UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE QUMICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE LABORATORIO DE TOXICOLOGA Clave 1848 Horas de teora: 3 Horas de prcticas: 4

Profesores: Adelina Jimnez Arellano Lourdes Mayet Cruz Liz Jannet Medina Reyes Carlos Prez Muoz Laura Cedillo Camarillo Javier Carballo Perea Francisco Hernndez Luis Juan Gabriel Navarrete Vzquez Ciudad Universitaria Mxico, D.F. 2001

INDICE Pgina 2 3 4 5 10 20 22 26 32 36 39

Reglamento para el Laboratorio de Toxicologa Criterios de Evaluacin para el Laboratorio de Toxicologa Reporte de Seguridad e Higiene EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE TOXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA. EFECTOS TXICOS DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE METALES PESADOS POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO DETERMINACION DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA CUANTIFICACIN DE UN TXICO VOLTIL (CIANURO DE HIDRGENO) EN GLUCSIDOS CIANOGNICOS. IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES Y BARBITRICOS EN MUESTRAS BIOLGICAS PRODUCCION DE MiHb POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO DETERMINACIN DE MALATIN RESIDUAL

REGLAMENTO PARA EL LABORATORIO DE TOXICOLOGIA

1. Dentro del laboratorio es obligatorio el uso de la bata de algodn, perfectamente cerrada. 2. Todos los alumnos durante la sesin de laboratorio debern usar zapato cerrado con un tacn no mayor a tres centmetros 3. Slo se prestar material mediante un vale firmado por el alumno con su credencial universitaria vigente. 4. El alumno se hace responsable del material en el momento de recibir la charola, por lo tanto se les aconseja, revisar con todo cuidado ste, pues el laboratorista no admitir reclamaciones posteriores. 5. Las ordenes de pago, para los adeudos pendientes, debern recogerse a la semana siguiente. Es recomendable pagarlos inmediatamente y evitar que se puedan extraviar. 6. Los comprobantes de pago de material se reciben de lunes a viernes de 10 a 13 h en el anexo 1-E/F. 7. Si el alumno desea reponer el material roto con otro que adquiera fuera de la Facultad, es indispensable presentar la nota de compra actualizada, de otra manera no se le podr recibir. 8. En ninguna prctica el alumno podr pipetear las diversas soluciones con la boca. Es obligatorio el uso de perillas para tal fin, adems ser indispensable el uso de lentes de seguridad durante toda la prctica. 9. Se requiere de una fotografa tamao infantil para el control interno de su asistencia y evaluacin. 10. Est terminantemente prohibido fumar, ingerir alimentos o bebidas y hablar por telfono en el laboratorio. 11. Es deseable que se pueda demostrar nuestro espritu universitario al mantener las reas de trabajo limpias despus de cada sesin. 12. Para que el alumno tenga derecho a la calificacin del laboratorio, debe entregar su comprobante de inscripcin en el periodo indicado y no tener adeudo pendiente de material. 13. Quedan estrictamente prohibidas las visitas, durante las horas de laboratorio. 14. Si el alumno necesita salir por cualquier motivo durante la sesin del laboratorio, deber comunicarlo a los profesores. 15. Es necesario que el alumno sea puntual a la sesin del laboratorio, teniendo como tolerancia 15 minutos. 16. Una vez que se reparta la ltima muestra problema, no se dar a ninguna otra persona que haya llegado tarde. 17. Para que el alumno tenga derecho a calificacin final de laboratorio, no deber tener adeudo pendiente de material.

CRITERIOS DE EVALUACION DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGA La calificacin del laboratorio estar constituida por los siguientes puntos: 1.- Reporte y trabajo en el laboratorio 2.- Examen 3.- Reporte de seguridad e Higiene 50% 40% 10%

Antes del inicio de cada guin o prctica, el alumno deber presentar un diagrama de flujo en el que se describan las actividades que se llevarn a cabo durante la misma, as como la investigacin previa que debi haber realizado para poder llevar a cabo la prctica (propiedades fisicoqumicas, solubilidad, toxicidad de los reactivos, etc.). 1.- EL REPORTE de los guiones consistir en una serie de preguntas relacionadas con los fundamentos del guin, resultados y conclusiones del mismo, de manera que nicamente se entregar el cuestionario completo a la siguiente sesin de haber finalizado la misma. Para el caso del reporte de prcticas, este deber contener: introduccin, respuesta al cuestionario, diagrama de flujo de las actividades a realizar, reacciones y fundamentos de la misma, resultados, conclusiones y bibliografa. 2.- EXAMEN. Consistir en preguntas relacionadas con la prctica a realizar. El alumno no tendr derecho a reprobar ms de dos exmenes durante el semestre, de lo contrario ser dado de baja. 3.- REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE. Se deber de entregar al final de cada prctica y slo por los alumnos que en esa prctica hayan sido designados como jefes de mesa. La hoja de seguridad e higiene ser proporcionada por el profesor y contendr los siguientes puntos: Utilizacin de reactivos.- que contempla los reactivos utilizados, la cantidad final e inicial de los mismos y como fueron manejados los residuos al final de la sesin. Vigilancia del equipo utilizado.- Se deber indicar la hora en que se prendieron y se apagaron todos los equipos empleados durante la prctica y las observaciones iniciales y finales. Medidas de seguridad.- Se debern anotar todas las medidas de seguridad que emplearon los integrantes de la mesa durante la prctica. (ejemplo, el uso adecuado de lentes de seguridad, bata, zapatos y alguna medias particulares). NOTA: POR NINGUN MOTIVO SE ACEPTARAN REPORTES DE SEGURIDAD DESPUES DE LA HORA DE LABORATORIO. EL ALUMNO TENDRA DERECHO A FALTAR SOLO UNA VEZ DURANTE EL SEMESTRE, PREVIA JUSTIFICACION.

REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE LABORATORIO DE TOXICOLOGIA GRUPO:___________________ FECHA:___________________ PRACTICA:_______________________________________________________ RESPONSABLE:__________________________________________________ INTEGRANTES (CLAVES):___________________________________________ ___________________________________________________________________ 1. UTILIZACION DE REACTIVOS. REACTIVO CANTIDAD INICIAL CANTIDAD FINAL OBSERVACIONES

2.- VIGILANCIA DE EQUIPO. EQUIPO HORA INICIO

HORA FINAL

OBSERVACIONES

3.- MEDIDAS DE SEGURIDAD EQUIPO DE SEGURIDAD

OBSERVACIONES

Vo.Bo.

TITULO DEL GUION: EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE TOXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA. ASIGNATURA: Toxicologa (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADMICO: Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente txicos no voltiles de naturaleza cida y bsica en una muestra problema y explique que mtodo de extraccin es el ms eficiente. PROBLEMA: Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin del 90% de los txicos no voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico y cafena) presentes en una muestra problema. La muestra deber trabajarla en medio cido y medio bsico. METODOLOGIA: El profesor proporcionar 30 mL de muestra, la cual deber dividirse en dos porciones (cada una de 15 mL) para realizar la extraccin en medio cido y en medio bsico. La cuantificacin de cido acetilsaliclico y cafena se determinar siguiendo los apndices correspondientes. A) PROCESO DE EXTRACCION EN MEDIO ACIDO PARA TOXICOS NO VOLATILES: 1. Agregar a la muestra biolgica cido tartrico hasta un pH= 2 y agitar. 2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de ter, separando las fases etreas y reunindolas en un matraz. 3. La fase acuosa remanente se guarda, etiquetndola como fraccin A ( sustancias bsicas). 4. La fase etrea se extrae con dos porciones de agua destilada (10 mL) y se renen las fases acuosas con la fraccin A. 5. Tratamiento de la fase etrea: sta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de bicarbonato de sodio, se separan las fases. En la fase acuosa se concentran los cidos fuertes (fraccin B). Tratar esta fraccin como se indica en el apndice I. 6. A la fase etrea se le aaden 5 mL de NaOH 0.15 N, mediante este proceso se extraen los cidos dbiles en la fase acuosa, etiquetarla como fraccin C y trabajarla como se indica en el apndice I. 7. Tratamiento de las fraccin A. Las fases acuosas reunidas en el inciso 4 se alcalinizan hasta pH = 10 con NaOH 2.5 N. 8. Extraer con dos porciones de CHCl3 (10 mL) y separar las fases. 9. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad (en rotaevaporador), etiquetar como fraccin D (sustancias bsicas) y tratarlo como se indica en el apndice II.

