Descriptores

1.Introducción y generalidades
2. Espectrofotometría molecular
4.Instrumentación y aplicaciones analíticas
Este grupo de
técnicas analíticas
se basan en la
interacción de la
radiación
electromagnética
con la materia
 Métodos ópticos espectroscópicos

Así se denominan genéricamente a un amplísimo número de

métodos instrumentales que utilizan técnicas instrumentales
en las que se genera una señal de tipo óptico cuyo fundamento
está basado en la interacción de la radiación electromagnética
con el analito.
Al interaccionar la radiación electromagnética con la muestra
que contiene el analito, se pueden originar distintos fenómenos, de
entre los cuales la absorción y emisión de luz, son los mas relevantes
y dan lugar a los métodos espectrofotométricos de absorción y (o)
emisión.
Los métodos pueden ser de absorción molecular o atómica, dependiendo
de que el analito se encuentre en estado molecular o atómico.
También existen métodos fluorescentes, en los que existe una absorción
precedida de emisión
Todos estos métodos se denominan también espectroscópicos, porque
están basados en los espectros de absorción o emisión del analito.
 El espectro electromagnético

Dada la amplitud de líneas y frecuencias espectrales que contiene,

el espectro electromagnético ,es el espectro que resulta de la interacción
materia- energia radiante, puede ser muy complejo y abarcar amplias
zonas: Vis-Uv, IR, Microondas..etc.

Características de la radiación electromagnética

Energía fotón =

Cuando l incrementa, disminuye la energía y frecuencia del fotón

 Tipos de interacción

Absorción: la luz se absorbe por un átomo, ion o molécula que

adquiere un estado superior de energía.
Emisión: se libera energía de un átomo, ion o molécula que
adquiere un estado inferior de energía.

Empezaremos considerando sólo algunos métodos de absorción !!!

 ABSORCIÓN DE RADIACIÓN
ELECTROMAGNÉTICA

M + h n = M*
PROCESO POR EL CUAL UNA ESPECIE EN UN MEDIO
TRANSPARENTE, CAPTA SELECTIVAMENTE CIERTAS
FRECUENCIAS DE LA RADIACIÓN

La ABSORCIÓN de luz por una sustancia tiene lugar cuando

la luz posee la energía precisa para provocar los cambios
precisos. Estos cambios ( siempre discretos), pueden ser:

•Electrónicos (átomos y (o) moléculas)

•Vibracionales (sólo moléculas)
•Rotacionales ( sólo moléculas)
 Espectroscopía de absorción

Absorción Atómica Absorción Molecular

En la absorción por moléculas, entran

El espectro está constituido por
en juego transacciones de tipo vibracional,
líneas, debido al gran nº de
rotacional entre subniveles electrónicos.
transacciones posibles, que
El resultado final se traduce en un espectro
incluyen la de los subniveles
de bandas.
electrónicos dentro de cada nivel
 TRANSICIONES ENERGÉTICAS

nl222
E
energía

uv l
n11
E
visible
nl333
E
nl444
E

IR IR
MO

hc
E=hn =
estado estado estado l
electrónico vibracional rotacional
 TIPOS DE ESPECTROS

A A

l l
ESPECTRO DE LÍNEAS ESPECTRO CONTINUO
 Espectrofotometría de absorción molecular
Es útil tanto para análisis cualitativo como cuantitativo
Transacciones Interacciones
electrónicas de enlace

Espectro

Variando la longitud de onda dentro de cada zona del espectro electromagnético

se puede obtener el espectro de absorción de una sustancia en cada región.

Información cualitativa:
Se obtiene comparando el espectro de la muestra con el de un material
de referencia.
Esta información es mas relevante en espectroscopía IR y menor en el
caso de espectroscopía Vis-UV.

Los espectros Vis-UV se pueden lograr usando un mismo equipo.

