UD 10 CULTIVOS CELULARES

INTRODUCCIÓN
DEFINICIÓN
Es el conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células eucariotas de
organismos pluricelulares in vitro, en medios de cultivo artificiales en condiciones controladas, preservando
al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES
Es donde se produce el crecimiento de células en medios de cultivo artificiales, en condiciones
controladas.
EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO
1.- Cabina de seguridad biológica
Consta de los siguientes elementos:

Consta además de luz UV germicida interior y luz fluorescente para iluminar área de trabajo.
La cabina de bioseguridad recomendada para trabajar con cultivos celulares es la cabina de
flujo laminar vertical de clase II. Previene la contaminación del cultivo, y protege al trabajador y al
medio ambiente. En ella se realizan todos los procesos y manipulaciones de cultivos celulares:
preparación del medio de cultivo, siembra de cultivos, cambios de medio, subcultivos…
2.- Incubador de CO2
Proporciona las condiciones ambientales óptimas para el crecimiento de las células en el
medio de cultivo. Permite el control de la temperatura, la concentración de CO2 en la atmósfera, y
el control de humedad relativa del ambiente. Las células de mamífero en cultivo (tipo de cultivo
celular habitual), que crecen en monocapa, requieren un incubador sin agitación, regulado a 37°C,
con 5% de CO2 y con ambiente húmedo al 95%.
3.- Equipo de criogenia
Permite conservar a largo plazo y en forma viable muestras de células y líneas celulares
mediante congelación. El equipo de criogenia mínimo está constituido por un tanque o depósito de
nitrógeno líquido.
4.- Microscopio invertido
Su estructura está invertida con respecto a los microscopios convencionales. Tienen la fuente
de luz en la parte superior. Se usa para ver las células en crecimiento sin realizar ningún tratamiento
previo. Lo ideal es trabajar con un microscopio invertido de fluorescencia y con contraste de fases.

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 EQUIPAMIENTO COMÚN
1. Equipo de esterilización
Para trabajar con cultivos celulares es imprescindible la esterilidad de todo el material y de
los reactivos que estén en contacto con los cultivos. Para la estirilización del material utilizamos el
autoclave, para esterilizar soluciones y reactivos se utilizan sistemas de filtración que tienen filtros
con un tamaño de poro de 0,22 pm, que retienen la mayoriá de los posibles contaminantes.
2. Sistema de purificación de agua
El agua utilizada para preparar reactivos, soluciones y medios de cultivos tiene que ser
ultrapura y estéril. Agua ultrapura tipo I.
3. Neveras y congeladores de -20ºc y -80ºC
Necesarios para conservar a las temperaturas adecuadas los diferentes reactivos empleados
en el laboratorio.
ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES
La prevención de la contaminación condiciona la estructura de los laboratorios de cultivos
celulares. Siempre que se pueda, se favorece la separación física de áreas. En cada una se
desarrollarán unas actividades específicas. Estas áreas son:
a) RECEPCIÓN DE MUESTRAS Y MATERIAL
b) LAVADO Y ESTERILIZADO DE MATERIAL
• esterilización de medios y reactivos
• lavado, esterilización y preparación del material
c) PREPARACIÓN DE MEDIOS Y REACTIVOS
preparación de medios de cultivo y otros reactivos como solución de conservación de
células…
d) CULTIVO CELULAR E INCUBACIÓN
cultivo celular y la manipulación del mismo: pases, subcultivo, recuento celular,
descongelación de células…
e) ÁREA DE ALMACENAJE
f) SALA DE FRÍO: congeladores y equipo de criogenia

La sala más importante es la sala de cultivos. En ella se encuentra:

• Cabina de Seguridad Biológica
• Incubadora de CO2
• Microscopio invertido de fluorescencia
• Contador de células
• Refrigerador
• Congelador - 20ºC
• Baño termostizado
• Micropipetas, pipeteadores automáticos
• Centrífuga

TÉCNICA ASÉPTICA
De igual forma que ocurre con los laboratorios de Biología Molecular, uno de los mayores
problemas que se dan en cultivos celulares, es el alto riesgo de contaminación . Por ello hay que
trabajar siguiendo unas estrictas normas que conforman la técnica aséptica para cultivos celulares.

En los laboratorios de cultivo celular la técnica aséptica es muy estricta, debe impedir
cualquier tipo de contaminación de los cultivos. Incluye 4 elementos a tener en cuenta, que impiden
un tipo de contaminación específica, y se lleva a cabo mediante unas acciones determinadas.

I. REACTIVOS Y MEDIOS ESTÉRILES

Se usan para prevenir la contaminación biológica, química…de los propios medios y reactivos.
Incluye el control de calidad de medios y reactivos, y la esterilización en autoclave de medios y
soluciones.

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 II. ÁREA DE TRABAJO ESTÉRIL
Previene la contaminación ambiental y cruzada (microorganismos en el aire, incubador y superficies
de trabajo sucias…). Para ello se recomienda:
- Trabajar en CBS: puntas de pipetas con filtro…
- Incubador de CO2 en buenas condiciones
- Limpieza y descontaminación de superficies
o Medios físicos: UV
o Medios químicos: reactivos, lejía, etanol….
- Trabajar con un solo tipo celular
- Uso exclusivo de materiales para cada técnico

III. BUENA HIGIENE PERSONAL

Previene la contaminación introducida por el propio técnico
- Lavado de manos
- Uso de EPIs: guantes, batas, mascarillas
IV. MANIPULACIÓN ESTÉRIL
También previene la contaminación introducida por el propio técnico. Se recomienda:
- Limpiarse siempre las manos y el área de trabajo con etanol al 70 %.
- Limpiar el exterior de los recipientes, matraces, placas y platos con etanol al 70% antes de
colocarlos en la campana de cultivo celular.
- Evitar verter medios y reactivos directamente de botellas o matraces.
- Usar pipetas de vidrio estériles o de plástico desechables con filtro.
- Usar cada pipeta solo una vez para evitar la contaminación cruzada.
- No desenvolver las pipetas estériles hasta que vaya a utilizarlas.
- Mantener las pipetas en el área de trabajo.
- Tapar siempre los frascos y matraces después de su uso.
- Sellar las placas de pocillos múltiples con cinta adhesiva (parafilm).
- Nunca destapar un matraz, botella, placa de Petri…estéril hasta el instante en que esté listo
para usar y nunca dejarlo abierto al medio ambiente.
- Tener cuidado de no hablar, cantar o silbar cuando se realicen procedimientos estériles.
- Realizar los experimentos lo más rápido posible (pero correctamente) para minimizar la
contaminación.

TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

A. CULTIVO DE ÓRGANOS
El cultivo de órganos consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un
medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
Se explanta una estructura casi completa sobre una rejilla, es decir, un órgano completo de pequeño
tamaño o fragmentos.
El órgano se mantiene a una atmósfera controlada y con los nutrientes necesarios, y expulsa al
exterior los productos de desecho.
Representa una buena réplica de la arquitectura característica del tejido in vivo, porque mantiene los
tipos celulares diferenciados. Su principal limitación es que sólo las células embrionarias situadas en la
periferia pueden proliferar, por lo que se mantienen durante un tiempo limitado.
Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a estímulos,
estudios regenerativos, ...
B. CULTIVO DE EXPLANTES
Los explantes son porciones de tejidos vivos. Los fragmentos de tejidos se adhieren a una superficie,
quedando en la interfase sólido-líquido, y en la que las células de la periferia pueden proliferar o migrar
por la superficie del soporte.
Es el caso de cultivos de fragmentos de tejidos diferentes, como pueden ser vellosidades coriónicas,
tejidos epiteliales, …

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 C. CULTIVO DE CÉLULAS
El cultivo de células se realiza a partir de suspensiones celulares, que se introducen en un recipiente
adecuado junto con un medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas para que las células
proliferen.
El cultivo de células es el tipo de cultivo más habitual y se realiza a partir de muestras de cualquier
tipo de tejido, restos ovulares, líquido amniótico, sangre periférica, células hematopoyéticas, células madre,
etc.
Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células pueden ser primarios
o secundarios.
Cultivo celular primario: Para obtener un cultivo celular primario, la suspensión celular de partida
se obtiene disgregando las células de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta manera se
obtiene una mezcla celular compleja formada por los distintos tipos celulares presentes en el tejido. El cultivo
primario se puede realizar a partir de esta mezcla o seleccionando un tipo celular concreto.
Cultivo celular secundario: La suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo
primario o de otro secundario, mediante un subcultivo o «pase». También se puede obtener a partir de una
línea celular mantenida en congelación.

APLICACIONES DE LOS CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares tienen múltiples aplicaciones, en investigación básica y en investigación
aplicada.
En investigación básica permiten estudiar:
• Cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular: ciclo celular, rutas metabólicas,
diferenciación,….
• Interacciones celulares: entre células, con la matriz extracelular, con el medio ambiente…
En investigación aplicada, son una potente herramienta biotecnológica que se utiliza en muchas
disciplinas, con importantes aplicaciones industriales:
• Inmunología, para producción de anticuerpos monoclonales.
• Virología, para producción de vacunas.
• Farmacología, para producción de fármacos.
• Toxicología, para estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis.
Dos aplicaciones relativamente modernas y muy interesantes son:
• La ingeniería de tejidos que pretende conseguir la producción in vitro de tejidos (cultivos histotípicos)
y órganos (cultivos organotípicos) funcionales para su uso en injertos y trasplantes. En el segundo
caso hablamos de organoides, masa de tejido tridimensional creada en el laboratorio mediante el
cultivo de células madre. Imitan la estructura y la función de órganos tan diversos y complejos como
los intestinos, los riñones o el cerebro. Presentan características mucho más parecidas a las
condiciones in vivo que los cultivos celulares tradicionales en dos dimensiones.
• Estudios con células madre o Stem cell, enfocados a la terapia celular.

ORGANOIDES STEM CELL

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1.1 FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO CELULAR
El cultivo de células implica:
- extraerlas de su entorno tisular fisiológico
- introducirlas en el interior de un recipiente adecuado que las aísla del exterior, inmersas o bañadas
por un medio de cultivo artificial
- y, finalmente, colocar este conjunto en el interior de un incubador que proporciona unas condiciones
ambientales adecuadas
El cultivo de células implica un conjunto de operaciones complejas y para que el proceso se desarrolle
adecuadamente es necesario controlar una serie de factores o condiciones:
• El soporte físico en el que van a crecer las células.
• La composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo.
• La atmósfera gaseosa.
• Las condiciones de incubación.

