LABORATORIO N°6

CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO EN FERMENTACIÓN BATCH

SUMERGIDA

ANA LICETH CASILLA PERTUZ

MARIA ALEJANDRA GENEY SAEZ

SARA JARMA ARROYO

MARIA CLAUDIA NEGRETE

CINSY ESTELLA RIOS RINCON

PROFESOR

Ph.D. DEIVIS LUJAN RHENALS

BIOTECNOLOGIA

VIII SEMESTRE

UNIVERSIDAD DE CORDOBA

FACULTAD DE INGENIERIAS

PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

BERASTEGUI

2013
 CALCULOS Y CONSULTAS

MUESTRAS PROBLEMAS

Para este procedimiento se diluyeron las muestras previamente preparadas en la siguiente

proporción.

1ml de la muestra problema: 2 ml agua destilada

De este modo se obtuvo los resultados de la absorbancia mediante una longitud de onda de
540nm

1. MÉTODO DE DENSIDAD ÓPTICA

N° de tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia 0 0,039 0,151 0,224 0,336 0,684
(540nm)
Tabla 1. Resultados obtenidos por el método de densidad óptica

2. DETERMINACIÓN DE PESO SECO

N° Tubo 1 2 3 4 5 6
Pesos tubos 12,8060 12,8041 11,4400 11,6829 12,35 11,0642
secos (g)
Pesos 12,8060 12,82 11,45 11,69 12,3632 11,08
tubos+
muestra
seca (g)
Tabla 2. Resultados obtenidos en el método de peso seco

Peso seco (ps)= peso (muestra seca+ tubo)g- peso del tubo seco g

Se debe multiplicar por el factor de dilución Fd= 1/10 para que el resultado de en g de
células/ml. Los pesos respectivos se observan en la tabla 1.

12,8060−12,860
Tubo 1: Ps= =0 g celula/ml
10

12 , 82−12,8041
Tubo 2: Ps= =0,0159 g celula /ml
10

11, 45−11,4400
Tubo 3: Ps= 0,001 g celula/ml
10
 11, 69−11,6829
Tubo 4: Ps= =0,00071 g celula/ml
10

12,3632−12 , 35
Tubo 5: Ps= =0,00132 g celula/ml
10

11, 08−11,0642
Tubo 6: Ps= =0,00158 g celula /ml
10

Absorbancia vs g cel/ mL
0.25

0.2
f(x) = 143.722516471821 x − 0.0245208315472742
R² = 0.858359331407906
0.15

0.1

0.05

0
0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018

Grafica 1. Absorbancia Vs g cel / ml

3. DETERMINACIÓN DE BIOMASA A TRAVÉS DEL TIEMPO

Tiempo (h) 0 2 4 6 8 24 26
Absorbancia 0,008 0,011 0,033 0,039 0,083 0,087 0,0962
(540nm)
Tabla 3. Resultados de la absorbancia a través del tiempo

De la ecuación obtenida de la grafica 1. Se puede obtener el valor de la biomasa en g cel /

ml conociendo el valor de absorbancia (Arnaiz 2000)

Y =143 ,72 x−0,0245

y+ 0,0245
X=
143 , 72
 Para tiempo= 0 horas

0,008+0,0245 −4 cel
X= =2 , 3∗10 g
143 , 72 ml

 Para tiempo= 2 horas

0,011+0,0245 −4 cel
X= =2 , 5∗10 g
143 , 72 ml

 Para tiempo= 4 horas

0,033+0,0245 −4 cel
X= =4∗10 g
143 , 72 ml

 Para tiempo= 6 horas

0,039+0,0245 −4 cel
X= =4 , 4∗10 g
143 , 72 ml

 Para tiempo= 8 horas

0,083+0,0245 −4 cel
X= =7 , 5∗10 g
143 , 72 ml

 Para tiempo= 24 horas

0,087+0,0245 −4 cel
X= =7 , 8∗10 g
143 ,72 ml

 Para tiempo= 26 horas

0,0962+ 0,0245 −4 cel

X= =8 , 4∗10 g
143 , 72 ml
 4. MEDICIÓN DEL SUSTRATO A TRAVÉS DEL TIEMPO

Para esta medida se selecciono un curva patrón obtenida en la determinación

azucares reductores por el método de DNS realizada en prácticas anteriores.

