Informe-Bioquimica-Biologia-2023-24 Sergi Mollá Caballero 1a A4

Prácticas de Bioquímica.
1º Grado de Biología
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad Complutense de Madrid
PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
1º Grado en Biología
Curso 2023-2024
NOMBRE DEL ALUMNO Sergi Mollá Caballero
GRUPO DE TEORÍA 1A EQUIPO DE PRÁCTICAS 4A
Práctica II
PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES TAMPÓN
1
Prácticas de Bioquímica. 1º Grado de Biología
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (1 página máximo)
1. Cálculos para obtener las cantidades de las sales a pesar.
PESO MOLECULAR GRAMOS
H2PO4K 136,09 4,22
HPO4K2 174,18 3,31
2. Resultados de volúmenes y pH obtenidos en el apartado de la comprobación de la capacidad

tamponadora.
Vol. HCl añadido (ml)/pH Vol. NaOH añadido (ml)/pH
6ml 5,5ml
Tampón
pH 3,06 pH 10,22
0,1 ml 0,1 ml
H2O
pH 3,07 pH 10,4
2
6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1/2 página máximo)
¿Por qué se han empleado las especies monopotásica y dipotásica para realizar el tampón?
Utilizamos estas especies debido a que su equilibrio tiene el valor de pka (7,21) más cercano al equilibrio
(7), que nos será más beneficioso para mantener la capacidad tamponadora de la disolución.
¿Por qué se ajusta el pH tras disolver la cantidad calculada de las especies del tampón?
Porque es una forma de garantizar que todo está correcto, ya que siempre nos podemos equivocar en los
cálculos o incluso el material a utilizar como la báscula pueden estar dañados.
En la segunda parte de la práctica, ¿qué resultado se habría obtenido si el tampón estuviera a 10 mM

en lugar de a 0.1 M de concentración?
Si hubiéramos utilizado un tampón con menor concentración, a la hora de añadir un ácido o una base el
PH variaría con mayor facilidad puesto que a menor concentración menor es la capacidad de
tamponamiento.
3
7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1 página máximo)
¿Cómo prepararías 400 ml de un tampón carbonato sódico 0.25 M, pH 9.5? Datos:
- pKa1= 3.77, pKa2= 10.2

- PM (Na2CO3) = 105.99 g/mol
- PM (NaHCO3) = 83.99 g/mol
- PM (H2CO3) = 61.99 g/mol
4
Práctica III
EXTRACCIÓN DEL DNA GENÓMICO DE UN TEJIDO VEGETAL
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (1/2 página máximo)
1. Gramos de cebolla en los 10 ml utilizados para el aislamiento.
2. Con el resultado de la concentración de DNA obtenido en la práctica VIII (ojo con la dilución),
calcular el rendimiento del proceso de extracción de DNA como µg de DNA obtenido por g de
cebolla.
3. Relación A260/A280 según los resultados de la práctica VIII.
5
6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1 página máximo)
¿Para qué se usa EDTA en los tampones de homogeneización y de resuspensión del DNA?
Se utiliza EDTA en los tampones de homogeneización y resuspensión del ADN para proteger el ADN de la
degradación enzimática al quelatar iones metálicos y mantener el pH adecuado de la solución.
¿Por qué precipita el DNA cuando se encuentra en una disolución alcohólica?
Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos fosfato de las moléculas de ADN, neutralizando
las cargas eléctricas del ADN y evita las uniones del DNA a proteínas. De esta manera se facilita la
precipitación del ADN de la solución al añadir el alcohol.
El ADN no se disuelve en alcohol. Por tanto el añadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de
la solución.
¿Por qué se ve el DNA blanquecino?
Se ve el DNA blanquecino debido a que cuando este precipita, las moléculas se agrupan formando una
estructura solida y cristalina que dispersa la luz, lo que resulta en la apariencia blanquecina del
precipitado cuando se observa a simple vista.
¿Qué ocurre cuando el DNA se lava con etanol al 70%?
Cuando lavamos el DNA en etanol 70% lo que conseguimos es eliminar las impurezas, como las sales.
¿El DNA obtenido está puro? ¿Cómo se podría mejorar la pureza de la preparación?
No, el DNA no es puro. Podríamos mejorar la pureza con una cromatografía de penetrabilidad.
6
7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1/2 página máximo)
Se ha llevado a cabo una extracción de DNA de fresa, que ha sido resuspendido en 80 µl de