1.1.1. SOPORTE FISICO

La mayor parte de las células en cultivo crecen en monocapa adheridas a la superficie del recipiente
en el que se efectúa el cultivo.
A la hora de planificar un cultivo hay que tener en cuenta tres aspectos relativos a los recipientes:
• el material o sustrato con el que están fabricados
• su diseño o forma
• los posibles tratamientos de la superficie
A.- MATERIALES PARA EL CULTIVO
El material con que se fabrican recipientes destinados a cultivos celulares debe permitir la adhesión
de las células, ser fácilmente esterilizable y tener una mínima calidad óptica para poder visualizar el
cultivo con un microscopio invertido.
Los más utilizados son el vidrio y los plásticos, pero hay otros materiales para situaciones
particulares:
• Vidrio. Es reutilizable, fácil de limpiar y de esterilizar por calor en autoclave. Además, tiene
muy buena calidad óptica para observaciones microscópicas.
• Plástico desechable. Actualmente es el material más utilizado por su bajo coste, su facilidad
de esterilización por irradiación y su buena calidad óptica, además de por el ahorro de
personal y tiempo de trabajo que supone no tener que reutilizarlo. Además, al reducirse el
número de tareas y manipulaciones, es menor el riesgo de contaminación.
• Matrices tridimensionales. Se consiguen con materiales que forman estructuras
tridimensionales porosas como los geles de colágeno o las esponjas de celulosa. Se utilizan
para cultivar algunos tipos celulares que se introducen en el interior de la red tridimensional y
crecen organizándose de manera más parecida a como lo hacen en su tejido de procedencia.
• Microesferas de sephadex o poliacrilamida. Las células pueden crecer adheridas a estas
microesferas, que se mantienen en suspensión en el seno del medio de cultivo.
De esta manera se cultivan células dependientes de anclaje como si fueran un cultivo en
suspensión, aumentándose notablemente la superficie de crecimiento disponibe.
• Metales. Para algunas aplicaciones muy concretas, como el cultivo de células de la glía, se
pueden utilizar sustratos metálicos específicos de paladio o acero.

B.- TIPOS DE RECIPIENTES

Existe una amplia variedad de recipientes para cultivo. El parámetro más importante que los
caracteriza es la superficie útil de cultivo, porque con base en ese valor se calcula la cantidad de
células que se siembran y se estima el número aproximado final de células cuando se alcanza la
confluencia (situación en la que las células presentan la morfología y fisiología más parecidas a su
estado original).

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Entre los más habituales están los siguientes:
• Placas multipocillo. Son placas con un número variable de pocillos (entre 6 y 96) con fondo
habitualmente plano, cubiertas por una tapa no hermética. El diámetro de los pocillos oscila
entre 8 y 35 mm y la superficie de cultivo entre 0,5 y 10 cm 2 por pocillo.
Son útiles para realizar experimentos puntuales simultáneos con distintas líneas celulares o
diferentes condiciones de cultivo. No son aconsejables para el mantenimiento de líneas
celulares por su mala estanqueidad y porque presentan mayor riesgo de contaminación.
• Placas transwell: Un tipo especial de placa multipocillo es la denominada placa Transwell,
dotada con cámaras individuales que encajan en los pocillos y cuyo fondo consiste en una
membrana plástica porosa. Cuando la cámara se inserta en el pocillo, el conjunto presenta
un compartimento inferior y otro superior separados por la membrana porosa, donde van a
crecer las células. Estas placas son especialmente útiles para el cultivo de células epiteliales
polarizadas y para estudios de migración e invasión.
• Placas de Petri: Son las clásicas placas de cultivo circulares con tapa, en tamaños que oscilan
entre 3,5 y 10 cm de diámetro, y que corresponde a superficies de cultivo entre 10 y 78 cm2.
Tienen las mismas utilidades y limitaciones que las placas multipocillo.
• Frascos o botellas Roux: Son frascos planos con tapón de rosca disponibles en muchos
tamaños. Se caracteriza por su superficie de crecimiento; los más habituales son los de 25 y
75 cm2, aunque los hay hasta de 225 cm2.
Son idóneos para todo tipo de cultivo en monocapa y en suspensión, y para el mantenimiento
de líneas celulares.
En este tipo de frascos se pueden realizar cultivos cerrados, enroscando totalmente el tapón,
o abiertos enroscando parcialmente el tapón. Estos últimos permiten el intercambio gaseoso
con la atmósfera del incubador, al tiempo que se previene la contaminación. Algunos modelos
llevan una membrana en el tapón que permite realizar cultivos ventilados enroscando
totalmente el tapón.

• Un tipo especial de frasco de cultivo es aquel en el que la superficie de crecimiento es un

portaobjetos del mismo material que el resto del frasco. Una vez finalizado el cultivo, se retira
el medio de cultivo y el resto del frasco se despega de la superficie de crecimiento, de manera
que esta se puede manejar como un portaobjetos convencional, fijando y tiñendo la monocapa
de células que ha crecido sobre él con tinciones convencionales, técnicas de
inmunocitoquímica o técnicas de hibridación in situ.
• Botellas para incubadores tipo roller: Son cilíndricas, de distintos tamaños, con una gran
superficie de crecimiento, específicas para incubarlas sobre rodillos que las hacen girar
lentamente, de manera que las células pueden crecer en toda la superficie interior de la
botella.
C.- TRATAMIENTOS DE SUPERFICIE
Con la finalidad de posibilitar o mejorar la adhesión de las células dependientes de anclaje a
las superficies de cultivo, estas se pueden tratar con proteínas de matriz extracelular, como colágeno,
laminina, fibronectina, vitronectina, etc. proteínas naturales o sintéticas, como la gelatina y la
polilisina.
El tratamiento puede realizarse antes del cultivo, inundando el recipiente de cultivo con una
solución estéril de la proteína, o bien añadiéndola al medio de cultivo como un componente más.

