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Arch Toxicol (2012) 86:935–945
DOI 10.1007/s00204-012-0856-9
COMPUESTOS INORGÁNICOS
El superóxido producido por NADPH oxidasa media la
transactivación de EGFR por c-Src en queratinocitos humanos
estimulados con trióxido de arsénico
Hong Yu Tseng•Zi-Miao Liu•Huei-Sheng Huang
Recibido: 2 de noviembre de 2011 / Aceptado: 11 de abril de 2012 / Publicado en línea: 25 de abril de 2012
- Springer-Verlag 2012
AbstractoEl arsénico es un veneno y carcinógeno bien conocido en
los seres humanos. Sin embargo, también se ha utilizado para
tratar eficazmente algunos cánceres humanos y dolencias no
cancerígenas. Anteriormente, demostramos en queratinocitos que
la p21 inducida por trióxido de arsénico (ATO)WAF1/CIP1(p21)
expresión que conduce a citotoxicidad celular a través de la vía c-
Src/EGFR/ERK y generación de especies reactivas de oxígeno (ROS).
En este estudio, encontramos que EGFR-Y845 y EGFR-Y1173 podrían
ser fosforilados por ATO. Utilizando microscopía confocal y
citometría de flujo, encontramos que el tratamiento previo con
apocinina, DPI y tiron podría eliminar la producción de ROS
inducida por ATO. Además, para aumentar la actividad de la NADPH
oxidasa, ATO podría inducir p67 citosólica.zorro expresión y
translocación a membrana. Además, caída de p67.zorropodría abolir
la producción de ROS inducida por ATO. Por lo tanto, sugerimos
que el superóxido producido por la NADPH oxidasa fue una fuente
importante de producción de ROS inducida por ATO. Por el
contrario, la activación de la NADPH oxidasa inducida por ATO y la
generación de superóxido podrían ser inhibidas por el inhibidor de
c-Src PP1, pero no por el inhibidor de EGFR PD153035. Además, la
sobreexpresión de c-Src así como el tratamiento con ATO podrían
estimular la fosforilación de EGFR-Y845/ERK, expresión de p21.
Material complementario electrónicoLa versión en línea de este artículo
(doi:10.1007/s00204-012-0856-9) contiene material complementario, que
está disponible para usuarios autorizados.
H.-Y. Tseng - Z.-M. Liu - H.-S. Huang (y)
Departamento de Ciencias de Laboratorio Médico y Biotecnología,
Facultad de Medicina, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan
701, Taiwán
correo electrónico: huanghs@mail.ncku.edu.tw
H.-Y. Tseng
Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina,
Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan 701, Taiwán
sión y detención celular / apoptosis, que podría atenuarse mediante
un tratamiento previo con apocinina o eliminación de p67zorro. En
conjunto, sugerimos que la NADPH oxidasa estuvo involucrada en
la detención / apoptosis de los queratinocitos inducida por ATO,
que fue regulada por la activación de c-Src.
Palabras claveTrióxido de arsénico - Psoriasis - ROS -
NADPH oxidasa - Superóxido
Introducción
El arsénico existe de forma ubicua en nuestro medio ambiente y diversas
formas de arsénico circulan en el suelo, el agua, el aire y los organismos
vivos. La ingestión crónica de agua potable contaminada con arsénico se
asocia con un mayor riesgo de cáncer humano, incluidos cáncer de piel,
pulmón, riñón, próstata y vejiga, así como otras dolencias no
cancerígenas, como diabetes, hipertensión, enfermedades
cardiovasculares, enfermedades periféricas. neuropatía y enfermedades
de la piel (Miller et al.2002; Yu et al. 2006). En el año 2000, la
Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos
aprobó el trióxido de arsénico (ATO) como agente quimioterapéutico de
primera línea para el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda
recidivante y refractaria (Mathews et al. 2006). En consecuencia,
recientemente se han iniciado ensayos clínicos con fármacos a base de
arsénico para el tratamiento de diversas neoplasias hematológicas y
tumores sólidos (Dilda y Hogg 2007). Además, los compuestos de
arsénico también se han utilizado eficazmente en la medicina tradicional
china (MTC) durante más de 2.400 años para el tratamiento de la sífilis,
las úlceras y la psoriasis (Efferth et al.2007; Molinero y cols.2002).
Hasta la fecha, los mecanismos de los efectos terapéuticos
inducidos por ATO no se han dilucidado por completo. Se han
propuesto varios mecanismos de acción del arsénico (Platanias
2009). En particular, la sobreproducción de reactivo
123
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Las especies de oxígeno (ROS) podrían desempeñar un papel importante
en los efectos de ATO, así como otros fármacos anticancerígenos
moduladores de ROS (Platanias2009; Trachootham et al.2009).
En condiciones normóxicas, la homeostasis redox se mantiene
entre la producción de ROS y la capacidad antioxidante.
ROS, incluido el superóxido (O--2), peróxido de hidrógeno
