Terapia génica

-La terapia génica es el conjunto de técnicas que utilizan la transferencia de material genético (o cualquier otro
método que permita editar o modificar la información genética del paciente) para prevenir o curar enfermedades
genéticas.
-Va directamente a la raíz del problema mediante la transferencia de la versión correcta de un gen defectuoso,
que es el que está causando la enfermedad. La finalidad de esta transferencia de material genético es restablecer
una función celular que estaba abolida o defectuosa, introducir una nueva función o bien interferir con una
función existente.
-Entre los principales obstáculos de esta aproximación se encuentra la dificultad de dirigir el material genético
específicamente a aquellas células o tejidos donde hace falta que el gen ejerza su función, o que la regulación
del gen introducido se aproxime a la forma en que se regula el gen en las personas sanas. Se realiza en las
células y/o tejidos con el objetivo de tratar una enfermedad o realizar un marcaje. *Recordar que un gen se
amplifica por PCR.
Objetivo
El objetivo de la terapia génica es la transferencia de una copia funcional de un gen que reemplace a una copia
defectuosa. Para poder hacer la transferencia se necesita un vehículo que es más conocido como un vector, el
cual va a permitir transportar el material genético a la célula diana.
Los vectores más conocidos son los virus, los cuales han sido
modificados para que no produzcan una respuesta del sistema
inmune y sólo sirvan para entregar el material genético a una
célula específica.
*También existen vectores no- virales.
Un virus infecta ciertas células específicas debido a los
receptores a los que se va a unir.
Ciclo infectivo de los virus
1.Adsorción
2.Penetración
3.Desintegración de la cápside viral y liberación del material genético
4.Síntesis: a) Transcripción b) Traducción C) Replicación.
5.Ensamblaje de la cápside y empaquetamiento del material genético
6.Liberación del virión.
→virión es la partícula vírica morfológicamente completa e infecciosa.
Consideraciones en la terapia génica

• Factores a tener en cuenta a la hora de plantearse el uso de terapia génica:

• Conocer y entender la causa de la enfermedad.
• Conocer la estructura y función del gen a introducir.
• Eficiencia de la transferencia del gen a la célula blanco
 • Control de la expresión del gen.
• Control y prevención de la respuesta inmune
• Evaluar el riesgo de efectos secundarios por el uso de vectores virales
• Ensayos en animales
• Ensayos clínicos
Estrategia de terapia génica
→Reemplazo del gen (es difícil lograrlo)
→Incremento de la expresión del gen
→Corrección del gen defectuoso *Lo más común en terapia génica
→Eliminación dirigida de las células que presentan el gen defectuoso (ej: uso combinado de terapia génica y
drogas)
→Inhibición de la expresión de un gen
• Antisense: oligonucleótidos formados por la secuencia complementaria (antisense en inglés) de un gen
especifico. Estos aligo al unirse a su secuencia complementaria impiden la transcripción del gen en cuestión.
• Ribozimas: enzimas encargadas de cortar mRNA especifico impidiendo la producción de proteínas
defectuosas.
• siRNA interferencia (small interference RNA): RNA pequeños que están conformados por una secuencia
complementaria al RNA que se quiere afectar. Al interaccionar el siRNA con su RNA complementario forman
una estructura de doble hebra que es reconocido por enzimas celulares y es degradado en pequeños fragmentos.
Terapia génica ex vivo
→Transfección del gen de interés a partir de una biopsia del tejido
del paciente mediante un vector, donde posteriormente son
trasplantadas al paciente.
→Una de las ventajas es que esta terapia es más fácil en
comparación con la terapia in vivo, ya que se va a tener un mayor
control de las células involucradas en el proceso. Porque se van a
extraer las células del ex vivo, se cultivan, se modifican, se les
agrega el gen y luego estas células modificadas se inyectan al
paciente, por lo que si o si se tiene la certeza de que si se pudo agregar el gen a las células.
→La principal desventaja es que no todas las células que se obtienen de las autopsias son fácilmente
cultivables.
*Si la modificación del gen no afectó el péptido el organismo no tendría motivos de generar rechazo a su
incorporación.
Terapia in vivo
→Se basa en la entrega directa del gen de interés al organismo
mediante un vector.
→El problema que presenta esta técnica es que es muy difícil
conseguir que un vector localice a un único tipo de células blanco,
ya que esto no es controlable en comparación al ex – vivo y sería de
sus principales desventajas.

