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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN PROTOCOLO DE


HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
PARA MEDIR COENZIMA Q10 EN PLAQUETAS.

MYRIAN IBETH CHILUIZA JÁCOME

SANGOLQUÍ, 14 DE AGOSTO DEL 2012


ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES
INTRODUCCIÓN

• Coenzima Q10
• Es una quinona isoprenoide no proteica,
liposoluble, y móvil, que se encuentra
prácticamente en todas las membranas
celulares.

• Sirve como transportador de electrones y


colector de átomos de hidrógeno en la
cadena respiratoria mitocondrial.
(Fuente: Coenzyme Q10 Nutrition
Health, 2012)
• La designación química de su forma
natural es: 2,3 dimetoxi-5-metil-6-
poliprenil parabenzoquinona.
Funciones de la CoQ10

• En la cadena de transporte de electrones.

• Como antioxidante.
• Señalización celular y expresión génica.
Relación con procesos patológicos

Parkinson Isquemia Alzheimer


• Restablecimiento miocárdica • Protección a cels. del
de la actividad de la • Acción protectora en neuroblastoma de
CTE en los daño oxidativo. efectos neurotóxicos.
fibroblastos. • Prevención de la • Atenuación de la
• Disminución de disfunción del producción de H2O2
apoptosis en endotelio. proveniente de la
neuronas fosforilación
• Reducción de RL. oxidativa.
dopaminérgicas.
Matrices de medición

Plaquetas,
músculo, linfocitos
• Concentración Q10 • Células predilectas por
plasmática no refleja la ser ricas en
concentración • Potenciales sustitutos del mitocondrias, fácilmente
intracelular de tejidos de estado de la Q10 en el aislables, presentar
interés médico. tejido. características similares
a las neuronas.

Necesidad otras
Plaquetas
matrices
Objetivos

Objetivo general:

Estandarizar y validar un protocolo de medición de


Coenzima Q10 en plaquetas mediante la metodología
de HPLC.
Objetivos específicos:

• Establecer que no existan interferencias de otros compuestos con la


medición del analito (coenzima Q10) en esta metodología.

• Demostrar que los resultados de la prueba son directamente


proporcionales a la concentración del principio activo, garantizando
la capacidad del método para obtener resultados lineales.

• Comprobar que el método planteado es exacto y produce


resultados consistentes.
Hipótesis:

El protocolo óptimo para la medición de coenzima Q10, sobre la


base de la metodología HPLC (cromatografía líquida de alto
rendimiento) permite la medición precisa y confiable de los niveles
de CoQ10 en plaquetas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Estandarización
Estandarización
Validación

Objetivos de la validación:
• Incertidumbre del método menor al 30%.
• Robustez del método dentro del rango: 90 a 110.
• Precisión: rango de repetibilidad y reproducibilidad menor a
0,05.
• Linealidad (correlación) igual o mayor a un R2 de 0,99.
• Veracidad (porcentaje de recuperación) mayor o igual al
90%.
Validación
• Exactitud, precisión y robustez
Validación
• Límite de detección y cuantificación
Validación
• Linealidad • Confirmación de identidad

Se prepararon 4 curvas con el Se corrieron los siguientes reactivos:


siguiente rango de concentraciones:
1-propanol grado HPLC, metanol de la
0,1uM - 0,5uM – 0,75uM – 1uM – misma pureza, y fase móvil de las
1,5uM y 2uM. muestras (metanol 60%: 1-propanol
40%).
Validación
• Incertidumbre
FUENTES DE
INCERTIDUMBRE

CERTIFICADOS O
ALEATORIAS RESOLUCIÓN DE
EQUIPOS

REPRODUBILIDAD,
REPETIBILIDAD, BALANZA, MICROPIPETAS,
RESOLUCIÓN DE LA
EXACTITUD, LD, LC, BALANZA Y PUREZA DEL
RANGO (K,ΔØ,R2), STD.
LINEALIDAD, R2.

CRITERIO: DESVIACIÓN CRITERIO:


ESTÁNDAR INCERTIDUMBRE
Muestras

Criterios de inclusión:

• Sexo: masculino o femenino.