B). PROCESO DE EXTRACCION EN MEDIO BASICO PARA TOXICOS NO VOLATILES: 1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N. 2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl3 (15 mL), separando las fases. 3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E (sustancias bsicas) y se trata como se indica en el apndice II. 4. La fase acuosa se etiqueta como fraccin F (sustancias cidas) y se trata segn el apndice I. EQUIPO Espectrofotometro Rotaevaporador Lmpara de luz ultravioleta Potencimetro Balanza analtica MATERIAL Gradilla Tubos de ensayo Matraz aforado de 10 mL Matraz aforado de 25 mL Embudo de separacin 250 mL Matraz Erlenmeyer 250 mL Matraz Erlenmeyer 50 mL Gogles Anillo metlico Para curva patrn Gradilla Matraz volumtrico de 10 mL Matraz volumtrico de 25 mL Tubos de ensayo REACTIVOS cido tartrico Hidrxido de sodio Nitrato frrico cido clorhdrico Bicarbonato de sodio Eter etlico Cloroformo Salicilato de sodio Cloruro mercrico 1 5 5 10 Vaso de precipitados 100 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta graduada de 10 mL 1 1 1 1 4 2 2 2 1 2 1 2 Piseta con agua destilada. Matraz de bola de 50 mL Pipeta Paster Probeta de 25 mL Esptula cromo/niquel Pipeta graduada 10 mL Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 1 mL 1 2 2 1 1 2 2 1

APNDICE I a) Tratamiento de la muestra: Tome 1 mL de la muestra (fraccin B, C y F) y adicione 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice III), agite, espere 2 min. y determine la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a realizar la lectura. Calcule la concentracin de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrn. b) Curva patrn del cido acetil saliclico: 1) Preparar una solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo en 10 mL de agua destilada y llevar hasta 25 mL con agua destilada (preparar 25 mL por curva patrn). 2) A partir de la solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva patrn como se describe a continuacin (realizar dos curvas patrn por grupo). Alicuota de la solucin patrn (mL) 0.5 1 3 5 7 Aforo con Agua destilada 10 10 10 10 10 Concentracin (g/mL) 50 100 300 500 700

En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recin preparadas y adicionar 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice III), agitar la muestra en un vrtex durante 1 min. esperar 2 min. y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color).

APNDICE II Cuantificacin de cafena: a). Tratamiento de la muestra 1. Disolver por separado los residuos D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N, pasarlo a un matraz volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N. 2. Determinar la absorbancia de la solucin a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N. 3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrn. b) Curva patrn 1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL) Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL de NaOH 0.1 N y afore con la misma solucin a 100 mL. 2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se describe a continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn. Alicuota de la solucin patrn (mL) 1 2 3 4 5 Aforo con NaOH 0.1 N 25 25 25 25 25 Concentracin (g/mL) 4 8 12 16 20

3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero con un blanco (NaOH 0.1 N).

APNDICE III Reactivo para desarrollar color: Pesar 4 g de cloruro mercrico y disolverlo en 12 mL de HCl 1N, adicionar 4 g de nitrato frrico, agitar hasta disolver y diluir con agua destilada a 100 mL. Solucin de hidrxido de sodio 2.5 N Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. Solucin de cido clorhdrico 1 M Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L. CUESTIONARIO 1. Con la experiencia que adquiri al realizar los procesos de extraccin qu sustancias cidas o bsicas recomendara para ajustar el pH antes de efectuar la primera extraccin en muestras biolgicas? Justifique su respuesta. 2. Esquematice los procesos de separacin empleados tanto en medio cido como en medio bsico y especifique que especies qumicas se encuentran en cada uno de las fases. 3. Al realizar las diferentes extracciones con el disolvente orgnico indique en cada proceso dnde permanece la fase orgnica y la fase acuosa. Por qu?. 4. En la extraccin cida por qu se pueden juntar las fracciones acuosas en la fraccin A? 5. Por qu se determina la cafena y cido acetil saliclico a diferentes longitudes de onda? Justifique su respuesta. 6. Una vez desarrollado el guin qu puntos del proceso de extraccin cree usted que son crticos para la extraccin de su txico no voltil? 7. Qu propiedades fisicoqumicas podrn mejorar el rendimiento de la extraccin de un xenobitico? 8. Presente los datos de absorbancia contra concentracin de las curvas patrn de AAS y cafena con sus respectivas grficas y los datos de regresin lineal correspondientes. Interpole los datos de absorbancia de sus muestras tanto en la extraccin cida como en la bsica. 9.Es necesario considerar las diluciones realizadas durante el proceso de extraccin para calcular la concentracin inicial de los xenobiticos en su muestra? Justifique su respuesta. 10. Indique el procedimiento para los clculos de la concentracin de AAS y cafena en su muestra.

TTULO DEL GUIN: EFECTOS TXICOS DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS ASIGNATURA: Toxicologa (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADMICO Que el alumno visualice las alteraciones morfolgicas del hgado, bazo y clulas sanguneas y relacione la variacin cuantitativa en el valor de hematocrito, hemoglobina libre y total al administrar dosis diferentes de plomo. PROBLEMA Indique que solucin causa mayor efecto txico al observar macroscpicamente los cambios morfolgicos del hgado, bazo y microscpicamente clulas sanguneas, y cuantifique el valor de hematocrito, hemoglobina libre y hemoglobina total. PROCEDIMIENTO El trabajo experimental se desarrollar por equipo en cuatro sesiones de laboratorio. SESION I (PRIMERA SEMANA) 1) Traer 4 jeringas de 1 ml por equipo. 2) Pesar los animales, anestesiarlos con ter etlico y marcarlos de acuerdo al sistema de marcaje. (El profesor indicar que numeracin se asignar a cada equipo y el sistema de marcaje.)
2 4 1 20 40

OREJA DERECHA (UNIDADES ) OREJA IZQUIERDA (DECENAS) 3) El profesor dar cuatro soluciones etiquetadas como sol. A, B, C, y D (SSI) a cada equipo. Cada una de las soluciones ser administrada por va intraperitonial en un volumen de 0.5 mL /rata con peso de 250 280gr.

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MATERIAL Balanza para animales (una por equipo) Caja de contencin ( una por equipo) Perforador ( uno por grupo) Algodn Cuatro jeringas para insulina (traer por equipo) Cubre boca (traer por equipo) Guantes de hule (traer por equipo)

REACTIVOS Acetato de plomo Solucin salina isotnica MATERIAL BIOLGICO * 4 ratas del mismo sexo (por cada equipo) Eter etlico Etanol

SESION II y III (SEGUNDA Y TERCER SEMANA) 1) Pesar a los animales nuevamente 2) Realizar una segunda administracin de las soluciones A, B, C, y SSI a la rata correspondiente. MATERIAL: Caja de contencin (una por equipo) Algodn Cuatro jeringas para insulina (traer por equipo) Cubre boca (traer por equipo) Balanza para animales REACTIVOS. Acetato de plomo Solucin salina isotnica.