Terapia génica: Vectores

Hay una gran diversidad de situaciones en las que se puede aplicar la terapia génica, por lo que no hay un solo
tipo de vector adecuado. Dentro de algunas características que se pueden definir para un “vector ideal” y luego
adaptarlas a situaciones concretas:
-Que sea reproducible
-Que sea estable
-Que permita la inserción de material genético sin límite de tamaño
-Que se integre una vez por célula, para así poder controlar la dosis
-Que reconozca y actúe sobre células específicas
-Que sea inocuo o que sus efectos secundarios sean mínimos
-Que sea fácil de producir y almacenar
-Que todo el proceso de su desarrollo tenga un precio razonable
-Que posibilite la integración del gen terapéutico en un sitio específico del genoma
-Que pueda ser caracterizado completamente.
• Los vectores van a contener los elementos que se quieran introducir al paciente, que no van a ser sólo los
genes funcionales, sino también elementos necesarios para su expresión y regulación, como pueden ser
promotores, enhancers o secuencias específicas que permitan su control bajo ciertas condiciones.
Terapia génica: vectores
Vectores virales: Retrovirus – Adeno asociado- Herpes- Adenovirus
Con los vectores virales se deben hacer modificaciones que aseguren que no va a ser una partícula que va a ser
infecciosa.
Vectores no virales: ADN – Liposomas – Antisentidos
-Los virus son capaces de introducir específicamente su material genético en una célula blanco Ciertos tipos de
virus integran sus genes al genoma de la célula hospedera, otros en cambio se replican directamente en el
citoplasma. Esto implica que en función del ciclo celular se escogerá el mejor vector para la terapia a realizar.
-La mayoría de las estrategias con vectores virales con virus requiere usar líneas celulares "empaquetadoras" o
virus helpers.
→Células empaquetadoras, hace referencia a células que se cultivan en el laboratorio y donde se multiplican
las partículas virales que en su interior tienen el gen de interés. (siempre se utilizan)
→Los virus helpers, son necesarios cuando el virus vector (el que lleva el gen de interés) necesita de la
presencia de otro virus que lo ayuda a replicarse (multiplicarse) y que en su ausencia el virus vector no tiene la
posibilidad de hacer más copias. (no siempre se utilizan)
Vectores virales: retrovirus
Material genético está constituido solo por una molécula de ssRNA.
Virus de ssRNA (ss= single-stranded / simple hebra)
Para poder replicarse debe pasar su genoma RNA a DNA, esto gracias a una enzima viral llamada
transcriptasa reversa.
El ahora DNA viral puede integrarse al genoma gracias a la enzima integrasa.
Al tener la capacidad de integrarse ofrece la ventaja de una expresión persistente del gen que se integró
(transgén). Esto los hace útiles en enfermedades hereditarias y/o crónicas.
Sin embargo, la integración es aleatoria, presentando el riesgo (aunque extremadamente bajo) de alterar un gen
normal en el genoma del huésped aumentando la posibilidad de error.
La gran desventaja que presenta este tipo de vectores es que sólo son capaces de infectar células en división.
No es un buen candidato para utilizarlo en el snc.

