Universidad de Buenos

Aires Facultad de Medicina

Guía de Trabajos Prácticos
Departamento de Biología Celular e Histología Histología - 2020
1° Unidad Académica

GUIA DE AUTOEVALUACIÓN

1. Describa cómo es posible mejorar el poder resolutivo (PR) de un microscopio óptico.

La resolución depende no sólo del sistema óptico, sino también de la longitud de onda de
luz y de otros factores como el espesor de la muestra, la calidad de la fijación y la
intensidad de la tinción. Con una luz de longitud de onda de 540 nm, luz proveniente de
un filtro verde para la cual el ojo es muy sensible, y con lentes objetivo y condensador
apropiados, la máxima resolución posible con un microscopio de campo claro sería de
alrededor de 0,2 μm.
Es posible mejorar el poder resolutivo disminuyendo el LR, otra forma es estableciendo la
apertura numérica del lente y para ello se emplea otro juego de lentes denominado
condensador el cual posee la misma apertura numérica que el objetivo, otra forma
depende de la intensidad de la onda de luz utilizada sobre la muestra observada, por
ultimo se puede utilizar aceite de inmersión para la mejorar la imagen cuando esta es
demasiado pequeña como para ser vista desde el menor número del lente.

2. Defina Limite de Resolución (LR) y mencione diferencia con aumento (A).

LR es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse
por separado y se diferencia del A ya que este ultimo indica en que medida se puede
aumentar la imagen de la muestra observada.

3. Señale en qué microscopio con los siguientes LR se pueden apreciar más detalles: a)
LR:0,4 μm; b) LR:0,3 mm; c) LR:0,4 nm; d) LR:0,8 μm.

μm significa micrómetro o micra

4. Realice un cuadro comparativo sobre el procesamiento de una muestra para MO y MET.

Microscopio Óptico Microscopio Electrónico de Transmisión

a. Obtención de la muestra a. Obtención de las muestras

b. Fijación b. Fijación química

c. Deshidratación c. Lavado

d. Inclusión d. deshidratación

e. Corte e. Inclusión

f. Desparafinacion e hidratación f. polimerización

g. coloración g. Corte

h. Deshidratación h. Contraste-decoloración

i. montaje
5. Complete el siguiente cuadro:
Características M M
O E
T
Fuente de radiación Fotones Electrones

Medio presente en el tubo

Lentes Condensador, objetivo, ocular Conjunto de lentes electromagnéticas,

cámara de vacío, pantalla fluorescente

Límite de resolución 0.2 mm 0.05 nm

Aumento 1.000 450.000

Nivel de observación Imagen mejor que foto Foto mejor que imagen

Fijador empleado Formaldehido Fijación con glutaraldehído seguida de

un enjuague en una solución
amortiguadora (buffer) y la fijación con
tetraóxido de osmio
Sustancia de Parafina y Congelación resinas, principalmente de tipo acrílicas
inclusión Empleada o epoxy

Espesor del corte 5 a 20 µm 0,5 y 1 µm

I n s t r u m e n t o de c o r t Microtomo Microtomo
e empleado

Obtención de contraste PAS y tricomicra de Mason Sombreado Metálico

(colorantes empleados)

Ventajas Mejor percepción de la imagen, más
cómoda la observación y se perciben con
nitidez algunos detalles
Desventajas La manipulación de reactivos se torna
peligroso por la elevada condición toxica
de los mismos
Alcanzar ampliaciones hasta 5100 veces
más potentes
El aumento obtenido con estos
microscopios es reducido, debido a la
longitud de onda de la luz visible que
impone limitaciones

6. Mencione los pasos de la técnica de rutina y explique el objetivo de cada uno de éstos

 Obtención de la muestra: Por biopsia (de un tejido vivo), necropsia (de un tejido
muerto), autopsia (tejido para observación inmediata), biopsia incisional (de una
sección de la lesión), biopsia excisional (es la lesión completa).

