Técnicas de Reproducción Asistida

Tecnologías de reproducción
asistida en bovinos
David Jessé González Arenas, DMV, M.Sc
Técnicas de reproducción asistida
• Definición
• Cualquier técnica que interfiera con la vía biológica normal de eventos y
estructuras fisiológicas relacionadas con la reproducción para contribuir con el
establecimiento de la gestación con el objetivo de producir descendencia sana
• Objetivo
• Nacimiento de descendencia sana
• Aumento de la eficiencia en los sistemas de producción de carne y leche
• Relacionadas con la manipulación de eventos y estructuras
• Ovulación
• Fertilización
• Desarrollo embrionario
Reproductive Technologies in Animals 1st Edition, 2020, 1-12; Annual Review of Biomedical Sciences, 2008, 10:36
• Críticas
• Modificación genética Sostenibilidad de hatos bovinos
• Mayor eficiencia productiva
• Producción individual
• Rasgos de salud Maximizar parámetros de rendimiento
• Manipulación de ciclos de producción
• Suelen asociarse con
• Manipulación de gametos
• Manipulación de embriones
• Manipulación del ciclo • Inseminación artificial
reproductivo (Ciclo estral) • Transferencia de embriones
• Sincronización del estro
• Sincronización de la ovulación • Fertilización in vitro
• Superovulación • Clonación
• Criopreservación • Transgénesis
• Gametos (Spz – oocitos) • Xenoinjerto
• Embriones
• Sexado de espermatozoides
• Producción de embriones
• In vivo
• ART importantes en investigación y estudio de
• In vitro los procesos reproductivos
Criopreservación de semen
• Incluye los siguientes pasos
• Colecta
• Evaluación del semen
• Cálculo del número de pajillas
• Dilución del semen
• Criopreservación
IVIS Reviews in Veterinary Medicine, 2007:11; REDVET, 2014:1; MVZ Córdoba, 2012, 12(23):12
Criopreservación de semen – Colecta
• Debe ser higiénico y evitar el shock térmico
• Métodos
• Vagina artificial
• Electroeyaculación
• Masaje transrectal
Criopreservación
de semen –
Colecta
• Usado en centros de IA
• Componentes de una vagina
artificial
• Carcasa rígida
• Revestimiento interior de
goma
• Bandas de goma
• Válvula
• Cono director
• Vial de semen
• Bolsa térmica
• Personal mínimo: 2
• Manejo del toro
• Entrenados con nariguera
• Manejo de la VA
• Animales para la monta
• Vaca (no es necesario que esté en celo)
• Novillo
• Otro toro
• Fantoma
• Lugar adecuado para hacer la colecta
IVIS Reviews in Veterinary Medicine, 2007:11; REDVET, 2014:1; MVZ Córdoba, 2012, 12(23):12; https://tecinsarbovinos.wordpress.com/2011/11/
IVIS Reviews in Veterinary Medicine, 2007:11; REDVET, 2014:1; MVZ Córdoba, 2012, 12(23):12; https://tecinsarbovinos.wordpress.com/2011/11/
IVIS Reviews in Veterinary Medicine, 2007:11; REDVET, 2014:1; MVZ Córdoba, 2012, 12(23):12;
https://www.ecestaticos.com/imagestatic/clipping/a2e/ddb/a2eddb25cd294e0c30f851ffb623c5a1/dentro-de-un-banco-de-esperma-para-vacas.jpg?mtime=1579565836
IVIS Reviews in Veterinary Medicine, 2007:11; REDVET, 2014:1; MVZ Córdoba, 2012, 12(23):12; https://www.volkskrant.nl/economie/zo-wordt-
macht-misbruikt-bij-handel-in-stierensperma~bb199e03/?referrer=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
IVIS Reviews in Veterinary Medicine, 2007:11; REDVET, 2014:1; MVZ Córdoba, 2012, 12(23):12; https://www.trouw.nl/nieuws/de-strijd-
om-het-stierensperma~bb6eaf98/?referrer=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
• Ventajas
• Permite observar el comportamiento la conducta sexual y apareamiento del toro