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SESION IV (CUARTA SEMANA) MATERIAL POR EQUIPO: 1 navaja para bistur 4 pipeta shalii 1 cubrebocas ( traer uno por persona ) 1 tijeras de diseccin 4 jeringas de 3 5 ml (por equipo) 8 tubos capilares 1 caja de contencin 16 portaobjetos 2 pipetas volumtricas de 5 ml 1 vaso de precipitados de 250 ml 1 pipeta graduada de 1 ml 4 cajas de Petri REACTIVOS Nuevo azul de metileno Solucin de heparina Estndar de cianometa hemoglobina Solucin salina isotnica. Bencidina al 1% Solucin de Drabkin Colorante de Wrigth Eter dietlico Etanol Agua oxigenada al 1% 1 boquilla para pipeta shalii (traer una por equipo) 1 gradilla 1 par de guantes (traer uno por equipo) 6 gogles 1 pinzas de diseccin 20 tubos de ensayo 13X100 1 Tabla de diseccin 2 pipetas graduadas de 10 ml 5 tubos de ensaye de 16x150 2 vasos de precipitado de 100 ml 2 celdas de vidrio (por grupo) Algodn

MATERIAL BIOLGICO * 4 ratas del mismo sexo (por cada equipo) EQUIPO Microcentrfuga Espectrofotmetro Microscopio de inmersin Centrfuga

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PROCEDIMIENTO: 1) Preparar 4 jeringas con 0.1 ml de solucin de heparina o EDTA y 4 tubos de ensaye con 0.3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo al No. de rata correspondiente. 2) Realizar puncin cardiaca a cada una de las ratas, previamente anestesiada con ter dietlico, para la obtencin de la muestra sangunea. 3) Una vez obtenida la muestra (aproximadamente un volumen de 5 ml de sangre), colocarla en el tubo correspondiente, TENER CUIDADO DE NO HEMOLIZAR LA SANGRE RETIRANDO LA AGUJA DE LA JERINGA. 4) Sacrificar a la rata por desnucamiento, hacer una incisin en la parte media del abdomen observar la cavidad abdominal, colocar el hgado y el bazo en una cajas de petri con 0.5ml de solucin salina para evitar la deshidratacin. Tratamiento de la muestra biolgica: 5) Homogeneizar la sangre. Llenar 2 capilares (Apndice I) por rata y centrifugar en la microcentrfuga a 11000 rpm por 5 minutos. Calcular el hematocrito (Hto). 6) Preparar un frotis con tincin de Wright. Utilizar agua de la llave en vez de sol. amortiguadora. Observar en el microscopio, identificar y anotar las alteraciones morfolgicas de los eritrocitos encontrados en las tinciones. Hacer un mnimo de 2 tinciones con la sangre de cada animal. 7) En un tubo de 13 X 100 mm colocar una gota de sangre y adicionar una gota de nuevo azul de metileno, mezclar suavemente, dejar reposar 5 minutos, hacer un frotis y observar al microscopio los reticulocitos, su morfologa y cantidad. 8) A la muestra de sangre restante, cuantificar la Hemoglobina total (Hb) por la tcnica de hemoglowiener (Apndice I) y Hemoglobina libre por el mtodo de la bencidina (Apndice I).

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CUESTIONARIO 1) Construir una tabla con la siguiente informacin: POR CADA EQUIPO rganos No. RATA/ SOLUCIN A B C D (SSI) 2) Segn las dosis administradas cules fueron las diferencias en las alteraciones morfolgicas en hgado y bazo? cules en las clulas sanguneas con respecto al control (rata D)? 3) Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y los valores de hematocrito para cada una de las soluciones? 4) Qu solucin provoc la aparicin de un mayor nmero de reticulocitos en el frotis y cmo se relaciona con los valores de hemoglobina libre y hemoglobina total? 5) Qu solucin provoc el mayor dao en la morfologa de los eritrocitos y cmo se relaciona con los valores de hematocrito y el nmero de reticulocitos? 6) Cmo afect la dosis de la solucin A, B y C al valor de hemoglobina libre y hemoglobina total con respecto al control? 7) De qu manera se correlacionan los valores de hemoglobina total y hemoglobina libre con el hematocrito en cada una de las ratas con respecto al control? 8) Con base en los resultados descritos en la tabla, explique qu solucin provoc mayor efecto txico? 9) De los resultados obtenidos experimentalmente qu factores podran influir para que stos no se correlacionen al 100 %? 10) Con la experiencia que adquiri en le desarrollo de este protocolo describa cmo podra obtener resultados ms confiables? Hb total Hb-L (g/dL) (mg/L) Hematcrito % Hgado Bazo Frotis Wright Nuevo Azul de metileno Efecto txico

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APNDICE I TCNICA DE MICROHEMATOCRITO 1) Se llenan con sangre proveniente del tubo de la muestra, las 2/3 partes de dos tubos capilares. 2) El extremo vaco se cierra con plastilina efectuando un movimiento de rotacin. 3) Colocarlos en los canales o surcos radiales de la centrifuga (cabezal ranurado con numeracin para colocar los capilares) con el extremo cerrado dirigido hacia afuera, centrifugar a 11000 rpm durante 5 minutos. 4) Clculos Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) con relacin a la altura total dela muestra (M1) y expresarla en %. M1 ----------- 100% M2 ----------- X% TINCIN DE WRIGHT. 1) Colocar una gota de sangre en un portaobjetos y hacer un extendido delgado. 2) Dejar que los extendidos sequen al aire. 3) Fijar los extendidos con alcohol metlico absoluto durante dos o tres minutos, (el color del frotis pasara de rojo a marrn). Lavar con agua . 4) Cubrir el portaobjetos por completo con la tincin. Despus de otros cinco minutos, enjuagar muy bien con agua potable; primero, dejar salir el agua con mucha lentitud y luego con ms fuerza para eliminar del extendido todo el exceso de tinte. Limpiar la parte posterior del portaobjetos en posicin vertical en una rejilla para portaobjetos. Cuando seque por completo, cubrir el extendido con un cubreobjetos rectangular, fijndolo en la posicin correcta . 5) Observar al microscopio con el objetivo de 100x. TINCIN CON NUEVO AZUL DE METILENO 1) Con una pipeta Pasteur, agregar cantidades iguales de sangre y de nuevo azul de metileno (3 gotas de cada uno) a un tubo de 12 x75 mm y mezclar. 2) Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min. 3) Despus de mezclar nuevamente, colocar una pequea gota de la mezcla en un portaobjetos y hacer un extendido delgado. Dejar secar al aire. 4) Observar al microscopio con el objetivo de 100x.

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DETERMINACION DE HEMOGLOBINA TOTAL (Por la tcnica de hemoglowiener) MATERIAL * 6 tubos de ensayo 13X100 mm * 6 pipetas de 1.0 ml * 1 pipeta de 5 ml * 1 boquilla * 1 gradilla * celdas de 1 cm de dimetro REACTIVOS * Sol. de EDTA al 10% o heparina 1000 UI * Reactivo de Drabkin * Sol. Estndar de cianometahemoglobina 15.1 m g/dL (puede variar la concentracin del estndar, verificar para realizar sus clculos) TOXICIDAD DE SUBSTANCIAS El reactivo de Drabkin y la sol. Estndar de (HbCN) contienen derivados de CIANURO, los cuales son txicos, sin embargo las concentraciones de stos estn por debajo de la dosis letal referido a un litro de solucin. SE RECOMIENDA UTILIZAR PERILLAS DE SEGURIDAD PARA PIPETEAR ESTAS SOLUCIONES Y NO INGERIR ALIMENTOS DURANTE LA PRACTICA, AL FINALIZAR LA DETERMINACIN ES NECESARIO LAVARSE BIEN LAS MANOS. PROCEDIMIENTO PREPARACION DE CURVA ESTNDAR: Tubos Sol. Estndar de (HbCN) (ml) Muestra problema (ml) Reactivo de Drabkin (mL) Blanco 0 ---5 Control 0.02 ---5 A B C D ---- ---- ---- ---0.02 0.02 0.02 0.02 5 5 5 5

Agitar cuidadosamente despus de la adicin de cada reactivo, dejar reposar 10 min. Leer la absorbancia contra el blanco de reactivos a 540 nm. Calcular la concentracin de hemoglobina total en g/dL Cprob = Aprob * F F= Cestndar / DOestndar

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donde: Cprob: concentracin del problema (g/dL) Aprob: absorbancia del problema F: factor de la solucin estndar Cestndar: concentracin de la solucin estndar (g/dL) Aestndar: absorbancia de la solucin estndar HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA MATERIAL * 4 tubos de ensaye de 13X100 mm * 6 tubos de ensaye de 16X150 mm * Pipetas serolgicas de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0 ml * 1 Propipeta * 1 Piseta * 1 Gradilla * Celdas MATERIAL BIOLGICO * Sangre venosa o arterial EQUIPO * Centrfuga * Espectrofotmetro REACTIVOS * Heparina * Bencidina al 1 % * Agua oxigenada al 1 % *Estndar de hemoglobina 300 mg/L (puede variar la concentracin del estndar, verificar para realizar sus clculos). TOXICIDAD DE LAS SUSTANCIAS La bencidina es un reactivo considerado como carcinognico por lo que se deben extremar precauciones en su manejo. TCNICA La muestra de sangre con anticoagulante se centrifuga a 2500 r.p.m. por 5 min., se separara el plasma cuidadosamente y se transfiere a otro tubo.