-Los retrovirus tienen una secuencia final que se llaman revertidas

invertidas tanto en el 5’ como en el 3´y después vienen segmentos
genéticos que codifican el cual se llama gag, y cuando se transcribe y
se traduce da origen a las proteínas que van a dar lugar a cápside el
cual se llama pol y va a formar la transcriptasa reversa, proteína
integrasa y una proteasa. La proteasa va a cortar la proteína
haciéndola funcional, por esto una de las terapias contra el VIH es
bloquear la proteasa, para evitar que las proteínas sean funcionales. El
otro segmento del retrovirus es la envoltura, que va a dar origen a las
proteínas que están en la envoltura que son claves para la llegada del
virus.
*Se necesita si o si que se siga la secuencia de la estructura para que
pueda ingresar.
Los retrovirus se van a propagar en una línea celular empaquetadora que posee integrado en su genoma los
genes que son necesarios para la replicación del virión. Estos genes son gag, pol y env. Estos virus son capaces
de transfectar solo células en división e integrar su material genético en forma inespecífica por lo que es
probable que se generen mutaciones. Se utilizan principalmente en ex-vivo.
Vectores virales: Adenovirus
Virus de dsDNA (ds= double-stranded / doble hebra)
-Debido a que no se integran en el genoma del huésped, estos virus sólo expresan el transgén en forma temporal
durante su estancia en la célula.
-Los adenovirus deben su uso exitoso al hecho de su seguridad biológica, porque en forma natural en el humano
sólo se les ha relacionado con padecimientos de vías respiratorias.
-Su producción es relativamente sencilla, lo que ha facilitado una administración eficiente in vivo.
-Infecta tanto células en división o en reposo El principal inconveniente para su utilización en el envío de genes
a órganos o tejidos específicos, es la vigorosa respuesta inmunológica que despiertan, caracterizada por una
intensa inflamación, así ́ como por activación de linfocitos T citotóxicos.
-Las proteínas codificadas en E1 incluyen, por ejemplo, E1A (proteína necesaria para transactivar la
transcripción de los demás genes virales) y E1B (que se une a E4). Además, estas proteínas interfieren con las
funciones de la célula hospedera: E1A es una oncoproteína, E1B/E4 inhibe la apoptosis mediada por p53 (p53
es un regulador del ciclo celular) promoviendo la degradación de p53.
*La célula empaquetadora tiene E1
-La región E2 codifica proteínas necesarias para la replicación viral: ADN polimerasa, proteína terminal, etc.
-La región E3 codifica algunas proteínas que ayudan al adenovirus a escapar al sistema inmune, como la
proteína gp que inhibe la presentación de fragmentos antigénicos por parte del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad clase II.
-La región E4 codifica diversas proteínas que silencian genes endógenos, regulando el transporte de ARN
mensajeros fuera del núcleo.

*Solo los que lleven la señal de empaquetamiento van a poder

entrar a la cápside.

-Ver video del ppt para entender el esquema

Vectores virales: Adeno – Asociados (AAV)
-Reciben este nombre debido a que se les detectó por primera vez como contaminantes en preparaciones de
adenovirus.
-Virus de ssDNA que son defectuosos en replicación, y dependen de un virus colaborador o helper (un
Adenovirus o un herpes virus) que proporcione las proteínas necesarias para completar su ciclo infectivo.
-La estructura del genoma es muy simple, con dos regiones codificantes: cap, que codifica las tres proteínas de
la cápside, y rep, que codifica 4 proteínas necesarias para la replicación viral.
-El genoma está flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR), que forman unas estructuras en
horquilla y que son los únicos elementos necesarios en cis para poder llevar a cabo el ciclo vital del virus.
-Los AAV son capaces de infectar todo tipo de células in vivo, tienen un largo periodo de expresión aprox 1 año
y además no producen respuesta inmune en las células infectadas.
-Estos se integran a la célula en forma específica en el cromosoma 19, el peligro está en que estos vectores se
inserten en la misma forma específica en las células germinales.

Se puede tener un gen con rep y cap sin la

señal de empaquetamiento.
-Este gen para poder replicarse necesita la
infección con adenovirus.