• Nacionalidad ecuatoriana.
• De 18 a 30 años de edad.
• Sin trastornos metabólicos
aparentes.
35 muestras • Sin ingesta de medicamentos.
• Previa autorización.
RESULTADOS
• Estandarización de la técnica
– Principales parámetros modificados
• Fase móvil
°T/R ÁREA ALTURA
FASE (minutos) (unidades AU) (unidades AU)
1 4,09 315395 17827
1 4,14 315555 18168
1 4,15 317202 18074
2 2,84 315582 23160
2 2,84 316290 23598
2 2,84 316345 23287
2 2,84 318437 24070
2 2,84 318066 23658
3 6,52 310986 12636
3 6,58 311198 12736
3 6,58 310664 12669
Nomenclatura: fase 1: metanol 70%: 1-propanol 30%; fase 2: metanol 60%: 1-propanol 40%
y fase 3: metanol 80%: 1-propanol 20%.
• Estandarización de la técnica
– Principales parámetros modificados
• Velocidad de flujo

°T/R ÁREA ALTURA FLUJO


(minutos) (unidades AU) (unidades AU) (ml/min)
3,75 418357 24419 0,3
3,76 419074 25135 0,3
3,76 420555 24451 0,3
2,84 315582 23160 0,4
2,84 316290 23598 0,4
2,84 316345 23287 0,4
2,84 318437 24070 0,4
2,84 318066 23658 0,4
2,29 255801 22196 0,5
2,29 254987 22341 0,5
2,29 255382 22403 0,5
• Estandarización de la técnica
– Protocolo óptimo de determinación de CoQ10 en plaquetas
• Estandarización de la técnica
– Protocolo óptimo de determinación de CoQ10 en plaquetas

Condiciones cromatográficas:
– Fase móvil: metanol 60%: 1-propanol
40%.
– Flujo: 0,4 ml/min.
– Volumen de inyección: 90 ul.
– Corrida isocrática.
– Temperatura de la muestra: 8ºC ± 2.
– Temperatura de la columna: 25ºC ± 5.
– Absorbancia: 275nm.
• Validación de la técnica
– Exactitud y robustez

CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN PORCENTAJE DE


IDENTIFICACIÓN
MUESTRA MUESTRA ESPIQUEADA RECUPERACIÓN
0,746 1,741 92,991
0,588 1,728 104,587
0,7 1,722 93,761
0,665 1,736 98,257
0,667 1,739 98,349
PERSONA N. 1
0,691 1,747 96,881
0,646 1,74 100,367
0,698 1,73 94,679
0,675 1,714 95,321
0,686 1,723 95,138
0,836 1,578 98,933
0,797 1,514 95,600
0,809 1,53 96,133
0,807 1,532 96,667
PERSONA N. 2 0,818 1,539 96,133
0,829 1,554 96,667
0,827 1,552 96,667
0,832 1,556 96,533
0,837 1,554 95,600
PROMEDIO 0,744947368 1,643631579 96,803
DESV. ESTÁNDAR 0,080461498 0,096789124 2,577
LIC 91,753
LSC 101,854
• Validación de la técnica
– Precisión

Prueba F para igualdad de varianzas (criterio de repetibilidad).


GRUPO GRUPO N N VAR VAR
VARIABLE F p PRUEBA
(1) (2) (1) (2) (1) (2)

1,10E- 4,30E-
CONCEN. {alto} {bajo} 10 10 2,47E+01 0,0001 Bilateral
04 06

1,10E- 1,70E-
CONCEN. {alto} {medio} 10 10 0,06 0,0003 Bilateral
04 03

4,30E- 1,70E- <0,000


CONCEN. {bajo} {medio} 10 10 2,60E-03 Bilateral
06 03 1

Prueba F para igualdad de varianzas (criterio de reproducibilidad).