(h2oh2), radical hidroxilo (-OH) y peroxinitrito, se generan
principalmente a partir de la cadena de transporte de
electrones mitocondrial u otros elementos celulares (Valko et
al. 2007). Específicamente, el superóxido se produce
predominantemente a través de los procesos metabólicos de
las mitocondrias o a través de varios sistemas enzimáticos que
incluyen la xantina oxidasa, la citocromo P450 reductasa o la
NADPH oxidasa (Leto et al.2009).
En general, la generación de ROS inducida por arsénico
depende de la regulación negativa de enzimas antioxidantes
(como el sistema de tioredoxina y la glutatión peroxidasa de
fosfolípido hidroperóxido [PHGPx/GPx4]) (Huang et al.2002; Lu
y col.2007) y la regulación positiva de las enzimas oxidasas
(como la NADPH oxidasa) (Flora2011; Wang y cols.2008). En
células NB4 derivadas de APL y en otras células no leucémicas,
ATO induce la apoptosis celular mediante la producción de ROS
para reducir el potencial de membrana de las mitocondrias, la
liberación de citocromo c y la activación de caspasa (Jing et al.
1999). También se descubrió que el arsénico puede activar la
NADPH oxidasa a través de la vía Rho-quinasa/p38-quinasa
para modular el fenotipo de los macrófagos humanos (Lemarie
et al.2008). La NADPH oxidasa derivada de fagocitos consiste en
una subunidad catalítica asociada a la membrana, gp91.zorro(
Nox2), complejado con un p22 reguladorzorro, componentes
citosólicos (p47zorro, p67zorroy p40zorro), y una pequeña GTPasa
(Rac1 o Rac2) (Babior1999). Las NADPH oxidasas derivadas de
células no fagocíticas pueden expresar isoformas de Nox,
incluidas Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 y Duox2 (Bedard y
Krause).2007). Estas enzimas producen superóxido para
participar en diversas funciones, como la proliferación celular,
la senescencia, la apoptosis, la biosíntesis de hormonas y la
transducción de señales (Bedard y Krause2007). Sin embargo,
los mecanismos subyacentes a la interacción entre la NADPH
oxidasa y los receptores de la membrana aún no están claros.
Anteriormente, encontramos que el arsénico aumenta la
generación de ROS para inducir p21.WAF1/CIP1(p21) expresión en
células A431 (Huang et al.2002). Las señales antagonistas,
incluidas las vías c-Src/EGFR/ERK y JNK, estuvieron involucradas
en las células tratadas con ATO (Huang et al.2006; Liu y Huang
2006,2008a,b). Sin embargo, el papel de las ROS en los efectos
inducidos por ATO aún no está bien definido. En este estudio
demostramos que la activación de c-Src inducida por ATO
estimuló la fosforilación de EGFR-Y845/ERK y la expresión de
p21. Utilizando varios ensayos funcionales, demostramos que
el superóxido de la NADPH oxidasa es una fuente importante
de producción de ROS inducida por ATO en los queratinocitos.
Además, el superóxido se produjo aguas abajo de c-Src.
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activación por ATO, que podría inducir la fosforilación de EGFR/
ERK, la expresión de p21 y la detención/apoptosis celular
resultante.
Materiales y métodos
Reactivos y anticuerpos.
ATO, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH),
apocinina, xatina/xatina oxidasa, diacetato de
diclorofluorescina (DCFH-DA) y tiron se adquirieron de Sigma-
Aldrich Co. (St. Louis, MI, EE. UU.). El inhibidor de EGFR
PD153035 y el inhibidor de Src PP1 se adquirieron de
Calbiochem (San Diego, CA, EE. UU.). El sistema de purificación
de ADN Wizard Plus MiniPreps y el sistema de ensayo de
luciferasa fueron de Promega (Madison, WI, EE. UU.). Qiagentip
100 era de Qiagen (Hilden, Alemania). El kit GENE-CLEAN III era
de BIO 101 (La Jolla, CA, EE. UU.). SobrescritoMTIII y el reactivo
del kit de extracción de ARN TRIzol eran de Invitrogen
(Carlsbad, CA, EE. UU.). El medio Eagle modificado por
Dulbecco, el suero bovino fetal, el inhibidor de ribonucleasa y el
medio Opti-MEM eran de Gibco BRL (Grand Island, NY). Los
anticuerpos contra fosfo-Tyr fosfo-EGFR-Y1173, fosfo-ERK1/2,
ERK2, c-Src y p21 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology.
El anticuerpo contra fosfo-EGFR-Y845 se adquirió de Abcam
(Cambridge, MA). Anticuerpos contra fosfo-c-Src-Y416 y p67.fox
se adquirieron en Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE.
UU.). El reportero del promotor p21, el plásmido p21-luc, fue
amablemente proporcionado por el Dr. Bert Vogelstein de las
Instituciones Médicas de la Universidad Johns Hopkins
(Baltimore, MD, EE. UU.). El plásmido Src de tipo salvaje (wtSrc)
fue proporcionado amablemente por el Dr. YR Chen (Institutos
Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán). El pLKO.1-p67
zorro-shRNA, que se dirige al p67 humanozorro
secuencia genética 50-GCTATCAAAGACCTTAAAGAA-30, y una
