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En algunos casos, puede ser difícil hacer un recuento de colonias (por ejemplo cuando existan microorganismos con
capacidad invasiva). Las colonias invasivas se consideran como colonias únicas. Si hay menos de un cuarto de la placa
sobrecrecida por la invasión, las colonias se cuentan en la parte no afectada, y se calcula por extrapolación el número
teórico de colonias de la placa entera, deduciéndolo por extrapolación del número teórico que debería corresponder a la
placa entera. Si hay sobrecrecimiento en un área superior a un cuarto de la placa, se rechaza este recuento. Las colonias
dispuestas en forma de cadenas se consideran como una sola colonia.

NOTA En algunos casos, puede ser útil para el recuento mantener las placas inoculadas a (3 ± 2) C para poderlas comparar con las placas
inoculadas incubadas, para evitar que determinadas partículas del producto estudiado puedan confundirse con colonias. El uso de una lente
binocular de aumento también puede ayudar a distinguir las partículas del producto estudiado de las colonias.

En los distintos métodos de cálculo mostrados en el apartado 10.3.2, anexo B y anexo D, deben tenerse en cuenta los
casos especiales y la información aportada sobre los intervalos de confianza. En los diferentes métodos de cálculo,
deben tenerse en cuenta las placas que no contienen colonias, cuando se escojan dichas placas, porque estas placas son
significativas al ser calculada la media ponderada.

Cuando se haya utilizado un sembrador espiral, el recuento de colonias se realiza según se indica en el aparta-
do 10.2.4.3.3.

10.3.2 Expresión de los resultados

10.3.2.1 Generalidades

10.3.2.1.1 Los casos considerados en este apartado son casos generales:

– inoculación de una placa Petri de 90 mm de diámetro por cada dilución, realizando por lo menos dos diluciones
sucesivas;

– recuento máximo de colonias totales presentes: 300 por placa;

– número máximo total de colonias (típicas y atípicas) de una placa cuando se recuentan colonias típicas y colonias
sospechosas: preferiblemente 300 por placa;

– número máximo contable de colonias típicas o sospechosas: 150 por placa;

– número de colonias sospechosas inoculadas para su identificación o confirmación (véase 10.3.2.3) de cada placa
escogida: de forma general, 5.

Estos valores se definen en las normas específicas. Para los microorganismos que produzcan colonias grandes, el
número máximo de colonias en una placa se definen en las normas específicas.

Cuando se utilizan placas de un diámetro diferente a 90 mm, el número máximo de colonias debe aumentarse o
reducirse proporcionalmente al área de la superficie de las placas (o membranas).

EJEMPLO

– Para siembra en placas con un diámetro de 55 mm, el número máximo de colonias debe ser de 110 (equivalente a un recuento
total de 300 ufc en una placa Petri de 90 mm)

– Para siembra en placas con un diámetro de 140 mm, el número máximo de colonias debe ser de 730 (equivalente a un recuento
total de 300 ufc en una placa Petri de 90 mm)

10.3.2.1.2 Los métodos de cálculo indicados a continuación corresponden a los casos que se presentan con mayor
frecuencia cuando los análisis se realizan siguiendo unas buenas prácticas de laboratorio. Ocasionalmente, pueden
producirse excepciones (por ejemplo, que los factores de dilución de dos diluciones consecutivas sean diferentes), por
lo que resulta necesario que los resultados del recuento sean examinados e interpretados por un microbiólogo
cualificado, y en su caso, rechazados.
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10.3.2.2 Método de cálculo: caso general (recuento de colonias totales o colonias típicas)
Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de colonias se realice al menos en una
placa que contenga un mínimo de 10 colonias [colonias totales, colonias típicas o colonias que cumplan los criterios de
identificación (véase 10.3.2.3)].

El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula como la media ponderada de dos
diluciones consecutivas, utilizando la fórmula (1):

C
N (1)
V 1,1 d

donde

C es la suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de las dos diluciones consecutivas, de la
cuales al menos una de las placas contiene un mínimo de 10 colonias;

V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;

d es la dilución correspondiente a la primera dilución escogida [d = 1 cuando se utiliza el producto líquido sin
diluir (para muestras líquidas)].

Si se emplea más de una dilución, la proporción entre el recuento de colonias de la dilución d2 y el recuento de colonias
de la dilución d1 se espera que sea del 10%. Se debería especificar por parte del laboratorio los límites superior e
inferior para el recuento de la dilución d2. Estos límites pueden ser, por ejemplo, los propuestos en la Norma
[42]
ISO 14461-2, Cuando estos límites no se cumplen, los resultados deberían ser interpretados con precaución.