La espectroscopia IR (mayor información), requiere otro tipo de instrumento
 LEY DE LAMBERT - BEER
potencia del
haz antes de
atravesar el
blanco

absortividad
absorbancia concentración
P0
=ebc
total medida molar de las
a la longitud
AT,l = log especies
P
de onda l absorbentes
camino
óptico

P potencia del A = -logT

= Transmitancia (T)
P0 haz luego
de atravesar
la muestra
 ABSORTIVIDAD MOLAR

DEPENDE DE:

CARACTERÍSTICAS DEL
DISOLVENTE
ESPECIE ABSORBENTE
LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO

UNIDADES

L /mol.cm
PROPIEDAD ADITIVA DE LA ABSORBANCIA
LA ABSORBANCIA TOTAL DE UNA MUESTRA A UNA
LONGITUD DE ONDA DETERMINADA ES LA SUMA DE LAS
ABSORBANCIAS DE CADA UNO DE SUS CONSTITUYENTES
A DICHA LONGITUD DE ONDA.

1,6
A T, l = Ai
i,l

1,4

1,2

1,0

0,8
A

0,6

0,4

0,2

0,0
0 200 400 600 800
longitud de onda (nm)

¡esto obliga a seleccionar muy bien la l del analito!

 LIMITACIONES DE LA LEY DE BEER

REALES

 variación de la absortividad debida al disolvente

 Concentración

APARENTES

 instrumentales: radiación policromática

 químicas: cambios químicos de las especies

absorbentes por interacción con el disolvente
 Desviaciones a la ley de Beer

La mayor parte de las especies cumplen con la ley en un determinado

intervalo de concentraciones. Fuera de él, experimentan desviaciones
positivas o negativas. Esto se observa bien en el calibrado:

absorbancia
respuesta debida
a la autoabsorción
o a la luz escasa que
atraviesa la cubeta
respuesta del blanco,
interferencias o escasa
sensibilidad
concentración

Es preciso asegurar
que se está trabajando
en el intervalo lineal!!
 SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA
DE TRABAJO
banda A banda C
A A
banda A
banda C banda B banda B

l concentración

Se debe de procurar medir las absorbancias en el entorno más próximo

a la l max. de absorción en el espectro (se minimizan errores) y se logran
máximas sensibilidades.
Midiendo lejos de ese punto de máxima absorción:
pequeñas variaciones en la medida se traducen en grandes errores.
COMPONENTES BÁSICOS DE LOS INSTRUMENTOS
PARA MEDIDAS DE ABSORCIÓN MOLECULAR EN
EL UV-VISIBLE
FUENTE DE ENERGÍA RADIANTE
SELECTOR DE LONGITUD DE ONDA
CUBETAS (Muestra)
DETECTOR
DISPOSITIVO DE LECTURA
Instrumentación básica comparada en los métodos espectroscópicos moleculares

Espectroscopía Vis-UV:

Espectroscopía IR:

Fluorescencia molecular:
(emisión)

Los tres componentes van juntos

como unidad de fuente y muestra
FUENTE DE ENERGÍA RADIANTE
CONTINUA
ESTABLE
intensidad lumínica INTENSA

lámpara de
lámpara de Tungsteno
Deuterio

300 500 700 900 1100

longitud de onda (nm)
 Fuentes de Energía

En absorción molecular la muestra debe ser irradiada con energía luminosa,

procedente de una fuente. Dependiendo de la zona de trabajo, las propiedades
de la fuente son distintas. Las fuentes deben ser uniformes en intensidad.

