ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE
Presencia de Sodio Dodecil Sulfato bajo condiciones reductoras (SDSPAGE)
Mtodo rpido, reproducible y de bajo costo
Utilizado para cuantificar, comparar y caracterizar protenas
Tcnica analtica semipreparativa : se separan biomolculas segn su tamao
molecular bajo la accin de un campo elctrico. (Laemmli 1.970).
Permite separar protenas hacindolas pasar por un gel o resina: bisAcrilamida, la
cual es un agente entrecruzador que genera un polmero sobre el cual se adherirn
las protenas.
La separacin electrofortica se realiza en condiciones desnaturalizantes, al aadir
compuestos que alteren las condiciones nativas de las protenas y que se agrupan
en una solucin denominada: tampn de carga.
GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Soporte: Gel de Poliacrilamida
* Polimerizacin de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
* Variacin de la concentracin variacin del tamao de poro
[poliacrilamida] tamao poro
Electroforesis vertical
1. Preparacin del gel
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicacin de la muestra
4. Electroforesis
5. Deteccin por tincin:
Azul de Coomassie
Sales de plata
Condiciones de la PAGE:
* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAO PAGE
* Desnaturalizantes: separamos slo por TAMAO SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sdico), urea,
reductores: DTT, -mercaptoetanol
SDS: detergente aninico (-), dota a todas las protenas de carga (-)
todas migrarn hacia el nodo (+), separndose slo por tamao
50 kDa
S-S
S-S
S-S
- - - -
-
S-S + SDS - -- - -
- - - - - - - --- - --
- S-S - S-S - - - -
S-S 44 kDa
S-S - - S-S -- -
+ SDS
+ DTT - --- - - -
- - - - - - --- - 25 kDa
Tampn de carga contiene:
Mercaptoetanol, un agente reductor, que
se encarga de eliminar los puentes
disulfuro que se forman en la estructura
terciaria de las proteinas entre los restos
Cistena
El SDS (lauril sulfato) es el detergente
que se une a las protenas, las
desnaturaliza y le aporta sus cargas
negativas
Azul de bromofenol, colorante con carga
negativa y con una movilidad
electrofortica que equivaldra a
pequeos polipptidos. Su funcin es la
de marcar el frente de electroforesis.
Al aplicar un campo elctrico a la muestra inmersa en el tampn de carga, el
complejo protena-SDS migrar hacia el polo positivo y se separar segn su
tamao.
Los polipptidos de menor peso molecular migrarn ms rpido.
Los de alto peso lo harn ms lentamente.
Las aplicaciones ms comunes de esta tcnica son:
Anlisis del grado de pureza de una protena
Determinacin de su peso molecular
Verificacin de la concentracin de protenas
Deteccin de protelisis
Identificacin de protenas inmunoprecipitadas
Separacin de protenas marcadas con istopos radioactivos
Ventajas:
Gran poder de separacin por TAMAO
Qumicamente inertes
Transparentes (permite densitometra)
Estables (pH, fuerza inica, temperatura)
Versatilidad en cuanto al tamao de poro y entramado uniforme
SDS-PAGE: determinacin del peso molecular
Marcadores de peso molecular:
Mezcla de diferentes protenas pre-
teidas de las que conocemos el peso
molecular.
Por comparacin podemos averiguar el
PM aparente de nuestra protena.
Cuatro componentes lquidos:
Acrilamida
Agente entrecruzante Bisacrilamida
APS (Persulfato de amonio) radicales sulfato inician la polimerizacin
TEMED (Tetrametilen, etilendiamina) propaga la polimerizacin
Geles de Corrida y Apilamiento
Tcnica de electroforesis discontinua. Se preparan 2 geles:
el gel de corrida donde se separan las protenas
el gel de apilamiento o gel concentrador (stacking) que concentra la mezcla
El gel de Corrida que separar las muestras posee mayor concentracin de
Acrilamida (10%) y pH ms bsico ( 8,3). Ofrece mayor resistencia en la corrida
El gel de apilamiento posee baja concentracin de acrilamida (4%) en tampn
ligeramente cido (Tris/HCl 1M pH 6,8). Ofrece poca resistencia a la mezcla de
protenas sometidas a electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa rapidez.
Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida, se prepara, en la parte
superior de ste el gel de apilamiento.
Bajo la accin del campo elctrico, la mezcla proteica, colocada sobre el gel de
apilamiento, comienza a migrar hacia el polo positivo.
Cuando las protenas atraviesan el gel de apilamiento, se encuentran con la
resistencia ejercida por el gel de corrida de manera que aquellas protenas
retardadas puedan alcanzar al resto y todas inicien la separacin desde el
mismo punto, mejorando as la calidad de la corrida.
El gel de apilamiento se prepara siempre a una concentracin de acrilamida
del 4%, mientras que el gel de separacin o gel de corrida se prepara segn
el rango ptimo de resolucin:
Preparacin y colocacin de las muestras
Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, colocar el cassette en el
tanque de electroforesis con aproximadamente 500 ml tampn de corrida en el
cual estn sumergidos los electrodos.
Quitar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos del gel.
Preparar las muestras. Se tomarn 20 l de la muestra y se diluirn con 20 l
de tampn muestra 5X por pocillo. Calentar 3 min. a 90C para desnaturalizar.
Incluir un estndar de peso molecular.
Sembrar 20l de muestra por pocillo mediante el uso de una pipeta hamilton
Corrida Electrofortica aplicando corriente (100 mA) de 40 a 80 volts 2 h aprox
Finalizada la corrida, extraer los vidrios cuidadosamente del cassette y separarlos
de manera que el gel quede posado sobre uno de los vidrios.
Sumergir el gel en solucin colorante azul de Coomassie durante 40 minutos.
Sumergir el gel en solucin decolorante metanol, cido actico glacial, agua dest.
para eliminar las asociaciones inespecficas del gel al colorante.
Observar las bandas proteicas.
