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microbiologia taxonomia

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TEMARIO

Taxonomía y concepto de especie en procariotas Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting) Filogenética: clasificación y relación evolutiva gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos Relación entre taxonomía clásica y filogenética. Diversidad bacteriana. Ejemplos. Identificación de una cepa

TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS

Silvana Tarlera
Cátedra de Microbiología Facultad de Química y Facultad de Ciencias 2007

TAXONOMÍA
BIBLIOGRAFÍA • Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria) Clasificación
estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud

Nomenclatura
asigna nombres a los taxones

Identificación
determina a que taxones pertenece un organismo que se aisla

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• Taxonomía
– – – – Caracterización exhaustiva Aplicación de teoría y método de clasificación Formación de grupos taxonómicos (taxones) Nomenclatura

ESPECIE BACTERIANA
• Definición en revisión continua • Definición metodológica estándar:
- % de hibridación ADN
bacteria1-ADN bacteria2

• Identificación
– Caracterización por número limitado de tests adecuados al problema – Comparación con spp conocidas – Asignación a una sp – No identificado: estudio taxonómico

> 70%

- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)

Definición genómica de especie • Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas)

Absorbancia

ADN simple hebra ADN doble hebra

ESPECIE
• unidad taxonómica básica • grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas • Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo o de una sola célula

220

260 300 Longitud de onda (nm)

Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion

Abs. relativa 260 nm

ADN simple hebra desnaturalización Tm = 86ºC ADN doble hebra 80 90 100 temperatura (ºC)

Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADNADN o de ADNARN

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Cinéticas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

Hibridación genómica como herramienta taxonómica

RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA
Taxones:
Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie importancia en estudios clínicos y ecológicos

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Categorías de clasificación a nivel de subespecie (tipificación) Sistema binomial de nomenclatura (Linneo)
Escherichia coli Escherichia coli o E. coli Variedades o tipos • serovariedad o serotipo (antígenos distintos) • fagovariedad (tipificación por fagos) • biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) • patovariedad (patogenicidad) • morfovariedad (diferencias morfológicas) • genomovariedad (grupos con ADN similares)

Jerarquía taxonómica de la bacteria Allochromatium warmingii
Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Secuencia del gen 16S rRNA Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Bacterias Gram negativas Chromatiales Bacterias fotótrofas púrpuras Chromatiaceae Bacterias púrpuras del azufre Allochromatium Allochromatium warmingii

Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)-1989(vol 4) Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001-2005 (vol 1-vol 5) The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)

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PUBLICACIONES International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB).

Publicado por la Sociedad General de Microbiología

Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico
Morfología: forma, tamaño y tinción Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo,
aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S

Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology COLECCIONES (cepas tipo y otras)
ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colección alemana) CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

Movilidad: tipo y disposición de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad
a antibióticos, patogenicidad

Taxonomía bacteriana
CLÁSICA
• caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.) • % G+C • ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

Características genotípicas clásicas
• Contenido

G+C

G+C x 100 G+C+A+T determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía Amplio rango en procariotas: 20 al 80% Poca información para la caracterización taxonómica

% G+C =

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Rangos de composición de bases de ADN

NUMÉRICA
- caracteres fenotípicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza = a+d . a+b+c +d
a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas

Taxonomía bacteriana
NUMÉRICA
• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos • Se basa en un gran número de caracteres • Cada carácter tiene igual peso • La similitud es función de la proporción de caracteres comunes

MOLECULAR
Caracteres Genotípicos • Hibridación ADN-ADN • Molecular fingerprinting (huella molecular) Caracteres Fenotípicos • Quimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos (FAME), otros

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CARACTERES FENOTIPICOS
• Hibridación

ADN-ADN

Marcadores quimiotaxonómicos
Características - análisis químico con equipamiento especializado - no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos - alto grado de discriminación - presentes en distintas estructuras celulares

- depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2 Δ Tm del híbrido - es el criterio actual de definición de especie

• Molecular

fingerprinting
• Pared: peptidoglicanos en Gram + • Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos • Membrana citoplasmática: ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), lípidos polares, ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. • Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. • Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. • Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

- secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestión con enzimas de restricción - resolución a nivel de sub-especie

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Desventajas de una clasificación artificial
• No permite inferir propiedades • No permite comprender microorganismos que no se han cultivado en el laboratorio • No permite estudiar el origen y evolución de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)

POLIFÁSICA
Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: Genotípicos:
- clásicos (morfología, nutrición, etc) - moleculares (marcadores quimiotaxonómicos) - perfil de proteínas totales y enzimas -clásicos: % G+C - moleculares: hibridación DNA-DNA, fingerprinting (ej. Perfiles

moleculares por restricción o amplificación de ADN)

Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

Clasificación natural
Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica. Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas

• El uso de secuencias moleculares para estudios filogenéticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporción de éstos permanece fijo en las moléculas.