agua estéril. De esta disolución de DNA se tomaron 5 µl, a los que se añadieron 495 µl de agua. Se
midió la absorbancia a 260 nm de esta muestra diluida, obteniéndose un valor de 0.1. Teniendo en
cuenta que Abs260 = 1 se corresponde con 50 µg/ml de DNA (ver práctica VIII):
1. Calcula la concentración de la disolución de DNA original, y los µg totales de DNA extraído.
2. ¿Qué volumen de esa disolución necesitarías para aplicar 1 µg de DNA en una electroforesis?
7
Práctica IV
PRECIPITACIÓN Y DIÁLISIS DE PROTEÍNAS
IV-A. PRECIPITACIÓN SALINA DE PROTEÍNAS
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS. (1 página máximo)

1. Calcula el primer porcentaje de saturación alcanzado y los gramos para obtener un 85% en el
segundo paso de la precipitación.
% SATURACIÓN 20,25%
gr (NH4)2 SO4 para un grado de saturación del 85% 2,03g
2. Pon una imagen de los diferentes sobrenadantes y precipitados de la disolución de hemoglobina

a lo largo del proceso.
SOBRENADANTE 1 SOBRENADANTE 2 SOBRENADANTE 3

3. Rellena la siguiente tabla (una vez cuantificada la concentración de proteínas en la práctica V)
8
6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1/2 página máximo)

¿Qué se deduce del resultado visual de la precipitación fraccionada de la hemoglobina?
Podemos observar una primera muestra que presenta las siguientes características: poco precipitado y un
sobrenadante con un color un más claro que la muestra original; y una segunda muestra con las
siguientes características: un mayor precipitado con un color más oscuro que el anterior y un
sobrenadante notoriamente más claro. Deducimos que con cada precipitación el precipitado tiene mayor
concentración de Hb, por eso el color, y que la concentración en el sobrenadante se reduce.
¿La recuperación cuantificada se corresponde con el resultado visual? ¿Es el resultado esperado?
Es lo que se esperaba, el primer sobrenadante con mayor concentración presenta un color más oscuro,
mientrs que el segundo es más claro y por tanto menos concentrado.
¿En qué se diferencia la disolución inicial de hemoglobina de la final tras la precipitación salina?
La principal diferencia la encontramos en que la disolución inicial era de un color más oscuro y además se
encontraba en una sola fase, mientras que tras la precipitación encontramos una disolución en dos fases
(precipitado y sobrenadante) y de color más clara.
Se parte de una mezcla de tres proteínas: P1, P2 y P3. Sabiendo que precipitan en los
siguientes porcentajes de saturación de sulfato amónico respectivamente: 15, 40 y 65%; ¿cómo
diseñarías un protocolo para separar las tres proteínas partiendo de un volumen inicial de 15 ml?
Incluye los cálculos necesarios.
9
IV-B. DIÁLISIS
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS. (1 página máximo)
1. Cálculos para preparar 2 litros de tampón fosfato 20 mM pH 7.0 a partir de la disolución madre.
2. Resultado de la diálisis de colorantes:
Antes de dializar Tras dializar
COLOR Azul verdoso Azul claro