construcción de plásmido de control de luciferasa (pLKO.1-
shLuc) se obtuvieron amablemente del Centro Nacional de
ARNi Central ubicado en el Instituto de Biología Molecular/
Centro de Investigación Genómica, Academia Sínica (Taipei,
Taiwán), con el apoyo del Programa Nacional de Investigación
en Genómica. Becas de Medicina del Consejo Nacional de
Ciencias (NSC97-3112-B-001-016). El ADNc que codifica la
quinasa Src mutada en el vector pUSE, pSrc (K297R), y el
anticuerpo contra la PARP [poli(ADPribosa)polimerasa]
escindida se obtuvieron de Upstate Biotechnology, Inc.
Cultivo de células
Las células A431 del carcinoma epidermoide humano y las células
HaCaT se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM) suplementado con 10 % (v/v) de células fetales.
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suero bovino, 100yog/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de
penicilina. Las células se cultivaron a 37 -C en una atmósfera
humidificada de aire/CO2(19:1, v/v).
mancha occidental
Lisados celulares (50yog) del vehículo, o las células tratadas con
fármacos se separaron en un gel analítico de SDS-PAGE al 8%.
Luego, las proteínas en el gel SDS-PAGE se transfirieron a una
membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante un
aparato semiseco. Anticuerpos contra fosfo-Tyr humano, fosfo-
EGFR, fosfo-ERK1/2, fosfo-c-Src-Y416, p67zorro, EGFR, ERK2, c-Src,b-Se
emplearon actina, PARP escindida y p21 como anticuerpos
primarios. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo IgG de
conejo o ratón acoplado con peroxidasa de rábano picante. La
densidad de las inmunotransferencias se determinó mediante un
sistema de análisis de imágenes instalado utilizando un software
BIO-ID (Vilber Lourmat, Francia) después del desarrollo con un kit
de quimioluminiscencia mejorado (Amersham ECLMT).
Detección de generación de ROS.
El DCFH no fluorescente puede ser oxidado por ROS a DCF altamente
fluorescente. Las células en placas de 35 mm se incubaron con 100yoM
DCFH-DA en DMEM durante 30 min a 37 °C y luego se midió mediante
microscopía confocal (Leica, TCS, Alemania) a 488 nm de excitación y 525
nm de emisión. Por otro lado, las células se tripsinizaron y se lavaron con
PBS helado para cuantificar la fluorescencia emitida por el DCF
fluorescente utilizando un clasificador de células activado por
fluorescencia (FACscan, Becton-Dickinson, EE. UU.). Además, la
generación de superóxido inducida por ATO se detectó mediante
quimioluminiscencia de lucigenina utilizando un analizador de
quimioluminiscencia de alto rendimiento (CLA-2100; Tohoku Electronic
Industrial, Co. Ltd., Rifu, Japón). Celdas (29105) fueron incubados con 20
yoSolución de lucigenina M en una cámara absolutamente oscura del
analizador de quimioluminiscencia. Después de 3 min, una alícuota (2yo
l) de ATO se inyectó en la unidad de cámara especial del analizador de
quimioluminiscencia hasta una concentración final (20yoMETRO). Los
recuentos de quimioluminiscencia se registraron continuamente
durante 60 minutos a intervalos de 10 s. Cada medición se realizó al
menos por triplicado. Los resultados se analizaron utilizando el software
de adquisición de datos del analizador de quimioluminiscencia (Tohoku
Electronic Industrial Co).
Fraccionamiento de proteínas subcelulares.
Celdas (19106) fueron tratados con o sin 20yoM ATO durante 30
min y luego cosechado con tipsina-EDTA. Según el protocolo
del fabricante del kit de fraccionamiento de proteínas
subcelulares (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), se recogió el
fraccionamiento de proteínas citoplasmáticas y de membrana y
luego se detectó mediante transferencia Western.
937
Ensayo de actividad NADPH oxidasa.
Celdas (29105) crecieron en una placa de cultivo de 35 mm, seguido
de tratamiento con medicamentos durante varios períodos de
tiempo según se indica. Luego, las células fueron raspadas y
centrifugadas a 4009gramodurante 10 min a 4 -C, y se resuspendió
en 35yol/por placa de medio DMEM helado. Celdas (29104) luego se
agregaron a medio DMEM precalentado (37 -C) que contenía 1yoM
NADPH o 20yoM lucigenina hasta 600 finalesyol volumen para
iniciar la reacción seguido de una medición inmediata de la
quimioluminiscencia en el analizador de quimioluminiscencia. Se
establecieron los blancos y los controles y se midió la
quimioluminiscencia de forma continua durante 10 minutos. La
actividad de la NADPH oxidasa se expresó como recuentos por
millón de células.
Ensayo de transfección y reportero.
Las células A431 se subcultivaron durante 24 h antes de la transfección a
una densidad de 3x105células por pocillo en una placa de 6 pocillos. El
método de transfección se realizó con TurboFect.MT