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CARACTERES FILOGENETICOS
• Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies) • Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas • Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución

Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos
•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) •Subunidad beta de ATPasa •RecA

Factor de Elongación Tu

•Genes funcionales

PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO

ARNr en Procariotas
Nombre 5S 16S Tamaño (nucleótidos) 120 1500 2900 Ubicación Subunidad mayor del ribosoma Subunidad menor Subunidad mayor

distribución universal (presente en todos los organismos) función homóloga en todos los organismos capacidad de alinear - secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables - ausencia de transferencia horizontal - cantidad de información suficiente

23S

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Secuencia del ARNr 16S • Estructura primaria:
Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria

Un árbol filogenético es una hipótesis de relación evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente

Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis filogenética resultante.

• Estructura secundaria:
Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral

¿Cómo se construye un árbol filogenético?

Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli
Líneas gruesas: dominios de conservación universal Líneas normales: dominios de conservación intermedia Líneas punteadas: regiones hipervariables

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2) Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas Organismos A B C D secuencias ARN CGU AGA CCU GAC C CUU CCU AGA GCU GGC CAA C CAA GAC GUG GCA C CAU GCU AGA UGU GCC
Posiciones mas variables Posicion mas conservada

Secuencias sin alinear en programa Clustal IX

Secuencia del organismo problema

secuencias obtenidas de la base de datos

Posiciones que van a ser comparadas

Árboles filogenéticos
• Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos • Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva • Similitud de secuencias implica similitud en los genes

Secuencias alineadas en programa Clustal IX

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Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a partir del gen 16S ARN

Definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S
Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes

Relación entre la similitud de secuencias del 16S rARN y la hibridización genómica de ADN entre pares de organismos.

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ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA
Alineamiento y corrección de la secuencia Comparación con bases de secuencias

(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar
> 3% < 3% pruebas fenotípicas Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes diferentes Hibridación ADN-ADN < 70% > 70% NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE similares

NUEVA ESPECIE

Secuencias signaturas o firma en ARNr
Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos
Ejemplos: AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria CACACACCG (posición 1400) en Archaea C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

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Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya

Secuencia del gen ARNr 16S
Se emplea frecuentemente para: COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: “Candidatus”

Bacteria Peptidoglicano Lípidos Operones RNA polimerasa Ribosomas tRNA iniciador Ribosoma sensible a: Toxina diftérica Cloranfenicol Kanamicina Estreptomicina No Sensible Sí Enl. ester Sí Una (4 subun) 70S Formilmetionina

Archaea No Enl. eter Sí Varias (8-12 subun) 70S Metionina

Eucarya No Enl. ester No Tres (12-14 subun) 80S Metionina

Sensible No

Sensible No

ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

Arbol del ARNr 16S
• Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria • Muchos de los linajes profundos son anerobios o microaerofílicos • Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria

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ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes
Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre sí) Fotótrofos anoxigénicos ambos poseen clorosomas con similar función y estructura posibles explicaciones: transferencia lateral evolución independiente el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama

Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S
• Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya • Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) • Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia • Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicacion, transcripción y traducción

Arbol del dominio Bacteria

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DOMINIO BACTERIA
Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Mas de 400 géneros Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros, Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 géneros

•Aquifex Bacterias autótrofas y termófilas •Bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus) Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato •Deinococci Altamente resistentes a la radiación (D. radiodurans) •Bacterias verdes del azufre (Chlorobium) Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del ácido cítrico •Planctomycetes Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación, compartimentalización celular (membrana nuclear),” annamox” fisiología única, “Candidatus” •Cyanobacteria Bacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica

• Gram positivos bajo GC
G+C < 50% Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus

• Gram positivos alto GC
G+C > 50-55% Géneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium

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PROTEOBACTERIAS • Alfa: metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas, litótrofas (Nitrobacter), fij. N2, bacterias rojas no del S fotosínteticas • Beta: litótrofas de NH3 (Nitrosomonas) • Delta: Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras

Ciclo de Myxobacterias

Ejemplos de diversidad: estructura y función
• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) • Membranas: diferente composición (Mycobacterium)

Etapas en el ciclo celular de Hyphomicrobium

• Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formación de hifas (Streptomyces) • Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) • Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) • Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio) • Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.: decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

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DOMINIO ARCHAEA
40 géneros 3 linajes separados: • Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos) • Crenarchaeota (termófilos) • Korarchaeota (solo secuencias ambientales)

Taxones definidos previamente coherentes filogenéticamente:
Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria)

Caracteres filogenéticamente no valiosos para definir taxones superiores:
Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad, morfología compleja (helicoidal, gemación micelio, apéndices)

¿Por qué hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)?
son ancestrales son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

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¿Cómo surge una nueva especie bacteriana?

ORIGEN DE LA VIDA
• Origen de la tierra 4600 millones de años • Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S • Temperatura > 100°C • Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos) • Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN) • Célula moderna: ADN ARN Proteína

Concepto polifásico de especie: Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes

Concepto ecotipo (Cohan, 2004): Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genómicamente coherente que difiere genéticamente de otros subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas.

Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados de las bases de datos proteómicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificación de las especies.

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