de la superficie de
un fluido, electromagnéticas,
etc.)
FENÓMENO DE LA DIFRACCIÓN

Max Von Laue (1912), en base a sus

estudios sobre cristales de cobre, sugirió que
los átomos de un cristal están espaciados a
una distancia tan pequeña que les permite
servir como elementos de una rejilla de
difracción tridimensional para los rayos X.

William Henry Bragg & William Lawrence

Bragg (1914), Padre e hijo explicaron la
difracción en los cristales de cobre como la
interferencia de los rayos X reflejados por
planos cristalinos paralelos, introduciendo la
descripción conocida desde entonces como
la ley de Bragg.
 FUNDAMENTO DIFRACCIÓN RX

• ¿Por qué estudiar Difracción de Rayos X?

 FUNDAMENTO DIFRACCIÓN RX

• Ley de Bragg
La Ley de Bragg calcula el ángulo en el cual la interferencia de los
rayos X dispersados por planos paralelos es constructiva- producirá
un pico de difracción.

a) Película fotográfica.
Se dice que la interferencia es constructiva
Ley de Bragg: cuando la diferencia de fase entre el haz
nλ = 2dsen(Θ) difractado por diferentes átomos es
proporcional a 2π.
 FUNDAMENTO DIFRACCIÓN RX

b) Difractograma de fases (en este caso un muestra policristalina)

 COMPONENTES BÁSICOS DE UN
DIFRACTOMETRO DE RX

1. Tubo de rayos X.
2. Colimador para el haz
incidente.
3. Goniómetro: la plataforma que
mantiene y mueve la muestra,
la óptica y/o el tubo.
4. La muestra y el soporte para la
muestra.
5. Colimador para el haz
difractado.
6. Detector: Mide el número de
rayos X que son dispersados por la
muestra.
 DIFRACCIÓN DE FIBRAS

Una molécula helicoidal, se caracteriza por

determinados parámetros:

 La repetición (c) de la hélice es la

distancia paralela al eje en la que la
estructura se repite exactamente.
 Número de residuos del polímero (m).
 La elevación (h) de la hélice es la
distancia paralela al eje, que va desde el
nivel de un residuo hasta el siguiente, es
decir, h = c/m.

Según la teoría de la difracción, una hélice produce siempre un

patrón de este tipo en forma de cruz.
 DIFRACCIÓN DE FIBRAS

Todas las manchas se encuentran en líneas perpendiculares al eje de

la fibra; estas líneas se denominan líneas de capa.
El espaciado entre estas líneas es inversamente proporcional a la
repetición de la hélice, c, que en este caso es igual al paso.
 D I F R A C C I Ó N D E C R I S TA L E S M O L E C U L A R E S

La celda unitaria puede

considerarse la unidad de
construcción básica del
cristal. La repetición de la
celda unitaria en tres
dimensiones crea el cristal
completo.

El espaciado de las manchas nos permite

determinar las distancias que se repiten en la
estructura periódica: en este caso, las
dimensiones x, y, z de la celda unitaria. Cristales de Insulina
 D I F R A C C I Ó N D E C R I S TA L E S M O L E C U L A R E S

Pasos a seguir para determinar la estructura

tridimensional de una macromolécula a partir
de los estudios de difracción de cristales:

1. Obtener cristales satisfactorios.

2. Registrar el patrón de difracción del cristal,
y medir las intensidades de muchas de las
manchas.
3. Encontrar alguna forma de realizar
sustituciones isomorfas en la molécula.
4. Repetir los pasos 1 y 2 para cada derivado
isomorfo.
5. Calcular los factores de estructura y, a Tomado de: Bioquímica,
partir de ellos, la distribución de densidad Mathew-Van Holde
electrónica. Estos cálculos suelen hacerse
en un gran ordenador.
¿QUÉ INFORMACIÓN PODEMOS OBTENER?

• Composición de fases de una muestra. Análisis

cuantitativo (determinación de las cantidades
relativas en una mezcla) referenciando las
intensidades relativas.

• Determinación de parámetros de celda y la

simetría del retículo de Bravais - Los
parámetros de red pueden variar, por lo tanto
brindar información sobre aleación, dopado,
etc.

• Determinación de la estructura cristalina.

• Textura/orientación.

• Tamaño del cristalito.

¿QUÉ INFORMACIÓN NO PODEMOS OBTENER?

• Qué cantidad de un elemento hay en

una muestra.
• Si hay un determinado átomo en la
muestra
• Si no se tiene información previa
algunas veces no se puede
determinar qué es la muestra
 APLICACIONES EN EL CAMPO DE LA
BIOQUIMICA

Varios de los descubrimientos y avances científicos que fueron llevados a

cabo gracias a la cristalografía de rayos X han sido galardonados con
el Premio Nobel.

