IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DE INTERS CLNICO

Blgo. Mblgo. Freddy Vallejo Len

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
tincin: uniforme, irregular, unipolar, bipolar, etc. forma: cocos, bacilos, cocobacilos, filamentosos, bacilos curvos, etc. cpsula: presente o ausente endosporas: ovales, esfricas, terminales, subterminales tamao: cortos, largos, etc. bordes laterales: abultados, paralelos, cncavos, irregulares extremos: redondeados, puntiagudos disposicin: parejas, cadenas, ttradas, racimos, etc.

CARACTERSTICAS MACROSCPICAS
El tamao de las colonias bacterianas a forma est determinada por los bordes y el grosor de la colonia (liso o rugoso e irregular; abultada o plana) La textura (seca a viscosa, con superficie lisa o granular) Algunos microorganismos producen una colonia pigmentada Hemlisis , ,

CULTIVO
Medios bsicos (ricos en nutrientes que permiten el crecimiento de la gran mayora de las bacterias) Medios de enriquecimiento (recuperar bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales) Medios selectivos (fomentan el crecimiento de algunas bacterias y evitan el de otras) Medios diferenciales (poner de manifiesto caractersticas distintivas de las colonias) Medios cromognicos (incorporan sustancias cromognicas para detectar distintas enzimas producidas por los microorganismos)

PRUEBAS BIOQUMICAS:
Pruebas que se utilizan en la identificacin preliminar, con lectura inmediata

Prueba de la catalasa
Presencia de la enzima catalasa Micrococacceae (+) Streptococcus spp y Enterocccocus spp (-)

Prueba de la oxidasa
Presencia de la enzima oxidasa (mtodo de Kovacs): El dihidroclorhidrato de tretrametil p-fenilendiamina se transforma en indol por la oxidasa (violeta oscuro) Bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y Vibrio fetus (+) Bacterias anaerobias estrictas, mayora de anaerobias facultativas (-)

Pruebas rpidas, con lectura en menos de 6 horas:

Hidrlisis del Hipurato

Hipurato de sodio se transforma en cido benzoico y glicina por la hipuricasa (indicador ninhidrina): Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis y Streptococcus agalactie (+: violeta intenso) (- : incoloro o amarillo rosado plido)

B-galactosidasa
O-nitrofenil-B-Dgalactopiransido (ONPG) se transforma en onitrofenol (amarillo) por la enzima B-galactosidasa: Bacterias fermentadoras lentas de lactosa (+: amarillo) (- : incoloro)

Aminopeptidasa (PYR)
Presencia de la enzima aminopeptidasa: La L-pirrolidonil B-naftilamida (PYR) se trasnforma en Bnaftilamina por la L-pirroglutamilaminopeptidasa detectada N,N-metilaminocinamaldehdo (rojo brillante) Streptococcus, Enterococcus y staphylococcus lugdunensis(+ : rojo brillante) (- : sin cambio de color o anaranjado)

Leucina aminopeptidasa (LAP)

Para cocos Gram positivos no productores de catalasa: Discos con leucina dan un color rosado cuando se ponen en contacto con el cinamaldehdo por la LAP Enterococcus (+ : rojo) Leuconostoc (- : sin cambio de color o amarillo plido)

Ureasa
La urea se transforma en amoniaco y CO2 por la ureasa que produce un medio alcalino (rojo de fenol pasa de naranja plido a rojo fucsia): Proteus, Physobacter, phenylpiruvicus, Helicobacter y Brucella (+ : rojo fucsia) Leuconostoc (- : sin cambio de color o naranja plido)

Indol
El triftfano es degradado por la enzima triftofanasa produciendio indol que se detecta con el reactivo de Kovacs o de Ehrlich): (+ : anillo de color rosado a rojo oscuro) (- : sin cambio de color)

Pruebas lentas, con lectura de 18 a 48 horas:

Oxido fermentacin
Determina la degradacin de un carbohidrato por va aerbica o anaerbica utilizando un indicador de pH (Ej. rojo de fenol): (A : amarillo significa acidez producida del carbohidrato) (K : rojo significa alcalino, no utilizo el carbohidrato)