Interior de Azul de dextrano y
la bolsa Azul de dextrato y
COMPUESTOS ferricianuro
H20
potásico
Incoloro
COLOR Incoloro
Medio de (amarillento)
diálisis Ferricianuro
COMPUESTOS Agua destilada
potásico
4. Concentración y cantidad de hemoglobina recuperada de la diálisis (práctica V).
10
¿Qué se consigue con la primera diálisis? ¿Por qué?
En la primera diálisis se consigue separar gracias a los diferentes pesos moleculares, los diferentes
colorantes de la mezcla. El ferrocianuro potásico al tener un p.m más bajo, sus moléculas consiguen
atravesar la membrana y pasan al medio de la diálisis. Mientras que el azul de dextrano ,que tiene mayor
p.m, no consigue atravesar la membrana y se queda en el interior.
¿Qué se consigue con la diálisis de la hemoglobina? ¿Por qué?
Con esta diálisis conseguimos separar la hemoglobina de las impurezas , como por ejemplo las sales, que
se hayan podido quedar en la muestra. Estas impurezas atravesarán la membrana semipermeable de la
diálisis gracias a su bajo peso molecular, aislando la hemoglobina.
¿Qué método alternativo a la diálisis podrías usar con el mismo propósito?
Podríamos utilizar la cromatografía de penetrabilidad.
¿Se ha recuperado toda la hemoglobina tras la diálisis?
En un caso idílico se recuperaría toda la hemoglobina.
Pero podría darse el caso en el que:
Algunas moléculas de hemoglobina escaparan a través de la membrana, debido a su pequeño tamaño o

debido a que estuvieran fragmentadas.
Si la membrana no es completamente selectiva.
No se recuperaría la hemboglobina al 100%
11
Se dializan 5 ml de una disolución de albúmina en 1 M de NaCl frente a 1 litro de agua destilada.

¿A qué concentración quedará el NaCl dentro de la bolsa de diálisis? ¿Cuántos cambios del
tampón de diálisis se tienen que realizar para que la concentración de NaCl quede por debajo de 1
µM?
12
Práctica V
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE EL MÉTODO DE

BRADFORD
1. Calcular la concentración en los 300 µl de las disoluciones de BSA (tubos 1-10).
2. Representar la CURVA DE CALIBRADO (en ordenadas las absorbancias y en abscisas las

concentraciones de las disoluciones estándar en µg/ml). Ajustar los datos experimentales a una recta.
13
3. Determinar la CONCENTRACION DE PROTEINA DE LA MUESTRA PROBLEMA: Interpolar los

valores de absorbancia para obtener la concentración de las diluciones A y B; y aplicar los factores
de dilución correspondientes para obtener la concentración de la muestra original.
4. Determinar la CONCENTRACION DE PROTEINA DE LAS FRACCIONES DE HEMOGLOBINA:

Interpolar los valores de absorbancia para obtener la concentración en los tubos 15-24; calcular la
concentración original de las muestras S1, S2, P2 y Hb-D; teniendo en cuenta la dilución realizada en
cada caso; usar esos valores de concentración para completar y discutir la tabla de la práctica IV-A.
Añadir los resultados para la hemoglobina dializada en la práctica IV-B.
14
Conc.
Conc. DILUCIÓN DILUCIÓN de la
TUBO Nº PROTEINA
(µg/ml) muestra en los 300 µl
original (µg/ml)
11- Dil. problema A 345,81
2
12- Dil. problema A 340,63
1972,27
13- Dil. problema B 319,88
10
14- Dil. problema B 331,74
15- Hb S1 73,6
15 5365,05
16- Hb S1 260,26
17- Hb S2 111,74
6
18- Hb S2 119,89
576,71
19- Hb S2b 153,96
3
20- Hb S2b 151,74
21- Hb P2 280,26
15 4087,2
22- Hb P2 263,96
23- Hb D 262,26 15 3995,55
24- Hb D 270,26

¿En qué rango de absorbancias y concentraciones estos datos son directamente proporcionales en
este experimento?
Encontramos estos datos dentro de la curva de calibrado, donde los datos son fiables. Encontramos dos
caso donde son directamente proporcionales.
¿Dirías que los resultados obtenidos son fiables?
Aunque en nuestro caso las absorbancias y datos como el % de recuperación sean mayores a la media,
pienso que si podemos fiarnos de los datos. Hay que tener en cuenta algunos ejemplos como los tubos 14
y 14, cuyos valores son “exagerados” y no podemos utilizarlos como validos. Estos posiblemente se hayan
dado por un mal pipeteo o por contaminación de la muestra.
¿Cómo podrías mejorar el ajuste de la curva de calibrado?
Podriamos mejorar el ajuste de la curva de calibrado si se añadieran más valores. Cuantos más valores,
menor será el error.
15
¿Por qué se hacen diluciones de las muestras problema?