reactivo (Fermentas, Glen Burnie, MD) según las instrucciones
del fabricante. Después de la incubación a 37 -C en una
atmósfera humidificada de aire/CO2(19:1) durante 48 h, las
células se lisaron para la detección de la actividad luciferasa. La
actividad luciferasa del promotor p21 se determinó y normalizó
con la cantidad de proteína total. Las estadísticas fueron
realizadas portprueba.
PCR en tiempo real
Los cebadores utilizados en la PCR en tiempo real se
describieron a continuación: p67zorro(cartilla de sentido: 50
-CATCAAGCTGTACAT TTGGTGC-30; cebador antisentido: 50
-GTACTTACTCCTTG GGCCTGG-30);b-actina (cebador de sentido:
50-TCCCTGGA-GAAGAGCTACGA-30; cebador antisentido: 50
-ACTCCAT GCCCAGGAAGG-30). El ARN total se aisló de las
células A431 usando una solución de ARN TRIzol, luego el ARN
(2yog) fue transcrita inversamente usando SuperScriptMTEnzima
III con cebadores oligo (dT). La PCR en tiempo real se realizó
utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) y se procesó en
un sistema de detección y PCR LightCycler (Roche Diagnostics).
Cada reacción (25yol) se ejecutó por duplicado y contenía 100
ng de plantilla de ADNc junto con 0,4yoM p67foxcebadores. Los
parámetros de ciclado fueron 95 °C durante 15 min para activar
la ADN polimerasa, seguidos de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s,
60 °C durante 20 s y 72 °C durante 30 s. Se generaron curvas de
fusión al final de la reacción. Los ciclos de umbral (Ct) para cada
gen analizado se normalizaron con respecto a la limpiezab-
valor del gen actina (DCt) y cada muestra experimental fue
remitida a su control (DDConnecticut). Los valores de cambio
de veces se expresaron como
2-DDConnecticut.
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Ensayo de muerte celular
Se utilizó un kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC
(Biovision) para detectar la apoptosis de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones.
Brevemente, las células A431 tratadas se recogieron y se lavaron
dos veces con PBS enfriado con hielo, y luego las células se
resuspendieron en 100yol de tampón de unión (Biovision). Anexina
V (5yol) y PI (yoduro de propidio, 10yol) se añadieron al tubo y la
mezcla se incubó durante 15 minutos en la oscuridad. Finalmente,
400yoSe añadió 1 l de tampón de unión al tubo y la mezcla se
analizó utilizando el clasificador de células activado por
fluorescencia (FACSCalibur; Becton-Dickinson, EE. UU.).
análisis estadístico
Se presenta un resultado representativo: este experimento se
ha realizado al menos tres veces. El análisis estadístico se
determinó mediantetprueba. Todos los valores se mostraron
como medias.±DE para tres determinaciones (*PAG \0,05;
* *PAGS\0,01; ***PAG \0,001 respecto al vehículo).
Resultados
c-Src-Y416, EGFR-Y845 y EGFR-Y1173
pueden ser fosforilados por ATO
Anteriormente demostramos que la activación de c-Src/EGFR y
la fosforilación sostenida de ERK están involucradas en
Expresión de p21 inducida por ATO (Huang et al.2006; Liu y
Huang2006,2008a). Sin embargo, no se midieron los residuos
fosforilados del EGFR en respuesta a ATO. Como se muestra en
la Fig.1a, la fosforilación de c-Src-Y416 aumenta rápidamente
con ATO a los 5 min. Además, los lisados celulares se
inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-EGFR seguido de
transferencia Western con anticuerpo p-Tyr, y los resultados
muestran que la fosforilación de tirosina de EGFR estimulada
por ATO comienza a aumentar ligeramente a los 5 minutos (1,4
veces) y continúa aumentando. a los 60 min (2,8 veces). Se ha
informado que c-Src puede asociarse físicamente con EGFR
para fosforilar Y845 del receptor (Biscardi et al.1999; Sato et al.
1995). En los queratinocitos epidérmicos humanos normales, el
arsénico estimula la activación del EGFR en su sitio de
autofosforilación, Y1173 (Tanaka-Kagawa et al.2003). Por tanto,
se utilizaron anticuerpos específicos para detectar la forma
fosforilada de estos dos residuos de tirosina. Como se muestra
en la Fig.1a, ATO puede inducir EGFR-Y845 y EGFR-Y1173, así
como la fosforilación de ERK1/2 de manera dependiente del
tiempo en células A431. En las células HaCaT, ATO también
puede activar la fosforilación de EGFR-Y845 y ERK1/2 (Fig. S1).
Además, el tratamiento previo con el inhibidor PP1 de c-Src,
seguido del tratamiento con ATO durante 4 h, puede bloquear
la fosforilación inducida por ATO de EGFR-Y845, EGFR-Y1173 y
EGFR/ERK1/2, que luego inhiben la expresión de p21 en las
células (Fig. .1b).
En respuesta a ATO, el perfil de fosforilación de EGFR
aumenta lentamente en comparación con la activación
rápida de c-Src (Fig.1a), implicando la participación de
proteínas de novo en esta regulación. Uso de la proteína