 Premio Nobel de Química(1962) a Max Perutz y John Kendrew por sus

estudios cristalográficos de las proteínas hemoglobina y mioglobina.

 Premio Nobel de Medicina(1962) a Francis Crick, James Watson y Maurice

Wilkins por descubrir que el ADN forma una doble hélice.

 Premio Nobel de Química(1964) a Dorothy Hodgkin por la determinación

de varias estructuras de importancia biológica, como la penicilina y la
vitamina B12, entre otras.
 MICROGRAFIAS EN 3D

INTRODUCCION:   0,61 𝜆
𝑟=
𝑛 𝑠𝑒𝑛 𝛼
El microscopio fue el instrumento que hizo
posible la biología celular. De hecho, puede
decirse que este campo tuvo su inicio con los
primeros estudios microscópicos realizados
por Hooke. Generaciones de biólogos han   =300nm = 0,3
seguido los pasos de Hooke con instrumentos
cada vez mejores. Pero cuando la biología ha
profundizado más en los detalles de la vida, la
microscopía óptica ha llegado a sus límites.
MICROGRAFIAS EN 3D

•FUNDAMENTO:
 
Los microscopios electrónicos utilizan un haz
de electrones para irradiar la muestra en lugar
de luz.

Cuando los electrones se aceleran con 500000-

100000 vatios .
 TIPOS DE MICROGRAFIAS.

MICROGRAFÍA DE MICROGRAFÍA DE BARRIDO:

TRASMISIÓN:

• Electrónica (SEM)
• Óptica • Óptica (Confocal)
• Electrónica (TEM) • De efecto túnel (STM)
• De fuerza atómica (AFM)
 MICROSCOPIO ELECTRONICO
DE TRANSMICION (TEM)
Un buen microscopio electrónico de
transmisión puede proporcionar
generalmente una ampliación de mas de
100 000 veces.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
DE BARRIDO (SEM)
 a) Células de la bacteria fotótrofa
Rhodovidrio sodomensis ,(0,75 µm)

b) Bucle de ADN de un organismo

unicelular (7200x) SEM
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
DE BARRIDO (SEM)

Los siguientes pasos son utilizados en general y dependen del

tipo de muestra y el modo de trabajo a usar:
• Limpieza
• Fijación
• Deshidratación
• Secado con CO2 en punto crítico
• Montaje de la muestra
• Recubrimiento con metal
Ventajas:
• Gran profundidad de campo.
• Alta resolución (hasta 3nm)
• La relativamente sencilla preparación de las muestras.
• Tamaño de muestras desde cm hasta nm
 MICROSCOPIA CONFOCAL
DE BARRIDO LASER.
Se basa en la fluorescencia, algunas muestras requieren el
uso de flurocromos
Ventajas:
• Excelente resolución
• Mayor contraste
• Posibilidad de realizar secciones
ópticas
• Reconstrucción en 3D
• Imágenes multidimensionales
• Imágenes Lambda
Aplicaciones:
La microscopía confocal es muy útil para
el estudio de muchos problemas en
biología, permitiendo un nuevo
conocimiento de la estructura celular y
sus procesos. Entre otras aplicaciones la
microscopía confocal se utiliza en:
estudios de estructura celular y
citoesqueleto, medida de actividad
intracelular (pH e iones), producción de Células HeLa. Imagen cedida amablemente por el Dr. Francisco
reconstrucciones tridimensionales, etc. Sanz Rodríguez (Universidad Autónoma de Madrid), adquirida en
un Microscopio Confocal Leica TCS SP2. Proyección en 3D de una
serie de secciones adquiridas con el objetivo de 63x y una resolución
de 1024x1024 píxeles, utilizando las siguientes líneas de láser: 488
nm (para el marcaje de citoesqueleto de actina, en verde), 561 nm
(para visualizar la membrana plasmática, en rojo) y UV351-364 nm
(para ver núcleos celulares, en azul).  
 MICROGRAFÍA DE EFECTO
TUNEL

Permite visualizar regiones de alta o baja densidad electrónica

superficial y de ahí inferir la posición de los átomos.
 MICROSCOPIA DE FUERZA
ATÓMICA (AFM)

Se basa en la fuerza que experimenta la punta al

acercarse a la muestra.
 a) Biofilm natural que se desarrollo sobre
un porta inmerso en el agua del comedero
de un perro durante las 24 horas. El porta
se seco antes de la observación en el
microscopio de FA. (2,2µm)

b) Linfoncitos
 MICROSCOPIO DE ILUMINACIÓN
DEL PLANO DE UN RAYO DE BESSEL
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Mathews Christopher k, van Holde K.E, Ahern Kevin G. BIOQUÍMICA.

Madrid 2002. Pearson educación S.A.

• Robert K. Murray, David A Bender, Kathleen M. Botham. HARPER

BIOQUIMICA ILUSTRADA. 29° edición. McGraw Hill