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1.1.2. MEDIO DE CULTIVO
Son medios nutritivos que sustituyen al medio natural en el que se encuentra la célula
fisiológicamente.
Son mezclas complejas que:
1. Aportan nutrientes y otras sustancias
2. Reúnen características fisicoquímicas que:
− Generan condiciones microambientales para el desarrollo celular
− Permiten acumular temporalmente los productos de desecho del metabolismo celular

A. COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

1. SALES MINERALES
La base de un medio de cultivo es una solución salina equilibrada en la que se disuelven el
resto de los componentes. Entre las sales minerales que forman parte habitual de los medios
de cultivo y que son responsables de la osmolaridad del medio están el cloruro sódico, cloruro
potásico, cloruro cálcico, cloruro magnésico, fosfatos sódicos y bicarbonato sódico. La
concentración de bicarbonato sódico es especialmente importante por su papel en la
regulación del pH junto con la concentración de CO2 ambiental.
2. TAMPÓN
El medio de cultivo tiene que estar tamponado, puesto que las células son muy sensibles a
los cambios de pH. El tampón más utilizado ha sido el bicarbonato, sin embargo, en la
actualidad se aconseja el uso del tampón HEPES, debido a su gran poder tamponador en el
rango de pH óptimo para el crecimiento celular (7,2-7,6).
3. GLUCOSA
La glucosa se incluye en los medios de cultivo como fuente de energía, como componente
único o junto con otros hidratos de carbono
4. AMINOÁCIDOS
El medio de cultivo debe contener, como mínimo, todos los aminoácidos esenciales (ingesta
directa con la dieta), para ser utilizados en la síntesis de proteínas. Se puede suplementar
además con otros aminoácidos, según las necesidades específicas de las células que se
quiere cultivar.
5. VITAMINAS
La composición en vitaminas varía mucho de un medio a otro y va a depender de la
concentración de suero que se utiliza. Las vitaminas son necesarias porque influyen en la
tasa de crecimiento y en la supervivencia de las células.
6. SUPLEMENTOS ORGÁNICOS
En esta categoría se incluyen ácidos grasos esenciales y otros lípidos, nucleósidos, piruvatos,
etc.
7. INDICADOR DE pH
Dado que el pH del medio es un parámetro fundamental para la supervivencia del cultivo, en
la composición del medio se incluye un indicador de pH que registre cambios mínimos en el
rango de pH óptimo para el crecimiento.
El más utilizado es el rojo fenol, que es púrpura a pH 7,8, rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0 y
amarillo a pH 6,5.
8. HORMONAS Y FACTORES DE CRECIMIENTO
Esta categoría incluye multitud de componentes esenciales para el crecimiento de las células
pero cuya proporción en el medio de cultivo es muy difícil de estandarizar. Por ello, la mayor
parte de los medios de cultivo conocidos como medios no definidos, solucionan este problema
suplementando el cultivo con suero animal en proporción variable, entre un 2% y un 20%.

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 9. SUERO
Como acabamos de ver aportan hormonas y factores de crecimiento. Además aporta
proteínas como la transferrina, hierro, oligoelementos (cobre, selenio), factores de adhesión,
inhibidores de proteasas, inhibidores de tripsian, ….
Los más usados son el suero bovino fetal para todo tipo de cultivos y el suero humano para
cultivar líneas celulares humanas. Además hay suero de ternera, de caballo…
10. ANTIBIÓTICOS Y ANTIFÚNGICOS
La suplementación del medio de cultivo con antibióticos y antifúngicos es esencial para
prevenir la contaminación por bacterias, levaduras y hongos.
Se pueden utilizar solos o en combinación, pero hay que controlar muy bien la concentración
final para evitar dañar las células.
Los antibióticos más utilizados son:
− Gentamicina
− Combinación de penicilina/estreptomicina
El antifúngico más utilizado es la anfotericina B.

MEDIOS DE CULTIVO CON COMPOSICIÓN CONOCIDA

En los laboratorios de cultivos celulares se utilizan medios de cultivo con composición conocida, los
más habituales son:
1. Medio basal de Eagle (BME): solo contiene aminoácidos esenciales.
2. Medio mínimo esencial de Eagle (MEM): más aminoácidos que el anterior y a mayor
concentración.
3. MEM modificado por Dulbeco (DMEM): multiplica por cuatro la concentración de aminoácidos
y vitaminas de BME.
4. RPMI 1640: suplementos específicos.

B. CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS
En un medio de cultivo hay que controlar las siguientes características físico químicas:
1. pH
Las células en cultivo suelen crecer en un margen de pH relativamente estrecho. El pH óptimo
para la mayoría de las células está en el rango 7,2-7,6, aunque algunos tipos concretos
pueden crecer mejor a otros pH. Como ya se ha mencionado, el pH del medio se fija con
tampones y se controla con un indicador de pH, de manera que un cambio en el color del
medio producido por un viraje del indicador en un cultivo en crecimiento sería razón suficiente
para cambiar el medio de cultivo.
2. OSMOLARIDAD
Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto de las células
que se cultivan. En general, las células en cultivo toleran valores de osmolaridad en el rango
de 260-320 mOsm / kg.
3. VISCOSIDAD
La viscosidad no suele ser un parámetro limitante para el crecimiento de las células. Depende
principalmente de la concentración de suero que se use. Una viscosidad ligeramente elevada
tiene efecto protector durante la tripsinización y agitación del cultivo, evita formación de
espuma. Cuando se usan medios libres de suero, se pueden añadir sustancias inertes que
aumentan ligeramente la viscosidad, como la carboximetil-celulosa o la polivinilpirrolidona.
4. TENSIÓN SUPERFICIAL
La tensión superficial debe mantenerse baja y no suele ser un problema en los cultivos
tradicionales. Solo en ciertos cultivos especiales en suspensión en los que se burbujea CO 2
puede producirse espuma en el cultivo. Para evitarlo se añaden agentes antiespumantes.