¿Qué otrosdiluciones
Se hacen métodos,dedirectos o indirectos,
la muestra podrías
porque debido a su alta concentración, esta puede causar algún tipo de
error en la medición de la absorbancia y para ajustarlo al rango de la absorbancia en el que vamos a
medir las muestras.
¿Qué otros métodos, directos o indirectos, podrías usar con la misma finalidad?
7.Podríamos
TAREAS utilizar
COMPLEMENTARIAS (1/2
métodos como el de página
Biuret máximo)
y Lowry o incluso una electroforesis.
En la práctica de la electroforesis se van a preparar:
-20 µl de S1 + 20 µl de tampón de carga (2x)
-20 µl de S2 + 20 µl de tampón de carga (2x)
7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1/2 página máximo) En la práctica de la electroforesis se van a

preparar: -20 µl de S1 + 20 µl de tampón de carga (2x) -20 µl de S2 + 20 µl de tampón de carga (2x) -
20 µl de P2 + 20 µl de tampón de carga (2x) De cada una de las mezclas, se van a cargar 15 µl en el
gel de electroforesis. Calcula los µg de S1, S2 y P2 que se cargan en el gel de electroforesis.
16
Práctica VI
ELECTROFORESIS DE DNA EN GEL DE AGAROSA
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (1/2 página máximo)
1. Adjuntar la imagen del gel con la leyenda de lo aplicado en cada carril y los tamaños de las
moléculas del patrón (en Kb o pb).
1- Control
2- DNA Salmón
3- DNA Plasmídico
4- Extracto del DNA de cebolla sin DNAasa
5- Extracto del DNA de cebolla con DNAasa
6-Extracto del DNA de cebolla sin DNAasa (GRUPO)
7- Extracto del DNA de cebolla con DNAasa (GRupo)
12- Vacío
2.- Calcular la cantidad de DNA genómico aplicada en la electroforesis teniendo en cuenta la

concentración de la muestra final obtenida en la práctica VIII.
17
6. DISCUSION (1/2 página máximo)
Teniendo en cuenta la apariencia en la imagen y comparándolo con el control, ¿qué se puede decir
del DNA purificado?
Por lo que se refiere al DNA de cebolla, la electroforesis ha salido correctamente. Podemos apreciar como
la muestra de DNA de cebolla con DNAasas ha sido capaz de desplazarse más que la muestra sin
DNAasas. Esto se debe a que las DNAasas son enzimas pueden cortar el ADN en fragmentos más
pequeños durante el proceso de electroforesis. Como resultado, los fragmentos de ADN más pequeños
tendrán una movilidad eléctrica mayor en el gel y se desplazarán más lejos en un tiempo determinado en
comparación con los fragmentos más grandes.
Por otro lado, en el caso del salmón, la muestra se ha degradado completamente.
¿Esperarías uno o varios tamaños para una muestra de DNA genómico eucariota? ¿Puedes calcular
el tamaño total del DNA genómico con esta técnica?
Esperarías ver múltiples tamaños de fragmentos de DNA ya que el genoma eucariota está compuesto por
una variedad de secuencias de ADN de diferentes longitudes.
En un gel de electroforesis, el ADN genómico eucariota suele aparecer como una banda continua y difusa
debido a la presencia de múltiples fragmentos de diferentes longitudes. Por lo tanto, no es posible
calcular el tamaño total del ADN genómico con precisión utilizando solo esta técnica de electroforesis.
¿Qué puedes decir de la muestra de DNA plasmídico? ¿Está pura, puedes calcular su tamaño?
En el caso del DNA plasmídico podemos observar patrones de elevadas masas moleculares a lo largo de la
columna. EN concreto observamos 3 bandas cuyo origen puede que sea el estado de el DNA:
superenrollado, lineal y relajado.
El DNA plasmídico se puede considerar puro, puesto que no se ha corrido a lo largo de la columna, lo cual
nos indica que no hay presencia de DNAasas.
18
Se han aplicado en un gel de agarosa 10 µl de una dilución 1/10 de la disolución de DNA

extraído a partir de fresas (tarea de la práctica III).
a) Calcula los µg de DNA aplicados en el gel.

