Extraído de las algas

Polisacárido lineal (con peso molecular ~12 000 Da)

Repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que
comprende unidades alternadas de galactosa y
3,6- anhidrogalactosa.

D-galactosa 3,6-anhidro-L-galactosa
% Agarosa Tamaño de ADN
(pb)
0.75 10000-15000
1.0 500-10000
1.25 300-5000
1.5 200-4000
2.0 100-2500
2.5 50-1000
 Fosfatos que le
dan carga
Buffer de corrida negativa a la
molécula
Buffer de carga
glicerol

xylene cyanol FF
1) Migra a aprox 4Kb;

Azul de bromofenol
1) Ayuda a visualizar que
la muestra este
migrando en el gel
2) migra a una velocidad
equivalente a si tuviera
un peso de 200 a 400
pb DNA (depende del
porcentaje de la
agarosa)

GLICEROL
Añade densidad a la
muestra
 Para cuantificar y visualizar el DNA se usan
agentes colorantes fluorescentes, los cuales
aumentan notablemente su emisión cuando
se unen a la doble hélice.

Son agentes intercalantes que se introducen

entre las bases del DNA. Generalmente son
policíclicos aromáticos, hidrofobos y
planares:

a) BROMURO DE ETIDIO
b) SYBR Safe DNA gel staining (invitrogen)
 Estos agentes
interrumpen la
alineación y
emparejamiento de las
bases de las cadenas
complementarias. Bromuro de etidio

 La emisión de
fluorescencia se da
cuando se unen al DNA
de cadena doble y
depende directamente
de la cantidad de éste.
Generalmente se usa en
la detección de DNA de Es el más utilizado en
doble cadena en PCR en biología molecular
tiempo real. Teratogénico
Es estable a un amplio Puede causar
rango de temperaturas. metahemoglobinemia
Es 25 veces más
sensible que el bromuro
de etidio.
Se trata de reactivos mutagénicos,
por lo que se deben trabajar con
equipo de seguridad.
El material contaminado con ellos
generalmente se trata con nitrito
sódico y ácido hipofosforoso para
su degradación.
También son usados en PCR,
citometría de flujo y separación de
ácidos nucleicos por ultra-
centrifugación.
Electroforesis en gel
 Utiliza como soporte un
gel de poliacrilamida o
agarosa.
 Las moléculas se separan
de acuerdo con su tamaño
por su efecto de filtración
por geles, y también se
separan por su carga.
 Para teñir a las moléculas sujetas a
separación se usan a) colorantes, b)
autorradiografía o c) Western blot.
 En el DNA, las diferencias de carga no
son suficientes para determinar una
separación eficaz. ESENCIALMENTE
CARGADO NEGATIVAMENTE
(FOSTATOS)
 Electroforesis en gel: la forma y la carga
son menos importantes, y la longitud
molecular es el determinante crítico de
la velocidad de migración. EN
PRESENCIA DE SDS
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS

 Es más frecuentemente  Es más frecuentemente

usado para separar usado para separar
ácidos nucleicos. proteínas.
 Cuando se separa DNA
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS
En ambos casos, el gel se prepara con distintas concentraciones en función del
tamaño de los fragmentos de DNA que se quieren separar.

 Los fragmentos de DNA  Se usan para separar

que puede separar son fragmentos de ADN más
de hasta 20 kpb (más pequeños
grandes). (aproximadamente hasta
1000 pb), ya que tienen
mayor poder de
resolución.
Cuando se separan proteínas
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS

 Separa a la proteína  Separa proteínas basado

únicamente basado en tanto en carga eléctrica
la carga molecular neta. como en tamaño
molecular.

 No separa proteínas con  Separa proteínas con

diferentes tamaños pero diferentes tamaños pero
con cargas similares. con cargas similares.

 Mayor resolución que la

que se obtiene en un gel
de agarosa.
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS

 Corren en forma  Suelen emplearse en

horizontal (submarina.) forma vertical.
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida-SDS

 En muestras de ADN
que se someten a un  Para estimar las masas
campo eléctrico durante macromoleculares
cierto tiempo, podemos comparando la muestra
verlas separadas según con estándares.
su tamaño.
 Se usan estándares de
peso molecular
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida
Aplicaciones: Aplicaciones:
 El análisis de fragmentos
de polimorfismos de  El análisis de fragmentos
longitud de fragmentos de del punto final de PCR
restricción. en el cual el tamaño de
 Análisis de experimentos
de DNA recombinante. los fragmentos sea
 Purificación de sondas ligeramente diferentes.
para ISH.
 Hibridación por escisión de
fragmentos de DNA de un
gel seguidos por
purificación en mini-
columna.
 Análisis del punto final de
PCR.
 Ensayos RT-PCR
(detección de patógenos).
Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja de gel, colocar el
peine.

Pesar 0.42g de agarosa en un matraz Erlenmeyer, añadir 35 mL

de buffer TAE 1X. Tapar con algodón y calentar en microondas
hasta que la agarosa se disuelva bien o 1 a 3 min.

Una vez que la temperatura sea entre 45 y 60°C, añadir 2 μL de

bromuro de etidio.

Depositar el gel en la bandeja de la

cámara y dejar polimerizar.

Quitar la cinta adhesiva y colocar la

bandeja en la cámara de electroforesis.
Añadir el amortiguador TAE.
Preparación y cargado
de muestras
Etiquetar 4 tubos de microfuga E, P, R1 y R2

Plásmido Plásmido
Plásmido digerido digerido
Estándar
Reactivos sin digerir con una con dos
(E)
(P) enzima enzimas
(R1) (R2)

Muestra

- - -

Amortiguador
de la muestra

Centrifugar por 3 seg

Cargado de
muestras Colocar tapa

Aplicar 80 V

De 30-40 min
Detección de las bandas:
1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la
lámpara de UV
2. Visualizar bandas de DNA
3. Tomar fotografía
4. Determinar el peso molecular de las bandas
Std de peso molecular: Lambda
HindIII Ladder

 λ HindIII DNA Ladder se

preparar por restricción del
fago seguido de la
inactivación de la enzima.
 Los 7 fragmentos 564 base
pairs a 23.13 kilobases.
 564, 2027, 2322, 4361,
6557, 9416, 23130 bp
Gel modelo 1 2 3 4 5 6

T
1. Std de peso VR
molecular P
2. Sin restringir
Inserto
3. Sin muestra
4. Restringido
con 2 enzimas
5. Restringido
con 2 enzimas
e incubado
toda la noche
6. Restringido 1 RNA
enzima

T= topoisómeros; P= plásmido vacío (5310);

VR= vector+inserto (6500 pb), Inserto 1190
Bibliografía
 Lizcano Losada F.; Fundamentos
moleculares en medicina. El manual
moderno, España, 2005. p 41-43.
 Mendoza DF. Practicas de Laboratorio de
Biologia Molecular: Su Aplicación en
Genetica Básica. Editorial de Universidad
del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62
 Luque Cabrera J. Texto ilustrado de
biología molecular e ingeniería genética.
Elsevier, España, 2001. p 138.