(A) (B)
ATO ( METRO) - 20 20 20 20 ATO ( M) - 20 20 20 20 -
Tiempo (min) 0 5 15 30 60 PP1 ( m) - - 1 5 10 10
p-Src-416
p-EGFR-845
1.0 2.1 2.3 2.7 2.7 1.0 1,5 0,9 0,8 0,9 0,9
Src p-EGFR-1173

p-Tyr IP: EGFR

EGFR
IB: p-Tyr
1.0 1.4 1.5 1.5 2.8
p-ERK1/2
EGFR Aporte
1.0 2,4 1,8 1,3 1,0 0,2

p-EGFR-845 ERK2

1.0 1.4 1.5 1.9 2.3 p21

p-EGFR-1173 1.0 1,7 0,9 0,5 0,6 0,8
1.0 1.0 1.2 1.2 1.4 - actina

EGFR

p-ERK1/2
1.0 4.3 2.8 3.8 5.5
ERK2

Figura 1Requisito de activación de c-Src en la fosforilación de EGFR/ERK inducida por bLas células A431 se trataron previamente con PP1 durante 1 h seguido de tratamiento con
ATO y expresión de p21.aLas células A431 fueron tratadas con 20yoM ATO por los o sin 20yoM ATO durante 4 h. Los lisados celulares totales se analizaron mediante
periodos de tiempo indicados. Los lisados celulares totales se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos específicos como se indica
transferencia Western con anticuerpos específicos como se indica.