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1.1.3. INCUBADOR
Proporciona los componentes y las condiciones de incubación al cultivo:
A. LA ATMÓSFERA GASEOSA
La atmósfera gaseosa es la mezcla de gases en la que se mantienen los cultivos; sus dos
componentes más importantes son el oxígeno y el CO2.
Oxígeno: Todas las células necesitan oxígeno para vivir. En general, la concentración de
oxígeno atmosférico es suficiente para cubrir las necesidades de cualquier cultivo celular.
Solo algunos cultivos de órganos requieren una mayor concentración de oxígeno (hasta un
95%) por la mala difusión de este elemento al interior del órgano.
CO2: El CO2 tiene un papel muy importante en los cultivos celulares puesto que la fracción
del CO2 ambiental disuelta en el medio de cultivo líquido está en equilibrio con el ion
bicarbonato del mismo. En consecuencia, los niveles de CO2 pueden influir en el pH del medio
cuando éste está tamponado con un tampón bicarbonato.
Por esta razón cada cultivo tiene una concentración recomendada de CO2 en la fase gaseosa,
en función de la cantidad de bicarbonato sódico que contiene el medio de cultivo. La
concentración más habitual es del 5%. Los incubadores llevan acopladas botellas de CO2 y
un dispositivo que permite controlar la concentración de este componente en la atmósfera de
incubación, el manómetro.
B. LA TEMPERATURA
La temperatura influye en gran medida en la tasa de crecimiento de las células. La
temperatura óptima de crecimiento suele ser la misma a la que están sometidas
fisiológicamente en los organismos de procedencia. Así, las células de mamíferos crecen bien
a 37 ºC, pero la temperatura óptima para las células de insectos es de 28 ºC.
C. LA HUMEDAD
La humedad ambiental es también un parámetro importante para el buen crecimiento de las
células. Debe ser suficientemente elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo, lo
que produciría aumento de la concentración de los componentes y de la osmolaridad, y
variaciones de pH.
Los incubadores actuales tienen dispositivos que inyectan agua estéril para conseguir
humedades relativas alrededor del 95%.

1.2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO

Una vez que a las células en suspensión se les añade el medio de cultivo, en el recipiente adecuado
(frasco de cultivo) y se incuban en condiciones óptimas de temperatura, concentración de CO2 y humedad,
las células comienzan a crecer.

1.2.1. CURVA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO

La dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la variación en la concentración de células a lo
largo de los días de evolución del cultivo, se representa gráficamente mediante una curva de crecimiento.
La curva de crecimiento adopta la forma de una curva sigmoide en la que se diferencian tres fases:
Fase de latencia: Es un tramo recto sin pendiente o con cierta concavidad. Corresponde a las
primeras 24 horas de evolución del cultivo, en las que no se produce crecimiento y, por lo tanto, el número
de células se mantiene constante o incluso puede disminuir ligeramente.
Fase de crecimiento exponencial: En la curva es el tramo recto con pendiente elevada. Dura
aproximadamente 6-7 días y corresponde a la fase en la que el número de células aumenta de manera
exponencial hasta alcanzar un máximo.
Fase estacionaria: Es un tramo recto de pendiente nula. Es la fase en el número de células
permanece constante.

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1.2.2. FORMAS DE CRECIMIENTO
La morfología de las células en cultivo está relacionada con
el origen del tejido primario y las características del soporte.

A. CRECIMIENTO EN MONOCAPA
Las células crecen adheridas a una superficie.
Necesitan adherirse para crecer, y se pueden distinguir diferentes etapas de su desarrollo:
• Adhesión a una superficie: las células se van adhiriendo a la superficie o soporte. F. latencia.
• Proliferación y formación de colonias. Fase exponencial: Las células ya pegadas empiezan proliferar,
expandiéndose, formando colonias celulares.
• Inhibición por contacto, detienen su crecimiento, aunque siguen vivas. Ocupan toda la superficie y
entran en confluencia. Fase estacionaria.
• En esta estado de confluencia la morfología y la fisiología de las células es la más parecida a las de
las células de origen.
• El final de la fase exponencial es el momento idóneo para realizar un subcultivo o «pase». Es
necesario para que las células reanuden su crecimiento pasar parte de las células a un nuevo frasco
de cultivo. El pase debe realizarse cuando lás células alcanzan el 75-80% de confluencia.
B. CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN
Las células no necesitan pegarse a una superficie para crecer, se mantienen suspendidas en el seno
del medio de cultivo proliferando. Es típico de células sanguíneas, hematopoyéticas, células madre
y algunas líneas celulares. Las fases por las que pasan estos cultivos son:
• Adaptación al medio de cultivo. Periodo de latencia: Las células se adaptan al medio y a las
condiciones de cultivo, antes de empezar a proliferar.
• Proliferación en suspensión. Fase exponencial: las células crecen exponencialmente.
• Inhibición por densidad. Fase estacionaria: cuando las células alcanza un número crítico en relación
con el volumen de medio de cultivo y sus nutrientes. Las células dejan de crecer, se mantiene su
densidad celular. Al igual que en el cultivo en monocapa es el momento de realizar un pase para que
las células reanuden el crecimiento.
C. CULTIVOS TRIDIMENSIONALES
Se busca mantener la arquitectura in vivo del tejido de origen.
Permiten estudiar la proliferación, morfología e interacciones intra e intercelulares y evaluar el efecto
de sustancias que pueden afectar tales interacciones.
Es posible mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de
origen.

1.3 COMPORTAMIENTO VITAL TRAS SUCESIVOS PASES

A partir de un cultivo primario los cultivos celulares evolucionan de diversas formas hacia
líneas celulares que pueden ser de diversos tipos:
A. LINEA CELULAR PRIMARIA
La línea celular primaria es aquella que obtuvo a partir de un tejido u órgano mediante un
cultivo primario y que se mantiene en cultivo mediante pases seriados durante un tiempo limitado.
La población celular aumenta en cada pase (se multiplica el número de frascos de cultivo) y,
normalmente, a partir del tercer pase se estabiliza en sus características.
Esto significa que las células se hacen uniformes y homogéneas, manteniéndose las
características morfológicas y fisiológicas estables durante las sucesivas generaciones.
Cuando el cultivo primario se realiza a partir de una mezcla celular compleja, el tipo celular
con mayor tasa de crecimiento acaba desplazando a los demás, es decir, impidiendo el crecimiento
de las células con tasas de crecimiento menores.