• Requiere la participación activa del toro
• Se aproxima a la situación natural
• Permite evaluación de libido y capacidad de monta (servicio)
• Se desarrolla totalmente la cadena de reflejos y mecánica del coito fisiológico
• Se obtiene eyaculados limpios
• Equipamiento de bajo costo
• Desventaja
• Requiere el uso de animales dóciles y entrenados
Criopreservación de semen –
Colecta
• Uso de electroeyaculador: electrodo conectado a una batería que genera
estimulaciones rítmicas provocadas por descargas no mayores a 20 voltios
• Diseñados para estimular los nervios pélvicos (simpáticos –
parasimpáticos)
• Impulsos de bajo voltaje y amperaje para inducir erección y eyaculación
• Componentes
• Caja de transporte
• Sonda rectal
• Unidad de control
• Cargador de batería
• Cable de energía
• Cable de conexión a la sonda
• Mango, cono y envase de colección
• Técnica: estimulación a través de pulsos eléctricos muy leves en la próstata y
vesículas seminales
• Eyaculación ocurre como un proceso bifásico
• Emisión
• Erección y eyaculación
• Personal mínimo: 3
• Maneja el electroeyaculador
• Maneja el toro
• Recoge el eyaculado
• Lugar adecuado para hacer la colecta (instalaciones)
• Preparación previa
• Recorte de pelos del orificio prepucial
• Lavado prepucial, secar muy bien
• Evacuación de la materia fecal de la ampolla rectal
• Estimulo manual de la próstata, vesículas seminales y ampollas del conducto deferente
• Introducción del electrodo
• Posicionamiento del mango (electrodos)
• Líneas metálicas dirigidas ventralmente (limpias y libres de corrosión)
• Se introduce el mango completamente en el recto del toro
• Aseguramiento del mango con la cola
• Inicio de estímulo a mínima intensidad, rítmicamente se incrementan de acuerdo a la
reacción del animal
• Cada estímulo debe durar entre 1 y 2 segundos, se deben aplicar entre 5 y 10 estímulos por
grado de intensidad
• La estimulación debe ir en aumento
• Líquido preseminal
• Semen
• Cuidados en la colecta por EE
• Alta frecuencia: afecta concentración y madurez de los spz
• Baja frecuencia: afecta la motilidad y viabilidad
• Se debe diferenciar entre la primera y segunda fracción del eyaculado
• Primera fracción: incolora, traslucida (no se debe recoger, dilución)
• Segunda fracción: blanco-amarillenta, cremosa u opaca (se debe colectar solo la segunda fracción
(seminal))
• Evitar la exposición a la luz mientras se traslada la muestra al laboratorio
• Retirar el mango del electroeyaculador
• Ventajas
• No requiere de animales adicionales
• No es físicamente demandante
• Fácilmente adaptable a la mayoría de instalaciones para manejo de bovinos
• Electroeyaculación automática
• Desventajas
• Descanso sexual 1-2 días antes de electroeyacular de nuevo al toro
• Cerca del 2% de toros fértiles no electroeyaculan (fallo en la elctroeyaculación)
• Vocalización durante el procedimiento
• Cortisol
• P4 de origen adrenal podrían ser indicativos de estrés y dolor
• Requiere de dos personas
• Efectúa el masaje rectal
• Recoge el semen
• Consiste en aplicar un masaje longitudinal repetitivo de delante hacia atrás
principalmente sobre las ampollas del conducto deferente, las vesículas
seminales y la próstata a través de la mucosa rectal
• Se desencadena la eyaculación
• Recoge el semen
• Ventajas
• No requiere equipos costosos
• Desventajas
• No es práctica en todas las situaciones