 Fijación: Mantener la estructura en el estado que tenia originalmente. Evitar la lisis

celular. Osmolaridad similar a la del tejido para evitar el colapso de estructuras.
Existen fijadores químicos y físicos que evitan la acción de enzimas proteolíticas por
formar enlaces químicos entre células.

 Deshidratación: Es necesario deshidratar la muestra para que se adapte al siguiente

paso que es la inclusión y se logra mediante el pasaje de alcoholes de creciente
graduación hasta llegar a la parafina. Se lo conoce como aclaración ya que el tejido
es translucido y se lleva a los lípidos de la membrana
  Inclusión: Se caliente la parafina para que no sea sólida, a continuación, se sumerge
la muestra en parafina que luego de otros pasajes, la parafina liquida pura
desplazara al xilol. Luego se pasa el líquido con la muestra a un bloque donde se
solidificará la parafina.

 Corte: Micrótomo corta los bloques con diferencia de micrones (5um para MO). Se
coloca la muestra en un baño termostático a 40° para que se estire y luego al
portaobjeto gelatinado o pretratado con albúmina para luego dejarlo secar a
temperatura ambiente hasta que se fije a este.

 Desparafinacion e hidratación: Los colorantes son acuosos y no debe haber parafina

para que actúen. Se sumerge la muestra con xilol en un recipiente (denominado
Coplin) que remueve la parafina. Luego se rehidratan en alcoholes de graduación
decreciente para finalmente pasar por agua destilada.

 Coloración: Por rutina se tiñen con hematoxilina y eosina. La Hematoxilina es un

colorante natural y la eosina es uno artificial derivado de la Fluoresceína. Primero
hematoxilina, luego agua o sustancia alcalina débil donde el color cambia del rojo al
azul. Luego en eosina que le da color rojo. Los fundamentos de ambas se basan en
principios químicos.

 Deshidratación: Antes del siguiente paso que es el montaje y se usa una sustancia
hidrofóbica por lo que se pasa la muestra por alcohol con graduación creciente y
luego por xilol que remueve a este.

 Montaje: Se agrega una gota de bálsamo de Canadá (sustancia hidrofóbica) y luego

se agrega una delgada lamina de vidrio llamada cubreobjeto evitando la formación
de burbujas de aire. Luego se solidifica y puede observarse con el microscopio
óptico.

7. Defina los conceptos de acidófila y basófila.

 La capacidad de los grupos aniónicos de reaccionar con una anilina o colorante
básico como la hematoxilina se denomina basófila (Afinidad por lo básico)
 La reacción de los grupos catiónicos con un colorante ácido como la eosina recibe
el nombre de acidófila (Afinidad por lo acido)

8. Describa diferencias en la obtención de la muestra para observar histología y citología.

Existen tres vías de obtener una muestra en histología, las cuales son por biopsia,
autopsia y necropsia. La biopsia se divide en otros tipos:

 Punción y aspiración con aguja fina (PAAF). Tejidos líquidos como la sangre se
obtienen por este método.

 Punción y aspiración con aguja gruesa (PAAG). La médula ósea roja, al ser un
tejido más viscoso que la sangre, se obtiene con una aguja de mayor calibre.

 Citología exfoliativa. Las células que se pueden desprender de los epitelios (como
las de endocérvix y exocérvix), de cavidad oral o de alguna lesión, se obtienen a
partir de un raspado o cepillado.

Otros tipos de biopsias son por sacabocado, por punción y absorción, por raspado y
por trepanación.
9. Mencione con que técnica especial identificaría cada uno de los siguientes
componentes tisulares. Mencione y justifique si en alguno de estos casos debe
realizarse algún cambio específico en los pasos de la técnica histológica:
 Triglicéridos de un adipocito: La tinción de los lípidos para microscopía óptica
requiere el uso de colorantes liposolubles, como los Sudanes o el "Rojo-O al
aceite". Se deben Fijar e incluir por congelación.