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El inhibidor de la biosíntesis, la cicloheximida, podría atenuar la
fosforilación de EGFR inducida por ATO (datos no mostrados),
lo que sugiere que podría haber un mediador intracelular para
la interferencia entre la fosforilación de c-Src y EGFR. Estos
resultados impulsaron una mayor exploración de la regulación
de la fosforilación de EGFR.
La generación de superóxido inducida por ATO se origina a
partir de la NADPH oxidasa
El EGFR puede transactivarse mediante otros agentes, como la
activación de la familia Src, la eliminación de ligandos similares a
EGFR mediante metaloproteinasas de matriz (MMP) y la inhibición
de fosfatasas mediante ROS (Wetzker y Bohmer).2003). Luego se
utilizó un inhibidor de MMP de base amplia, GM6001, para
examinar si la eliminación de ligandos similares a EGFR por parte de
MMP está implicada en la transactivación de EGFR (Levy et al.1998).
Los resultados indican que las MMP no están involucradas en la
regulación (datos no mostrados).
Como se mencionó anteriormente, la sobreproducción de ROS
es un modo de acción importante de ATO para inducir la apoptosis
de las células cancerosas (Platanias2009; Trachootham et al.2009).
También se sugiere que las ROS son mediadores potenciales de la
transactivación de los receptores tirosina quinasas (Joo et al. 2008).
Para dilucidar aún más su papel en la señalización inducida por
ATO, se analizaron varios sistemas de detección de ROS. Utilizando
DCFH-DA como indicador, las células se estimularon con 20yoMATO
durante varios períodos de tiempo y su producción de ROS se
detectó mediante microscopía confocal (a corto plazo) y citometría
de flujo (a largo plazo), respectivamente. Encontramos que la
generación de ROS inducida por ATO de manera dependiente del
tiempo (Fig.2a, c), y la producción de ROS fue completamente
bloqueada por los inhibidores de la NADPH oxidasa DPI, apocinina
(Fig.2b) y tiron (Fig.2C). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que
la principal fuente de producción de superóxido en respuesta a ATO
podría ser la NADPH oxidasa. Como se muestra en la Fig.2d, la
actividad NADPH oxidasa fue inducida por ATO hasta el máximo a
los 30 min. Translocación de membrana de la subunidad citosólica
p67.zorroes un indicador de la activación de la NADPH oxidasa. Como
era de esperar, tratamiento con ATO durante 30 min, p67
citoplásmicozorrose transloca desde el citosol a la fracción de
membrana (Fig.2e), lo cual es consistente con la activación de la
NADPH oxidasa (Fig.2d). Además, la RT-PCR cuantitativa en tiempo
real y la inmunotransferencia también muestran que p67zorroLa
subunidad está regulada positivamente por ATO de manera
dependiente del tiempo (Fig. S2). Por lo tanto, sugerimos que la
principal fuente de superóxido en respuesta a ATO es el resultado
de la biosíntesis y la translocación de p67 citoplasmática.zorropara
inducir la activación de la NADPH oxidasa.
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El superóxido media la señalización c-Src/EGFR/ERK inducida
por ATO para activar la expresión de p21
Además, se exploraron las funciones del superóxido en la señalización
inducida por ATO. Usando microscopía confocal, encontramos que la
generación de ROS inducida por ATO fue bloqueada por el inhibidor PP1
de c-Src (Fig.3a), pero no por el inhibidor de EGFR PD153035 (Fig.3b). La
generación de superóxido inducida por ATO también se detectó
mediante quimioluminiscencia derivada de lucigenina. Después del
tratamiento con ATO, el superóxido resultante alcanza su nivel máximo a
los 30 min, que se mantiene durante 1 h. Este superóxido inducido por
ATO fue bloqueado por PP1, DPI y apocinina (Fig.3C). Además, la
actividad NADPH oxidasa también fue inhibida por DPI, apocinina y PP1,
pero no por PD153035 (Fig.3d). Además, el pretratamiento con el
eliminador de superóxido tiron puede bloquear la activación del
promotor p21 inducida por ATO, pero no inducida por EGF (Fig.3mi). Por
lo tanto, proponemos que en respuesta a ATO, la señalización de EGFR/
ERK puede activarse mediante superóxido, que se produce aguas abajo
de la activación de c-Src.
Se requiere la producción de superóxido para la
fosforilación de EGFR y la expresión de p21
Nuestros resultados indican que la activación de c-Src es
necesaria para la fosforilación de EGFR y que ATO produce
superóxido aguas abajo de la activación de c-Src. Por lo tanto,
abordamos más a fondo el papel del superóxido en la
fosforilación de EGFR y la expresión de p21 inducida por ATO.
La sobreexpresión de wtSrc podría inducir la fosforilación de
EGFR-Y845 y la expresión de p21 en células A431 y HaCaT (Fig.
S3a y S3b), respectivamente. Derribo del p67zorroLa subunidad
por su shRNA podría bloquear la producción de superóxido
inducida por ATO (Fig.4a), fosforilación de EGFR-Y845 (Fig.4b), y
la fosforilación de EGFR-Y845 y expresión de p21 inducida por
wtSrc (Fig.4C). El tratamiento previo con apocinina también
podría bloquear la fosforilación de EGFR-Y845 y la expresión de
p21 inducida por wtSrc (Fig. S3c). Además, el superóxido
exógeno, producido a partir del sistema xantina/xantina
oxidasa (X/XO), también indujo la fosforilación de EGFR-Y845 y
ERK1/2 de una manera dependiente del tiempo (Fig.4d).
En conjunto, sugerimos que c-Src induce la activación de la NADPH
oxidasa para producir superóxido, lo que a su vez media la
transactivación de la fosforilación de EGFR, la activación de ERK1/2, lo
que resulta en la regulación positiva de p21 en los queratinocitos.
La señalización de c-Src/NADPH oxidasa está implicada
en la detención/apoptosis celular inducida por ATO
Para confirmar aún más las funciones de la señalización de c-Src/NADPH
oxidasa en los efectos de ATO en los queratinocitos, la muerte celular
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940 Arco Toxicol (2012) 86:935–945

(A)
0 minutos 5 minutos 30 minutos 60 minutos

(B)
Control ATO (20µMETRO) ATO + apocinina ATO + PPP apocinina PPP
60 minutos

(C) (D)
Control (9,3%) 3.0
ATO (1h) (16,1%)
*
Actividad relativa de la NADPH oxidasa

ATO+tirón (8,7%) 2.5

2.0
*
1.5

1.0

0,5

0.0
Controlar (7,9%) 0 5 15 30 60
ATO (5 h) (85,3%)
Tiempo (minutos)
ATO+tirón (13,1%)

(MI) citosol Membrana

Tiempo (minutos) - 30 - 30
p67
1 0,7 1 1.4
tubulina

Figura 2Implicación de la NADPH oxidasa en la producción de ROS inducida
por ATO. Las células fueron tratadas con 20yoM ATO durante varios períodos
de tiempo como se indica. Luego, las células se incubaron adicionalmente con
100yoM DCFH-DA durante 30 minutos antes de la detección de la
fluorescencia poramicroscopía confocal oCmediante citometría de flujo. Las
células fueron pretratadas conbapocinina y DPI, oCtiron, o vehículo, seguido
de tratamiento con 20yoM ATO durante 60 min o 5 h. Luego, las células se
incubaron adicionalmente con 100yoM DCFH-DA durante 30 min antes
detección de la fluorescencia mediante microscopía confocal oc flcitometría
de flujo.dLas células fueron tratadas con 20yoM ATO durante varios períodos
de tiempo como se indica para medir su actividad NADPH oxidasa como se
describe en ''Materiales y métodos'' sección.miLas células fueron tratadas con
20yoM ATO durante 30 min. El fraccionamiento de proteínas citoplasmáticas y
de membrana se recogió como se describe en ''Materiales y métodos'' para
detectar p67zorroy expresión de tubulina mediante Western blot