GRUPO GRUPO N N VAR VAR
VARIABLE F p PRUEBA
(1) (2) (1) (2) (1) (2)
1,10E-
CONCEN. {alto} {bajo} 10 10 0,03 23487,75 <0,0001 Bilateral
06
CONCEN. {alto} {medio} 10 10 0,03 0,03 0,97 0,969 Bilateral
1,10E-
COENCEN. {bajo} {medio} 10 10 0,03 4,10E-05 <0,0001 Bilateral
06
• Validación de la técnica
– Precisión

Rangos de aceptación del método.


REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD

0,004 0,02 0,002 0,037


RANGOS DE
ACEPTACION
bajo alto bajo alto
• Validación de la técnica
– Sensibilidad del método: límite de detección y cuantificación.

Concentración de los blancos de muestra.

IDENTIFICACIÓN CONCENTRACIÓN LD = Xblancos + 3Sblancos


0,018
0,016
LC = Xblancos + 10Sblancos
0,018
0,017
0,015
BLANCOS DE MUESTRA
0,016 Límite de detección y límite de cuantificación del método.
0,016
CONCENTRACIÓN
0,022 CRITERIO
(umol/L)
0,015
0,018 LD 0,023+/-0,002
PROMEDIO 0,017 LC 0,038+/-0,002
DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,002
• Validación de la técnica
– Sensibilidad del método: límite de detección y cuantificación.

Comportamiento de estándares preparados al límite de detección y


cuantificación del método.
RANGO RANGO
LÍMITE DE LÍMITE DE
CRITERIO LD LC
DETECCIÓN CUANTIFICACIÓN

0,027 0,002 0,040 0,002


0,025 0,038
0,025 0,002 0,040 0,002
0,023 0,038
CONCENTRACIÓN 0,026 0,002 0,038 0,001
(umol/L) 0,024 0,039
0,027 0,002 0,039 0,001
0,025 0,038
0,026 0,001 0,040 0,001
0,027 0,039
• Validación de la técnica
– Linealidad.
CONCENTRACIÓN
ID. CURVA ÁREA ECUACIÓN R2
(umol/L)
0,1 15127
0,5 90261
0,75 137817
1 y = 189986x - 4296,4 0,9999
1 184656
1,5 283384
2 374396
0,1 14837
0,5 88543
0,75 136326
2 y = 195476x - 8811,7 0,9989
1 178873
1,5 289226
2 382861
0,1 15749
0,5 89785
0,75 132248
3 y = 184156x - 5993,8 0,9953
1 172965
1,5 256577
2 374026
0,1 10629
0,5 76261
0,75 122697
4 y = 182175x - 13644 0,9976
1 157171
1,5 263600
2 353502
• Validación de la técnica
– Linealidad.

Curva de calibración tipo del método.

Límites de aceptación de las curvas de calibración del método.


PROMEDIO DESV STD LIC LSC
PENDIENTE 187948,4565 6014,769486 176159,5083 199737,4047
CORTE EJE Y -8186,536719 4087,291072 -16197,62722 -175,4462174
COEFICIENTE DE
0,998956385 0,000977813 0,997039872 1
CORRELACIÓN
• Validación de la técnica
– Confirmación de identidad: selectividad/especificidad

Cromatograma de la inyección de
metanol grado HPLC.

Cromatograma de la inyección de la
fase móvil del método (metanol 60%:
1-propanol 40%).

Cromatograma de la inyección de 1-
propanol grado HPLC.
• Validación de la técnica
– Incertidumbre

Desviaciones estándares de las fuentes aleatorias de Incertidumbres asociadas a las fuentes sistemáticas de
incertidumbre del método (Evaluación Tipo A). incertidumbre del método (Evaluación Tipo B).

DESVIACIÓN MATERIAL INCERTIDUMBRE UNIDADES


CRITERIO
ESTÁNDAR
Balanza 0,00001 ml
Reproducibilidad 0,018742406 Micropipeta 0,0005 ml
Resolución
Repetibilidad 0,010327956
balanza 0,00005 ml
Exactitud 0,053768778
Estándar CoQ10 0,057917294 ml
LD 0,001354006

LC 0,001024374

Rango 0,000977813

Linealidad 0,000977813

incertidumbre estándar del método: 0,07


incertidumbre expandida: 0,14.
• Muestras
– Concentración promedio de CoQ10: 0,69uM.
– No hubo correlaciones significativas entre: edad, género o número de
plaquetas con la concentración de CoQ10 intracelular.
DISCUSIÓN
• Estandarización
Fase móvil.
Ventajas: disminución del tiempo de retención, incremento del área y altura de
las muestras y mayor compatibilidad con las mismas.
Desventaja: tiempo de vida media de la solución patrón en el 1-propanol.