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 En este tipo de líneas celulares es importante el concepto de senescencia. Las líneas
celulares primarias tienen una vida finita, es decir, se mantienen en crecimiento durante un número
determinado de generaciones o pases, característico de cada tipo celular (suele oscilar entre 20 y
100) y después entran en la denominada fase de senescencia.
La fase de senescencia es la etapa vital
en la que las células van perdiendo su capacidad
de dividirse y el cultivo acaba muriendo.
Esto es debido a que con las sucesivas
divisiones los telómeros* se acortan y las células
van acumulando anomalías genéticas y
perdiendo funciones.
Se puede conservar una línea celular primaria
congelando células antes de alcanzar la
senescencia y, a ser posible, en los primeros
pases.
En cualquier caso hay que anotar siempre
el número de pase del que proceden las células
congeladas, para saber en todo momento
aproximadamente cuántos pases les quedan
antes de que el cultivo muera.

*telómero:
Un telómero es el final de un cromosoma.
Los telómeros son secuencias repetitivas de ADN no codificante del cromosoma.
Protegen al ADN de cualquier daño.
Cada vez que una célula se divide, los telómeros se acortan.
Con el tiempo, los telómeros se vuelven tan cortos que la célula ya no puede dividirse.
Las células van acumulando anomalías genéticas y perdiendo funciones.

B. LINEA CELULAR CONTINUA

Las líneas celulares continuas son aquellas que se obtienen a partir de un cultivo primario y
que se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases seriados.
Estas líneas aparecen espontáneamente en algunos cultivos, que se mantienen durante más
pases de los esperados. La primera línea celular contínua que se decubrió fue Hela, obtenida a partir
de células de cáncer cérvico uterino de Henrietta Lacks. Se empezaron a hacer cultivos de estas
células en 1951 y todavía se utilizan en investigación. Estas líneas celulares contínuas se deben a
la aparición en el cultivo de células inmortales, capaces de originar líneas estables y permanentes.
Aparecen como consecuencia de un fenómeno de transformación de las células normales,
relacionado con la pérdida de los mecanismos de control celular. Las células transformadas tienen
unas características especiales:
o Crecen indefinidamente en cultivo (son inmortales).
o Pierden la dependencia del anclaje para crecer, por lo que pueden crecer en suspensión.
o Pierden la inhibición por contacto.
o Pueden invadir tejidos y producir tumores.
o Acumulan anomalías genéticas.
o Normalmente son aneuploides, con múltiples aberraciones cromosómicas.
La aparición de líneas celulares continuas, además de espontáneamente, se puede inducir por:
− Métodos físicos: irradiación del cultivo.
− Métodos químicos: tratamiento con productos químicos carcinogénicos.
Métodos biológicos: infección vírica, transfección de ADN.

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1.4. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR
En los laboratorios de cultivos celulares se realizan procedimientos múltiples, desde la obtención de
las células a partir de tejidos, hasta la conservación y almacenamiento de las líneas celulares establecidas,
pasando por el mantenimiento de los cultivos, la realización de pases, los estudios de viabilidad celular, …
A continuación, vamos a estudiar todos estos procesos en el orden cronológico en que se producen.
A. DISGREGACIÓN CELULAR
Cuando se quieren cultivar células provenientes de un órgano o tejido, el primer paso consiste en
obtener el tipo celular que nos interesa en suspensión. Para lo cual hay que separar las células entre
sí y de la matriz extracelular en la que se encuentran inmersas.
MÉTODOS DE DISGREGACIÓN CELULAR
Esta disgregación celular se puede realizar por métodos mecánicos o enzimáticos, aunque lo normal
es una combinación de ambos.
Métodos mecánicos
Los métodos mecánicos se basan en cortar, raspar, tamizar, triturar (con jeringa o pipeta)
suavemente fragmentos de órgano o tejido colocados en una placa de Petri con tampón o medio de
cultivo. Luego se recogen las células disgregadas tras filtrarlo para retirar los restos de tejido.
Hay que asegurarse de trabajar en condiciones de esterilidad y realizar un lavado final de las células
en tampón o medio de cultivo antes de proceder al cultivo en sí.
Métodos enzimáticos
Los métodos enzimáticos se basan en el tratamiento del tejido con enzimas proteolíticas que digieren
las proteínas de la matriz extracelular, liberando las células englobadas en ella.
Entre las proteasas más utilizadas están: hialuronidasa, tripsina, colagenasa, elastasa, papaína, ...
Las soluciones enzimáticas se pueden combinar con EDTA, quelante que al retirar los cationes de
Ca2+ que estabilizan las uniones entre las proteínas de matriz y las células, favorece su disgregación.

SELECCIÓN DE CÉLULAS
Tras la disgregación de un tejido se obtiene una mezcla compleja de células en suspensión que se
puede utilizar directamente para iniciar un cultivo primario. Pero otras veces interesa seleccionar un
tipo celular concreto para cultivarlo.
La selección de células se basa en:
• Natural: como ya sabemos a partir del tercer pase, el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el
tipo celular de mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo, desplazando
a los otros tipos celulares. En el caso de mezclas celulares lo normal es que sean
seleccionadas las células del tejido conjuntivo (fibroblastos).
• Basada en las propiedades específicas de las células. Las células se pueden separar por su
adhesión distinta a sustratos, tanto naturales (endotelios, colágeno) como artificiales (lana de
vidrio, plástico). La suspensión celular se hace pasar por columnas o filtros con estos
sustratos, de manera que las células de interés quedan retenidas en ellos. Posteriormente se
eluyen con un tampón adecuado que disminuya la adhesión.
• Métodos inmunológicos de selección de células. Se basan en el uso de anticuerpos
específicos que reconocen epítopos o determinantes antigénicos de la superficie de las
células de interés. Hay varias posibilidades:
o Separación inmunológica en placa: Se recubren los pocillos de una placa mutipocillos
con el anticuerpo específico. La mezcla de células se incuba en los pocillos, de
manera que las células de interés quedan retenidas sobre la superficie de los pocillos
y el resto de las células se eliminan mediante lavados.
o Separación inmunológica con esferas: Recubrir esferas de material inerte con el
anticuerpo. Estas esferas se introducen en la suspensión con la mezcla de células, de
manera que las células de interés quedan retenidas sobre la superficie de las esferas.
La solución se filtra después con un filtro que retiene las esferas pero no el resto de
las células.