EJEMPLO Si el recuento de colonias de la dilución d1 es de 250, el recuento de colonias de la dilución d2 no debería ser menor de
13 (5,2%) no mayor de 39 (15,6%). Véase la Norma ISO 14461-2.[42]

El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando se realiza esta operación, si la tercera cifra es
inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la tercera cifra es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en
una unidad.

Preferiblemente, el resultado se expresa como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, o
como un número entero con dos cifras significativas.

El resultado se expresa como número de microorganismos N por mililitro (para los productos líquidos) o por gramo
(para el resto de productos).

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2): 168 colonias;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 14 colonias;

C 168 14 182
N 16 545
V 1,1 d 2 0, 011
1 1,1 10

Redondeando el resultado como se indicó anteriormente, el número de microorganismos es de 17 000 o 1,7 104 por
mililitro o por gramo de producto.
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10.3.2.3 Método de cálculo: después de la identificación

Cuando el método utilizado requiere identificación, se identifica un número determinado A de colonias sospechosas
(generalmente 5) de cada placa escogida para el recuento de colonias. Tras la identificación, se calcula el número de
colonias de cada placa, a, que cumplen los criterios de identificación, utilizando la fórmula (2):

b
a C (2)
A

donde

b es el número de colonias que cumplen los criterios de identificación dentro de las colonias identificadas A;

C es el número total de colonias sospechosas contadas en cada placa.

El resultado calculado se redondea al número entero más próximo. Cuando se realiza esta operación, si la primera cifra
decimal es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la primera cifra decimal es igual o superior a 5, la cifra
anterior se incrementa en una unidad.

El número de microorganismos identificados o confirmados N, NE o N' presentes en la muestra para análisis se calcula
reemplazando C por a en la fórmula indicada en el apartado 10.3.2.2 o reemplazando C por a en la fórmula indicada
en el apartado 10.3.2.4.1 y 10.3.2.5.3. El resultado se redondea como se indica en el apartado 10.3.2.2.

El resultado se expresa según se indica en al apartado 10.3.2.2, 10.3.2.4.1 y 10.3.2.5.3, respectivamente.

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-3): 66 colonias;
– para la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias.

Realizando el análisis de las colonias escogidas:

– de las 66 colonias, se analizaron 8, de las que 6 cumplieron los criterios; por consiguiente a = 50;
– de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por consiguiente a = 4.

a 50 4 54
N 49 090
V 1,1 d 1 1,1 10 3
1,1 10 3

Redondeando el resultado como se indicó en el apartado 10.3.2.2, el número de microorganismos es de 49 000 o

4,9 104 por mililitro o por gramo de producto.

10.3.2.4 Método de cálculo: recuento bajo

10.3.2.4.1 Caso en el que una placa (de la muestra para análisis o suspensión inicial o primera dilución)
contiene menos de 10 colonias
El intervalo óptimo de precisión corresponde a un recuento de entre 10 y el límite superior de cada método. Por otra parte,
la precisión disminuye rápidamente al reducirse el número de colonias por debajo de un valor de 10. Sin embargo, en
función del objetivo del análisis, se puede definir un límite de determinación inferior basado en un recuento inferior a 10.

Conforme al Informe Técnico ISO/TR 13843,[40] la definición del límite de determinación es: “la concentración media
de partículas más baja x por porción analítica para la que la incertidumbre estándar relativa esperada es igual a un valor
definido (RSD)”. Actualmente se prefiere el término “coeficiente de variación” a RSD. El coeficiente de variación, CV
es calculado dividiendo la desviación estándar estimada s de la población de una muestra entre la media x para esa
muestra. Por tanto, CV s x .
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 38 -

Para una distribución de Poisson, x se calcula mediante la fórmula (3):

1
x (3)
CV2

Si CV se establece como el límite de precisión relativa aceptable al 50% (lo que parece ser razonable en microbiología),
el límite inferior de determinación será el número de colonias obtenido mediante la fórmula:

1
x 2
4
0,50

Por consiguiente, los resultados basados en recuentos inferiores a 4 deberían considerarse como simple detección de la
presencia del microorganismo.

En resumen:

Si la placa contiene menos de 10 colonias, pero como mínimo cuatro, el resultado se calcula siguiendo la siguiente
fórmula:

C
NE
V d

y se expresa como número estimado NE de microorganismos x por mililitro (productos líquidos) o por gramos (resto de
productos).

NOTA El término “número estimado” significa una estimación menos precisa del valor verdadero.

Si el resultado total oscila entre 1 y 3, la precisión del análisis es demasiado baja y el resultado debe expresarse como:

“Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 4/Vd por gramo o ml”.