Las fuentes de IR se
producen al paso de corriente
a través de materiales
incandescentes:
ZrO2-óxidos de itrio (400-20,000nm)
Cr-Ni (750-20,000 nm), SiC..etc

lámpara de deuterio
(UV)
fuente de tungsteno (W)

Se usa en VIS e IR próximo

produce luz en intervalos de 350-2200 nm
160- 380 nm
 ESPECTRO VISIBLE Y COLORES
COMPLEMENTARIOS
visualización complementario
l (nm) color l (nm) color
380-420 violeta 520 - 550 amarillo-verde
420 - 440 azul-violeta 550 - 580 amarillo
440 - 470 azul 580 - 620 anaranjado
470 - 500 verde-azul 620 - 680 rojo
500 - 520 verde 680 - 780 púrpura
520 - 550 amarillo-verde 380 - 420 violeta
550 - 580 amarillo 420 - 440 azul-violeta
580 - 620 anaranjado 440 - 470 azul
620 - 680 rojo 470 - 500 verde-azul
680 - 780 púrpura 500 - 520 verde
UNA SOLUCIÓN SE OBSERVA DE COLOR AZUL CUANDO SE
ILUMINA CON LUZ POLICROMÁTICA PORQUE ABSORBE
TODOS LOS COLORES EXCEPTO EL AZUL, QUE ES EL
COLOR QUE DEJA PASAR
 SELECTOR DE LONGITUD DE ONDA

CARACTERÍSTICAS
LONGITUD DE ONDA DE MÁXIMA TRANSMISIÓN
PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA EN EL MÁXIMO
ANCHO DE BANDA EFECTIVO

DISEÑOS
FILTROS DE CORTE
FILTROS DE ABSORCIÓN
FILTROS DE INTERFERENCIA
*MONOCROMADORES DE PRISMA
*MONOCROMADORES DE RED
SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA
CON MONOCROMADORES

COMPONENTES BÁSICOS

RENDIJAS DE ENTRADA Y DE SALIDA

ESPEJO COLIMADOR

ELEMENTO DISPERSANTE (PRISMA O RED)

ESPEJO O LENTE FOCALIZADOR

VENTANAS DE ENTRADA Y SALIDA

 MONOCROMADORES

espejo espejo
colimador focalizador

con red de
difracción
l2

l1
rendija de rendija de
entrada elemento salida
dispersante

con prisma l2

l1
lente colimadora lente focalizadora
 CUBETAS

CARAS NORMALES A LA DIRECCIÓN DEL HAZ

IR

VIS-UV
ABSORCIÓN MÍNIMA A LA LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO
1. Vidrio ordinario o sílice (VIS).
2. Sílice fundida o cuarzo (UV).
3. NaCl, NaI, etc (IR).
 DETECTORES

Al final la luz seleccionada tiene que ser detectada y cuantificada.

*Esto se consigue con el empleo de detectores cuyo cometido es convertir
la respuesta del instrumento en una señal medible.
*Dependiendo del tipo de luz con el que se trabaja existen distintos tipos
de detectores:

variada

variable variado

Termistores

En espectroscopia IR se puede acoplar

FOTOTUBO
al detector un procesador de transformada
de Fourier (FTIR).
 REQUISITOS DE LOS DETECTORES

DEBEN RESPONDER A UN AMPLIO RANGO DE

LONGITUDES DE ONDA

DEBEN DAR RESPUESTA RÁPIDA

DEBEN SER SENSIBLES A BAJOS NIVELES DE RADIACIÓN

DEBEN PRODUCIR SEÑAL ELÉCTRICA FACÍLMENTE

AMPLIFICABLE

DEBEN TENER BAJO NIVEL DE RUIDO

LA SEÑAL DEBE SER PROPORCIONAL A LA POTENCIA

RADIANTE
 FOTOTUBOS Y FOTOMULTIPLICADORES

Están basados en el efecto fotoeléctrico, en el que la incidencia de un

haz fotónico sobre un metal es capaz de generar energía eléctrica

FOTOTUBO

En el caso de los fotomultiplicadores, la señal se amplifica mediante

el uso de dinodos en serie.
 DETECTOR

TUBO FOTOMULTIPLICADOR

Cada dinodo se conecta a

una fuente externa de 90 V
generando en el colector
una avalancha de 106 a 107
electrones por cada fotón
incidente para el caso de un
colector
tubo fotomultiplicador de 9
dinodos
En la actualidad es el detector espectrofotométrico mas utilizado
acoplado a un sistema cromatográfico líquido
 Procesador de señal y lectura