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 o Separación inmunomagnética: Recubrir esferas magnéticas con el anticuerpo. Las
células con el epítopo específico se une al AC ancado a las esferas. En este caso, las
células ancladas a las esferas magnéticas se retienen con un imán y el resto de las
células se eliminan con lavados.
En los tres casos, las células se separan del soporte cambiando el pH o digiriendo los
anticuerpos con enzimas. Ambos métodos hacen que la célula se separe del AC.
B. DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS
Se realiza a partir de líneas celulares mantenidas en congelación, en nitrógeno líquido o a - 80ºC.
Se realiza en varios pasos:
1.Incubar el criotubo que contiene las células congeladas en un baño a 37 ºC.
2.Limpiar la superficie externa del criotubo con etanol al 70% para prevenir contaminaciones.
3.Transferir el contenido a un tubo falcon de 15 ml y añadir 10 ml de medio de cultivo completo
precalentado a 37 ºC.
4.Centrifugar 4-5 minutos a 700-800 rpm.
5.Eliminar el sobrenadante, con lo que se elimina el DMSO (producto utilizado en los medios
para congelar las células, y que es tóxico para las mismas cuando no están congeladas).
6.Añadir 4-5 ml de medio de cultivo completo nuevo. La suspensión celular de partida está lista
para iniciar el cultivo. Todas las manipulaciones deben realizarse en condiciones de esterilidad.
C. RECUENTO Y VIABILIDAD CELULAR
Una vez obtenida la suspensión celular de partida, para iniciar el cultivo celular es imperativo conocer
su densidad celular, es decir, el número de células/ml.
Esto es debido a que el cultivo se inicia con un número concreto de células, dependiendo de la
superficie del recipiente que se vaya a utilizar. Además, hay que comprobar la viabilidad de esas
células, es decir, confirmar que están vivas. La viabilidad se expresa en porcentaje. Ambos procesos
se realizan simultáneamente diluyendo las células con un colorante vital (azul tripán) y contándolas
en una cámara de recuento (Neubauer).
El colorante vital permite distinguir las células vivas de las muertas.
El colorante más habitual es el azul tripán, un coloide de color azul que penetra en el interior de las
células que tienen la membrana rota, pero que no atraviesa las células con las membranas intactas.
En consecuencia, cuando se observa al microscopio una población de células teñida con azul tripán,
se ven dos tipos de células:
Células de color azul, que se han teñido porque tienen rota su membrana citoplásmica. Estas
células se consideran no viables.
Células blancas, en las que el colorante no ha podido penetrar porque su membrana
citoplásmica está intacta. Se considera que estas células están vivas y son viables para un cultivo.
El recuento de las células blancas (viables) y azules (no viables) se lleva a cabo en la cámara de
contaje celular o hemocitómetro. La más usada es la cámara de Neubauer.

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 1.Una vez homogeneizada la suspensión celular descongelada mediante inversión suave del
tubo, se diluye una alícuota de ella (por ejemplo, 20 µl) al 50% con una disolución de azul
tripán al 0,4% en PBS.
2.Se monta la cámara de Neubauer, colocando un cubrecámaras encima. El cubrecámaras
queda a una altura exacta de 0,1 mm de la cámara.
3.A continuación se cargan 10 µl de la suspensión teñida en cada cámara. El volumen de
suspensión situado encima de un cuadrado de esquina es de:
1 mm 1 mm 0,1 mm = 0,1 mm 3 .
4.Se deja reposar unos minutos para que las células sedimenten y se visualiza la cámara con
un microscopio óptico convencional.
5.Se cuentan las células blancas (viables) y azules (no viables) presentes en las cuatro
esquinas de 0,1 mm3 y se realizan los siguientes cálculos:
Densidad celular en la suspensión: (células totales / ml) = [(A + B)*2*104 ]/4
Densidad celular viable: (células viables / ml) = (A*2*10 4) /4
Densidad celular no viable: (células no viables / ml) = (B*2*104)/4
Siendo A, el número de células blancas contadas en las cuatro esquinas y B, el número
de células azules contadas en las cuatro esquinas).
La viabilidad sería el porcentaje de células que están vivas = [A/(A+B)]*100. Un cultivo es viable
cuando el porcentaje es superior al 90%. Las células totales vivas = [(A*2*104)/4]*ml de muestra
totales. Este dato es el que necesitamos para realizar la siembra.

D. SIEMBRA DEL CULTIVO

Partiendo de una suspensión celular obtenida por disgregación, selección o descongelación, el
cultivo se inicia sembrando un número determinado de células. Este procedimiento implica:
1.Elegir el tipo de recipiente que se va a utilizar para el cultivo, en función del número de
células que vayamos a sembrar.
2.Hacer recuento de células viables totales en la suspensión.
4.Transferir un volumen de suspensión que contenga el número de células deseadas a un
tubo falcon.
5.Diluir las células con el volumen adecuado de medio de cultivo completo e introducirlas en
el recipiente de cultivo.
6.Colocar el recipiente de cultivo en un incubador a la temperatura adecuada (normalmente
37 ºC), con la proporción de CO2 requerida (del 5%, habitualmente) y 95% de humedad.