Concentración (g/l) Absorbancia (575nm)

0 0
0,2 0,02
0,4 0,058
0,6 0,125
0,8 0,183
1 0,225
Tabla 4. Datos de Concentración y absorbancia

Concentracion Vs Absorbancia
0.25

f(x) = 0.240142857142857 x − 0.0182380952380953

0.2 R² = 0.977840206842577

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Grafica 2. Concentración Vs absorbancia

Tiempo (h) 0 2 4 6 8 24 26
Absorbancia 0,582 0,374 0,298 0,21 0,176 0,08 0,04
(575 nm)

Tabla 5. Resultados obtenidos de la absorbancia a través del tiempo

De la ecuación obtenida de la grafica 2. Se puede obtener el contendido de glucosa en el
sustrato conociendo el valor de absorbancia:

Y =0,2401 x−0,0182

y+ 0,0182
X=
0,2401

 Para tiempo= 0 horas

0,582+ 0,0182 g
X= =2 ,5 ∗1000=2500 g /ml
0,2401 l
 Para tiempo= 2 horas

0,374+0,0182 1 ,63 g
X= = ∗1000=1630 g/ml
0,2401 l

 Para tiempo= 4 horas

0,298+0,0182 1 , 31 g
X= = ∗1000=1310 g/ml
0,2401 l
 Para tiempo= 6 horas

0 ,21+0,0182 0 , 95 g
X= = ∗1000=950 g /ml
0,2401 l

 Para tiempo= 8 horas

0,176+0,0182 0 , 80 g
X= = ∗1000=800 g /ml
0,2401 l
 Para tiempo= 24 horas

0 ,08+ 0,0182 0 , 40 g
X= = ∗1000=400 g /ml
0,2401 l

 Para tiempo= 26 horas

0 ,04 +0,0182 0 , 24 g
X= = ∗1000=240 g /ml
0,2401 l
 Tiempo (h) Biomasa (g cel /ml) [] sustrato (g/ml)
−4
0 2 , 3∗10 2500
−4
2 2 , 5∗10 1630
−4
4 4∗10 1310
−4
6 4 , 4∗10 950
−4
8 7 , 5∗10 800
−4
24 7 , 8∗10 400
−4
26 8 , 4∗10 240
Tabla 5. Resultados obtenidos de la biomasa y [] de sustrato

5. ECUACION DE MONOD

Se hace necesario realizar los cálculos convenientes para determinar

experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod.

Tiempo Vs Biomasa
0.0009
f(x) = 0.00000000423923 x⁶ − 0.000000272796 x⁵ + 0.0000059683 x⁴
0.0008 − 0.0000523923 x³ + 0.000194124 x² − 0.000212196 x + 0.00023
R² = 1
0.0007
0.0006
0.0005
0.0004
0.0003
0.0002
0.0001
0
0 5 10 15 20 25 30

Grafica 3. Tiempo Vs biomasa

Tiempo (h) Biomasa (g/L) Sustrato (g/L) (dx/dt) 1/B (dx/dt) S/u
0 0,00023 2500 0,0002 0,86956522 2875
2 0,00025 1630 -0,00049123 -1,964928 -829,546935
4 0,0004 1310 -0,00046342 -1,15856 -1130,71399
6 0,00044 950 0,000686624 1,56050909 608,775691
8 0,00075 800 0,002970432 3,960576 201,990822
24 0,00078 400 0,007174976 9,19868718 43,484466
26 0,00084 240 0,001173024 1,39645714 171,863491
Tabla 6. Cálculos obtenidos a través de la ecuación de monod
 S Vs S/U
0
1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650
-200

-400

-600

-800
f(x) = 0.941147046022903 x − 2363.61662007042
-1000 R² = 1

-1200

Grafica 4. S Vs S/U

S 1 ks
= ∗s+
U Umax Umax

Velocidad especifica de crecimiento (μmax)

μmax= 1,06258634 1/h

Constante de saturación (Ks)

Ks= 2511,52906 g/l

1/umax= 0,9411
ks/Umax= 2363,6
Rendimiento Sustrato (Yx/S)

So-S X-Xo

0 0
870 0,00002
1190 0,00017
1550 0,00021
1700 0,00052
2100 0,00055
2260 0,00061
 (So-S) vs (X-Xo)
0.0007

