Tcnicas de Cultivo Celular

Laboratorio de Hematopoyesis y
Leucemia

Cultivo Celular

Mantener clulas in vitro conservando al

maximo sus propiedades fisiologicas,
bioquimicas y genticas.

Cultivos Celulares
Establecidos a partir de tejidos u rganos
Cultivos Primarios: Derivan
de tejidos animales normales o
embriones enteros. Periodo de
tiempo limitado.
Senectud
celular (Hepatocitos, neuronas,
etc.)
Cepa Celular: Linaje de
clulas originario a partir de
un cultivo primario
Linea Celular:
Cultivo de
clulas con un perodo de vida
indefinido, se le considera
inmortal. (tumorgenicas o
trasformadas)
Lodish, et al. Biologa Celular y

Disgregacin celular ya sea por medios enzimticos o

mecnicos. Se puede cultiva como capa adherente o en
suspensin en el medio de cultivo, aumentando la masa
celular a lo largo de las generaciones.
Permite un control preciso y fino
del medio ambiente
Caracterizacin y homogeneidad
de la muestra
Motivaciones ticas

Tcnica sensible
Cantidad y costo
Inestabilidad
(no
estn
reguladas por otras clulas y
tejidos.)

Disgregacin celular

Aumentan en nmero aquellas

que tienen mayor tasa de
crecimiento.

Confluencia,
momento
necesario
para
resembrar
en
una nueva placa.
Se
reduce
la
densidad en un
porcentaje desde
80% a 90% (1/5
1/10)

Una lnea celular ser ms fcil de cultivar cuanto ms

indiferenciada sea, con excepciones de lneas tumorales
de clulas diferenciadas.

Las lneas
celulares suelen
mantener la
naturaleza de las
clulas in vivo

Tisulares, o
tumorales
adherentes.

Circulantes,
clulas
hematopoytica
s.

Medios artificiales

Mezcla
de
componentes
purificados o de soluciones
orgnicas complejas

Instrumentos que mantienen

las condiciones fsico-qumicas
adecuadas

Naturaleza del sustrato o fase en que

crecen las clulas.
Soportes o recipientes que los
contienen y aslan
del medio
Condiciones
fsico-qumicas
y
exterior.
fisiolgicas del medio.

Condiciones
Fisiolgicas.
Medios de cultivo
Soluciones
salinas
equilibradas
Aminoacidos
Principal
dificultad
obtener
medios
Vitaminas
nutritivos adecuados que
Glucosa
sean
capaces
de
Suplementos
reemplazar
al
medio
organicos
"natural"
Hormonas y factores
de
crecimiento
(Suero)
Medio Basal de Eagle (BME) Fibroblastos de ratn y
clulas HeLa
Medio mnimo esencial de Eagle (MEM)
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM) Cultivo de
linfocitos en medio libre de suero

Suero
En los medios no definidos las hormonas y factores de
crecimiento los aporta el suero.
Suero
Suero
Suero
Suero

de ternera (ms utilizado)

bovino fetal (lneas ms exigentes
de caballo
humano (lneas humanas)

Gran cantidad de componentes presentes en cantidades

variables que pueden influir en el cultivo (hormonas, factores
de crecimiento.)
Esterilidad: Filtros de 0,22 m
Bacterias (0,5 - 5 m)
Mycoplasma (0,2 0,8 m)
Mohos (2 10 m)
Levaduras (1-10 m)
Virus (20 300 nm)

Tipo de linaje celular

Tipo del cultivo
Composicin qumica del medio
Objetos de la investigacin o
utilizacin

Protenas
Polipptidos
Hormonas
Nutrientes y
metabolitos
Minerales
Inhibidores

Inactivacin: 56 C 30
min
(Sistema
del
complemento)

Fase gaseosa
O2 y CO2
O2:
Tensin
atmosfrica
CO2: influye CO2 disuelto,
el pH y iones HCO3-

Cada medio tiene una concentracin recomendada de

HCO3- en fase acuoso y tensin de CO2 en fase gaseosa
para alcanzar el pH correcto.
Temperatura fisiolgica. ( 37 C )
Humedad ambiental elevada.

Superficies de cultivo

El pH ptimo para la mayora de tipos celulares es de 7,4

(fisiolgico) aunque existen pequenas variaciones.

Indicador Rojo fenol: 7,4

7,0

El cambio de color se debe a

cambio
estructural
6,5 un
inducido por la protonacin o
desprotonacin
de
la

 Inhibidores del crecimiento de

contaminantes (antibiticos y
antifngicos)

Controles de esterilidad disenados para detectar

contaminantes de crecimiento en el medio de
cultivo, incubando alcuotas de medio en la
incubadora durante 24 o 48 h

Asepsia

Esterilizacin

Cabinas de flujo laminar

Recuento
Azul de tripano se
introduce en el interior
de clulas no viables.
Cristal violeta: Tine
clulas cultivadas

Se emplean diferentes tcnicas para determinar la densidad celular:

cmara de Neubauer Equipos automticos Cell Coulter
Cmara adaptada a microscopio de contraste de fases, cuadricula de
medidas definidas, volumen a contar mediante la cuadrcula de
recuento ( volumen de muestra celular).
# cel. (# cel.
Conteo)(Factor de
Profundidad de la cmara: 0,1 mm
dilucin)(volumen de
(superficie contada * profundidad de la cmara)muestra)( 10 000) #

Conservacin
Neveras (4C) para el almacenamiento
de medios, PBS, ...
Congeladores de -20C para el
almacenamiento de suero, aditivos
(glutamina, antibiticos) y soluciones
enzimticas (tripsina, colagenasa,...).
Congeladores de -80C para el
almacenamiento a largo plazo de los
aditivos del medio (suero, glutamina,
antibiticos,...)
y
de
sustancias
especialmente sensibles (factores de
crecimiento, mitgenos, inductores,...).
Unidad
de
almacenamiento
en
nitrgeno lquido (-196C), para el
almacenamiento de las lneas celulares.

Dimetilsulfxido (DMSO)
Agente penetrante, evita
formacin de cristales