10.3.2.4.2 Caso en el que la placa (de la muestra para análisis, suspensión inicial o primera dilución) no
contiene colonias
Si la placa que contiene la muestra para análisis (productos líquidos) o la suspensión inicial (resto de productos), o la
primera dilución inoculada o escogida no contiene colonias, el resultado se expresa de la siguiente manera:

“menos de 1/Vd microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o

“menos de 1/Vd microorganismos por gramo” (resto de productos).

donde

d es el factor de dilución de la suspensión inicial, o de la primera dilución inoculada o escogida (d = 100 = 1

cuando se inocula directamente la muestra para análisis);

V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa en mililitros.

10.3.2.4.3 Casos especiales

10.3.2.4.3.1 Generalidades
Estos casos afectan al recuento de colonias típicas o sospechosas.
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10.3.2.4.3.2 Caso 1
Si el número de colonias típicas y atípicas de la placa que contiene la primera dilución d1 es mayor de 300 (o de otra
cantidad establecida en la norma específica), con colonias confirmadas o colonias típicas visibles, y si la placa de la
siguiente dilución d2 contiene hasta 300 colonias (u otra cantidad establecida en la norma específica), sin colonias
típicas o confirmadas visibles, el resultado se expresa de la siguiente manera:

“menos de 1/V2d2 y más de 1/V1d1 microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o

“menos de 1/V2d2 y más de 1/V1d1 microorganismos por gramo” (resto de productos).

donde

d1 y d2 son los factores de dilución correspondientes a las diluciones d1 y d2;

V1 es el volumen de inóculo utilizado en la placa de la primera dilución d1 en mililitros;

V2 es el volumen de inóculo utilizado en la placa de la subsiguiente dilución d2 en mililitros.

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2): más de 300 colonias en la placa, con colonias típicas o confirmadas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 33 colonias, sin colonias típicas o confirmadas;

El resultado, expresado en número de microorganismos, es inferior a 1 000 y superior a 100 por mililitro o por gramo
de producto.

10.3.2.4.3.3 Caso 2
Si el número de colonias típicas y atípicas de la placa que contiene la primera dilución d1 es mayor de 300 (o de otra
cantidad establecida en la norma específica), sin colonias confirmadas o colonias típicas visibles, y si la placa de la
siguiente dilución d2 contiene hasta 300 colonias (u otra cantidad establecida en la norma específica), sin colonias
confirmadas o típicas visibles, el resultado se expresa de la siguiente manera:

“menos de 1/V2d2 microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o

“menos de 1/V2d2 microorganismos por gramo” (resto de productos).

donde

d2 es el factor de dilución correspondiente a la dilución d2;

V2 es el volumen de inóculo utilizado en la placa de la subsiguiente dilución d2 en mililitros.

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2): más de 300 colonias en la placa, sin colonias típicas o confirmadas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 33 colonias, sin colonias típicas o confirmadas;

El resultado, expresado en número de microorganismos, es inferior a 1 000 por mililitro o por gramo de producto.

10.3.2.5 Método de cálculo: casos especiales

NOTA 1 Algunos ejemplos no cumplen con las reglas del apartado 10.3.2.2 en el cual se especifican los límites superior e inferior de recuento de
colonias de la dilución d2 comparados con los resultados de la dilución d1. Si la repetición del análisis no es posible o apropiado, los
resultados se pueden calcular y se expresan como se indica en el apartado 10.3.2.2 pero la precisión es menor que en una situación normal
y esto debería indicarse en el informe de resultados.
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 40 -

NOTA 2 Todas las descripciones y ejemplos se realizan para el caso en el que se utiliza una placa Petri por dilución. En el caso de utilizar dos
placas por dilución véase el anexo D.

NOTA 3 El límite inferior de recuento de colonias de la dilución d2 propuesto en los ejemplos se toma de la Norma ISO 14461-2.[42]

NOTA 4 Las cifras de los intervalos de confianza deberían adaptarse a los números máximos especificados para el recuento de colonias.

10.3.2.5.1 Si el número de colonias del recuento (colonias totales, colonias típicas o colonias sospechosas) en la placa
que contiene la primera dilución d1 es superior al número máximo contable (300 o a otra cantidad establecida en la
norma específica), mientras que el número de colonias (colonias totales, colonias típicas o colonias que cumplen los
criterios de identificación) en la placa que contiene la siguiente dilución d2 es inferior a 10 (límite inferior de recuento),
el resultado se expresa de la siguiente manera:

NOTA Los contenidos de este punto se expresan como ejemplo

a) si el número de colonias de la placa que contiene la dilución d1 está incluido entre el intervalo [número máximo
contable más 1, límite superior del intervalo de confianza para el número máximo de colonias contables] (por
ejemplo 301-334 (véase el anexo B) y el recuento de colonias de la dilución d2 no es menor que el límite inferior
especificado en el apartado 10.3.2.2, se utiliza el método de cálculo del caso general (véase 10.3.2.2);

EJEMPLO 1 El recuento (cuando se ha establecido para el recuento de colonias el número máximo de 300) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): 310 colonias (menor de 334, límite superior para el intervalo de confianza
de 300);
– para la segunda dilución escogida (10-3): 8 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 18 colonias, establecido a partir de las 310 colonias de la dilución (10-2).