Velocidad del flujo.


• Tiempo de retención corto, características cromatográficas deseables.

Volumen de PRP, sangre total, 1-propanol y fase móvil


(extracción Q10).
• El incremento del volumen del PRP y la sangre total, así como, la disminución
del volumen de reconstitución (fase móvil) de la muestra, permitió una mayor
concentración de la CoQ10.
• La disminución del 1-propanol no trajo efectos adversos y fue necesaria para
disminuir el tiempo de secado.

Volumen de inyección.
• Componente clave para la visualización óptima del pico cromatográfico de
coenzima Q10 de las muestras.
• Validación
Exactitud.
Porcentaje de recuperación del 96,8%, cumple con objetivos de validación del
método y las normas internacionales. En comparación con Contin (2011): 89 –
95,3%, éste método es más exacto.

Precisión.
• Lím. Repetibilidad: 0,004 - 0,02, Lím. Reproducibilidad: 0,002 – 0,037.
• Lim. Repetibilidad Contin: 0,04 – 0,057, Lím. Reproducibilidad: 0,043 – 0,063.

Robustez.
• De 91,75 a 101,85% de recuperación, cumple con objetivo de validación (90 –
110%), recomendado por el Eurachem.

Sensibilidad.
• Dos criterios: límite de detección de 5,31 picomol/1E9 plaquetas y límite de
cuantificación de 8,04 picomol/1E9 plaquetas. En comparación con Contin: LD
de 21 picomol/1E9 plaquetas y LC de 84 picomol/1E9 plaquetas.
• Validación
Linealidad.
Coeficiente de correlación promedio: 0,998, cumple con objetivos de validación
y normas internacionales (Eurachem, ICH y USP).

Confirmación de identidad.
• No existe ninguna interferencia al tiempo de retención de la CoQ10.

Incertidumbre.
• Incertidumbre expandida del método: 14%, cumple con objetivos de validación
y criterios del Eurachem.

Muestras.
• Promedio concentración: 0,7uM. No correlación entre: edad, género, número
de plaquetas y concentración Q10 en plaquetas.
• Carta de control:30 muestras bajo control y 5 muestras atípicas.
CONCLUSIONES
Se estandarizó y validó un
protocolo de medición de
coenzima Q10 en plaquetas,
mediante la metodología de
HPLC.
La exactitud, precisión,
linealidad, y sensibilidad Se estableció que no
del presente método, existieron interferencias de
presentan mejores otros compuestos en la
resultados que los medición del analito,
obtenidos en el protocolo mediante esta
propuesto por Contin metodología.
(2011).

Se demostró que los


El volumen de inyección,
resultados de la prueba
así como los volúmenes
son directamente
de plasma rico en
proporcionales a la
plaquetas y de
concentración del principio
redisolución del residuo
activo, garantizando la
seco, determinaron la
capacidad del método
visualización óptima del
para obtener resultados
pico de coenzima Q10.
lineales.

Se evidenció que la fase Se comprobó que el método


móvil implementada brinda planteado es exacto y
importantes ventajas sobre produce resultados
la fase móvil original. consistentes.
RECOMENDACIONES

Se deben crear
estrategias de Ampliar este
Para la validación
verificación del estudio con una
Adicionalmente, se de métodos
control del método población
deben implantar analíticos es
a corto plazo. Así representativa del
medidas necesaria la
como a largo Ecuador para
sistemáticas para utilización de
plazo, para establecer una
el tratamiento de instrumentos
comprobar que la línea base de la
las muestras calibrados y
exactitud y concentración
atípicas o fuera de materiales de
precisión del intracelular de la
control. referencia
método siguen coenzima Q10 en
certificados.
estando bajo adultos sanos.
control.
AGRADECIMIENTO