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Marcar 6 tubos de 16 X 150 mm y trabajarlos segn la siguiente tabla: PROBLEMA ESTANDAR BLANCO (A, B, C, SSI) Bencidina 1% 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Plasma 0.02 ml -----Estndar de Hb --0.02 ml ---Agua destilada ----0.02 ml H2O2 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml MANTENER LOS TUBOS A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 20 MIN. Acido actico 10 % 10.0 ml 10.0 ml 10.0 ml Mezclar y dejar reposar 10 min. A temperatura ambiente, leer a 515 nm. Clculos: Absorbancia del problema mg de Hb/L = -------------------------------------- * [Concentracin del estndar]mg/L Absorbancia del estandar

APNDICE II PREPARACIN DE REACTIVOS: SSI. Solucin salina isotnica. (Puede utilizarse la solucin comercial o preparar una solucin de cloruro de sodio al 0.9 %) Solucin de Drabkin: Bicarbonato de sodio Ferrocianuro de potasio Cianuro de potasio Saponina Agua destilada c.b.p 1.0g 0.20g 0.05g 0.1g 1000 ml

Solucin difana de color amarillo plido, estable en frasco mbar a temperatura ambiente durante seis meses, la aparicin de coloracin azul claro o intenso indica el deterioro total o parcial del reactivo.

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Solucin Nuevo Azul de Metileno: (preguntar al profesor si sta se encuentra ya preparada). Nuevo azul de metileno 0.5g Oxalato de potasio 1.40g Cloruro de sodio 0.80g Agua destilada c.b.p 100 ml Filtrar antes de usar. Solucin de Bencidina al 1% Solubilizar 1 gr de bencidina en 100 ml de cido actico al 10%. Colorante de Wright (preguntar al profesor si sta se encuentra ya preparada). Agregar el alcohol poco a poco, unos cuantos mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar bien tapado para evitar la evaporacin, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo. Amortiguador: Na2 HPO4 .....................2.56 g KH2 PO4........................6.63g Agua destilada (cuanto baste para un litro) Fijador. Alcohol metlico absoluto Heparina Agua oxigenada Ac. actico al 10%

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EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE METALES PESADOS POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO OBJETIVOS. * Determinar cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cermica a diferentes valores de pH. * Discutir los efectos toxicolgicos que presenta el plomo sobre los organismos vivos. MATERIALES. Vasija de cermica Rejilla de asbestos Tubos de ensayo 13x100 Termmetro Anillo metlico Papel pH REACTIVOS. Agua destilada Hidrxido de sodio 1 N Yoduro de Potasio

3 1 10 1 1 3

Mechero Gradilla Bao Mara Pipetas de 1 ml Pinza para tubos Probeta de 100 ml cido Clorhdrico conc. Acido Ntrico

1 1 1 3 1 1

PROCEDIMIENTO. 1.- El alumno debe traer tres vasijas de barro vidriadas, iguales y nuevas. 2.- Marcar las vasijas como A, B y C. 3.- Colocar agua destilada en la vasija A. Colocar agua destilada y ajustar a pH < 2 con HCl conc., en la vasija B. Colocar agua destilada en la vasija C y ajustar a pH > 10. Medir el pH de cada vasija. 4.- Calentar las vasijas a ebullicin y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el contenido de agua disminuya considerablemente puede agregar mayor cantidad de la misma. 5.- Enfriar la solucin y medir el pH. 6.- Colocar por separado 0.5 ml de solucin de cada vasija en tubos de ensayos ms tres gotas de HNO3 concentrado. 8.- Agregar a cada tubo, 1 ml de la solucin de yoduro de potasio (16.5 g de yoduro de potasio aforados a 100 ml; esta solucin es sensible a la luz), procurando que la solucin caiga directamente en el contenido del tubo. No agite y observe. 9.- Un precipitado amarillo indica la presencia de plomo en la solucin original 10.- Emplee un blanco de agua destilada y proceda de la misma forma como se indica en el paso 5 al paso 8. 11.- Para el reporte elabore una tabla que relacione el valor de pH en los pasos 3 y 5 con la presencia del plomo.

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CUESTIONARIO. 1.-Cules son los minerales que pueden ser fuentes de contaminacin de plomo? 2.- Mencione 5 alimentos cuyo pH sea cido y 5 cuyo pH sea alcalino. 3.- Construya una tabla donde se indiquen otras fuentes de exposicin al plomo y la cantidad estimada que estas fuentes contienen del metal. 4.- Cmo influye la edad del individuo en la absorcin gastrointestinal del plomo? 5.- Cules son los tejidos principales de distribucin y depsito del plomo en el organismo? 6.- Qu efectos ocurren en los eritrocitos cuando la concentracin de plomo rebasa el valor de 80g/dl y que es lo que provoca esta manifestacin? 7.- Diga el nombre de los dos sistemas enzimticos que intervienen en la sntesis del grupo Hem y que se ven afectados en una intoxicacin por Pb. 8.- Proponga a travs de un esquema la influencia del plomo en la biosntesis del grupo Hem. 9.- Cmo se manifiesta principalmente la intoxicacin por plomo en el sistema nervioso central? 10.- Cules son los sntomas principales de intoxicacin por plomo en el tracto gastrointestinal? 11.- Cmo influye la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos? 12.- Qu efectos producen la anemia que se manifiesta por la intoxicacin por plomo? 13.- Esquematice los valores de plomo en sangre debajo de los cuales no hay manifestacin clnica de intoxicacin. 14.- Cul es la t1/2 del plomo en sangre y huesos? Y qu papel juegan los eritrocitos en la relacin de concentracin plasma/orina en la eliminacin del mismo? 15.- Cmo se manifiesta una intoxicacin crnica (30-50 g/dl) por plomo en los nios? 16.- Qu papel juega la sal Na2CaEDTA, en dosis de 40 mg/Kg en el diagnstico por intoxicacin por plomo? 17.- Qu medidas teraputicas se toman en una intoxicacin por plomo y que concentracin plasmtica del mismo debe de estar presente para que se aplique a los nios? 18.- Cmo va a influir la intoxicacin por Pben los valores de HbL y Hbt. ?

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Titulo del guin: DETERMINACION DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA ASIGNATURA: Toxicologa (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADMICO: Que el alumno identifique y determine la concentracin de etanol en muestras problema, mediante un mtodo indirecto PROBLEMA Cuantificar la concentracin de etanol en mg/dl en muestras problema y mediante los resultados obtenidos indique en qu grado de intoxicacin se encuentra cada una de ellas. MATERIAL Caja de Petri con centro de vidrio Pipeta volumtrica de 2 mL. Pipeta volumtrica de 1 mL. Gogles Tubos de ensayo 16 X 150 Celda de vidrio para espectrofotomtro Pipeta volumtrica de 5 mL. EQUIPO: Espectrofotmetro Estufa Balanza analtica Bao mara REACTIVOS Dicromato de potasio cido sulfrico Carbonato de potasio (Solucin saturada) Etanol R. A. 3 3 4 1 6 2 5 Matraz volumtrico de 10 mL Pinzas para tubo de ensayo Papel filtro (2X5 cm) Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta pasteur con bulbo 3 3 1 3 3 4

PROCEDIMIENTO A cada alumno se le proporcionarn 2 muestras problema donde se identificar y cuantificar la concentracin de etanol. I.- Prueba presuntiva para Etanol

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1.- Rotular 4 tubos como A, B, C, y D. Al tubo A agregarle 5 gotas de etanol (control positivo). Al tubo B agregarle 5 gotas de agua destilada (control negativo). A los tubos C y D agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema respectivamente. 2.- A cada uno de los tubos, aadirles 0.5 mL de solucin de dicromato de potasio (solucin A) y tapar el tubo con papel aluminio. 3.- Colocar los tubos en bao mara durante 2 minutos. Se desarrolla un color azul-verdoso en caso positivo. II.- Cuantificacin de etanol Cada una de las muestras se tratarn de acuerdo al siguiente procedimiento.