• Irritación de la mucosa rectal
• No hay protrusión del pene (muestras contaminadas)
• Machos agresivos no eyaculan con esta técnica
• Destreza en palpación de machos bovinos
• No se puede evaluar la libido y la capacidad de apareamiento
Criopreservación
de semen –
evaluación seminal
• La evaluación seminal incluye la
determinación de
• Volumen
• Apariencia (Color)
• Motilidad
• Masal
• Individual progresiva
• Concentración
• Morfolofía
Criopreservación de semen – evaluación seminal
• Parámetros
• Volumen 3-6 ml
• Olor Sui generis
• pH 6.4-6.9
• Apariencia (Indicativo de concentración)
• Cremosa Muy bueno Mayor a 750x106 spz
• Lechosa Bueno 400-750x106 spz
• Blanquecino Regular 250-400x106 spz
• Translúcido Malo Menor 250x106 spz
• Parámetros
• Motilidad masal (Sin diluir, una gota lámina portaobjetos)
• Microscopio 4x-10x
• Muy bueno ondas oscuras marcadas con rápido movimiento
• Bueno ondas oscuras marcadas, con movimiento moderado
• Regular ondas claras con movimiento ligero
• Malo no hay ondas, se observan los spz inmóviles
• Motilidad individual progresiva –MIP- (Diluido, con lamina cubreobjetos)
• Muy bueno >80%
• Bueno 60-79%
• Regular 40-59%
• Malo <40%
Criopreservación de semen –
evaluación seminal
• Parámetros
• Concentración
• Número de spz/ml de semen
• Conteo directo de células
• Hematocitómetro
• Cámara de Neubauer®
• NaCl 3%
• Dilución de la muestra de semen 1:200
• Parámetros
• Morfología (eosina-nigrosina)
• Anormalidades primarias
• Anormalidades secundarias
% Anormalidades Total de
Calificación
primarias anormalidades
Muy bueno <10% <25%
Bueno 10-19% 26-39%
Regular 20-29% 40-59%
Malo >29% >59%
Criopreservación de semen – cálculo pajillas
• Semen colectado
• Volumen 10ml
• Concentración 800x106 spz/ml
• Morfología 80% normales
• MIP 80%
• Total de spz viables
• Volumen (ml) x concentración x spz normales x spz móviles = Total spz normales, motiles
• 10 x 800 x 0.8 x 0.8 = 5120 x106 spz normales, motiles en eyaculado
• Total de pajillas
• 20 x106 spz en una pajilla (0.5 ml o 0.25 ml)
• Pajillas de 0.5 ml
Criopreservación de semen – cálculo de pajillas
• Total de pajillas
• Total spz viables / [] spz en pajilla
• 5120 millones / 20 millones = 256 pajillas
• Volumen final pajillas
• Total de pajillas x volumen de la pajilla a usar = volumen final pajillas
• 256 x 0.5 ml = 128 ml
• Volumen de diluyente
• Volumen final pajillas – volumen inicial de semen = volumen del diluyente
• 128ml – 10 ml = 118 ml
• Diluyente
• Tipo TRIS (buffer)
• Contiene sustancias iónica y no iónicas para mantener la osmolaridad
• Fuente de lipoproteína de alto peso molecular
• Yema de huevo
• Leche descremada
• Fuente de energía
• Fructosa
• Glucosa
• Crioprotector
• Penetran membrana (1,2-Propanodiol, DMSO, Etilen glicol, glicerol [] final diluyente 7%)
• No penetran la membrana (Sacarosa, glucosa, dextrosa, Plivinil-pirrolidona, Dextran,
Polietilen-glicol)
• Diluyente
• Una fracción (contiene crioprotector [glicerol] 7%)
• Añade lo más pronto posible después de la colecta a temperatura ambiente
• Dos fracciones (A: Buffer, B: crioprotector [glicerol] 14%)
• Fracción A se añade a temperatura ambiente
• Fracción B se añade cuando el semen halla alcanzado una temperatura entre 4-5°C
• Independientemente del tipo de dilución
• Comenzar curva lenta de frío (temperatura 5°C, 2 horas después de añadido el diluyente)
• Periodo de equilibrio (2-24 horas) se realiza a temperatura de 5°C
