FACULTAD DE CIENCIAS DE LA

SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE

MEDICINA

TEMAS:

CASO CLÍNICO

CURSO:

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

DOCENTE:

Blgo. BRENDA MORALES TAPIA

ESTUDIANTS :

Farfán Carreño Viviana Alexandra

Changanaque Gonzales Eliana
Escobar Pulache Alexia Isabel

PIURA - 2024-I
 SEMINARIO 1

Temática: Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica.

INTRODUCCIÓN:

El uso de la instrumentación es una parte atractiva y fascinante del análisis químico que
interacciona con todas las áreas de la química y con muchos otros campos de la ciencia pura y
aplicada. Los análisis de suelos marcianos, de los líquidos biológicos de caballos de carreras y
de atletas olímpicos, del aceite para los motores de aeronaves comerciales y militares, y aún
del Sudario de Turín, son ejemplos de problemas que requieren técnicas instrumentales. A
menudo es necesario usar varias técnicas de esa clase a fin de obtener la información
requerida para resolver un problema de análisis. La instrumentación analítica juega un papel
importante en la producción y en la evaluación de nuevos productos y en la protección de los
consumidores y del medio ambiente.

Esta instrumentación proporciona los límites de detección más bajos requeridos para asegurar
que se disponga de alimentos, medicinas, agua y aire no contaminados. La fabricación de
materiales cuya composición debe conocerse con precisión, como las sustancias empleadas
en los chips o pastillas de los circuitos integrados, se controla con instrumentos analíticos. La
amplia inspección de cantidades de muestra que se ha hecho posible por la instrumentación
automatizada, frecuentemente libera al analista de las tediosas tareas relacionadas - en un
principio - con el análisis químico. Entonces el analista puede estar libre para examinar los
componentes del sistema analítico, como los métodos de muestreo, el procesamiento de
datos y la evaluación de los resultados.
 I. ESPECTROFOTOMETRÍA

• “Espectro” Espectro de radiación electromagnética

• “Foto” Luz visible
• “Metría” Medición

Definición:

Es una de las técnicas experimentales más utilizadas

para la detección específica de moléculas. Se
caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de
agregación (sólido, líquido, gas).

Los fundamentos físico-químicos de la

espectrofotometría son relativamente sencillos. Las
moléculas pueden absorber energía luminosa y
almacenarla en forma de energía interna. Esto
permite que se inicien ciclos vitales de muchos
organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en
plantas y bacterias
ESQUEMA DE UN ESPECTROFOTOMETRO

Fundamento

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA:

En la pantalla se pueden mostrar dos dimensionales:

Una escala de TRANSMITANCIA (expresada en porcentaje), en la cual se expresa la cantidad

de energía que logró atravesar el medio absorbente de la cubeta óptica y llegar hasta la foto
celda. Y una escala de ABSORBANCIA que expresa el logaritmo de (100 / %T), en la cual se
expresa la cantidad de energía que quedó absorbida en las moléculas del medio absorbente,
sin lograr atravesarlo.

Son escalas inversas y si estuvieran

expresadas en la misma dimensional

nos mostrarían que, por ejemplo, una sustancia que absorba el 30 % de la energía del rayo,
mostraría en la pantalla 70 % de transmitancia y 30 % de absorbancia. El concepto se aplica de
la misma forma y por esa razón una sustancia que logre absorber el 50% de la energía del rayo
luminoso nos dará una transmitancia del 50% y una absorbancia de 0.3, el logaritmo
correspondiente a (100 / 50% T) absorbido. Como norma general usaremos la escala de
Absorbancia, porque las cifras obtenidas en logaritmos pueden graficarse en mejor forma
cuando el procedimiento de fotometría es utilizado en estudios de investigación médica

BASES DE LA FOTOMETRÍA

La mayoría de los compuestos biológicos, tales como las proteínas, las grasas, los
carbohidratos y los ácidos nucleicos, absorben energía en alguna parte de las regiones
ultravioleta, luz visible e infrarroja. Cuando el rayo de luz llega a la cubeta óptica lleva el 100%
de su energía. A medida que penetra en la sustancia, las moléculas presentes gradualmente
absorberán cada vez más energía por lo que la intensidad de la energía del rayo luminoso
progresivamente irá perdiendo su potencia, en función de tres variables:

a) el grado de concentración de solutos en la sustancia que se analiza,

b) la longitud del medio absorbente o sea la distancia que el rayo debe recorrer – que
depende del ancho del tubo que se está utilizando – y Absorbancia Transmitancia A mayor
concentración.

c) la longitud de onda (o color) del rayo que se está usando, porque si la sustancia que se
analiza tiene un color determinado, se comporta de forma diferente (en cuanto a la cantidad
de energía que puede absorber) frente a los diferentes colores de luz que se puedan hacer
pasar a través de ella. En eso se basa la afirmación de que la fracción de la luz incidente (Io)
absorbida por una solución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con la
concentración de la especie que absorbe y con el espesor de la capa absorbente.

Las relaciones anteriores se expresan en las Leyes de Beer y Lambert de la manera siguiente:

• LEY DE BEER: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio

absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la
concentración del medio absorbente aumenta.
• LEY DE LAMBERT: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta. La combinación de ambas leyes puede expresarse en
forma integral de la manera siguiente:

II. ELECTROFORESIS
Definición:
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de
estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se
use.

La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un
electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que
contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de
corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira.
La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son
reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.

Fundamentos y Conceptos Básicos

La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado
gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los
procedimientos más tradicionales de electroforesis. Esta técnica permite separar
bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz,
y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de estudiar por los
procedimientos clásicos de electro migración en soporte.