b) ¿Qué volumen de tampón de carga 6X y de agua necesitarías para preparar la
muestra si se aplican 25 µl en el pocillo?
19
Práctica VII
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE

SDS (PAGE-SDS)
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (2 página máximo)
1. Adjuntar la imagen del gel con la leyenda de lo aplicado en cada carril y las masas moleculares del
patrón.
1- Patrón con pesos moleculares conocidos
2- Sobrenadante 1
3- Sobrenadante 2
4- Precipitado 2
5- Hb-D
6- Extracto de cebolla
7- Extracto cebolla con

proteasa
8- DNA
9- Muestra de prot 1
10- Muestra de prot 2
2. Cálculo de las MASAS MOLECULARES de las PROTEÍNAS PROBLEMA:
- Calcular la movilidad relativa (µr) de las distintas bandas que aparecen en el gel, proteínas
problema y patrones. µr= distancia recorrida por la proteína problema/distancia del frente
(azul de bromofenol). Las distancias se miden desde el comienzo del gel separador.
20
21
Realizar la recta patrón representando el logaritmo de las masas moleculares de las

proteínas patrón (eje de ordenadas) frente a la movilidad relativa (eje de abscisas).
- Calcular las masas moleculares de las proteínas de las muestras M1 y M2.
- Calcular la masa molecular de la hemoglobina (muestras S1, S2, P2, HbD).
22
¿Qué contienen las muestras problema M1 y M2? ¿Puedes identificar las proteínas en función de su
masa molecular?
No es posible conocer los componentes de las muestras 1 y 2, ya que para eso necesitaríamos conocer la
composición del patrón para utilizarlo de guía y no lo conocemos.
¿Qué diferencias hay entre las muestras de la precipitación y diálisis de la hemoglobina? ¿Coincide
el resultado con las concentraciones calculadas en las prácticas V y VIII?
La diferencia que encontramos entre estas muestras es la pureza. Como podemos observar la muestra de
Hb-D presenta bandas finas y claras mientras que la del precipitado presenta bandas más pronunciadas.
Esto nos lleva a pensar que en la última hay más presencia de sales, y como ya hemos comentado en
prácticas anteriores puede ser porque la muestra esté contaminada.
Comparando las prácticas anteriores, podemos observar qu ea concentración en la Hb-D es mayor.
Compara la masa molecular de la hemoglobina obtenida con la teórica y discútelo. ¿Se habría
obtenido el mismo resultado en ausencia de agente reductor en el tampón de carga?
Encontramos una diferencia notoria entre los valores de la masa molecular (64kDa) con la obtenida
(32,88). Esto se puede deber al reductor que se ha empleado, el b-mercaptoetanol, para desnaturalizar
las proteínas y romper los puentes disulfuro, con el objetivo de facilitar su análisis y separación mediante
técnicas como la electroforesis.
En caso de que no se hubiera utilizado el reductor, posiblemente, el valor real y el obtenido serían
próximos aunque no idénticos, pues otros factores como la forma y la carga neta de la proteína, que
pueden influir en su movilidad en el gel.
¿Qué contiene el extracto de cebolla? ¿Qué ocurre cuando se añade la proteasa?
El extracto de cebolla contiene SDS y DNA genómico de cebolla.
Añadir proteasas puede facilitar la purificación del DNA, mejorar la calidad de los resultados de la
electroforesis y eliminar interferencias causadas por proteínas residuales, lo que optimiza los análisis
posteriores. Aunque en nuestro caso, a tener una muestra tan limitada se podría perder o degradar
completamente el DNA.
23
¿El resultado de la muestra de DNA purificado es el esperado? Compáralo con el obtenido en la

práctica VIII.
Comparando el resultado de la electroforesis con lo obtenido en la práctica VIII, confirmamos que se ha