1.En el recipiente A de una caja petri colocar 1 mL de la muestra problema y en el recipiente B, colocar 2 mL de la solucin B de dicromato de potasio, agitando suavemente el recipiente coloque 1 mL de solucin saturada de carbonato de potasio. 2.Tapar con el recipiente C y mezclar suavemente. Meter la caja petri con las celdillas durante 45 min en una estufa a 37 o C. 3.Una vez transcurrido este tiempo, transferir el contenido de B a un tubo de ensayo, lavando perfectamente dicho recipiente y la parte externa de A, y finalmente aforar a 10mL con agua destilada (al final puede aparecer un precipitado que desaparece al llevar a volumen con agua destilada). 4.- realizar un control positivo contres gotas de ETOH o MeOH. 5.Tomar la lectura de absorbancia a 450nm utilizando como estndar, la solucin de dicromato de potasio ( solucin B ). Si es necesario realizar otra dilucin, puede hacerla hasta ajustar la absorbancia ( 450nm ) entre los lmites establecidos por la ley de Lambert-Beer (D.O.= 0.2-0.7). Leer contra un blanco de agua destilada. 6.-Tomar la absorbancia del problema, utilizando como blanco agua destilada. NOTA: A) Las lecturas de absorbancia que se obtienen en sus muestras se deben al dicromato de potasio residual en la reaccin. Reaccin: R-OH Calor CH3OH + K2Cr207 Cr+3 OH + R-COO +

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PREPARACION DE REACTIVOS Solucin de dicromato de potasio ( solucin A ). Pesar 2.5 g de dicromato de potasio y solubilizarlo en 20 mL de cido sulfrico al 50%, aforar a 100mL con cido sulfrico al 50%. Solucin de dicromato de potasio( solucin B ). Disolver 3.37 g de dicromato de potasio en 150mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 280mL de cido sulfrico concentrado, dejar enfriar y diluir con agua destilada a 650mL. Solucin saturada de carbonato de potasio:Disolver la cantidad necesaria de carbonato de potasio en 100 mL de agua destilada. PM del Etanol: 46 gr PM del K2Cr2O7: 294.7 gr Densidad del Etanol: 0.7893 a 200C EJERCICIO (para entregar al inicio de la prctica): Calcular la concentracin de etanol en sangre en el siguiente problema: Estndar: 2 mL de una solucin 0.01 M de dicromato de potasio se diluyeron a 10 mL, de esta solucin se tomaron 5 ml y se diluyeron a 10 ml. La ltima solucin se ley en un espectrofotmetro a 450 nm dando una lectura de 0.205 de absorbancia. Problema: 2 ml de la solucin 0.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la celdilla B y se hicieron reaccionar con 1 ml de muestra problema (celdilla A). Al trmino de 45 minutos de calentamiento, el contenido de la celdilla B se diluy a 10 ml y se ley a 450 nm, dando una absorbancia de 0.23. Respuesta. 60.72 mg de etanol/100 ml de sangre. CUESTIONARIO. 1.-A qu se debe la presencia de un color verde-azul en una prueba presuntiva positiva? 2.- Con la prueba presuntiva podra asegurar la presencia de etanol en sus muestras. Justificar su respuesta. 3.- Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Muestra Absorbancia

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1 2 Estndar Calcular la concentracin de etanol en la muestra en mg/dl, desglosando los clculos realizados para cada una de las muestras Tomando en cuenta la lectura de absorbancia de la solucin estndar, considere todas las diluciones realizadas tanto de su muestra biolgica como de su estndar. Muestra 1 2 Concentracin( mg/dl )

4.- Con los valores obtenidos considere si sus muestras biolgicas corresponden a personas que estn bajo los efectos del etanol desde un punto de vista legal, de acuerdo a la tabla siguiente. Concentracin (mg/dl): 10-50 90-120 100-150 150-200 Concentracin (mg/dl): 200-250 250-450 Observaciones clnicas: Euforia nula o leve Influencia ligera sobre la visin estereostpica y la adaptacin a la oscuridad Euforia, desaparicin a la inhibicin, tiempo de reaccin prolongado Intoxicacin moderadamente intensa. Tiempo de reaccin muy prolongado, perdida de inhibicin y ligeros trastornos en el equilibrio y coordinacin. Observaciones clnicas: Grado intenso de intoxicacin, trastornos de equilibrio y coordinacin. Coma profundo y posiblemente mortal.

5.- De qu manera se puede hacer cuantitativa la prueba presuntiva?

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TITULO DEL GUIN: CUANTIFICACIN DE UN TXICO VOLTIL (CIANURO DE HIDRGENO) EN GLUCSIDOS CIANOGNICOS. ASIGNATURA: Toxicologa (8o semestre, carrera Q.F.B.) DEPARTAMENTO: Farmacia OBJETIVO ACADMICO: Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de glucsidos cianognicos presentes en muestras de plantas y semillas que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentracin con su potencial toxicolgico. PROBLEMA: Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie de 3 muestras de semillas o plantas. Una de estas ser proporcionada por el profesor y se deber reportar al menos el 80% de la concentracin real. Al final de la prctica el alumno indicar cual semilla podra presentar mayor riesgo de toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que estara presente en el consumo de 50 g de muestra. INTRODUCCIN: Existe en la naturaleza una amplia gama de vegetales, alrededor de 1000 especies, que contienen glucsidos cianognicos. Algunos de stos estn constituidos por alfa-hidroxinitrilos (aglucn), unidos a travs de un enlace beta a un carbohidrato, que puede ser un monosacrido o un disacrido. Al hidrolizar estos compuestos, se obtiene, entre otros productos, cido cianhdrico. Dicho proceso requiere de la presencia de la enzima -glucosidasa, que rompe el enlace glucosdico, y de la enzima hidroxinitriliasa, que libera el cido cianhdrico. Estas enzimas se encuentran presentes en la misma planta y actan sobre los glucsidos, cuando la planta sufre ruptura del tejido debido a daos mecnicos( 2,3 ). La importancia de estos compuestos desde el punto de vista toxicolgico radica en que se encuentran presentes a diferentes concentraciones, en vegetales que forman parte de la dieta de humanos y animales. Los estudios realizados en algunos alimentos, han permitido detectar glucsidos cianognicos tales como: faseoliona, amigdalina, durrina y linamarina entre otros( 2 ). Entre dichos alimentos se encuentran leguminosas (varios tipos de frijol incluyendo el colorin); tubrculos como la casava; cereales como el sorgo; y semillas de algunas frutas como limn, lima, manzana, pera, cereza, durazno, albericoque y ciruela( 1, 4, 5 ). FUNDAMENTO:

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El mtodo en el presente guin aprovecha la reaccin, sensible y especfica de Guignard, la cual es ampliamente utilizada en pruebas cualitativas para la deteccin de HCN como de glucsidos cianognicos; sin embargo, con el uso de una curva estndar de cianuro alcalino, se podr realizar dicha prueba en forma cuantitativa, expresndose en base al cido
OH O2 N NO2 OH Medio Alcalino O 2N NC NO2 Isopurpurina NHOH

+ 2HCN
NO2 Acido pcrico

+ 1/2 O2
CN

cianhdrico liberado( 4, 6, 7 ). MATERIAL CANTIDAD. Tubos de ensaye( 20*150) con tapn de hule. 10 Cajas petri 1 Papel filtro cualitativo( filtracin rpida ) 2 x10 cm. Tijeras, pinzas de diseccin y regla o escuadra graduada 1 juego (Traer por persona) Matraz erlenmeyer de 250ml. con tapn de hule. 10 Mortero con pistilo 1 Navaja 1 (Traer por persona) Pipeta de 1ml. graduada. 3 Probeta de 50ml. 1 Matraces volumtricos de 10 ml 6 Embudo de cola corta. 5 Vaso de precipitado de 100ml. 3 Tubo de ensaye( 13*150 mm ) 2 Celdas de 1 cm de dimetro 2 Guantes de hule 1 par (Traer por persona) Hielo Traer por equipo MATERIAL DE ESTUDIO Traer por persona aproximadamente 1g de muestras de plantas o semillas de: durazno, manzana roja, ciruela pasa, sorgo, bamb, colorn, lima, almendra de capuln, germen de soya. REACTIVOS Acido clorhdrico concentrado. Acido pcrico. Carbonato de sodio. Cloroformo. Cianuro de potasio