El resultado de este recuento no es aceptable.

EJEMPLO 2 El recuento (cuando se ha establecido para el recuento de colonias el número máximo de 150) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): 160 colonias (menor de 174, límite superior para el intervalo de confianza
de 150);
– para la segunda dilución escogida (10-3): 8 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 7 colonias, establecido a partir de las 160 colonias de la dilución (10-2).

Se utiliza el método de cálculo de los casos generales (véase 10.3.2.2) utilizando las placas de las dos diluciones
escogidas.

b) si el número de colonias de la placa que contiene la dilución d1 es mayor que el límite superior del intervalo de
confianza para el número máximo contable (por ejemplo 334) y el recuento de colonias de la dilución d2 no es
menor que el límite inferior especificado en el apartado 10.3.2.2 y calculado a partir del límite superior del intervalo
de confianza para el número máximo contable, se considera el resultado del recuento de la dilución d2 y se calcula
un recuento estimado (véase 10.3.2.4.1).

EJEMPLO 1 El recuento (para el que se ha establecido un número máximo de recuento de colonias de 300) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): más de 334 colonias en la placa;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 9 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 20 colonias, establecido a partir de las 334 colonias de la dilución 10-2.

El resultado de este recuento no es aceptable.

 - 41 - ISO 7218:2007/Amd.1:2013

EJEMPLO 2 El recuento (para el que se ha establecido un número máximo de recuento de colonias de 150) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): más de 174 colonias en la placa;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 9 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de ocho colonias, establecido a partir de las 174 colonias de la dilución 10-2.

El recuento estimado se expresa en función de las colonias contadas en la placa de la dilución de 10-3 (véa-
se 10.3.2.4.1).

EJEMPLO 3 El recuento (para el que se ha establecido un número máximo de recuento de colonias de 150) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): más de 174 colonias en la placa;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 5 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de ocho colonias, establecido a partir de las 174 colonias de la dilución 10-2.

El resultado de este recuento no es aceptable.

10.3.2.5.2 Si el recuento de colonias (colonias totales, colonias típicas y colonias sospechosas) en todas las placas de
todas las diluciones inoculadas es mayor de 300 (u otra cantidad establecida en la norma específica), el resultado se
expresa de la siguiente manera:

“más de 300/Vd” (para el caso de colonias totales o colonias típicas); o

“más de (300/Vd) x (b/A)” (para colonias confirmadas), expresado en microorganismos por mililitro (productos líquidos) o
microorganismos por gramo (resto de productos).

donde

d es el factor de dilución correspondiente a la última dilución inoculada;

V es el volumen de inóculo incluido en cada placa, en mililitros;

b es el número de colonias que cumplen los criterios de identificación dentro de las colonias sospechosas A.

10.3.2.5.3 Si únicamente la placa correspondiente a la última dilución inoculada contiene más de 10 colonias y menos
de 300 colonias (colonias totales, colonias típicas o colonias sospechosas) (u otra cantidad establecida en la norma
específica), el número de microorganismos presentes N' se calcula utilizando la fórmula (4):

c
N (4)
V d

donde

c es el número de colonias contadas en la placa;

V es el volumen de inóculo incluido en cada placa, en mililitros;

d es la dilución correspondiente a la dilución escogida.

El resultado se redondea según se indica en el apartado 10.3.2.2.

El resultado se expresa como número de microorganismos N' por mililitro (para los productos líquidos) o por gramo
(para el resto de productos).
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 42 -

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la última dilución inoculada (10-4): 120 colonias;

Entonces

120
N 1 200 000
4
1 10

Redondeando el resultado como se indicó en el apartado 10.3.2.2, el número de microorganismos N' es de 1 200 000 o
1,2 106 por mililitro o por gramo de producto.

10.3.2.6 Medida de la incertidumbre

Para las determinaciones cuantitativas, véase la Especificación Técnica ISO/TS 19036.

10.4 Recuento de levaduras y mohos

10.4.1 Generalidades
El recuento de las levaduras y los mohos debería realizarse normalmente mediante la técnica de siembra en
profundidad, que permite un recuento más sencillo o mediante la técnica de siembra en superficie, que proporciona la
máxima exposición de las células al oxígeno atmosférico y evita el estrés térmico del agar fundido. Las placas
previamente vertidas deberían secarse antes de inocularse (véase la Especificación Técnica ISO 11133).

