Microbiología

Ambiental
5to Semestre 2016, LGA

1  
 Clase 3:
o Estructura y replicación del ADN.
o Plásmidos bacterianos: concepto y
significado biológico.
o Mutaciones. Tipos de mutaciones.
Agentes mutágenos.
o Recombinación genética: concepto,
conjugación, transformación y
transducción.
o Relevancia sanitaria & ambiental

2  
Estructura y replicación del ADN  
Genoma: conjunto de
elementos genéticos.

En procariotas los elementos

genéticos son:

ü Cromosomas
ü Elementos no cromosómicos:
plásmidos, virus y Transposones
 

El material genético de las bacterias se encuentra en

el citoplasma: nucleoide, cuerpo nuclear o región
nuclear. 3  
 Estructura y replicación del ADN  
Cromosoma bacteriano: doble
cadena de ADN (~1 mm de
longitud), circular y
cerrada de manera covalente.

El ADN bacteriano no está

rodeado por una membrana,
tiende a aglomerarse como
una estructura definida: el
nucleoide

La célula bacteriana es
haploide, existe una copia
sencilla de cada gen. 4  
Comparación tamaños genomas

5  
Tamaño depende de estilo de vida…

Giovannoni et al. 2005

6  
Estructura y replicación del ADN  

Los procesos genéticos requieren

tres tipos de polímeros:

o Acido Desoxirribonucleico
(ADN).
o Acido Ribonucleico (ARN).
o Proteínas.

7  
 Componentes de los Ácidos Nucleicos

Las cadenas poliméricas de los ácidos

nucleicos están conformadas por monómeros,
denominado NUCLEÓTIDOS constituidos por:

o Un azúcar pentosa (ribosa o desoxirribosa,

según el ácido nucleico)
o Un grupo fosfato
o Una base nitrogenada (purina o
pirimidina).

8  
 Componentes de los Ácidos Nucleicos
• Las purinas de una cadena
forman puentes de
hidrógeno con las
pirimidinas.

• El par A-T con 2 uniones

• El par G-C con tres
uniones.

• Cada una de las cuatro

bases esta unida a una
fosfo-2’-desoxirribosa
para formar un nucleótido.

• El contenido de pares GC
es herramienta taxonómica

9  
 ADN
• La longitud de una molécula de
ADN se expresa en miles de
pares de bases o en kilobases
(kb).

• Por ejemplo: el cromosoma de

una bacteria, E. coli, tiene
4,500,000 pares de bases o 4500
kb.

10  
 ARN
Existen 3 diferencias entre la química del
ADN y la del ARN :

1. Las macromoléculas del ARN contienen el

azúcar ribosa en lugar de desoxirribosa.

2. El ARN tiene la base uracilo en lugar de

timina.

3. El ARN no es una molécula de tira doble,

sin embargo,se puede doblar sobre si
misma en regiones complementarias.

11  
 ARN
Las bacterias contienen 3 tipos de RNA:

1.ARNm: (mensajero), su función es copiar el

código genético del gen (DNA cromosómico) y
llevar este mensaje al sitio de síntesis de
proteínas (Ribosomas).

2.ARNt (transferencia,
"adaptadoras”),traducción del mensaje de RNA
en una secuencia específica de aminoácidos.

3.ARN (ribosomal) síntesis de proteínas.

12  
 ARN Ribosomal

21 Proteínas

16S rRNA

Ribosoma

5S rRNA

Escherichia coli
34 Proteínas
16S rRNA
23S rRNA

13  
 Enzimas
1. Topoisomerasa II: promueve el superenrollamiento
(ADN girasa)
2. Toposiomerasa I: controla el desenrrollamiento.
3. ARN polimerasa: hace que las dos tiras de ADN se
desenrollen de modo que se pueda transcribir la
información.
4. ADN ligasa: une los fragmentos sintetizados.
5. Primasa: inicia la síntesis de un fragmento roto.
6. Endonucleasas de restricción: causan rupturas en
la doble cadena en secuencias especÍficas que
presenten simetría binaria

14  
Elementos no cromosómicos:
Plásmidos  

15  
 Plásmidos

• ADN bicatenario (circular)

• Tamaño de 1- 100 Kpb
• Pueden haber varias copias en la misma
célula
• Pueden haber varios plásmidos diferentes
(compatibles) en la misma célula
• Los plásmidos son generalmente elementos
que se replican independientemente del
cromosoma del hospedador.
• No tienen formas extracelulares en la
naturaleza

16  
 Plásmidos
Confieren ventajas al hospedador en
determinadas condiciones:

ü Resistencia antibióticos
ü enzimas para degradación de compuestos
orgánicos
ü rutas metabólicas especiales

• Se pueden transferir mediante contacto

célula-célula.