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PRECAUCIN: ALTAMENTE TXICO, PREPARAR Y MANEJAR CON GUANTES ( SOLUCIN ESTNDAR II). SEGURIDAD: A pesar de que la concentracin utilizada de KCN en este guin es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentracin est por debajo de la DL50 en ratones, no deber descuidar las medidas de seguridad para su trabajo. MANEJO DE RESIDUOS: Los residuos de las soluciones que contienen KCN no debern ser tiradas al drenaje directamente, recolectarlas en frascos y etiquetarlas. Tratamiento de residuos de soluciones que contienen KCN: colocarlas en hielo y adicionar lentamente una solucin de hipoclorito de sodio, se dejan reposar por 24 horas y posteriormente podrn ser desechadas por la tarja con abundante agua. EQUIPO Espectrofotmetro Balanza analtica Estufa PROCEDIMIENTO: El alumno trabajar 3 muestras problema de plantas o semillas segn la lista mencionada. Una de las cuales ser proporcionada por el profesor. A) PREPARACIN DE LA TIRA REACTIVA Cortar papel filtro en tiras exactamente de 2x10 cm (preparar 1 tira por muestra), se sumergen en el reactivo de Guignard, dejndose escurrir. Introducirlas en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-55oC, donde se dejan por aproximadamente 10 min (las tiras reactivas preparadas deben quedar ligeramente humedecidas al ser utilizadas en el procedimiento). B) PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DE SEMILLAS O PLANTAS. Pesar 1 g de muestra de y colocarla por separado en el mortero, y con la ayuda de las pinzas de diseccin y navaja cortarlas y macerarlas lo ms rpido posible. A cada una de las muestras se le realizar el siguiente procedimiento: Colocar la muestra fragmentada en un matraz erlenmeyer de 250 mL, medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumtrica y agregarlos al matraz. A continuacin aadir 2 gotas de cloroformo y 1 mL de HCl 0.5 N. Colocar con cuidado la tira de papel reactivo humedecida como se ilustra en la figura (1). PRECAUCIN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapn despus de concluir este procedimiento. Colocar el matraz Erlenmeyer en la estufa a 40oC por espacio de 1 h, agitando suavemente a intervalos de 15 min, teniendo precaucin de que el contenido del matraz no tenga contacto con la tira reactiva de papel filtro, meter simultneamente a la estufa los matraces con las diferentes concentraciones de la curva estndar de HCN. (El gas de HCN

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liberado reacciona con el reactivo de Guignard de la tira reactiva, formando un complejo NO TXICO).

TAPON DE HULE PAPEL FILTRO (TIRA REACTIVA)

MUESTRA

FIGURA 1. Preparacin de la muestra en el matraz y colocacin de la tira reactiva. C) PREPARACIN DE LA CURVA ESTNDAR La curva estndar de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los volmenes de la solucin patrn indicados en la siguiente tabla y llevando a volumen con agua destilada: CURVA ESTNDAR DE HCN. Alcuota de la solucin Concentracin (g/mL) patrn (mL) 0.0 Blanco 0.1 0.4 0.2 0.8 0.3 1.2 0.4 1.6 0.5 2 Tratamiento de la curva estndar: 1) Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas inmediatamente a matraces erlenmeyer de 250 ml, debidamente etiquetados.

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2) Colocar la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar a cada matraz 1 ml de la solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de cloroformo. PRECAUCIN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapn despus de concluir este procedimiento. 3)Incubar por una hora con agitacin cada 15 minutos. D) TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA ESTNDAR Y BLANCO. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Se observan las tiras reactivas de las muestras problema y aquellas que no muestren ni siquiera una leve coloracin caf-rojiza se considerarn como prueba negativa; en tanto que aquellas que s lo presenten son positivas y se introducen en un tubo de ensaye al cual se le adiciona 20 ml de agua destilada, se tapa y se agita vigorosamente con el fin de extraer el pigmento colorido; se procede a filtrar (con papel Whatman No. 40) para eliminar residuos de la tira de papel. Se determina la absorbancia de las muestras y de la curva patrn en el espectrofotmetro a 520nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva. NOTAS: a) Las soluciones II, III y agua destilada deben de estar en bao de hielo antes de usarse. b) No olvidar poner 2 gotas de cloroformo a los matraces de la curva patrn. c) Antes de meter a la estufa los matraces de la curva patrn, colocar las tiras reactivas a cada uno de ellos (como se indica en la figura 1). PREPARACIN DE SOLUCIONES: Reactivo de Guignard: Se disuelve en agua destilada 2.5 g de cido pcrico y a continuacin 12.5 g de carbonato de sodio, llevndose a un volumen de 500 ml con agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO EL CIDO PCRICO, YA QUE ESTAS SUSTANCIA ES CANCERGENA Y SE ABSORBE FCILMENTE POR PIEL. Solucin patrn de cianuro de potasio: se pesa exactamente 12.05 mg de KCN y se lleva a 50 ml de agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO Y CON GUANTES LA SOLUCIN DE CIANURO ALCALINO YA QUE ES ALTAMENTE TXICO COLOCAR LA SOLUCIN EN BAO DE HIELO DESPUS DE PREPARARLA. cido clorhdrico 0.5 N. COLOCAR LA SOLUCIN EN BAO DE HIELO DESPUS DE PREPARARLA. CUESTIONARIO: 1.-Qu importancia tiene durante la prctica que la trituracin de la muestra se realice rpidamente? 2.-Por qu la tira reactiva de papel no debe tocar la solucin y por qu se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto con la muestra? 3.-Por qu considera necesario colocar la solucin patrn de cianuro de potasio y el HCl 0.5N en bao de hielo? 4.-Por qu es necesario agregar cloroformo en el paso B) a sus muestras y en el paso D) a su curva estndar?

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5.- Por qu es necesario calentar la muestra? 6.-Cmo podra eliminar la presencia de glucsidos cianognicos de una planta comestible? 7.- Grafque los valores de absorbancia vs concentracin obtenidos e interpole las absorbancias de las muestras. 8.- Reportar los resultados obtenidos en mg/50g de muestra, tomando en cuenta que la solucin patrn es equivalente a 100 g HCN/ml y llenar la siguiente tabla:. Muestra de semilla Concentracin de mg HCN/50 g de muestra HCN (g/mL) Riesgo de Toxicidad (marque con cruces)

9.- Con base a los resultados obtenidos cul muestra considera que representa un mayor riesgo potencial en su consumo? 10.- Proponga un mtodo para extraer txicos voltiles a partir de una muestra. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: 1. Linder, E.; Toxicologa de los alimentos; Acribia, pg. 15-19, Zaragoza ( 1978 ). 2. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. In: Toxicants ocurring naturally in foods; National Academy of Sciences; 2th Edition, pp. 290-308, Washington, D.C.( 1973 ). 3. Montgomery, R.D.; Cyanogens: AToxic constituyent of plant food stuffs; Liener, I.E; Academic Press, pp. 143-160, N.Y.( 1980 ). 4. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides; Agr. Food Chem. 17, 519-526 (1969). 5. Eyjolfsson, R.; Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides; Fortsch. Chem. Orgn. Naurist. 28, 74-108 (1970). 6. Fabre, R. Y Truhaht, R.; Tratado de toxicologa; Paraninfo, S.A., Vol. I, pg. 311-332, Madrid (1976). 7. Lucas, B. and Sotelo, A.; A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated seeds; Nutr. Rep. Int. 29 ( 3 ), 711-719( 1984 ).