producido una contaminación de la muestra, cosa que ya sospechábamos
Se dispone de una muestra de BSA a 1 mg/ml y de un tampón de aplicación 5x. Si

queremos aplicar 5 µg de proteína en el gel de electroforesis, y sabiendo que el volumen máximo
que permite el pocillo es de 20 µl, ¿cómo prepararías la muestra?
Se sabe que la proteína P forma un trímero mediante puentes disulfuro intermoleculares. Se

obtiene una versión de la proteína sin cisteínas P-cys y se quiere saber si es capaz de
oligomerizar. ¿Lo puedes comprobar mediante PAGE-SDS?, ¿Cómo lo harías?
Mediante una electroforésis:
Primer pocillo: patrón – proteína P + tampón misglicina (no B-mercaeptoetanol para mantener cisteínas)
Segundo pocillo: proteína P + B-mercaeptoetanol + tampón misglicina
Tercer pocillo: proteína P (sin cisteínas) + PAGE-SDS
Sobservando el resultado, si coinciden las bandas del primer y tercer pocillo, la proteína si puede
oligomerizar (sin presencia de cisteínas).
24
Práctica VIII
CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNAS
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (2 páginas máximo)
1. Adjuntar los espectros de absorción de las muestras de DNA. Calcular la concentración original de
cada uno de ellos teniendo en cuenta la dilución realizada y la pureza según la proporción
A260/A280. Incluir estos resultados en la práctica III.
DNA CEBOLLA 1/10 DNA CEBOLLA ½ DNA SALMÓN
2. Adjuntar el espectro de la BSA. Calcular los coeficientes de extinción molar teórico y experimental.
25
ABS280 BSA
3. Adjuntar el espectro de la hemoglobina dializada. Calcular la concentración (molar y en mg/ml) de

la disolución original teniendo en cuenta que el coeficiente de extinción molar a esa longitud de onda
es 14000 M-1 x cm-1. Calcular la cantidad de hemoglobina recuperada tras la diálisis (mg). Incluir estos
resultados en la práctica IV.
26
4. Adjuntar los espectros de las distintas formas de la hemoglobina con la leyenda apropiada.
1) METAHB
2) OXIHB
3) DESOXIHB
27
¿Qué diferencias observas entre el espectro de absorción de DNA y el de BSA?
La principal diferencia que encontramos es que el DNA, muestra una absorbancia máxima alrededor de
260 nm mientras que el espectro de absorción de BSA muestra una absorbancia máxima en el rango de
280 nm.
De los coeficientes de extinción calculados para la BSA, ¿cuál es más fiable?
EL coeficiente más fiable es el teórico debido a que este puede ser erróneo simplemente por cálculos,
cosa que se puede solucionar con la repetición de las operaciones oportunas. Por otro lado el
experimental esta expuesto a otros fenómenos como son la contaminación o un pipeteo erróneo.
Compara los dos métodos y resultados utilizados en estas prácticas para calcular la concentración de
la hemoglobina dializada.
¿Los espectros de las formas de la hemoglobina son los esperados según la bibliografía?
Si, estos coinciden más o menos. Podemos ver unos picos similares:
La metaHb presenta picos en los 500nm
La deesoxiHb presenta picos en 555nm
La oxiHb presnta picos en 577 y 541nm
Teniendo en cuenta estos espectros, ¿la hemoglobina dializada en qué forma está?
Si observamos estos espectros, nuestra hemoglobina dialiazada está de la forma metahemoglobina, ya

que comparando ambos espectros podemos apreciar que tienen la misma forma
28
En una disolución que contiene dos compuestos (A y B) se determinaron, en una cubeta de