Algunos mohos y levaduras pueden ser infecciosos o inducir respuestas alérgicas, a veces incluso en individuos sanos.
Por consiguiente, es importante ser razonablemente cuidadoso cuando se trabaje con ellos. Idealmente, las placas
deberían mantenerse en los incubadores, no en una sala abierta. Las tapas de las placas deberían abrirse con la menor
frecuencia posible, normalmente sólo con objetivos esenciales, como por ejemplo la realización de preparaciones para
el análisis microscópico. Las agujas flameadas deberían enfriarse antes de realizar las transferencias, para evitar la
dispersión de conidia y de otras células. Las mesas de trabajo y los incubadores deberían desinfectarse rutinariamente.

Las placas Petri deberían incubarse en posición no invertida y en reposo hasta que estén listas para el recuento, ya que
el movimiento puede ocasionar la liberación de conidia o de esporas y el subsiguiente desarrollo de colonias satélites,
que ocasionarían una sobreestimación de la población.

10.4.2 Recuento de colonias de levaduras y mohos

Se suelen contar placas con un número de colonias de entre 10 y 150. Si la micoflora está compuesta principalmente de
mohos, se seleccionan las placas dentro del intervalo de recuentos más bajos; si la micoflora consiste fundamentalmente
en levaduras, pueden seleccionarse las placas que contienen hasta el límite superior de recuento.

Si la identidad de las colonias es dudosa, se examinan preparaciones húmedas o teñidas de células procedentes de un
mínimo de cinco colonias por muestra para confirmar que no hay bacterias presentes.

10.5 Recuento mediante el uso de un medio líquido

10.5.1 Principio
Se inoculan las porciones de análisis en un medio líquido diseñado para permitir el crecimiento de un microorganismo o
un grupo de microorganismos determinados, y que normalmente inhibe la proliferación de los demás microorganismos.

Pueden utilizarse distintos criterios para determinar si se ha producido crecimiento de los microorganismos estudiados,
como por ejemplo la detección visual de la turbidez, la producción de gas, los cambios de color o el posterior
aislamiento de los microorganismos en un medio de agar selectivo con la atmósfera y temperatura adecuada. La
composición del medio de cultivo y los criterios con los que discriminar entre un resultado positivo o negativo se
definen en las normas correspondientes.
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 66 -

Anexo D (Normativo)

Recuento de colonias con dos placas por dilución

D.1 Introducción
Este anexo especifica los casos de cálculo y la expresión de resultados para el recuento con dos placas por dilución.

Son aplicables todos los requisitos y recomendaciones especificadas en el apartado 10.3.

Se describen en este anexo únicamente los puntos diferentes o aquellos necesarios para su comprensión.

D.2 Recuento de colonias

Son aplicables los requisitos y recomendaciones especificadas en el apartado 10.3.1 y apartado 10.3.2.1.1.

Después del período de incubación establecido en la norma específica, se cuentan las colonias (colonias totales,
colonias típicas o colonias sospechosas) de cada placa que contenga hasta 300 colonias (u otra cantidad, establecida en
la norma específica).

En este apartado, los casos tratados corresponden a los siguientes casos generales:

– inoculación de una2) placa Petri de 90 mm de diámetro por cada dilución, realizando por lo menos dos diluciones
sucesivas;

– recuento máximo de colonias totales presentes: 300 por placa;

– número máximo total de colonias (típicas y atípicas) de una placa cuando se recuentan colonias típicas y colonias
sospechosas: preferiblemente 300 por placa;

– número máximo contable de colonias típicas o sospechosas: 150 por placa;

– número de colonias sospechosas inoculadas para su identificación o confirmación (véase el capítulo D.4) de cada
placa escogida: de forma general, 5.

Estas cifras se definen en las normas específicas.

Los métodos de cálculo indicados a continuación corresponden a los casos que se presentan con mayor frecuencia
cuando los análisis se realizan siguiendo unas buenas prácticas de laboratorio. Ocasionalmente, pueden producirse
excepciones (por ejemplo, que el número de colonias de dos placas de la misma dilución pueda mostrar una
discrepancia significativa o que la proporción del factor de dilución empleado para dos diluciones consecutivas sea muy
diferente), por lo que resulta necesario que los resultados del recuento sean examinados e interpretados por un
microbiólogo cualificado, y en su caso, rechazados.

D.3 Método de cálculo: caso general (recuento de colonias totales o colonias típicas)
Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de colonias se realice al menos en una
placa que contenga un mínimo de 10 colonias [colonias totales, colonias típicas o colonias que cumplan los criterios de
identificación (véase el capítulo D.4)].

2) NOTA NACIONAL: En el original se indica una placa por error, dado que debería indicar dos placas Petri.
 - 67 - ISO 7218:2007/Amd.1:2013

Si se utilizan dos placas Petri por dilución, la proporción entre el recuento de colonias de la primera placa y el recuento
de colonias de la segunda placa debería ser igual a 1

Se recomienda que el laboratorio especifique límites para el recuento de colonias de la segunda placa.