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IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES Y BARBITURICOS EN MUESTRAS BILGICAS. OBJETIVOS. 1. Aplicar los procesos de extraccin en medio cido y medio bsico para extraer alcaloides y barbitricos en muestras biolgicas. 2. Aplicar la cromatografa en capa fina (CCF) para identificar txicos no voltiles (alcaloides y barbitricos) en muestras biolgicas. MATERIAL Embudo de separacin de 250 ml Embudo de cola corta Matraz Erlenmeyer de 125 ml Matraz de bola de 50 ml Vaso de precipitado de 250 ml Vaso de precipitados de 100 ml Pipeta pasteur Tubo capilar REACTIVOS Hidrxido de amonio Metanol cido actico glacial, Carbonato de bismuto Acetato de cobalto tetrahidratado Silica Gel Yodo metlico Ioduro se sodio Acetato de etilo Isopropilamina 2 Agitador de vidrio 2 Probeta de 10 ml 3 Pipeta graduada de 10 ml 2 Gogles 3 Anillo metlico 4 Tubos de ensayo 3 Anillos de corcho 2 1 1 2 1 1 4 2

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EQUIPO Rotaevaporador Lmpara de luz ultravioleta Bomba de aspersin Potencimetro

PROCEDIMIENTO 1. Obtener en forma no ionizada los alcaloides (ergotamina y cafena) y barbitricos (fenobarbital), proporcionados por sus profesores, de su muestra problema empleando tcnicas de extraccin en medio bsico y/o en medio cido. 2. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias a evaluar dividirlo en 2 partes, ambas se evaporarn a sequedad en un rotaevaporador, se dejaran enfriar y los residuos se reconstituirn con 0.5 mL (3 o 4 gotas) de metanol. 3. Solicitar a los profesores 2 placas para cromatografa en placa fina. 4. Preparar la fase mvil, investigada previamente, para eluir sus cromatoplacas y sature sus cmaras cromatogrficas con la mezcla correspondiente, durante 10 minutos. 5. Realizar por separado, la placa cromatogrfica de su muestra problema con su referencia (colocar una gota de la fraccin de alcaloides o de barbitricos, con un capilar, y una gota del estndar proporcionado por el profesor), desarrolle el cromatograma correspondiente en cada uno de los sistemas de elucin. 6. Visualice la presencia de alcaloides y/o barbitricos con una lmpara de luz U.V. y posteriormente revele las placa cromatogrficas en una cmara de yodo. Calcule el Rf para de cada sustancia y compare el valor obtenido con el del estndar. 7. Con la otra parte, realizar el siguiente procedimiento (pruebas de identificacin): 7.1 Alcaloides a) Colocar 2 gotas de la fraccin, previamente solubilizada en metanol y agregar 2 gotas de HCl 1N ms 2 gotas del reactivo de Dragendorff (solucin reveladora). La aparicin de un precipitado color marrn indica positiva la reaccin. b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reaccin. 7.2 Barbitricos

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a) Colocar tres gotas de la fraccin correspondiente previamente solubilizada en metanol y agregar tres gotas del reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi), la aparicin de un color prpura-rojizo indica prueba positiva. b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reaccin. PREPARACION DE REACTIVOS a) Reactivo de Dragendorff (Solucin stock) Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 ml de cido actico glacial, calentar por l0 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la solucin. 20 ml del filtrado (solucin rojo-caf) se mezclan con 8 ml de acetato de etilo, la solucin anterior guardarla en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses). b) Reactivo de Dragendorff (Solucin reveladora) Mezclar 10 mL de la solucin stock con 25 ml de cido actico glacial y 60 mL de acetato de etilo. c) Reactivo A (Dille-Koppanyi) Solubilizar 0.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 ml de metanol absoluto, y agregar 0.2 mL de cido actico glacial. d) Reactivo B (Dille-Koppanyi) Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 25 ml de metanol absoluto NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 das.

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CUESTIONARIO 1. Esquematice la forma no ionizada de sus txicos 2. Cmo identific los alcaloides de su muestra problema? 3. Cmo identific los barbitricos de su muestra problema? 4. Cules son las reacciones que se llevan a cabo en esta prctica? 5. Qu ventajas podra sealar en el uso de la extraccin cida para alcaloides y en la extraccin bsica para barbitricos? 6. Desde el punto de vista qumico cmo se comportan los alcaloides (Nicotina y Cafena) en un medio cido y en un medio bsico? 7. Desde el punto de vista qumico cmo se comportan los barbitricos (Fenobarbital y Pentobarbital) en un medio cido y en un medio bsico? 8. Qu parmetro resulta ms importante para realizar una extraccin del 100% para alcaloides y barbitricos, el valor del pka el valor del pH? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Clark E. E. Isolation and identification of Drugs. Pharmaceutical Press, London, 1972 Vol. I y II 2. Bowman y Rand. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. 2. Ed. Interamericana, 1984. 42.25-42.32. 3. Goodman and Gilman. Las Bases Farmacolgicas de la Teraputica. Panamericana. Mxico. 8. Ed 1991.

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PRODUCCION DE MiHb POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO OBJETIVO: Demostrar la formacin de metahemoglobina (MiHb) por la administracin de nitrito de sodio in vivo y el efecto protector del azul de metileno. MATERIAL: Jeringa de insulina Tubos de ensaye de 13x100 Pinzas de diseccin Caja de contencin Balanza para animales Pipeta graduada de 5 mL Centrfuga Pipeta graduada de 0.1 mL

3 10 1 1 1 2 1 1

Jeringa de 3 mL Tijeras de diseccin Tabla de diseccin Rejilla Pipeta graduada de 1 mL Tubos de ensaye de 16x150 Espectrofotmetro Frasco gotero con su gotero

3 1 1 1 1 3 1 1

REACTIVOS: Heparina 1000 UI al 30% o EDTA al 10% Cianuro de potasio Solucin salina isotnica (SSI) Acido actico glacial Hidrxido de amonio conc. MATERIAL BIOLOGICO: 3 ratas del mismo sexo de 200-250 g por equipo. PROCEDIMIENTO:

Buffer de fosfatos pH 6.6 Ferricianuro de potasio 20% Nuevo azul de metileno (4 mg/rata en SSI) Nitrito de sodio (50 mg/Kg en SSI) Eter dietlico

1. En esta sesin se trabajar en equipos, a cada uno de los cuales les sern proporcionadas 3 ratas.

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2. Pesar cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III. 3. Administrar a la rata III, por va intraperitoneal (i.p.) una dosis unica de 4 mg de la solucin de azul de metileno disueltos en 0.5mL de SSI y 15 minutos despus administrar por la misma va 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio. 4. Administrar a la rata I (rata control) por va i.p., 0.5 mL /rata de SSI. 5. Administrar a la rata II por va i.p., 50 mg/kg de nitrito de sodio disuelto en un volumen mximo de 0.5mL de SSI. 6. Extraer de cada rata 30 mim despus de cada administracin y por puncin cardiaca, bajo anestesia con eter, 3 mL de sangre y colocarla en un tubo de ensaye con 5 gotas de heparina o EDTA. Mezclar perfectamente por inversin los tubos para evitar la coagulacin de las muestras. 7. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra como se indica a continuacin: a) Colocar 4.9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos en un tubo de ensaye. b) Agregar 0.1 mL de sangre. c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos. d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos. e) Separar el sobrenadante. f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (Lectura A1), contra un blanco de buffer de fosfatos. g) Devolver la solucin al tubo de prueba. h) Agregar una gota de la solucin neutralizada de cianuro de potasio al sobrenadante y al blanco. i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos. j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (Lectura A2). k) Agregar una gota de hidrxido de amonio concentrado al tubo del inciso i, y mezclar. l) Transferir 2 mL de la solucin del tubo del inciso i, a otro tubo y agregar 8 mL de la solucin amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de ferricianuro de potasio al 20% en solucin acuosa. m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solucin amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de ferricianuro de potasio al 20% en solucin acuosa. n) Despus de 2 minutos agregar una gota de la solucin neutralizada de cianuro de potasio a cada tubo (blanco y problema). o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm contra su respectivo blanco (Lectura A3). 8. Clculos: Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4 Metahemoglobina total (MiHbt) en g/100 mL = (A1-A2) 23.4 % de MiHb en sangre total = (MiHbt) x 100/Hbt 9. Reporte Con las absorbancias obtenidas en el grupo, hacer una tabla con los valores de Hbt y MiHbt en g/100 mL para cada rata. Para cada tratamiento, promediar los valores obtenidos y graficar los resultados de Hbt y MiHbt . Realizar otra grfica nicamente con los % de MiHbt promedio de cada tratamiento y,