paso óptico de 1 cm, los valores de absorbancia a 340 nm y 260 nm, resultando 0.3 y 1.2
respectivamente. Teniendo en cuenta que ambos compuestos absorben a 260 nm, pero sólo el B
absorbe a 340 nm, calcula la concentración de cada uno de ellos en la disolución. Coeficientes de
extinción molar del compuesto A: ɛ260 = 18000 M–1 cm–1 y ɛ340 = 0 M–1 cm–1; Coeficientes de extinción
molar del compuesto B: ɛ260 = 15000 M–1 cm–1 y ɛ340 = 6220 M–1 cm–1.
29
Práctica IX
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA FOSFATASA ALCALINA
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (2 páginas máximo)
1. Calcular las velocidades iniciales de reacción para cada concentración de sustrato:
- Restar a cada serie (A, B, C o D) la absorbancia del control (Abscorr a 680nm).
30
- Representar Abscorr a 680nm frente a tiempo (min) para cada serie y ajustar los datos a una
recta.
31
- Calcular las v0, que serán las pendientes de las rectas en el tramo en el que se mantiene
la linealidad (u.a./min) y completar la tabla.
Conc. sustrato (mM) 1/Conc. sustrato (mM-1) V0 (u.a./min) 1/ V0 (u.a-1 x min)
1.00 1 0,2951 1/0,2951= 3,39
0.75 1/0,75= 1,33 0,2417 1/0,2417 = 4,14
0.50 1/0,5 = 2 0,1801 1/0,1801 = 5,55
0.25 1/0,25 = 4 0,1268 1/0,1268 = 7,89
2. Realizar la representación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]) y la de Lineweaver-Burk (1/v0

frente a 1/[S]) (1 página máximo)
Debido a una mala toma de datos, a contaminación o a algún factor externo, la gráfica tiene la
forma adecuada. Tendría que ser una gráfica logarítmica y no sale una recta. También podría ser
que los puntos que emos utilizado sean muy cercanos entre sí y por eso no llegamos a ver la zona
curva.
32
3. Obtener los valores de Vmax (u.a./min) y Km (mM) de cada representación.
Michaelis-Menten Lineweaver-Burk
Km 0,3462 0.6617
Vmáx 0,2951 0,4523
Evalúa la fiabilidad de los resultados obtenidos. ¿Cómo se podría mejorar?
En general los gráficos y resultados parecen ser fiables. No encontramos ningún dato que sea exagerado.
¿Qué representación es más fiable para obtener los parámetros cinéticos?
La representación más fiable es la de Lineweaver-burk, ya que esta trabaja los valores exactos de -1/km y
de 1/vmax, es decir, el punto donde la recta corta al eje de abcisas y el punto donde corta con el eje de
coordenadas, respectivamente.
¿Qué otras representaciones indirectas se podrían hacer?
Podríamos hacer la de Eadie-Hofstee consta de v/[S] en función de v, la de Hanes: [S] en función de [S]/v
y la de Scatchard: v en función de v/[S]. V representa la velocidad y [S] concentración de sustrato.
¿Cuáles son los sustratos naturales de esta enzima? ¿Por qué se emplea el FFDS para cuantificar
su actividad?
La fosfatasa es una enzima que actúa sobre ésteres monofosfóricos en sustratos naturales. Para
cuantificar su actividad, se utiliza el sustrato FFDS, que al ser hidrolizado por la enzima, libera fenol y
fosfato. El fenol generado reacciona con el reactivo de Folin, que inicialmente es de color amarillo,
produciendo un cambio de coloración que se puede medir colorimétricamente. Cuanto más tiempo esté
la enzima en contacto con el reactivo de Folin, mayor será la cantidad de fenol formado, lo que
proporciona una medida indirecta de la actividad enzimática.
33
7. TAREAS COMPLEMENTARIAS.
Para poder obtener los parámetros cinéticos kcat y kcat/Km de la fosfatasa alcalina en el
experimento realizado se debe expresar la velocidad en unidades de concentración molar de
producto por unidad de tiempo. Para ello, se ha realizado una recta patrón en las mismas
condiciones que el ensayo enzimático en la que se relaciona la concentración de fenol producida
en el volumen de ensayo (1.4 ml) con la absorbancia a 680 nm (figura adjunta. Sabiendo además
que la masa molecular del monómero de fosfatasa alcalina bovina es 70 kDa, calcula los
parámetros cinéticos mencionados.
34

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Prácticas de Bioquímica.