0.0006

0.0005 f(x) = 3.00558077941733E-07 x − 0.000118056659099508

R² = 0.817890344841441
0.0004

0.0003

0.0002

0.0001

0
0 500 1000 1500 2000 2500

Yx/S = 3,00E-07

6. MÉTODO LINEWEABER- BURK

Aplicamos los métodos integral y diferencial de análisis del modelo de monod

1/B (dx/dt) Sustrato (g/L) 1/S 1/μx

0,869565217 2500 0,0004 1,15
-1,964928 1630 0,000613497 -0,5089245
-1,15856 1310 0,000763359 -0,86314045
1,560509091 950 0,001052632 0,640816517
3,960576 800 0,00125 0,252488527
9,198687179 400 0,0025 0,108711165
1,396457143 240 0,004166667 0,71609788
Tabla 7. Datos para el método leineweaber- burk
 1/s Vs 1/ Ux
0.8
0.6 f(x) = 5199.09568164525 x − 4.83191577971426
0.4 R² = 1

0.2
0
0.0007 0.00075 0.0008 0.00085 0.0009 0.00095 0.001 0.00105 0.0011
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1

Grafica 5. 1/S Vs 1/μx

Velocidad especifica de crecimiento (μmax)

U máx.= 0,206957925 1/h

Constante de saturación (Ks)

Ks= 1075,99495 g/l

1/umax= 4,8319
Ks / Umax= 5199,1

7. METODO DE LANGMUIIR

Sustrato (g/L) S/μx

2500 2173,913043
1630 -3202,83264
1310 -1517,7136
950 1482,483636
800 3168,4608
400 3679,474872
240 335,1497143
Tabla 8. Datos para el método de langmuir

Velocidad especifica de crecimiento (μmax)

Ux máx.= 0,130799315 1/h

Constante de saturación (Ks)

Ks= 1170,22223 g/l
 1/umax= 7,6453
Ks / Umax= 8946,7

S Vs S/ Ux
4000

3000
f(x) = − 7.64532279222261 x + 8946.74052297192
2000 R² = 0.98169484268982
1000

0
700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
-1000

-2000
-3000

-4000

Grafica 6. S Vs S /Ux

8. METODO DE EADIE-HOFSTEE

Sustrato (g/L) μx/S 1/B (dx/dt)

2500 0,000347826 0,869565217
1630 -0,001205477 -1,964928
1310 -0,000884397 -1,15856
950 0,001642641 1,560509091
800 0,00495072 3,960576
400 0,022996718 9,198687179
240 0,005818571 1,396457143
Tabla 9. Datos para el método de Eadie- hofstee
 Ux/s Vs 1/B (dx/dt)
0
-0.00125 -0.0012 -0.00115 -0.0011 -0.00105 -0.001 -0.00095 -0.0009 -0.00085

-0.5

-1
f(x) = 2511.42117489353 x + 1.06253321861423
R² = 1 -1.5

-2

-2.5

Grafica 7. Ux Vs 1/B (dx/dt)

Velocidad especifica de crecimiento (μmax)

Ux máx.= 1,0625 1/h

Constante de saturación (Ks)

Ks= 2511,4 g/l

9. Graficar log [x] Vs tiempo

log [x] tiempo (h)

-3,63827216 0
-3,60205999 2
-3,39794001 4
-3,35654732 6
-3,12493874 8
-3,1079054 24
-3,07572071 26
Tabla 10. log [x] Vs tiempo
 log [x] Vs tiempo
30

25

20

15

10

0
-3.7 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 -3.1 -3

Grafica 8. Log [x] Vs T

Graficar [s] Vs tiempo

[] sustrato Tiempo
(g/ml) (h)
2500 0
1630 2
1310 4
950 6
800 8
400 24
240 26
Tabla 11. Datos [s] Vs tiempo
 [] sustrato Vs tiempo
30