Reduccin de nitratos
Pone de manifiesto al reduccin de nitratos a nitritos al agregar cido sulfanlico reacciona con el nitrito dando una sal de diazonio que reacciona con la alfanaftildiamina (colorante azoico rojo hidrosoluble): (+ : rojo) (- : sin cambio de color)

Rojo de metilo
Comprueba la capacidad de un microbio de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa con el reactivo rojo de metilo: Bacilos entricos Gram negativos (+ : rojo) (- : amarillo)

Voges-Proskauer
Comprueba la fermentacin de la glucosa por la va butanodilica formando un intermediario (acetona) que forma un color rojizo con el alfanaftol: Bacilos entricos Gram negativos, Aeromonas y Vibrio (+ : rojo) (- : amarillo)

Agar Hierro Kigler

Sirve para determinar metabolismo de un carbohidratos (glucosa, lactosa o ambos), produccin de gases (CO2 y H2) y produccin de H2S: (A : cido, es amarillo) (K : alcalino, es grosella) (gas +: presencia de gas) (gas -: ausencia de gas) (H2S +: color negro) (H2S -: sin color negro)

Fermentacin de azcares
Determinar la fermentacin de carbohidratos a cidos orgnicos con usando indicadores de pH: (+ : cambio de color) (- : sin cambio de color)

Hidrlisis de la esculina
La esculina es transformada a esculetina y glucosa, la esculetina reacciona con una sal de hierro y forma un compuesto castao oscuro o negro: (+ : negro) (- : sin cambio de color)

Coagulasa
El plasma es coagulado por la coagulasa: Staphylococcus aureus (+ : cogulo) (- : sin cogulo)

Fenilalanina desaminasa
La fenilalanina es desaminada por la fenilalanina desaminasa en cido fenilpirvico que se detecta al agregar gotas de cloruro frrico: (+ : color verde en la superficie del agar inclinado) (- : sin cambio de color en el agar inclinado)

ADNasa
Determina la capacidad de algunas bacterias de hidrolizar el ADN produciendo un halo alrededor del agar ADNasa: (+ : formacin de halo) (- : sin halo)

Hidrlisis de la gelatina
Capacidad de lagunas bacterias de hidrolizar la gelatina a pptidos y aminocidos: (+ : licuefaccin total o parcial del tubo sembrado a 4C) (- : solidificacin completa del tubo a 4C)

Descarboxilasa
Determina la capacidad de algunas bacterias para descarboxilar (a aminas) la lisina ( a cadaverina), ornitina (a putrescina) y arginina (a citrulina) en medio anerbico previa utilizacin de la glucosa usando un indicar de pH: (+ : cambio de color al alcalino que es violeta) (- : no hay cambio de color o es amarillo por la acidez)

Lipasa
Capacidad de algunas bacterias para descomponer las grasas en glicerol y cidos grasos en un medio con lpidos: (+ : crecimiento) (- : no hay crecimiento)

Lecitinasa
Capacidad de algunas bacterias para descomponer lecitina (yema de huevo) en un medio de cultivo: (+ : crecimiento) (- : no hay crecimiento)

Utilizacin del citrato

Capacidad de algunas bacterias de utilizar el citrato como fuente de carbono y las sales de amonio como fuente de nitrgeno con un indicador de pH azul de bromotimol (verde a azul): Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas salmonelas (+ : crecimiento con cambio de color) Escherichia, Shigella, S. Typhi, S. Paratyphi (- : no hay crecimiento)

Utilizacin del malonato

Capacidad de algunas bacterias de utilizar el malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrgeno produciendo NaOH detectado con un indicador de pH azul de bromotimol (verde a azul): Enterobacter y Klebsiella (+ : azul) (- : verde)

Prueba de CAMP
Ciertos microbios producen una protena extracelular difusible (Factor CAMP) que acta en forma sinrgica con al B-lisina del S. aureus para producir una mayor lisis de los eritrocitos: (+ : hemolisis pronunciada) (- : verde)

