UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

ESTUDIANTE: Wendy Sailema Ronquillo

CARRERA: Ingeniería Bioquímica
ASIGNATURA: Ingeniería de las Fermentaciones
NIVEL: Séptimo “U”
PRÁCTICA DE LABORATORIO N: 1

TEMA: “Cinética de crecimiento microbiano”

1. INTRODUCCIÓN
En microbiología, la palabra “crecimiento” se define como un incremento en el
número de células o de masa celular por unidad de tiempo de una población
microbiana (Bikandi J., 2014). El crecimiento ocasiona un aumento del número
de células cuando los microorganismos se multiplican por procesos como
gemación o fisión binaria. En este caso las células individuales se agrandan y
dividen para originar dos células hijas de un tamaño aproximadamente igual. El
incremento depende fundamentalmente de la especie bacteriana, pero también del
pH, composición del medio, temperatura de incubación, edad del cultivo, factores
inhibidores, etc. (Brock et al., 2004).
La curva del crecimiento microbiano representa la evolución del número de
células viables presente en un cultivo microbiano líquido a lo largo del tiempo de
estudio. La curva de crecimiento de un cultivo microbiano puede ser subdividida
en cuatro partes distintas denominadas: fase de latencia, fase exponencial, fase
estacionaria y fase de muerte (Solorzano C., 2009).
En el presente informe se desea evaluar la cinética microbiana de Escherichia coli,
para ello se utilizó un método turbidimétrico el cual está establecido para estudiar
el crecimiento bacteriano a través de mediciones de densidad óptica, lo cual hace
posible el seguimiento del crecimiento de la población bacteriana en tiempo real.
La densidad óptica (DO) o absorbancia está siendo utilizada desde hace muchos
años para medir la concentración, expresada en masa, número o longitud media
 celular, de suspensiones bacterianas, y la creación de los instrumentos
turbidimétricos automatizados ha permitido a los microbiólogos conseguir
mediciones de DO más eficazmente y más aproximadas a la realidad (Navarro C.,
2017). Además de utilizar el método turbidimétrico también se realizó la siembra
en placa de distintas diluciones de E. coli, de esta forma se obtiene el número de
unidades formadoras de colonias por mililitro inoculado (UFC/ ml) útil para la
construcción de la curva de crecimiento bacteriano.

2. OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar la cinética de crecimiento microbiano de Escherichia coli.
Objetivo Específico
 Determinar la cinética de crecimiento microbiano mediante Absorbancia y
siembra en placa de distintas diluciones de la muestra.
 Definir el crecimiento microbiano mediante el análisis de la fase exponencial
de la curva de crecimiento.

3. MATERIALES Y MÉTODOS
Se esterilizó todos los materiales a utilizar como tubos, puntas, cajas Petri, en el
autoclave, después se preparó agar nutritivo para la siembra en placa. Se utilizó
una cepa de Escherichia coli de tipo patógena, previamente a la práctica se activó
la bacteria, la cual se encontraba en una concentración 108, esta solución madre
se encontraba en gran cantidad así que se diluyo hasta obtener una dilución 10 4,
para ello se añadió 4µL de la solución madre en 40ml de medio de cultivo EC.
Antes de ello se tomó 2ml de medio de cultivo para utilizarlo como blanco en el
espectrofotómetro al momento de medir absorbancia. Una vez que se inoculó los
4µL de E. coli se tomo en cuenta el tiempo, debido a que este se usara como
tiempo cero para el análisis del crecimiento bacteriano. Después de 20 min de
realizado el inoculo de los 4µL de E. coli se tomaron 2 ml del medio y se llevó
rápidamente al espectrofotómetro para medir absorbancia a una longitud de onda
de λ=540 nm, al mismo tiempo que se realizaba la medición de la absorbancia,
también se realizó diluciones 103 y 102, seguidamente se realizó la siembra en
placa de dichas diluciones, las cuales posteriormente fueron llevadas a incubación
durante 24 horas. El proceso de medición de absorbancia, la dilución y siembra
 en placa se repitió tres veces cada 20 min.Por último, se realizó el recuento
bacteriano después de un día de incubación de las placas.

4. RESULTADOS

Tabla Nº1. Resultados Obtenidos

Nº de colonias Tiempo Absorbancia UFC ln UFC
10-2 10-3 (min) λ=540 nm 10 -2 10-3 10-2 10-3
0 0 0 0 - - - -
5
138 22 39 0,007 1,38 × 10 2,2 × 105 11,835009 12,3013828
510 41 184 0,009 5,1 × 105 4,1 × 105 13,142166 12,9239124
430 105 227 0,013 4,3 × 105 1,05 × 106 12,971540 13,8643007
440 137 247 0,285 4,4 × 105 1,37 × 106 12,994530 14,1303213

Tabla Nº2. Tiempo de generación (Fase exponencial)