17  
 Plásmido R (resistencia)
Confieren resistencia a inhibidores del
crecimiento:
•Antibióticos
• Metales pesados

Otras funciones codificadas

por plásmidos:
• Factores de virulencia
• Degradación de compuestos
recalcitrantes (ej tolueno)
•Producción de bacteriocinas
•Fijación de Nitrógeno 18  
 Plásmidos conjugativos
• Gobiernan su propia transferencia de
una célula a otra por contacto.

• La transmisibilidad por conjugación

esta controlada por un conjunto de
genes (región tra) dentro del
plásmido.

• Los no-conjugativos no pueden

iniciar la conjugación, sólo se
transfieren con la asistencia de
plásmidos conjugativos

19  
 Plásmidos de diseño

• las técnicas de ingeniería genética

han hecho posible la construcción en
el laboratorio de un número
ilimitado de nuevos plásmidos
artificiales.

• Incorporación de genes de una amplia

variedad de orígenes
• Aplicación en biología molecular,
terapias génicas, biotecnología
20  
Elementos no cromosómicos:
Virus  

21  
 Virus

• Parásitos obligados
• Pequeños (20-200nm)

Ciclo de vida en dos fases:

• Fase extracelular no activa (virión)
• Fase intracelular (replicación)
modifican el funcionamiento celular
(hospedador) para su propia
subsistencia
22  
Ciclos lítico y lisogénico

23  
Elementos no cromosómicos:
Elementos genéticos
transponibles

24  
 Elementos genéticos
transponibles
• Pueden “moverse” de un lugar a otro del DNA
• Se replican con la molécula de ADN en la cual
están insertos

En procariotas:

1. Secuencias de inserción (IS)

• 750 –1600 pb
• gen tnp codifica la transposasa
• secuencias repetidas inversas en extremos

2. Transposones:
• IS (dos) + otros genes
• (ej. resistencia a antibióticos)

3. Algunos virus: bacteriófago Mu

25  
 Cómo se genera la
variación genética?

26  
 Replicación del ADN
o Proceso por el cual el ADN que contiene el
código genético se duplica.

o El producto son dos moléculas, es decir

las dos cadenas se convierten en cuatro.

o La división es semi-conservadora, las dos

dobles hélices de la progenie constan de
una molécula de la progenie y otra de la
madre, es decir una “nueva” y la otra
“vieja”

Errores durante la replicación:

introducción de variabilidad
genética 27  
 Replicación del ADN

 
 
 
   

28  
Replicación del ADN

29  
 Variaciones en la información
genética
La variación en la constitución genética se
puede dar por dos procesos:

1. La mutación: origina un cambio heredable

en la secuencia de bases del ADN
bacteriano.

2. La recombinación genética: involucra la

transferencia de ADN entre una bacteria
donadora y otra receptora y la
integración del material transferido al
genoma de la bacteria receptora.
30  
 Mutaciones
• Cambio heredable en la secuencia de bases del
ácido nucleico que constituye el genoma de un
organismo.

• Los errores en la replicación introducen

mutaciones a una velocidad baja 10-9 10-12.

• Corrección de lectura: ADN polimerasa ejerce

también una actividad 3’-5’exonucleasa que
consiste en remover nucleótidos mal insertados y
reemplazarlo por el correcto.

• Existen proteínas endonucleolíticas que suprimen

nt insertados erróneamente mucho después que la
polimerasa ha pasado.

• Los sistemas de reparación (especialmente el SOS)

31  
también tienen errores ocasionando mutaciones
 Mutaciones

Un mutante diferirá de su progenitor en su

genotipo y fenotipo (no siempre).