Estos límites pueden ser los descritos en la Norma ISO 14461-2.[42]

El resultado debe ser interpretado con precaución cuando no se respeten estos límites.

EJEMPLO 1 Si el recuento de colonias de la primera placa, con el recuento más alto, es de 250, el recuento de colonias de la
segunda placa, con el recuento inferior, no debería ser inferior a 196 (véase la Norma ISO 14461-2[42]).

Son aplicables las recomendaciones en la proporción entre el número de colonias contadas en la dilución d1 y d2
(apartado 10.3.2.2).

Se calcula el número N de microorganismos presentes en la muestra analizada como la media ponderada de las dos
diluciones sucesivas utilizando la fórmula (D.1):

C
N (D.1)
V n1 0,1 n 2 d

donde
C es la suma de las colonias contadas en todas las placas escogidas de las dos diluciones consecutivas, de la
cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias;
V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;
n1 es el número de placas escogidas de la primera dilución;
n2 es el número de placas escogidas de la segunda dilución;
d es la dilución correspondiente a la primera dilución escogida [d = 1 cuando se utiliza el producto líquido sin
diluir (para muestras líquidas)].

El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando se realiza esta operación, si la tercera cifra es
inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la tercera cifra es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en
una unidad.

Preferiblemente, el resultado se expresa como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, o
como un número entero con dos cifras significativas.

El resultado se expresa como:

– número de microorganismos N por mililitro (para los productos líquidos) o por gramo (para el resto de productos).

EJEMPLO 2 El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2): 168 y 215 colonias;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 14 y 25 colonias;

C 168 215 14 25 422

N 19182
V n1 0,1 n 2 d 2 0, 022
1 2 (0,1 2) 10

Redondeando el resultado como se indicó anteriormente, el número de microorganismos es de 19 000 o 1,9 104 por
mililitro o por gramos de producto.
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 68 -

D.4 Método de cálculo: después de la identificación o confirmación

Cuando el método utilizado requiere identificación o confirmación, se identifica un número determinado A de colonias
sospechosas (generalmente 5) de cada una de las placas escogidas para el recuento de colonias. Tras la identificación o
confirmación, se calcula, para cada una de las placas, el número de colonias, a, que cumplen los criterios de
identificación, utilizando la fórmula (D.2):

b
a C (D.2)
A

donde

b es el número de colonias que cumplen los criterios de identificación o confirmación dentro de las colonias
inoculadas A;

C es el número total de colonias sospechosas contadas en cada placa.

El resultado calculado se redondea al número entero más próximo. Cuando se realiza esta operación, si la primera cifra
decimal es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la primera cifra decimal es igual o superior a 5, la cifra
anterior se incrementa en una unidad.

El número de microorganismos identificados o confirmados N, NE o N' presentes en la muestra para análisis se calcula
reemplazando C por a en la fórmula indicada en el apartado D.3, D.5.1 y D.7.3 respectivamente.

El resultado se redondea como se indica en el apartado D.3.

El resultado se expresa según se indica en al apartado D.3, D.5.1 y D.7.3, respectivamente.

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-3): 66 y 80 colonias;
– para la segunda dilución escogida (10-4): 4 y 7 colonias.

Realizando el análisis de las colonias escogidas:

– de las 66 colonias, se analizaron 8, de las que 6 cumplieron los criterios; por consiguiente a = 50;
– de las 80 colonias, se analizaron 9, de las que 6 cumplieron los criterios; por consiguiente a = 53;
– de las 7 colonias, se analizaron 5, de las que 4 cumplieron los criterios; por consiguiente a = 6;
– de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por consiguiente a = 4.

a 50 53 6 4 113
N 3
51 364
V n1 0,1 n 2 d 1 2 0,1 2 10 0,0022

Redondeando el resultado como se indicó en el apartado D.3, el número de microorganismos es de 51 000 o 5,1 104
por mililitro o por gramo de producto.

D.5 Método de cálculo: recuentos estimados

D.5.1 Caso en el que las dos placas (muestra para análisis o suspensión inicial o primera dilución) contienen
menos de 10 colonias
Se aplican los requisitos y recomendaciones del apartado 10.3.2.4.1 relativas al límite inferior de determinación.
 - 69 - ISO 7218:2007/Amd.1:2013

Si cada una de las dos placas de la muestra analizada (productos líquidos) o de la suspensión inicial (otros productos), o de
la primera dilución inoculada o escogida, contiene menos de 10 colonias (colonias totales, colonias típicas o colonias que
cumplen con el criterio de identificación o confirmación) y las dos placas en conjunto contienen al menos 4 colonias, se
calcula el número estimado de microorganismos NE presentes en la muestra analizada como la media aritmética de las
colonias contadas en las dos placas utilizando la fórmula (D.3):

C
NE (D.3)
Vnd

donde

C es la suma de las colonias contadas en las dos placas;

V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;

n es el número de placas escogidas (en este caso, n = 2);

d es la dilución correspondiente a la suspensión inicial o a la primera dilución inoculada o escogida [d = 1

cuando se utiliza en el producto líquido sin diluir (para muestras líquidas)].