 Glicoproteínas de secreción de una célula mucosa: Se tiñen con PAS positivo

o ácido periódico de Schiff. Sumergirlo en ácido periódico y los grupos
aldehídos se tiñen de rojo magenta agregándole reactivo de Schiff.

 Peroxidasa de los peroxisomas de un macrófago:

 ADN de células que proliferan en cultivo: Se tiñen con Feulgen, se debe

sumergirlo en ácido clorhídrico y también se tiñen por el reactivo de Schiff.

 Fibras de colágeno de la matriz extracelular: Tricrómico de Masson que las

tiñe de un color verde-azulado.

10.Complete el siguiente cuadro:

Tinci Fundamento de la técnica
ón
HyE Es uno de los métodos más populares de tinción
utilizado en histología y medicina diagnóstica. El
método supone la aplicación de la tinción de
Hematoxilina que tiñe estructuras acidas y el uso
de eosina que tiñe componentes básicos.
Tricrómico de Masson Emplea hematoxilina de Mayer, fucsina ponceau
y azul de anilina
PAS La utilidad de la reacción de PAS consiste en que
permite visualizar glúcidos de todo tipo,
glucógeno y glucoproteínas en los tejidos a los
que tiñe de color magenta
Sudán El principio por el cual tiñen a los lípidos es un
principio físico. Los sudanes son más solubles en
los lípidos que en los solventes que los contienen,
y por ello, tienden a unirse en el tejido a los sitios
donde se encuentran lípidos
Inmunohistoquímica El complejo antígeno-anticuerpo se identifica en
el tejido mediante microscopia, localizándolo allí
donde se ha unido a moléculas específicas
presentes en las células del tejido en estudio
Tinción vital Al provocar que determinadas células o
estructuras adquieran los colores de contraste, se
puede estudiar su ubicación y morfología mientras
están desempeñando su función. El propósito más
común es revelar detalles de la citoestructura que
Utilid
ad
Hematoxilina tiñe en tonos azul y
púrpura, como por ejemplo los
núcleos celulares. La eosina tiñe en
tonos de color rosa, gracias a su
naturaleza aniónica o ácida, como el
citoplasma.
Tiñe los núcleos de color azul, los
citoplasmas rojos, las fibras de
colágenas de color celeste, los
glóbulos rojos y el musculo de color
fucsia
Es una fucsina básica. Cuando se
pone en contacto con el aldehído
toma un color magenta intenso. Se
usa en las coloraciones de PAS y
Feulgen
Permite la demostración de lípidos en
los tejidos
La inmunohistoquímica es una
técnica basada en la tinción de tejido
fijado e incluido en parafina,
procedente de biopsias de ganglios
linfáticos, médula ósea y otros
tejidos hematopoyéticos, con
anticuerpos específicos marcados con
una enzima que torna visible un
sustrato invisible.
Es el proceso de teñir tejidos vivos.
Se utiliza a menudo una combinación
de varios colorantes para revelar más
detalles y características de las que se
obtendrían con la utilización de uno
 de otra manera no resultarían evidentes, sin
embargo, la tinción vital puede revelar además
donde aparece un determinado producto químico
o donde se lleva a cabo una determinada reacción
química dentro de las células o tejidos.
Técnica de Se basa en la capacidad que tienen algunos
actividad enzimática enzimas del tejido de mantener funcional su
centro activo tras el proceso de fijación. Estos
enzimas y las células que los poseen se ponen de
manifiesto mediante la adición de un sustrato que
produce una reacción enzimática, que
normalmente libera electrones y convierte a unas
sustancias solubles e incoloras en complejos
insolubles y coloreados.
solo. Una contra tinción es una
tinción que consigue que las células
o estructuras sean más visibles,
cuando no se consigue que sean
totalmente visibles con la tinción
principal
El sustrato es específico para cada
enzima, pero las moléculas que dan
color pueden usarse para varios tipos
de enzimas. Las moléculas que dan
color, durante la reacción enzimática,
se depositan en el lugar preciso
donde se produjo dicha reacción, es
decir, donde se localiza el enzima.