El ensayo se realizó como se describe en la sección "Materiales utilizando tinción con Anexina V/PI seguida de análisis de citometría
y métodos". La sobreexpresión de wtSrc podría inhibir el de flujo. Como se muestra en la Fig.5c, las células tratadas con ATO
crecimiento celular de las células A431 (Fig.5a) y células HaCaT tenían 3,0 % de anexina V?/PI- (apoptosis temprana) y 7,1 % de
(Fig. S4a), respectivamente. Derribo del p67zorroLa subunidad anexina V?/PI? (última apoptosis), mientras que las células vehículo
por su shRNA podría bloquear la escisión de PARP inducida por tenían 0,4 % de anexina V?/PI- y 1,8 % de anexina V?/PI?. Derribo de
ATO (Fig.5b). Además, se midió el ensayo de muerte celular. p67zorrosubunidad seguida de tratamiento

123
Arco Toxicol (2012) 86:935–945 941

(A)Control ATO ATO + ATO + PP1 (5)

(C)
PP1(1) PP1(5) 2.5
60 minutos

2.0

CVX relacionado
1.5
ATO + ATO +
(B) Control ATO PD (1) PD (5) PD (5)
1.0
60 minutos ATO
ATO+PP1
0,5 ATO+APO
ATO+DPI

0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (minutos)

(D) (MI)2.5

2.5
Actividad relativa de la NADPH oxidasa

Doble cambio de actividad LUC

2.0

2.0
*
1.5
1.5
* ** **
1.0
1.0

0,5 0,5

0.0 0.0
ATO - + + + + + ATO ( METRO) - 20 20 20 - - - -
PP1 + FEAG (ng/ml) - - - - - 10 10 10
apocinina +
PPP + tiron (M) - - 40 80 80 - 40 80
PD153035 +

Fig. 3Se produjo superóxido antes de la activación de EGFR. Las células
fueron pretratadas conainhibidor de c-Src PP1, obcon inhibidor de EGFR
PD153035 (PD), seguido de tratamiento con 20yoM ATO durante 60 min.
Luego, las células se incubaron adicionalmente con 100yoM DCFH-DA
durante 30 minutos antes de la detección de la fluorescencia mediante
microscopía confocal. Además, las células fueron pretratadas con 5yoM
PP1, 20yoM apocinina, 10yoM PPP o 5yoM PD153035, respectivamente,
seguido de tratamiento con 20yoM ATO para la detección de
Cgeneración de superóxido por quimioluminiscencia de lucigenina, o d
Actividad NADPH oxidasa como se describe en ''Materiales y métodos''
sección.miLas células se transfectaron transitoriamente con p21-luc reporter
durante 24 h y luego se pretrataron con varias dosis de tiron seguido de
tratamiento con 20yoM ATO o 10 ng/ml EGF durante 4 h. Los ensayos de
reportero se realizaron como se describe en ''Materiales y métodos'' sección

con 20yoM ATO durante 24 h en células A431 (Fig.5c) o células 2008b). En este estudio, se exploró más a fondo la comunicación
HaCaT (Fig. S4b). Las células apoptóticas tempranas (Anexina cruzada entre ROS y estas señales c-Src/EGFR/ERK.
V?/PI-) se atenuaron al 0,3 %, y las células apoptóticas tardías En el presente estudio, la sobreexpresión de c-Src en células
(Anexina V?/PI?) se atenuaron al 1,7 % (Fig.5C). También se A431 y HaCaT podría inducir la expresión de p21 y la detención
observaron efectos similares en las células HaCaT (Fig. S4b). En del crecimiento celular (Fig.5a, S4a). Sin embargo, se ha
conjunto, sugerimos que la señalización de c-Src/NADPH informado que c-Src está involucrado en cánceres asociados
oxidasa contribuye a la detención celular/apoptosis de los con el arsénico, como los de piel, vejiga urinaria y pulmón
queratinocitos inducida por ATO. (Simeonova y Lustre2002). El c-Src puede interactuar
funcionalmente con EGFR-Y845 para translocar EGFR a las
mitocondrias para asociarse con la subunidad II del citocromo c
Discusión oxidasa, lo que contribuye a la promoción de cánceres (Biscardi
et al. 1999; Boerner et al.2004; Demory et al.2009). Por el
El arsénico puede inducir la apoptosis asociada a Fas/FasL en contrario, también se ha informado que la activación de c-Src
queratinocitos de prepucio humano cultivados (Liao et al.2004). También por EGF promueve la fosforilación de EGFR en la tirosina 845,
encontramos que el arsénico puede aumentar la generación de ROS, así que media la vía STAT/p21 en células A431 (Sato et al. 2003,
como inducir la señalización de c-Src/EGFR/ERK para activar la expresión 1995). La activación sostenida de EGFR y Src contribuye al
de p21 y dar como resultado la citotoxicidad de los queratinocitos agente antitumoral AplidinMT-Apoptosis de células cancerosas
(Huang et al.2002,2006; Liu y Huang2006, inducida (Cuadrado et al.2003). EGFR y Src también pueden