Se redondea el resultado acorde a lo recomendado en el apartado D.3.

Se expresa el resultado como sigue:

– NE Número estimado de microorganismos por mililitro (productos líquidos) o por gramo (otros productos).

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2) se han contado 8 y 9 colonias;

8 9 17
NE 850
2 0, 02
1 2 10

Redondeando el resultado como se indicó en el apartado D.3, el número estimado NE de microorganismos es de 850 o
8,5 102 por mililitro o por gramo de producto.

D.5.2 Caso en el que las dos placas (muestra para análisis o suspensión inicial o primera dilución) no contienen
colonias
Si las dos placas de la muestra analizada (productos líquidos) o de la suspensión inicial (otros productos), o de la primera
dilución inoculada o escogida no contiene ninguna colonias, expresar el resultado como:

“menos de 1/Vd microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o por gramo (otros productos);

donde

V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa en mililitros.

d es el factor de dilución de la suspensión inicial o de la primera dilución inoculada o escogida [d=1 cuando se
utiliza un producto líquido sin diluir (muestra analizada), d = 0,1, cuando se utiliza la dilución 10-1, etc.]
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 70 -

D.6 Casos especiales

D.6.1 Si el número de colonias típicas y atípicas de las dos placas que contienen la primera dilución d1 es mayor de 300
(o de otra cantidad establecida en la norma específica), con colonias confirmadas o colonias típicas visibles, y si las dos
placas de la siguiente dilución d2 contiene hasta 300 colonias (u otra cantidad establecida en la norma específica), sin
colonias típicas o confirmadas visibles, el resultado se expresa de la siguiente manera:

“menos de 1/V2d2 y más de 1/V1d1 microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o por gramo (resto de
productos).

donde
V1 y V2 es el volumen de inóculo utilizado en cada placa de cada dilución d1 y d2 en mililitros;
d1 y d2 son los factores de dilución.

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2): más de 300 colonias en cada una de las dos placas, con colonias típicas o
confirmadas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 33 y 35 colonias, sin colonias típicas o confirmadas;

El resultado, expresado en número de microorganismos, es inferior a 1 000 y superior a 100 por mililitro o por gramo
de producto.

D.6.2 Si el número de colonias típicas y atípicas de las dos placas que contienen la primera dilución d1 es mayor de 300
(o de otra cantidad establecida en la norma específica), sin colonias confirmadas o colonias típicas visibles, y si las dos
placas de la siguiente dilución d2 contiene hasta 300 colonias (u otra cantidad establecida en la norma específica), sin
colonias confirmadas o típicas visibles, el resultado se expresa de la siguiente manera:

menos de 1/V2d2 microorganismos por mililitro (productos líquidos) o por gramo (resto de productos).

donde
V2 es el volumen de inóculo utilizado en cada placa de la subsiguiente dilución d2 en mililitros.
d2 es el factor de dilución.

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la primera dilución escogida (10-2): más de 300 colonias en cada una de las dos placas, sin colonias típicas o
confirmadas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 33 y 35 colonias, sin colonias típicas o confirmadas;

El resultado, expresado en número de microorganismos, es inferior a 1 000 por mililitro o por gramo de producto.

D.7 Método de cálculo: casos especiales

Se aplican los requisitos y recomendaciones del apartado 10.3.2.5.

D.7.1 Si el número de colonias del recuento (colonias totales, colonias típicas o colonias sospechosas) en las dos placas
que contienen la primera dilución d1 es superior al número máximo contable (300 o a otra cantidad establecida en la
norma específica), mientras que el número de colonias (colonias totales, colonias típicas o colonias que cumplen los
criterios de identificación) en las dos placas que contienen la siguiente dilución d2 es inferior a 10 (límite inferior de
recuento), el resultado se expresa de la siguiente manera:

NOTA Los contenidos de este punto se expresan como ejemplo.