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Analizar y concluir sobre los resultados obtenidos. 10. Preparacin de soluciones: a) Solucin amortiguadora de fosfatos (M/60, pH = 6.6). Preparar inicialmente una solucin amortiguadora M/15, pH 6.6 disolviendo 3.8 g de fosfato disdico anhdro y 5.44 g de fosfato monopotsico anhdro en 1000 mL de agua destilada. A partir de esta solucin M/15 mezclar una parte con tres partes de agua destilada, para obtener la solucin M/60. b) Solucin de cianuro de potasio neutralizada: mezclar una parte de la solucin de cianuro al 10% y otra parte de cido actico glacial al 12% (v/v). CUESTIONARIO: 1. Proponga un esquema que explique el efecto protector de los nitritos en una intoxicacin por cianuro y el efecto protector del azul de metileno, en una intoxicacin por nitritos. 2.-Qu complejo se esta determinando a 630 nm y a que corresponde A1, A2 y A3, 3.-Por qu leemos en el espectrofotometro a dos diferentes longitudes de onda? 4.-Para qu se agrega hidrxido de amonio en el paso k de su tcnica? 5.-Por qu se agrega ferricianuro de potasio? 6.-Para qu se agrega el cianuro de potasio neutralizado? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1. Amadeo J. Pesce, Kaplan, L.A. Methods in Clinical Chemistry c.v. Mosby Co. USA 1987. 2. Boer N.C. et. Al Clinical Chemistry. Plenum press. USA 1989. 3. Frank, K.R., Blood Essay in Toxicology Academic Press. Vol. I 1969. 84-109.

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DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL INTRUDUCCION El desarrollo de compuestos txicos con mayor especificidad hacia los insectos, es un camino que se ha seguido en la industria de pesticidas; de los cuales los insecticidas organofosforados son los de mayor uso en la actualidad. Este grupo de compuestos, a diferencia de los organoclorados no causan daos severos al medio ambiente, ya que son biodegradables (1,2). Los insecticidas organofosforados actan por fosforilacin de una enzima srica de suma importancia en el metabolismo del insecto. Las enzimas destoxificantes tanto en los mamferos como en los propios insectos son: carboxiesterosas, oxidasas (microsomales) y carboxiamidasas; sin embargo, en los insectos stas son muy poco efectivias (1). El malatin es un insecticida de amplio espectro, especialmente til contra caros y otros parsitos y desde su lanzamiento en los aos cincuenta, es uno de los de mayor uso, que se puede encontrar frecuentemente en los alimentos aunque a un nivel bajo de contaminacin (3,5). FUNDAMENTO: El malatin residual que se encuentra en la superficie de una fruta se extrae con tetracloruro de carbono y se somete a una hidrlisis alcalina en presencia de etanol para efectuar una -eliminacin (2)el O,O-dimetil-fosforoditionato de sodio al ponerse en contacto con el catin Cu+2, nos forma un complejo quelante de coloracin amarilla, el cual es directamente proporcional a la concentracin de malatin en la muestra y puede ser medido a una longitud de onda de 416 nm (3,4,5). MATERIAL Pipeta volumtrica de 20 mL Matraz aforado de 10 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 10 mL Embudo de filtracin rpida

1 1 3 2 2 1

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Embudo de separacin de 250 mL 2 Probeta graduada de 100 mL 2 Tubo de ensaye de 16x150 mm 2 Propipeta 1 Vaso de precipitado de 250 mL 6 Soporte universal con anillos de fierro 2 jgos. Nota: Traer guantes y cubrebocas por alumno

REACTIVOS Sulfato de sodio Hidrxido de sodio Cloruro frrico Sulfato cprico Malation al 50% Fenolftalena al 1% en etanol Etanol Tetracloruro de carbono

PREPARACION DE LAS SOLUCIONES: I) Solucin patrn: 0.1 mL de malatin al 50% se lleva a 100 mL con etanol; en esta solucin se toman 8 mL y se llevan a 100 mL nuevamente con etanol. II) Disulfuro de carbono al 0.5% en tetracloruro de carbono. III) Solucion de sulfato de sodio al 9%. IV) A 100 mL de la solucin anterior adicionarle 3 mL de HCl concentrado (solucin cida de sulfato de sodio). V) Hidrxido de sodio 6N. VI) 5 g de cloruro frrico se disuelven en 1 mL de HCl 6N (4.85 mL de HCl concentrado en 10 mL de agua destilada), y despus se lleva a 100 mL con agua. VII) Solucin de sulfato cprico al 3.5%. VIII) Fenolftalena (gotas por muestra). IX) HCl 6N (gotas por muestra). PROCEDIMIENTO: a) Se colocan 25g del material sospechoso en un frasco de vidrio de boca ancha y se le aaden 25 mL de tetracloruro de carbono, se tapa y se agita vigorosamente por 5 minutos, se procede a filtrar a travs del papel filtro recolectndose cuando menos 60 mL (medido con probleta). El material vegtal desecharlo en forma correcta. Se procede a preparar 3 tubos para la curva patrn y dos para el problema de la siguientes manera: b) Para los tubos problemas se colocan 10 mL del extracto filtrado y se le adiciona 0.2 mL de solucin II y 5 mL de etanol, esta mezcla se pasa a un embudo de separacin donde se agita suavemente y se le adiciona 15 mL de solucin cida de sulfato de sodio (IV).

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c) Agitar vigorosamente el embudo por 1 minuto, separar las fases y filtrar la fase orgnica colectndola en un embudo de separacin limpio, aadir 5 mL de etanol, agitar y despus aadir 0.2 mL de NaOH 6N (sol. V) agitando nuevamente por 5 minutos, dejar reposar otro minuto y adicionar 15 mL de solucin de sulfato de sodio (III), mezclar y descartar la fase orgnica. d) Aadir 5 mL de tetracloruro de carbono a la fase acuosa y 0.3mLde sol. de sulfato cprico (sol. VII) gota de indicador de fenolftalena, agitando el embudo se procede a neutralizar gota a gota con HCl 6N hasta desaparicin del color azul violeta.

e) Una vez neutralizada la mezcla anterior se aade 0.2 mL de solucin de cloruro frrico (sol.VI) se agita y se deja reposar para poder desechar la fase orgnica. f) Por ltimo se aaden a la fase acosa 5 mL de tetracloruro de carbono y 0.3 mL de solucin de sulfato cprico (VII); en el caso del blanco de la muestra se sustituye por agua destilada, se agita vigorosamente por 1 minuto y se colecta la fase orgnica, la cual se lee en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustndolo previamente con su respectivo blanco. En el caso de los tubos de la curva estndar se preparan de la siguiente forma: Tubo 1 1 mL de solucin patrn (I)/ 4 mL de etanol Tubo 2 2.5 mL de solucin patrn (I)/ 2.5 mL de etanol Tubo 3 5.0 mL de solucin patrn (I) Cada uno de ellos se colocan en un embudo de separacin y se le adicionan 15 mL de tetracloruro de carbono y 0.2 mL de solucin II. Se agita suavemente y se continua como en los prrafos anteriores. CALCULOS: Construir la curva de referencia ajustando a 100 % T con el solvente orgnico de uso en la extraccin. Al revisar los resultados, s encontr la presencia de malatin en su muestra, reportarlo en ppm. CUESTIONARIO: a) Escriba la estructura qumica del malatin y cuales son los productos de la -eliminacin. b) Indique brevemente el mecanismo de toxicidad del malatin en el insecto. c) C) Por qu el malatin relativamente es inofensivo a los mamferos? d) Indique el DL50 del malation para un insecto y un mamfero cualquiera y d un breve comentario. e) La cantidad de malatin que usted encontr en su alimento analizado, cmo lo considera? BIBLIOGRAFIA:

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1. Albert, Adrien. Selective Toxicity (the physico-chemical basis of theraphy) 6th Edition Chapman and Hall, pp. 455-463, London (1979). 2. Esto, Morifusa Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry CRC Press, pp. 62-77, 103, 196-199, Cleveland (1976). 3. Norris, M.V.; Voil, W.A. and Averall, P.R. Colorimetric estimation of malation residues. J. Agric. Foof Chem. 2, 570 (1954). 4. Cremlyn, C. Pesticides and mode of action John Wiley & Sons, N.Y. (1978). 5. White-Stevens, R. Pesticides in the enviroment Part I and II, Marcel Dekker, Inc., N:Y: (1971).

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