ü Genotipo: constitución génica precisa de

un organismo. (conjunto de genes)
ü Fenotipo: propiedades visibles de un
organismo
ü Cepa salvaje o silvestre: cepa aislada de
la naturaleza

Pueden ocurrir cambios perjudiciales,

neutros o beneficiosos.
32  
 Tipos de mutaciones
o Selectivas: confiere al mutante una
ventaja, ej. Resistencia a fármacos: el
mutante es capaz de crecer en presencia de
un antibiótico que inhibe a la cepa
parental.

o No selectivas: No confieren ventajas o

desventajas.

o Nutricionales: cambian el requerimiento de

factores de crecimiento (cepas auxótrofas
y protótrofas).

33  
 Tipos de mutaciones

Puntuales:
-Sustitución de una pirimidina por otra
(transición)

-Sustitución de una pirimidina por una purina

(transversión)

-Inserciones o deleciones de uno o unos pocos

nucleótidos que ocasionan corrimiento del
marco de lectura

De muchos pares de bases:

-Inserciones o deleciones de grandes
segmentos de ADN 34  
 Efectos de las mutaciones
UAC
Codón de
tirosina
CAC UAU
Codón de UAG Codón de
histidina Codón de tirosina
terminación

PROTEÍNA  DEFECTUOSA   PROTEÍNA  INCOMPLETA   PROTEÍNA  NORMAL  

MUTACIÓN  
MUTACIÓN  DE   MUTACIÓN  SIN  SENTIDO   SILENCIOSA  
CONTRASENTIDO  
35  
Corrimiento marco de lectura

THE FAT CAT SAT

36  
Corrimiento marco de lectura

THE FAT CAT SAT

HEF ATC ATS AT

37  
 Recombinación genética

o Proceso mediante el cual los elementos

genéticos de dos orígenes diferentes se
reúnen en una sola unidad.

o Se transfieren genes completos, grupos de

genes o cromosomas completos.

o En los procariotas se da por la inserción

en una célula receptora de un fragmento de
ADN genéticamente diferente derivado de
una célula donadora

38  
 Fuentes de ADN para
recombinación
ü Transformación

ü Transducción

ü Conjugación

39  
 Transformación
o ADN libre se incorpora a la célula
receptora y provoca un cambio genético.
o Una célula capaz de adquirir una molécula
de ADN y transformarse se dice que es
competente (propiedad heredada por el
organismo).
o Intervienen proteínas especiales en el
transporte e incorporación del DNA.
o Durante la replicación de este ADN
híbrido, se forma una molécula parental y
otra recombinante.
o El ADN viral también puede participar en
la transformación mediante el proceso
denominado transfección.

40  
 Competencia inducida

Experimentos con E. coli han encontrado

métodos de inducción artificial :

o Tratamiento con cloruro de calcio y

shock térmico.

o Electroporación: las células se

exponen a campos eléctricos pulsados
para abrir pequeños poros en su
membrana.

41  
a) Fijación del ADN por una
proteína de unión al ADN ligada
a la membrana (autolisina y
nucleasas).
b) Incorporacion del ADN:
Se fija reversiblemente,
luego se vuelve
irreversible.Pasa una
de las dos cadenas mientras la
actividad nucleasa degrada la
otra.

c) Integracion del DNA: la

cadena sencilla se une a
proteína de unión y tiene lugar
la recombinación con regiones
homólogas del cromosoma mediada
por la proteína RecA

d) Célula transformada

42  
Experimento de Griffith

43  
 Transducción
Proceso por el cual el ADN es transferido de una
célula a otra mediante la participación de un
virus.

o Generalizada: ADN del huésped, de cualquier

parte del genoma, pasa a formar parte del ADN
de una partícula madura del virus en lugar
del genoma de éste.

o Especializada: ocurre solo en algunos virus

atemperados, el ADN de una región específica
del cromosoma bacteriano se integra
directamente en el genoma del virus,
generalmente reemplazando algunos de los
genes del virus.

44  
Transducción generalizada

45  
Transducción especializada
Ej. Transducción de los genes
de la galactosa por el fago
atemperado lambda de E. coli

46  
 Conjugación (apareamiento)
Proceso de transferencia
genética que requiere contacto
célula a célula.

o Mecanismo codificado por un

plásmido conjugativo.

o Célula donadora, que

contiene
el plásmido conjugativo y
y una célula receptora
que carece de él.