 - 71 - ISO 7218:2007/Amd.1:2013

c) si el número de colonias de las dos placas que contienen la dilución d1 está incluido entre el intervalo [número
máximo contable más 1, límite superior del intervalo de confianza para el número máximo de colonias contables]
(por ejemplo 301 a 324 (véase el anexo B) y el recuento de colonias para las dos placas de la dilución d2 no es
menor que el límite inferior especificado en el apartado 10.3.2.2, se utiliza el método de cálculo del caso general
(véase el capítulo D.3);

EJEMPLO 1 El recuento (cuando se ha establecido para el recuento de colonias el número máximo de 300) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): 310 y 322 colonias (menor de 324, límite superior para el intervalo de
confianza de 300);
– para la segunda dilución escogida (10-3): 8 y 12 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la
dilución (10-3) es de 18 y 19 colonias, establecidos a partir de las 310 y 322 colonias de la dilución (10-2).
El resultado de este recuento no es aceptable.

EJEMPLO 2 El recuento (cuando se ha establecido para el recuento de colonias el número máximo de 150) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): 151 y 160 colonias (menor de 167, límite superior para el intervalo de
confianza de 150);
– para la segunda dilución escogida (10-3): 8 y 9 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 6 y 7 colonias, establecido a partir de las 151 y 160 colonias de la dilución (10-2).
Se utiliza el método de cálculo de los casos generales (véase el capítulo D.3) utilizando las placas de las dos diluciones
escogidas.

d) si el número de colonias de la placa3) que contiene la dilución d1 es mayor del límite superior del intervalo de
confianza para el número máximo contable (por ejemplo 324) y el recuento de colonias de la dilución d2 para las dos
placas no es menor que el límite inferior especificado en el apartado 10.3.2.2 y calculado a partir del límite superior
del intervalo de confianza para el número máximo contable, se considera únicamente el resultado del recuento de la
dilución d2 y se calcula un recuento estimado (véase D.5.1).

EJEMPLO 3 El recuento (para el que se ha establecido un número máximo de recuento de colonias de 300) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): más de 324 colonias en cada una de las dos placas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 7 y 9 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 19 colonias, establecido a partir de las 324 colonias de la dilución 10-2.
El resultado de este recuento no es aceptable.

EJEMPLO 4 El recuento (para el que se ha establecido un número máximo de recuento de colonias de 150) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): más de 164 colonias en las dos placas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 8 y 9 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 8 colonias, establecido a partir de las 167 colonias de la dilución 10-2.
El recuento estimado se expresa en función de las colonias contadas en las dos placas de la dilución de 10-3 (véase
D.5.1).

EJEMPLO 5 El recuento (para el que se ha establecido un número máximo de recuento de colonias de 150) ha proporcionado los
siguientes resultados:
– para la primera dilución escogida (10-2): más de 167 colonias en las dos placas;
– para la segunda dilución escogida (10-3): 5 y 7 colonias. El límite inferior para el recuento de colonias de la dilución
(10-3) es de 8 colonias, establecido a partir de las 167 colonias de la dilución 10-2.
El resultado de este recuento no es aceptable.

3) NOTA NACIONAL: En el original se indica por error la placa, cuando debería decir "las placas que contienen".
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 - 72 -

D.7.2 Si el recuento de colonias (colonias totales, colonias típicas y colonias sospechosas) en todas las placas de todas
las diluciones inoculadas es mayor de 300 (u otra cantidad establecida en la norma específica), el resultado se expresa
de la siguiente manera:

“más de 300/Vd” (para el caso de colonias totales o colonias típicas); o

“más de (300/Vd) x (b/A)” (para colonias confirmadas), expresado en microorganismos por mililitro (productos líquidos) o
microorganismos por gramo (resto de productos).

donde

d es el factor de dilución correspondiente a la última dilución inoculada;

V es el volumen de inóculo incluido en cada placa, en mililitros;

b es el número de colonias que cumplen los criterios de identificación dentro de las colonias sospechosas A.

D.7.3 Si únicamente las dos placas correspondientes a la última dilución inoculada es contable y contienen hasta
300 colonias (colonias totales, colonias típicas o colonias sospechosas) (u otra cantidad establecida en la norma
específica), el número de microorganismos presentes N' se calcula como media aritmética de las colonias contadas en
las dos placas utilizando la fórmula (D.4):

C
N (D.4)
V n d

donde

C es la suma de las colonias contadas en las dos placas, donde al menos una contiene un mínimo de 10
colonias;

V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;

n es el número de placas escogidas (en este caso, n = 2);

d es la dilución correspondiente a la dilución escogida.

El resultado se redondea según se indica en el apartado D.3.

El resultado se expresa como:

– Número de microorganismos N' por mililitro (para los productos líquidos) o por gramo (para el resto de productos).

EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

– para la última dilución inoculada (10-4): 120 y 130 colonias;

120 130 250

N 1 250 000
4 0, 000 2
1 2 10

Redondeando el resultado como se indicó en el apartado D.3, el número de microorganismos N' es de 1 300 000 o
1,3 106 por mililitro o por gramo de producto.