NOMBRE DEL ALUMNO Sergi Mollá Caballero

GRUPO DE TEORÍA 1A EQUIPO DE PRÁCTICAS 4A

PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES TAMPÓN

5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (1 página máximo)

1. Cálculos para obtener las cantidades de las sales a pesar.

PESO MOLECULAR GRAMOS

H2PO4K 136,09 4,22

HPO4K2 174,18 3,31

2. Resultados de volúmenes y pH obtenidos en el apartado de la comprobación de la capacidad

Vol. HCl añadido (ml)/pH Vol. NaOH añadido (ml)/pH

6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1/2 página máximo)

En la segunda parte de la práctica, ¿qué resultado se habría obtenido si el tampón estuviera a 10 mM

7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1 página máximo)

¿Cómo prepararías 400 ml de un tampón carbonato sódico 0.25 M, pH 9.5? Datos:

- pKa1= 3.77, pKa2= 10.2

EXTRACCIÓN DEL DNA GENÓMICO DE UN TEJIDO VEGETAL

5. CÁLCULOS Y RESULTADOS (1/2 página máximo)

1. Gramos de cebolla en los 10 ml utilizados para el aislamiento.

3. Relación A260/A280 según los resultados de la práctica VIII.

6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1 página máximo)

¿Por qué precipita el DNA cuando se encuentra en una disolución alcohólica?

¿Por qué se ve el DNA blanquecino?

¿Qué ocurre cuando el DNA se lava con etanol al 70%?

7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1/2 página máximo)

Se ha llevado a cabo una extracción de DNA de fresa, que ha sido resuspendido en 80 µl de

1. Calcula la concentración de la disolución de DNA original, y los µg totales de DNA extraído.

PRECIPITACIÓN Y DIÁLISIS DE PROTEÍNAS

IV-A. PRECIPITACIÓN SALINA DE PROTEÍNAS

5. CÁLCULOS Y RESULTADOS. (1 página máximo)

gr (NH4)2 SO4 para un grado de saturación del 85% 2,03g

2. Pon una imagen de los diferentes sobrenadantes y precipitados de la disolución de hemoglobina

SOBRENADANTE 1 SOBRENADANTE 2 SOBRENADANTE 3

6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1/2 página máximo)

7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1/2 página máximo)

5. CÁLCULOS Y RESULTADOS. (1 página máximo)

2. Resultado de la diálisis de colorantes:

Antes de dializar Tras dializar

COLOR Azul verdoso Azul claro

4. Concentración y cantidad de hemoglobina recuperada de la diálisis (práctica V).

6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1 página máximo)

¿Qué se consigue con la primera diálisis? ¿Por qué?

¿Qué se consigue con la diálisis de la hemoglobina? ¿Por qué?

¿Qué método alternativo a la diálisis podrías usar con el mismo propósito?

Podríamos utilizar la cromatografía de penetrabilidad.

¿Se ha recuperado toda la hemoglobina tras la diálisis?

En un caso idílico se recuperaría toda la hemoglobina.

Pero podría darse el caso en el que:

Algunas moléculas de hemoglobina escaparan a través de la membrana, debido a su pequeño tamaño o

Si la membrana no es completamente selectiva.

No se recuperaría la hemboglobina al 100%

7. TAREAS COMPLEMENTARIAS (1/2 página máximo)

Se dializan 5 ml de una disolución de albúmina en 1 M de NaCl frente a 1 litro de agua destilada.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE EL MÉTODO DE

1. Calcular la concentración en los 300 µl de las disoluciones de BSA (tubos 1-10).

2. Representar la CURVA DE CALIBRADO (en ordenadas las absorbancias y en abscisas las

3. Determinar la CONCENTRACION DE PROTEINA DE LA MUESTRA PROBLEMA: Interpolar los

4. Determinar la CONCENTRACION DE PROTEINA DE LAS FRACCIONES DE HEMOGLOBINA:

6. DISCUSIÓN Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA (1 página máximo)

¿Dirías que los resultados obtenidos son fiables?

¿Cómo podrías mejorar el ajuste de la curva de calibrado?

¿Por qué se hacen diluciones de las muestras problema?

-20 µl de S1 + 20 µl de tampón de carga (2x)