• Crioprotector difunde a través de la membrana del spz
• Congelación del semen en vapores de nitrógeno (-120°C) por 10 minutos
• Sumergen en nitrógeno líquido (-196°C)
Semen sexado
• Controlar el sexo de la cría
• 2001 tecnología de semen sexado de forma comercial
• Métodos del sexaje
• Citometría de flujo
• Colorante se adhiere al DNA
• Permite diferenciar la cantidad de DNA presente en el cromosoma
• 4% más de DNA en los cromosomas X
• Separa uno a uno los spz
• Rayos UV detecta la cantidad de DNA a través de la cantidad de luz emitida por el colorante
• Añade otro colorante (Ioduro de propidio)
• Separa los SPZ vivos de los muertos
Semen sexado
• Eficiencia del 85-90% semen bovino
• Solo el 50% de los spz se logran sexar
• Resto debe ser descartado
• Requiere ser estandarizada para cada raza y especie
• Inconvenientes
• Equipo costoso
• Baja velocidad con que se separan los spz
• Alteración de la capacidad fertilizante de cada spz
• No se ha podido generalizar a todos los toros (solo toros de alta fertilidad)
• Spz menor fertilidad
• Incrementar la reproducción
de vacas superiores
• Productividad de una vaca: 10
crías
• ET: Cientos
• Estimular vacas para que
hagan ovulaciones múltiples
• Ganancia genética
• Exportar
• Pruebas genéticas
• Producir gemelos
Propósito de la transferencia
de embriones
Theriogenology, 2014, 81(1):152; Theriogenology, 2011, 76(9):1583; Vet Clin N Am – Food, 2016, 32(2):365
Procesos
• Sincronización • Receptoras
donadora-receptora • Reproductivamente sanas
• Estro • Sincronizadas con la
• Ovulación donadora
• Transferir embrión
• Donadora • Diagnóstico de preñez
• Superovulación
• Inseminación
• Colección de embriones
• Transferencia
• Criopreservación
Proceso
general
Métodos de
Superovulación
• Hormonas
• FSH 3 o 4 días cada 12
horas
• Pluset®
• Folltropin®
• Ovagen®
• Tratamiento entre el día 9
y 14 del ciclo
Superovulación
CIDR PGf2a CIDR
Lavado de embriones
AM P4
AM AM AM AM GnRH IA
PGf2a PGf2a BE2 PM PM PM PM IA IA
Donadora Estro FSH
-28 -17 -14
0 1 10 16 17 18 19 20 21
0 4 5 6 7 8 9 15
Transferencia de embriones
CIDR CIDR
AM PM
PGf2a PGf2a BE2 PGf2a GnRH Detectar celos
Receptoras Estro
-28 -17 -14
0 10 16 17 18 19 20 21
4 5 6 7 8 9 15
Superovulación
Lavado de
Embriones:
Elementos
Lavado de
Embriones
Lavado de
Embriones
Lavado de
Embriones
Lavado de
Embriones
Lavado de Embriones
Lavado de
Embriones
Lavado de
Filtro
Evaluación de
embriones
Evaluación
• Etapa de desarrollo
1. No fertilizado
2. 2-12 células
3. Mórula temprana
4. Mórula
5. Blastocisto temprano
6. Blastocisto
7. Blastocisto expandido
8. Blastocisto eclosionado
9. Blastocisto eclosionado y expandido
Categoría 1 y 2
• No fertilizados
• 2 - 12 células
Categoría 3 y 4
Categorías 5 y 6
Etapas de desarrollo
Mórulas
Blastocistos
Lavado de embriones
PBS + Lavados Tripsina

0.4% albúmina Grupos de diez embriones 45 secs
1 2 3 4 5
10 9 8 7 6
Embriones
lavados sin
mayor
cantidad de
detritos
Calidad
• Código 1 Excelente o Bueno
• Código 2 Regular
• Código 3 Pobre
• Código 4 Muerto o degenerado
Calidad
Calidad
Transferencia
• Novillas
• 6-7 días después del celo
• Distocias
• Buen desarrollo
• Nutrición
• 10 receptoras/vaca
Resultados
• Embriones 0-50
• Promedio 8
• Transferibles 5
• Tasa de preñez frescos 60-70%
• Tasa de preñez congelados 50-60%
• Mejor edad 3-8 años
• Variación
• por raza, especie
• Estrés
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