Pruebas basadas en la resistencia a ciertas sustancias:

Optoquina
Clorhidrato de etilhidroxi-cuprena (optoquina) inhibe (5 ug/mL) el crecimiento de Streptococcus pneumoniae: (+ : halo de inhibicin) (- : no hay halo de inhibicin)

Bacitracina
Los estreptococos B-hemolticos del grupo A de Lancefield (Strep. pyogenes) es sensible a la bacitracina y no la mayora de estreptococos: (+ : halo de inhibicin) (- : no hay halo de inhibicin)

Solubilidad en bilis
Sirve para diferenciar Strep. pneumoniae (positivo) de los estreptococos alfahemolticos (negativos) empleando una solucin de sales biliares que lisan a los neumococos (baja la tensin superficial y las enzimas autolticas lisan a la clula): (+ : colonia se desintegra) (- : colonia intacta)

Crecimiento en caldo hipersalino

Determina la capacidad de algunos microbios para crecer en medios hipersalinos (NaCl 6,5%), se le puede aadir al medio un carbohidrato (glucosa) y un indicador de acidez (prpura de bromocresol): (+ : turbidez visible en el caldo con cambio de color del violeta al amarillo o sin l) (- : ausencia de turbidez y cambio de color)

 Sistemas comerciales manuales o galeras multipruebas Sistemas comerciales automatizados

SISTEMAS COMERCIALES MULTIPRUEBAS

Sistemas de identificacin multipruebas (API 20 E)

Si la reaccin es negativa se pone 0. Si la reaccin es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es el tercero. Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene un cdigo de 7 cifras.

0104140 0104452 0104504 0104521 0140004 0144042 0206042 0210004 0210004 0210004 0314000 0504512 0676001 0776000 1000004 1014743 1104112 1214012 1214773 2206004

Shigella flexneri Salmonella paratyphi A Pasteurella multocida Yersinia enterocolitica Pasteurella multocida Shigella boydii Acinetobacter calcoaceticus Achromobacter sp. Alcaligenes faecalis Alcaligenes sp. Proteus mirabilis Salmonella paratyphi A Proteus vulgaris Proteus mirabilis Pasteurella sp. Klebsiella ozaenae Shigella sonnei Yersinia pseudotuberculosis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa

2504752 Salmonella spp. 3005573 Enterobacter cloacae 3246527 Aeromonas hydrophilia 4004550 Salmonella cholerasuis 4004550 Salmonella typhi 4104100 Salmonella gallinarun 4357106 Vibrio parahemolyticus 4404112 Salmonella gallinarum 4604552 Salmonella spp. 4704500 Salmonella cholerasuis 5004024 Pseudomonas cepacea 5044124 Vibrio cholerae 5046753 Serratia odorifera 5100100 Yersinia ruckeri 5104111 Hafnia alvei 5104542 Salmonella arizonae 5144572 Escherichia coli 5207323 Serratia rubidae 5255573 Klebsiella oxytoca 5346761 Serratia marcescens

5314173 Enterobacter gergoviae 5317761 Serratia marcescens 5314173 Enterobacter gergoviae 5317761 Serratia marcescens 5704412 Salmonella arizonae 5704552 Salmonella arizonae 6004540 Salmonella typhi 6144204 Plesiomonas shigelloides 6404112 Salmonella spp. 6504750 Salmonella spp. 6604512 Salmonella spp. 6704342 Salmonella spp. 6704532 Salmonella spp 6704752 Salmonella gallinarum 7244126 Aeromonas hydrophila 7305773 Enterobacter cloacae 7704752 Salmonella arizonae 7704752 Salmonella spp.