47  
48  
 Relevancia sanitaria &
ambiental
o Transferencia de propiedades:
Ej.: resistencia a
antibióticos, degradación de
xenobióticos

o Bacterias como indicadores de

mutagenicidad (test de Ames)

49  
 Relevancia sanitaria &
ambiental
o resistencia a antibióticos

50  
 Blancos de los antibióticos

(1) Síntesis de la pared celular

penicilinas
cefalosporinas (β-lactámicos)
vancomycina (péptido no-ribosomal)

(2) Síntesis Proteica

erytromycina (macrolide polyketides)

tetracyclina (aromatic polyketides)
streptomycina, kanamycina (aminoglycosides)

(3) Replicación del ADN

quinolonas (Cipro)
51  
 Blancos de los antibióticos
Explotan diferencias celulares procariotas/
eucariotas

(1) Síntesis de la pared celular

Bloquean síntesis de peptidoglicano

(2) Síntesis Proteica

Se dirigen contra el ARN ribosomal 23S y

proteínas asociadas

(3) Replicación del AND

Inhiben la girasa

52  
 Resistencia a antibióticos

Ocurre cuando un antibiótico pierde

la habilidad de controlar el
crecimiento bacteriano. Las bacterias
“resistentes” siguen creciendo en
presencia de niveles terapéuticos del
antibiótico

53  
 Bombas de resistencia
MultiDroga

Proteínas de membrana que bombean cualquier

molécula lipofílica fuera de la célula

Muy poderoso, expulsa muchas drogas

distintas

54  
 Mecanismos de transferencia
horizontal
1. Transducción

2. Transformación
üNeisseria gonorrhoeae Penicilina-
resistente

3. Conjugación
üEn 1968, 12,500 personas murieron en
Guatemala en una epidemia de diarrea
por Shigella dysenteriae
55  
Resistencia a Antibióticos

Droga Introducción Aparición de resistencia

Penicilina 1943 1946
Estreptomycina 1945 1959
Tetracyclina 1948 1953
Erythromycina 1952 1988
Vancomycina 1956 1988
Methicilina 1960 1961
Ampicilina 1961 1973
Cephalosporinas 1964 fines de los 60’s

56  
 Estrategias para demorar la
expansión de resistencia:

ü No usar antibióticos para tratar

infecciones virales.

ü Evitar dosis bajas de antibióticos por

períodos largos de tiempo.

ü Culminar el tratamiento prescripto al

tratar una infección bacteriana.

ü Reducir/eliminar el uso “preventivo” de

antibióticos en ganado y cultivos.
57  
 Relevancia sanitaria &
ambiental
o Bacterias como indicadores de
mutagenicidad (test de Ames)

58  
 Ensayos de mutagenicidad y
genotoxicidad
Genotoxicidad: toxicidad que afecta al
material genético y que manifiesta una
expresión retardada en el tiempo

o sustancias genotóxicas:
ü mutágenos (capaces de incrementar la tasa
de mutación)
ü carcinógenos (capaces de incrementar la
tasa de aparición de un tumor).

o pueden alcanzar el medio ambiente, ej. el

acuático, y producir efectos directos o
indirectos sobre el hombre, animales,
59  
incluso a bajas concentraciones
 Ensayos de mutagenicidad y
genotoxicidad
-ensayos para determinar el potencial genotóxico de una
sustancia química o muestra ambiental:

•intercambio de cromátidas hermanas en peces o el

ensayo de determinación de micronúcleos en los
linfocitos periféricos de larvas de anfibios

•Células de cebolla y roedores han sido empleado en un

ensayo de determinación de la genotoxicidad en el que
se investigan parámetros citológicos como el índice
mitótico, aberraciones cromosómicas, aneuploidía y c-
mitosis.

Caros, laboriosos, llevan mucho tiempo, como

alternativa se han desarrollado ensayos que
utilizan microorganismos 60  
 Test de Ames
experimento control

Agente mutágeno Extracto de hígado

Cultivo Salmonella his-

Medio sin histidina

Incubación

Colonias de revertientes No hay crecimiento

Salmonella his+

61  
 Test de Ames
experimento

Agente mutágeno Extracto de hígado

Cultivo Salmonella his-

Medio sin histidina

Incubación

Colonias de revertientes Salmonella his+

Crecimiento dosis/potencia dependiente
62  
 Próxima clase

• Arrancamos con metabolismo!

• Repasar óxido-reducción

63  
Recombinación  
-entre secuencias con alta
homología
-mediada por RecA
-fases:
corte de una hebra
apareamiento de hebras
intercambio entre las hebras
resolución de las hebras

64