PURIFICACIN

DE
PROTENAS
Semestre 2013-2
Febrero 12 2013
Las protenas son macromolculas formadas por
cadenas lineales de aminocidos
Qu es un aminocido?

Cmo se llama el enlace que une dos aminocidos?
LAS PROTENAS SON VITALES PARA EL BUEN
FUNCIONAMIENTO CELULAR
FUNCIN EJEMPLOS
Catlisis
Defensa
Transporte
Soporte
Movimiento
Regulacin
Sealizacin
LAS PROTENAS SON VITALES PARA EL BUEN
FUNCIONAMIENTO CELULAR
FUNCIN EJEMPLOS
Catlisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas
Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas
Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales
membranales
Soporte Colgeno, queratina
Movimiento Actina, miosina
Regulacin Factores de transcripcin (protenas de
unin al DNA)
Sealizacin Hormonas (insulina)
PARA QU NECESITAMOS PURIFICAR
PROTENAS?
Para la produccin de anticuerpos
ESTUDIAR SU FUNCIN y regulacin enzimtica
REALIZAR ANLISIS ESTRUCTURALES:
cristalografa de rayos X, espectroscopa NMR.
Estudiar sus interacciones con otras protenas o con
cidos nuclecos
Si no se conoce el gen que codifica a la protena aislada:
La protena purificada se puede usar para determinar la
secuencia de aminocidos y por tanto la secuencia del
gen que la codifica!!!!



ANTES DE EMPEZAR!!!!

1. Seleccionar la muestra biolgica (fuente)
2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA
Muy alta > 99% Usos terapeticos , estudios in vivo
Alta > 95-99% Estudios estructurales, cristalografa de
rayos X, Caracterizacin fisicoqumica
Moderada > 95% Obtencin de antigeno(s) para la
produccin de anticuerpos
Secuenciacin
Espectrometra de masas
ANTES DE EMPEZAR!!!!
2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA
ANTES DE EMPEZAR!!!!

3. Investigar las PROPIEDADES de la protena que
se desea purificar
1. Tamao
2. Propiedades inicas (punto isoelctrico)
3. Hidrofobicidad (solubilidad)
4. Estabilidad (temperatura, pH, oxidacin-
reduccin)
5. Afinidad por un ligando

ANTES DE EMPEZAR!!!!

4. Contar con un mtodo adecuado para la
deteccin de la protena de inters.

Monitorear el progreso de la purificacin


a. Cuantificacin de protena total

a. Detectar especficamente la protena de inters
SDS-PAGE: una tcnica utilizada ampliamente para
monitorear el progreso de una purificacin
PARA PURIFICAR UNA PROTENA ES NECESARIO REALIZAR
VARIAS PASOS
Fase I. El objetivo inicial es la obtencin del homogeneizado o extracto crudo y su
clarificacin o concentracin.







Fase II. El objetivo principal es eliminar una cantidad importante de contaminantes que
pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms
utilizados para eliminar protenas contaminantes es el de la precipitacin.






Fase III. El objetivo es obtener una protena pura o con mnimas trazas de
contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios
mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular, intercambio
inico, interaccin hidrofbica y de afinidad.
PARA PURIFICAR UNA PROTENA ES NECESARIO REALIZAR
VARIAS PASOS
Al final de la prctica aprenderemos a
hacer e interpretar un
CUADRO DE PURIFICACIN
A PURIFICAR SE HA DICHO!!!!!
1. Ya seleccionamos la muestra biolgica (fuente)
Cul es el primer paso?
MTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR
Algunos ejemplos son:
1. Lisis celular vlido para clulas sin pared celular como las clulas de
tejidos animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias.
2. Destruccin mecnica
Congelacin-descongelacin, prensa de
French, sonicacin, macerado con N2
lquido
3. Lisis con detergentes
Una vez que la protena se ha extrado de su entorno
natural est expuesta a
muchos agentes que pueden daarla!!!!!!.





Cmo protegemos a la protena de inters?
UTILIZAR:
Soluciones amortiguadoras
Inhibidores de proteasas
Bajas temperaturas (4C)

EVITAR
Altas temperaturas
Manipular demasiado la muestra

PROCURAR
que el proceso sea lo ms corto posible.
Algunos agentes estabilizadores son:
El resultado de la lisis celular es un lisado u
homogenado que contiene una mezcla de
protenas, membranas y clulas rotas.
Esta preparacin se somete a filtracin y/o
centrifugacin
Para obtener el clarificado
OBTENCIN DEL EXTRACTO CRUDO
Centrifugacin
CENTRIFUCACIN DIFERENCIAL
VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIN A
DIFERENTES VELOCIDADES
La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de
diferentes partculas en la suspensin que difieren en su densidad
de la del medio.
Mtodos de purificacin de protenas
BAJA
RESOLUCIN
Precipitacin con sales,
precipitacin con temperatura y pH
ALTA
RESOLUCIN
Mtodos cromatogrficos:
filtracin en gel, intercambio inico,
afinidad
Mtodos electroforticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante, isoelectroenfoque
Precipitacin con sales
Sal ms usada: Sulfato de Amonio
EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE
AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE
SATURACIN ESPECFICO

Piruvato + NADH Lactato + NAD
+

LDH
Oxidorreductasa que cataliza la reduccin del
piruvato a lactato gracias a la oxidacin de NADH a
NAD+.
Lactato deshidrogenasa (LDH)
LDH - Isoenzimas
La LDH es un tetrmero
Las cinco isoenzimas se han enumerado del 1
al 5 en funcin de su movilidad electrofortica.
As la LDH-1 (H4) es la que ms avanza hacia
el nodo mientras que la LDH-5 (M4) es la de
menor movilidad electrofortica.
LDH - Isoenzimas
LDH - 1 (H4): en el corazn, msculos y eritrocitos.
LDH - 2 (H3M): en el sistema retculo endotelial y leucocitos.
LDH - 3 (H2M2): en los pulmones.
LDH - 4 (HM3): en los riones, placenta y pncreas.
LDH - 5 (M4): en el hgado y msculo esqueltico.
Todas las isoenzimas pueden unir 4 molculas de coenzima


LDH
Vida media de 144 horas.
Peso molecular es de aproximadamente 140
kDa, cada subunidad pesa aproximadamente
35 kDa.
EC. 1.1.1.27
- Clase : 1 (oxidorreductasa)
- Subclase : 1 (acta sobre un sustrato que posee
un grupo CH-OH como donador de electrones)
- Subsubclase : 1 (NAD+ o NADP+ es el coenzima
aceptor)
- Orden dentro de la subsubclase : 27 (nmero de
enzima en este grupo)