Tiempo (min) ln UFC 10-2 ln UFC 10-3
39 11,835009 12,3013828
184 13,142166 12,9239124
227 12,971540 13,8643007

y = mx + b
ln N células/ml = 0,0068 abs + 11,63
𝑇
𝐺= 𝑁
3.32 log( )
𝑁𝑜
227−184
𝐺= 5,1 × 105
= 174,78 ≈ 175 𝑚𝑖𝑛
3.32 𝑙𝑜𝑔 ( )
4,3 × 105

Gráfico Nº1. Tiempo vs UFC 10-2

600000

500000

400000
UFC 10^2

300000

200000

100000

0
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (min)
 Gráfico Nº2. Tiempo vs UFC 10-3

1600000
1400000
1200000
1000000
UFC 10^3

800000
600000
400000
200000
0
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (min)

Gráfico Nº3. Tiempo vs ln UFC 10-2 (Fase Exponencial)

13.4
y = 0,0068x + 11,63
13.2
13
12.8
ln UFC 10^2

12.6
12.4
12.2
12
11.8
11.6
0 50 100 150 200 250
Tiempo (min)

Gráfico Nº4. Tiempo vs ln UFC 10-3 (Fase Exponencial)

14.4
y = 0,0196x + 9,3445
14.2
14
ln UFC 10^3

13.8
13.6
13.4
13.2
13
12.8
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (min)
 Gráfico Nº5. Absorbancia vs ln UFC 10-2 (Fase Exponencial)

13.4
13.2
13
12.8
ln UFC 10^2

12.6
12.4
12.2
12
11.8
11.6
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014
Absorbancia

Gráfico Nº6. Absorbancia vs ln UFC 10-3 (Fase Exponencial)

14
13.8
13.6
13.4
ln UFC 10^3

13.2
13
12.8
12.6
12.4
12.2
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014
Absorbancia