Ejemplo

Prueba

Reaccin / Enzimas

Negativo

Positivo

ONPG
ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND

Beta-galactosidasa
Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Utilizacin del citrato Produccin de H 2 S Ureasa Triptfano desaminasa Produccin de indol

sin color
amarillo amarillo amarillo verde sin precipitado negro amarillo amarillo amarillo

amarillo
rojo o naranja rojo o naranja rojo o naranja azul oscuro o turquesa precipitado negro rojo o naranja marrn-rojo color rosa o anillo rosa-rojo

VP
GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

Produccin de acetona (Voges-Proskauer)

Gelatinasa Fermentacin/oxidacin de glucosa Fermentacin/oxidacin de manitol Fermentacin/oxidacin de inositol Fermentacin/oxidacin de sorbitol Fermentacin/oxidacin de ramnosa Fermentacin/oxidacin de sacarosa Fermentacin/oxidacin de melobiosa Fermentacin/oxidacin de amigdalina Fermentacin/oxidacin de arabinosa Citocromo oxidasa

sin color
sin difusin azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde

rosa-rojo
difusin de pigmento amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo

Panel de pruebas bioqumicas y antibiograma con sistema automatizado MicroScan

Siglas de algunos antibiticos para antibiograma

Acido nalidxico (NAL); Amicacina (AMK); Amoxicilina (AMX); Amoxicilina-Ac. clavulnico (AMC); Ampicilina (AMP); Ampicilinasulbactam (SAM); Azitromicina (AZM); Azlocilina (AZL); Aztreonam (ATM); Cefaclor(CEC); Cefaloridina (CEF); Cefalotina (CEP); Cefalosporinas de tercera generacin (C3G); Cefazolina (CFZ); Cefepime (FEP); Cefoperazona (CFP); Cefotaxima (CTX); Cefotaxima-Ac. clavulnico (CTC); Ceftazidima (CAZ); Cefoxitina (FOX); Ceftriaxona (CRO); Cefuroxima (CXM); Ciprofloxacino (CIP); Claritromicina (CLR); Clindamicina (CLI); Cloranfenicol (CHL); Colistina (COL); Doxiciclina (DOX); Eritromicina (ERI); Estreptomicina (STR); Estreptomicina de alta carga (STH); Fosfomicina (FOS); Furazolidona (FRZ); Gentamicina (GEN); Gentamicina de alta carga (GEH); Imipenem (IPM); Levofloxacina (LVX); Lomefloxacina (LOM); Meropenem (MEM); Minociclina (MINO); Nitrofuratona (NIT); Norfloxacina (NOR); Oxacilina (OXA); Ofloxacina (OFX); Penicilina (PEN); Pefloxacina (PEF); Piperacilina (PIP); Piperacilina-tazobactam (TZP); Rifampicina (RIF); Sulfatiazol (SLF); Teicoplanina (TEC); Tetraciclina (TCY); Ticarcilina (TIC); Trimetoprimasulfametoxazol (SXT); Tobramicina (TOB); Vancomicina (VAN).

OTROS MTODOS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

Las pruebas serolgicas (ELISA y Western Blot )

 La tipificacin por fagos es la identificacin de cepas y especies bacterianas mediante la determinacin de susceptibilidad a diversos fagos.

 Los perfiles de cidos grasos pueden utilizarse para identificar algunos organismos. La citometra de flujo determina caractersticas fsicas y qumicas de las clulas. En la clasificacin de los microorganismos puede utilizarse el porcentaje de pares de bases GC del cido nucleico.

 El nmero y los tamaos de los fragmentos de DNA, o huellas de DNA, producidos por enzimas de restriccin se utilizan para determinar similitudes genticas.

 La reaccin de cadena de la polimerasa (PCR) puede utilizarse para amplificar una pequea cantidad de DNA microbiano en una muestra. La presencia o la identificacin de un organismo es indicada por el DNA amplificado.

 Las cadenas simples de DNA, o de DNA y RNA, provenientes de organismos relacionados se unirn por enlaces de hidrgeno para formar una molcula bicatenaria; esta unin se denomina hibridacin del cido nucleico. El Southern Blot, las micromatrices (chips) de DNA y el mtodo FISH son ejemplos de tcnicas de hibridacin de cido nucleico.

 La secuencia de bases en el RNA ribosmico puede utilizarse en la clasificacin de microorganismos.