Vectores no virales
Las principales características de estos vectores son:
-No se integran en el cromosoma
-Son de bajo costo
-No producen respuesta inmunológica
-Son de baja eficiencia en la transfección in vivo
-El método más simple de la transfección no viral, consiste en la inyección de
un plásmido de DNA sin la utilización de ningún otro vector.
Vectores no virales: Liposomas
-El vector de DNA puede ser cubierto por lípidos formando una estructura organizada, como una micela o un
liposoma.
-Cuando la estructura organizada forma un complejo con el DNA entonces se
denomina lipoplex.
-Hay tres tipos de lipidos:
Aniónicos: tienen carga negativa
Neutros Catiónicos: tiene carga positiva
-Hoy en día los más utilizados son los catiónicos debido a que sus cargas
positivas interactúan de mejor manera con el DNA y con la membrana
plasmática (carga negativa).
-Son inespecíficos, pero se les puede adicionar un ligando o receptor para que se vuelva específico a un tejido.
Vectores no virales: Oligonucleótidos

La terapia antisentido se basa en el uso de oligonucleótidos (pequeños fragmentos de ácido nucleico (13-25
nucleótidos), antisentido, complementarios para una secuencia específica de un gen, con objeto de unirse al
mRNA del mismo y evitar así la producción de una proteína mutada.
Entran en la célula y se unen a la hebra complementaria de ARN mensajero (ARNm) impidiendo el avance del
ribosoma y por tanto la traducción de esa hebra. Luego una hidrolasa de ARN o ARNasa H degrada el ARNm.
Los ARN antisentido nos sirven para bloquear o disminuir
específicamente la expresión de una determinada proteína
que sepamos causa alguna alteración.

*Es específico
 CRISPR- Cas
• El sistema permite almacenar material genético foráneo cuando la bacteria es infectada. Luego, si la bacteria
vuelve a encontrar el mismo material genético, puede reconocerlo y destruirlo.
• De este modo, los sistemas CRISPR-Cas constituyen básicamente un sistema inmune adaptativo y que puede
ser transmitido a través de sucesivas divisiones celulares
• Esto ha sido aprovechado como una potente herramienta de edición genética dada su capacidad para detectar y
modificar secuencias específicas, y su relativamente fácil adaptabilidad
• Si bien fue descrito originalmente como una herramienta para editar DNA, también se han descrito enzimas
que son capaces de editar RNA.
•Es una enzima que actúa in situ, corta a través de una nucleasa desapareciendo esa secuencia que cortó.
¿Cómo funciona un sistema CRISPR-Cas?
• En la naturaleza, los sistemas CRISPR-Cas mejor descritos toman
segmentos de material genético foráneo y lo incorporan en un lugar
específico de su genoma.
• Luego, utilizan este material para crear crRNAs, que con ayuda de
enzimas específicas, destruyen la secuencia de material genético
correspondiente si la vuelven a encontrar.
• En sistemas artificiales, la enzima Cas, una nucleasa, dirigida por un RNA
guía (gRNA, sintetizado artificialmente), reconoce y corta la secuencia
deseada en el genoma de la célula blanco.
• Si bien las células blanco intentan reparar el corte a la doble hebra, muchas veces no lo logra y se produce la
inactivación del gen que contiene la secuencia blanco.
• Sin embargo, las células tienen mecanismos de reparación del DNA, y uno de ellos puede utilizar otra
molécula de DNA para reparar la molécula dañada.
• Esto permite “engañar” a la célula, utilizando una copia correcta del gen defectuoso.
CRISPR-Cas
→Modificaciones a los sistemas CRISPR-Cas han permitido muchos avances, entre los que se pueden
mencionar:
• Herramientas para un mejor estudio de diferentes tipos celulares
• Desarrollo de mejores modelos animales para el estudio de enfermedades
• Prototipos de diagnóstico más sensibles, rápidos y baratos
• Terapias génicas con ensayos clínicos en curso (ex vivo e in vivo).