E. MANTENIMIENTO DEL CULTIVO

El mantenimiento de los cultivos consiste en diferentes operaciones para el control de su viabilidad
y crecimiento.
Control periódico microscópico
Los cultivos se controlan microscópicamente con la periodicidad que se estime oportuna
(normalmente entre 1 y 3 días), para lo cual se retiran del incubador (si son cultivos ventilados hay
que cerrarlos) y se examinan con un microscopio invertido para observar la apariencia y el
crecimiento de las células.
Cambio de medio
La operación de mantenimiento más frecuente es el cambio de medio de cultivo, para renovar los
nutrientes consumidos por las células y retirar los productos de desecho generados por el
metabolismo celular.
El cambio de medio se suele realizar cada 2-3 días y, en cualquier caso, siempre que se observe un
cambio de color del medio (viraje del indicador de pH).

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El cambio de medio nunca es total, sino que se cambian sólo 2/3 de su volumen. De esta manera se
consigue que posibles sustancias beneficiosas para el cultivo producidas y secretadas por las células
se mantengan en él.
→ En los cultivos en monocapa el cambio de medio consiste en retirar con pipeta 2/3 de medio
de cultivo y sustituirlo por medio nuevo.
→ En los cultivos en suspensión, se centrifuga a 700-800 rpm el cultivo, se retiran 2/3 del
volumen del medio y se sustituye por medio nuevo.
Una vez cambiado el medio se reanuda la incubación en condiciones adecuadas.

Subcultivo o pase
Tras un cierto tiempo de cultivo (6-7 días), los cultivos en monocapa se encuentran en situación de
confluencia y los cultivos en suspensión alcanzan una densidad crítica. En ambos casos el
crecimiento se detiene y hay que realizar un subcultivo o pase.
o Cultivos en suspensión
En los cultivos en suspensión, se realiza un recuento de viables por ml y se calcula el factor
de dilución necesario para que la densidad celular sea la adecuada para reiniciar el
crecimiento.
Por ejemplo, supongamos que la dilución adecuada es 1/5. En ese caso se preparan 5
recipientes con 4/5 de medio nuevo y se agrega a cada uno 1/5 del cultivo viejo. Los 5
subcultivos se pasan al incubador para reiniciar el crecimiento celular. De esta forma se va
expandiendo la población celular.
Otra posibilidad es ir escalando el tamaño del recipiente de cultivo, de manera que cada pase
se realiza en un recipiente mayor que el anterior.
o Cultivos en monocapa
En los cultivos en monocapa es necesario despegar las células de la superficie del recipiente
para poder hacer el pase. Esto se puede hacer por métodos mecánicos, con un rascador,
pero el procedimiento más habitual es la tripsinización.
La tripsinización es el procedimiento de despegado de una monocapa de células de la
superficie del recipiente mediante una solución de tripsina / EDTA.
La tripsina digiere las proteínas responsables de la adhesión a la superficie y el EDTA retira
del medio los iones de Ca2+, que estabilizan la interacción célula-sustrato.
El procedimiento es el siguiente:

RECUENTO

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F. CONSERVACIÓN DE LAS CÉLULAS
Las líneas celulares continuas se pueden mantener en el tiempo mediante pases seriados ya que
son células inmortales. Sin embargo, esta estrategia consume recursos y tiempo. Por esta razón, el
método habitual de conservación de líneas celulares es la congelación.
Cuando se ha obtenido una suspensión de células, después de tripsinizar, se lavan con medio de
cultivo y se hace un recuento de viables.
Se retira el medio de cultivo y se sustituye por un volumen adecuado de medio de congelación: medio
de cultivo con un 10% de DMSO, sustancia crioprotectora que evita la formación de cristales en el
interior de las células cuando se congelan. Una densidad celular final en el medio de congelación
óptima es alrededor de 106 células / ml.
Esta suspensión se alicuota en criotubos (1ml/criotubo) y se procede a congelación progresiva. Se
puede hacer de dos formas, siempre utilizando el recipiente de congelación o Mr frosty, al que hemos
echado isopropanol, que regula un descenso progresivo de la temperatura y hace que las células se
congelan lentamente (-1ºC/min), lo ideal es mantener a -20 ºC durante 24 h, luego a –80 ºC durante
24 h más y en nitrógeno líquido indefinidamente.

1.5 CONTAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS CELULARES

Presencia de microorganismos no deseados y que son omnipresentes en el ambiente
A. BACTERIAS. LEVADURAS Y HONGOS
Las bacterias y levaduras son los contaminantes más habituales, tanto por contaminación directa
como por liberación de sustancias tóxicas para el cultivo celular como pueden ser las endotoxinas
de bacterias Gram-.
Crecen más rápido que las células, lo que provoca muerte del cultivo a corto plazo.
La contaminación es de origen ambiental o por malas prácticas de laboratorio.
Se detecta visualmente y por un cambio de pH del medio.
Se previene con el uso de antibióticos o antifúngicos, pero no siempre es suficiente. En caso de
contaminación el cultivo se deshecha.

B. MICOPLASMAS
Microorganismos procariotas sin pared celular que pueden infectar cultivos y alterar su crecimiento.
Puede proceder las propias líneas celulares o del suero.
Entre el 35 – 50% de los cultivos están contaminados por micoplasmas.
Se detecta con tinción fluorescente que se une de forma selectiva al ADN del micoplasma con DAPI
o mediante PCR con cebadores específicos
El tratamiento; una vez contaminados los cultivos; se realiza con antibióticos (kanamicina o
quinolonas), o con suero inmune antimicoplasmas.
C. VIRUS
La mayor fuente de contaminación por virus son los sueros utilizados al preparar el medio de cultivo.
Es infrecuente ya que están muy controlados y se someten a esterilización.
En caso de contaminación hay que eliminar el cultivo.

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