La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de

electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies de la
muestra en disolución, portadoras ELECTROFORÉSIS Illán Morales Becerril de una
carga
 eléctrica global, bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte
(medio de desplazamiento) adecuado. En electroforesis capilar la tira se reemplaza
por un tubo capilar abierto en sus extremos, fabricado con un diámetro pequeño (15
a 150µm). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y está lleno de una solución buffer. Un
detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento
catódico. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que
muestra el registro de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen
hacia el cátodo serán detectadas.

Métodos de Detección
En la detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar en
una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco. La detección por
fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente láser muy intensa,
asociada a menudo a un procedimiento de preformación de derivados de los analitos
portadores de un fluoróforo.

Técnicas Electroforéticas

❖ Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE) : Es el procedimiento

de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por el
electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato),
básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico
crece con el pH del medio electroforético.

❖ Eectrocinética micelar (MEKC) En esta variante del procedimiento anterior se

añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico para formar micelas
cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a
los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad
hidrófilahidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas
que tienen tendencia a migrar sin separación, como es el caso de algunos
enantiomeros.

❖ Electroforesis capilar en gel (CGE) Esta es la transposición de la electroforesis

en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno con un
electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que
ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de
convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden
separar de este modo. Isoelectroenfoque capilar (CIEF) Esta técnica, también
conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de
pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. Cada
compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto
isoeléctrico (al pI su carga neta es nula).

Seguidamente, bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el

campo eléctrico, se desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias
obtenidas con este procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren
entre sí 0.02 unidades de pH.
 - III.ELISA (Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas)

Definición:

Se trata de una técnica de laboratorio que fue diseñada por científicos suecos y holandeses en
1971, que permite detectar pequeñas partículas llamadas antígenos, que habitualmente son
fragmentos de proteínas. La identificación es específica, es decir, consigue que pequeños
segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser confundidas con otras.
Molécula de anticuerpo inmunoglobulina con antígeno

Para poder identificar los antígenos se utilizan moléculas con dos componentes acoplados:
un anticuerpo (que se une al antígeno de forma específica) y una enzima (que se activa y
señala la unión al antígeno). Antes del descubrimiento del ELISA se utilizaban moléculas
radioactivas en vez de enzimas, lo que suponía un riesgo añadido innecesario en el laboratorio
y un mayor coste.

Entre otras, este tipo de prueba serológica, se usa por ejemplo para la detección o diagnóstico
del COVID-19, ya que es capaz de detectar anticuerpos en la sangre cuando ya se ha
producido una reacción inmune al patógeno.

Los diferentes tipos de ELISA son:

➢ ELISA directo: es la forma más básica de realizar la técnica. Consiste en recoger una
muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (un recipiente pequeño) en frente de una
muestra igual pero contaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en la que
se sabe que no hay germen. Se aplica el anticuerpo con la enzima en los tres pozos y
se compara la muestra a estudio con las otras dos.
➢ ELISA indirecto: se realiza de forma similar al ELISA directo, pero en este caso se añade
primero un anticuerpo sin enzima y después uno con enzima. De esa forma, la señal
que emite el enzima es mucho más potente y la prueba es más sensible.
➢ ELISA sándwich: en este caso en los pocillos primero se añade un anticuerpo y después
la muestra, para que los antígenos queden ya retenidos en el fondo del pozo. Después
se añade el anticuerpo con la enzima. Es la forma más eficaz de realizar la prueba.
➢ ELISPOT: se trata de un tipo de ELISA que permite conocer de forma cuantitativa el
antígeno, incluso identifica el número concreto de células donde se encuentra.

-
IV.PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Definición:

La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos
nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde. En procariontes se han
encontrado al menos 12 proteínas involucradas en la replicación. Estas proteínas actúan en
diferentes actividades, como:

1) la identificación del sitio de origen de la replicación

2) el desenrollamiento de la doble hélice
3) la estabilización de la estructura desenrollada
4) 4) la generación de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo 3’ libre que
sirve de iniciador para que la ADN polimerasa comience su actividad catalizadora
5) el avance de la bifurcación replicadora por desenrollamiento;
6) los pasos finales del ensamblaje de dos cadenas complementarias
7) la identificación de los sitios de terminación
8) el superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN
ETAPAS DE LA TÉCNICA

SE EXTRAE EL ADN GENÓMICO DESDE

LA MUESTA A ANALIZAR

utilizada para separar el ADN, el ARN, o

moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga
eléctrica

Utilidad del PCR

Teniendo en cuenta su extrema sensibilidad, la PCR permite detectar la presencia de

material genético de microorganismos en una muestra. Esto por un lado permite el diagnóstico
de infecciones y por el otro ayuda a comprobar la eficacia de un determinado tratamiento frente
a esa infección.

REFERENCIAS:

• UMSM GUIA PRÁCTICA DE LABORATORIO NO. 2 ESPECTROFOTOMETRÍA , Lima

• Laboratorio de Equilibro y cinética ,México 2010

• Díaz AS, Rentería LF, Cortez JA, Palacios y. ES. PCR: reacción en cadena de la
polimerasa [Internet]. Gob.mx. [citado 5 de septiembre de 2021]. Disponible en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

• Diz Mellado OM, NPunto. Técnicas de biología molecular en el diagnóstico

de enfermedades infecciosas. Técnicas de biología molecular en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas. 2020;100(100):1–100.

• Corralo DS. ELISA [Internet]. Webconsultas.com. Webconsultas Healthcare; 2014

[citado 5 de septiembre de 2021]. Disponible en:

https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/elisa-13695

• Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética (conceptos , técnicas

y aplicaciones en ciencias de la salud, Jose Luque y Ángel herrares .