25

20

15

10

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Grafica 9. [s] Vs T

10. CRECIMIENTO DIAUXICO

Este tipo de crecimiento tiene lugar cuando una bacteria crece en un medio con dos
fuentes de carbono, una de las cuales se usa con preferencia frente a la otra. Es
consecuencia de la represión catabólica (Mecanismos de regulación de expresión
génica).
Da lugar a una curva de crecimiento con dos fases exponenciales separadas por una
fase estacionaria corta.
Esto ocurre porque la bacteria crece primero a expensas de la fuente de carbono
preferente, cuando la agota entra en fase estacionaria hasta que sintetiza enzimas
para degradar la otra fuente de carbono, entonces reemprende el crecimiento
exponencial, si bien con una pendiente más suave.
Ejemplo: En un medio con glucosa y lactosa, la glucosa es el azúcar preferente y su
presencia reprime la síntesis de beta galactosidasa, enzima necesaria para degradar
la lactosa.
Cuando se agota la glucosa, la enzima se sintetiza y se reanuda el crecimiento a
expensas de la lactosa.
Dependiendo de las necesidades y condiciones de crecimiento de microorganismo
se puede elegir el modelo más adecuado. (Duarte 1995)
Grafica 10. Crecimiento diauxico
 DISCUSION

1. DETERMINACIÓN DE BIOMASA A TRAVÉS DEL TIEMPO

En base a los resultados obtenidos podemos inferir que a medida que aumenta el
tiempo la biomasa (g cel /ml) también aumenta tiene una relación directamente
proporcional, lo cual se corrobra con la medida de la absorbancia cuando esta
aumenta. Sin embargo por disponibilidad del laboratorio no se llevaron a cabo los
estudios completos pero no estamos exento de dar una breve explicación e los
resultados.

2. DETERMINACIÓN DE SUSTRATO EN BIOMASA

Se logro el objetivo esperado a medida que aumenta el tiempo la concentración de

de sustrato (glucosa) disminuye y al compararlo con la curva patrón los datos
obtenidos por la lectura de la absorbancia evidencian que la absorbancia obtenida
experimentalmente se encuentra dentro de los parámetros o intervalos de la curva
patrón.

3. APLICACIÓN DE LOS MODELOS DE MONOD INTEGRAL Y

DIFERENCIAL

De lo anteriormente expuesto y de la agilidad y veracidad con que se obtuvieron los

datos, depende en gran manera la eficiencia de los métodos aplicados para la
determinación de los parámetros cinéticos microbianos.
Cabe resaltar que para la simulación de estos modelos se hizo necesario una serie de
ajustes al momento de graficar para una mejor claridad de los gráficos, no
necesariamente se graficaron todos los datos solo los que mejor se ajustaban o
presentaban un menor porcentaje de error.
Se observa cierta variabilidad en los parámetros obtenidos como constante de
saturación, velocidad especifica de crecimiento, y el rendimiento sustrato biomasa
por los distintos modelos no lejos de la realidad.
La constante de saturación disminuye para el modelo de lineweaver- burk, langmuir
y Eadie- hofstee a diferencia del modelo de Monod.
La velocidad de crecimiento específica disminuye en los modelos de lineweaver-
burk y langmuir en comparación con el de Monod pero es igual en el modelo de
Eadie- hofstee.
4. Grafica log [x] Vs T

Se observa cierto decremento en el peso seco de la biomasa cuando el tiempo

aumenta.los microorganismos han culminado su ciclo por falta de nutrientes ya no
siguen reproduciéndose hasta el momento que mueren.

5. Grafica [s] Vs T
Al igual que la biomasa el sustrato también decrece con el aumento del tiempo, se
da una relación inversamente proporcional. Como resultado del agotamiento del
contenido de glucosa, por ende ya no hay alimento para el microorganismo continúe
su proceso de fermentación.
 CONCLUSIÓN

 La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes en un

bioproceso, ya que establece las tasas de producción y de consumo de nutrientes.

 El modelo de Monod es el modelo que mejor se ajusta al evaluar el efecto de la

concentración de sustrato sobre la velocidad específica de formación de biomasa.

 La evaluación de la cinética de crecimiento microbiano es muy importante al

momento de simular y predecir el comportamiento en los fermentadores al
interactuar con el medio mientras se adaptan.

 El tiempo es un factor determinante en el crecimiento microbiano ya que a medida

que aumenta el tiempo disminuye, es decir no crecen más hasta llegar a la muerte.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Duarte A 1995. Evaluación de los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod.

Revista ingeniería e investigacion. Universidad nacional de colombia

 Arnaiz, C isaa,L lebrato. 2000. Determinación de biomasa en procesos bilógicos.

Sevilla España.

 Ruiz de Galarreta determinación de azucares reductores PEC/EN/V-058 edicion 3.