Gráfico Nº7. Absorbancia vs Tiempo

0.3

0.25

0.2
Absorbancia

0.15

0.1

0.05

0
0 50 100 150 200 250 300
-0.05
Tiempo (min)
5. DISCUSIÓN
La cinética microbiana se encarga de entender todas las manifestaciones y reacciones
de la vida microbiana: crecimiento, supervivencia, muerte, adaptaciones, formación
de producto, ciclos celulares e interacciones con el medio ambiente (Aguilar A.,
2014). Para la práctica se realizó la medición de absorbancia, el cual es un método
turbidimétrico, este se caracteriza por la medición de la densidad óptica de las
partículas, en este caso el crecimiento bacteriano de E. coli está relacionado con el
aumento de la turbidez del medio. Este método se enfoca en el hecho de que las
partículas pequeñas difractan la luz, dentro de ciertos límites, de manera proporcional
a su concentración. Cuando un haz luminoso pasa a través de una suspensión
bacteriana, la reducción en cantidad de luz transmitida a consecuencia de la
difracción es una medida de masa bacteriana presente. Tales mediciones se hacen
normalmente con un fotómetro o espectrofotómetro; estos, están equipados con un
prisma o una red de difracción que permite la iluminación de la muestra con luz de
un margen estrecho y ajustable de longitudes de onda (Navarro C., 2017). Como se
observa en el gráfico Nº7 la absorbancia aumenta a medida que transcurre el tiempo,
pero al medir el ultimo punto la densidad óptica aumenta considerablemente, esto
pudo ocurrir debido a que el tiempo de medición no se dio exactamente cada 20 min,
de esta manera el blanco pudo haberse contaminado con partículas del ambiente,
dando una medida errónea de absorbancia, y a su vez no se pudo determinar
exactamente las fases de la curva de crecimiento microbiano debido la alta
concentración de bacterias presentes en el último punto de medición, lo cual
representa un problema al momento de identificar el tiempo en el que las bacterias
mueren y a su vez supone una gran desventaja en el uso del método turbidimétrico.
Debido a estos problemas también se realizó el recuento en placa y se calculo
UFC/ml como se muestra en la Tabla Nº1, es bien conocido que para el calculo de
UFC/ml el numero de colonias no debe superar 300 para poder contarlas y no debe
ser menor a 30 para que tenga significado estadístico, pero en este caso se realizó el
UFC/ml de todas las diluciones sembradas, esto con el fin de poder identificar la fase
exponencial en la curva de crecimiento de esta manera se obtuvo el gráfico Nº1 y el
gráfico Nº2 de las cuales se pudo identificar la fase exponencial, los gráficos
mencionados anteriormente no fueron útiles para estudiar la cinética de crecimiento
microbiano debido a que el tiempo y el número de células no tienen un relación lineal,
para ello se realizó la grafica Nº3 y grafica Nº4 basando el tiempo en función del ln
 UFC/ml de la fase exponencial, se realizó esta graficas con el fin de identificar el
tiempo de generación el cual se refiere al tiempo necesario para duplicar la población
bacteriana. Stanier et al., en el año 2007 lo definieron como el tiempo requerido para
que todos los componentes del cultivo aumenten en un factor de 2. Durante el período
de generación, el número de células y la masa celular se duplica. El tiempo de
generación varía entre los distintos microorganismos. Muchas bacterias tienen
tiempos de generación de 1–3 horas, conociéndose pocos microorganismos que
crezcan tan rápidamente como para dividirse en menos de 10 minutos. Otros tienen
tiempos de generación de varias horas o incluso días. El tiempo de generación es útil
como indicador del estado fisiológico de una población celular, y es usado con
frecuencia para comprobar el efecto negativo o positivo de un determinado
tratamiento sobre un cultivo bacteriano (Navarro C.,2017).
Según Fernández P., (2014), el tiempo de generación de Escherichia coli va desde
los 18 min a 20 min aproximadamente, esta bacteria posee un crecimiento acelerado
de tal manera que a partir de una sóla célula se obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 =
480 minutos; 480: 20 = 24 generaciones; 224 = 2 x 106 células) 2 millones de células.
El tiempo de generación obtenido en la práctica es de 175 min lo cual comparado
bibliográficamente es muy lejano del valor real de generación, la tasa del crecimiento
exponencial se ve influenciada por las condiciones ambientales de temperatura, pH,
composición del medio, oxígeno, así como por las características genéticas del
microorganismo, pero en este caso el tiempo de generación posiblemente se vio
afectado por el intervalo de tiempo en el que se realizó las respectivas siembras en
placa, las cuales no fueron cada 20 min, puesto que las siembras en placa se realizaron
en periodos de tiempo muy distantes uno del otro, se debe tener en cuenta que al
momento de realizar la siembra ya existía una excesiva concentración de bacterias y
que únicamente el recuento en placa solo permite el conteo de células vivas.
Los gráficos Nº5 y Nº6 muestran la densidad óptica en función de ln UFC/ml, esta
graficas se las realizó en base a la fase exponencial para comparar el número de
partículas medidas por el espectrofotómetro con el umero de unidades formadoras de
colonias, es decir el número de células viables que se identificó en el recuento en
placa.
6. CONCLUSIONES
 Se evaluó la cinética de crecimiento microbiano de Escherichia coli, para esto
se realizaron diferentes gráficas que indican el aumento de la densidad óptica
 en función del tiempo y la cantidad de UFC/ml de células vivas por recuento
en placa.
 Se determinó la cinética de crecimiento microbiano mediante el método
turbidimetrico el cual se enfoca en la turbidez de las particulas presentes en la
muestra de E. coli, cuando un haz luminoso pasa a través de la suspensión
bacteriana, la reducción en cantidad de luz transmitida a consecuencia de la
difracción es una medida de masa bacteriana presente. La siembra en placa
permitió el conteo de células viables que crecieron dentro de 24 horas,
importantes para la determinación de UFC/ml, con lo cual se pudo identificar
la fase exponencial de la curva de crecimiento microbiano.
 En la practica existieron distintas complicaciones que no permitieron dejar en
claro el tiempo de generación en la fase exponencial, debido a que las
condiciones de medición de absorbancia y siembra en placa no se realizaron en
un intervalo exacto de tiempo.

7. BIBLIOGRAFÍA
 Aguilar, A. (2014). Cinética microbiana de microorganismos biofertilizantes.
Recuperado el 09/06/2019 de:
https://www.researchgate.net/publication/264442301_Cinetica_microbia
na_de_microorganismos_biofertilizantes
 Bikandi, J. (2014). Cinética de la fase exponencial de la curva de crecimiento
microbiano. Recuperado el 09/06/2019 de:
http://testak.org/microbiologia/crecimiento/cinetica.pdf
 Brock T, Madigan T, Martinko J, Parker J. (2004). Biology of microorganisms. 9ª
Ed. New Jersey: Prentice Hall.
 Navarro, C. (2017). CINÉTICA DEL CRECIMIENTO Y DETERMINACION DE
LA FASE DE MUERTE EN Staphylococcus aureus COWAN I BAJO
DIFERENTES CONDICIONES NUTRICIONALES. Recuperado el
09/06/2019 de: http://tesis.luz.edu.ve/tde_arquivos/52/TDE-2011-10-
11T14:43:45Z-1924/Publico/navarro_ocando_carlos_navarro.pdf
 Solorzano, C. (2009). Cinética de Crecimiento Vegetativo y Fase de Esporulación
en Representantes del Género Bacillus bajo Diferentes Condiciones
Nutricionales. Trabajo Especial de Grado Presentado Como Requisito para
Optar al Título de Lic. en Biología, Facultad Experimental de Ciencias,
Universidad del Zulia.
 Stanier, R., Ingraham, J., Wheelis, M., and Painter, P. (2007). Microbiología.
11Ed. Ed. Reverté. pp. 195–209.