Es el último componente básico de instrumentación

Todo espectrofotómetro ha de disponer de:

1. Sistema de amplificación propia que produzca una señal medible
2. Un sistema procesador de la señal, que permita eliminar, promediar
datos, proporcionar salida de lectura, dirigir la salida de la señal..etc
3. Una salida de la señal: digital,registrador..etc
4. Tener cierta capacidad de procesar números /FTIR
 Espectrofotómetros

Pueden ser :
1 Monohaz o haz simple
 2 Espectrofotómetro de doble haz

• Se puede desdoblar el haz a intervalos regulares con la ayuda de un choper

• La mitad de la luz atraviesa la muestra y la otra un “blanco”
• La absorbancia medida tiene en cuenta la ratio de absorción muestra/blanco
y permite corregir las desviaciones en el detector y en la fuente de salida
•La velocidad de cambio del chopper es una limitación a la l que puede
seleccionar el instrumento.
 3 Espectrofotómetros IR

Son de dos tipos:

1) Dispersivos (descansan en un sistema monocromador y de barrido para
producir el espectro).
2) Transformada de Fourier (usan una combinación de interferencias
constructivas y destructivas junto con la transformada para producir
el espectro).

Dispersivos

fuente muestra monocromador detector

generalmente son de doble haz

el monocromador precede a la muestra

 Infrarrojo con transformadade Fourier

Fundamento:

A un tiempo fijo se pasan muchas l a través de la celda y se

registra la señal.
Con cada barrido, cualquier l puede atravesar la celda muchas veces.
Se obtiene así el interferograma:
 Aplicaciones analíticas

La espectrofotometría de absorción molecular se puede aplicar tanto

al análisis cualititativo como cuantitativo.

Análisis cualitativo: los espectros de la muestra se han de comparar con

los correspondientes a estándares con el fin de identificar las bandas de
absorción coincidentes. Este tipo de análisis es mas frecuente en UV e IR
para identificar compuestos orgánicos y mas rara vez se utiliza el Vis.

Análisis cuantitativo: está basado en la ley de Beer-Lambert en el intervalo

de concentraciones de cumplimiento de la ley. Se establece la curva de
calibrado usando estándares y la absorbancia de la muestra de concentración
desconocida se remite a la curva ( a veces basta con un solo estándar).
Procedimiento:
•En espectrofotometría Vis., el analito se suele incorporar a una especie
compleja que presente bandas de absorción intensas.
•La selección de la l a la que se mide la absorbancia, puede contribuir
a incrementar la selectividad de la medida (si absorbe sólo el analito)
•Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a lmax

Es una técnica rutinaria y especialmente sensible en fluorescencia.

 APLICACIONES ANALÍTICAS

AMPLIO CAMPO DE APLICACIONES

(análisis orgánico e inorgánico)
ALTA SENSIBILIDAD

BUENA SELECTIVIDAD

BUENA PRECISIÓN

FACILIDAD OPERATIVA

APLICACIÓN A ESPECIES NO ABSORBENTES

(FORMACIÓN DE COMPLEJOS)
 La cafeína (C8H10O2N4•H2O) posee una
absorbancia de 0.510 a 272 nm y 1 cm de
paso óptico en disoluciones de concentración
de 1 mg/ 100 mL. Una muestra de 2.5 g de
café soluble se diluye con agua a 500 mL. Se
toman 250 mL se añaden 25.0 mL de H2SO4
0.1 N y se diluye a 500 mL. Se mide la
absorbancia a 272 nm resultando ser 0.415.
Calcular los gramos de cafeína por Kg de café
soluble que tiene muestra muestra.
 Dato: masa molar (cafeína)=212 g/mol