123
942 Arco Toxicol (2012) 86:935–945

(A) (B)
2.5 wtSrc (µgramo) - 1 1 -
p67-ARNsh ( gramo) - - 1 1
2.0 p-Src-416

CVX relativo 1.5

p67
1.0 2.3 0,9 1.1
p-EGFR-845
1.0
1 .0 1.6 1.0 0,7
ATO
0,5 ATO+p67-ARNsh p21
p67-shARN
1.0 2.3 1.3 1.1

0 10 20 30 40 50 60
EGFR

Tiempo (minutos)

(C) (D)
ATO ( 0 METRO) 20 20 20 - X/XO (50/0,05 M/U) - ++++ ATO
p67-ARNsh ( g) 0 0 1 2 2 Tiempo (minutos) 0 5 15 30 60 5
p-EGFR-845 p-EGFR-845
1.0 1.6 0,9 0,7 0.3 1.0 1,4 1,6 1,5 1,5 1,5
p-ERK1/2
p67
1.0 1.8 1.1 0,7 0.3 1.0 1,3 3,2 3,5 2,8 2,1
EGFR EGFR
1.0 1.1 1.0 0,9 1.0

Figura 4La producción de superóxido media la fosforilación de EGFR inducida por c-
Src. Las células se transfectaron con pLKO.1-p67.zorro-shRNA o vector vacío seguido
de tratamiento con 20yoM ATO durante 1 h, luego aLa generación de superóxido se
midió mediante quimioluminiscencia de lucigenina como se describe en ''Materiales
y métodos'' sección, obLos lisados celulares totales se recogieron y se sometieron
a transferencia Western con anticuerpos específicos como se indica (abajo).CLas
células fueron cotransfectadas con
wtSrc con varias cantidades de pLKO.1-p67zorro-plásmidos shRNA durante 24 h.dEl
superóxido exógeno fue producido por xantina/xantina oxidasa (50yoM/0,05 U)
sistema como se describe en ''Materiales y métodos'' sección para estimular las
células durante varios períodos de tiempo. Las células también fueron tratadas con
20yoM ATO durante 5 min como control positivo. Los lisados celulares totales se
recogieron y analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos específicos
como se indica.

ser activado por el indol-3-carbinol para aumentar la expresión de p21 y
la consiguiente detención del ciclo celular y muerte de las células de
cáncer de mama humano (Moiseeva et al.2007).
En este estudio, c-Src podría transactivar la fosforilación de
EGFR en otros residuos de tirosina, como EGFR-Y1173, lo que
contribuye a la autofosforilación de EGFR, la fosforilación
sostenida de ERK1/2 y conduce a un aumento de la expresión
de p21. También podría deberse a la senescencia inducida por
oncogenes o a la senescencia replicativa, que sirve como acción
infalible contra la transformación de oncogenes (Campisi2005;
Moiseeva et al.2009).
Además, la producción de superóxido a partir de la NADPH
oxidasa fue regulada por c-Src en respuesta a ATO. La NADPH
oxidasa ha sido implicada en la citotoxicidad inducida por
arsénico en células NB4 (Chou et al.2004; Wang y cols. 2008), y
en el daño oxidativo del ADN en células del músculo liso
vascular humano (Lynn et al.2000). El arsénico puede aumentar
la actividad de la NADPH oxidasa mediante la regulación
positiva de p22zorroo p67zorro(Cooper et al.2009; Lynn y col.2000),
fosforilación de p47zorroo p67zorro(Cooper et al.2009; Qian et al.
2005), o translocación de Rac1 o p67zorro(Qian et al.2005; Smith y
cols.2001). Sin embargo, la regulación de la NADPH oxidasa por
el arsénico aún no ha sido bien definida.
La activación de la NADPH oxidasa dependiente de Src y la
producción de ROS se han detectado en células endoteliales del
pulmón humano (HPACE) (Chowdhury et al.2005), en células del
músculo liso traqueal (HTSMC) (Lee et al.2008), y en células de
queratinocitos (HaCaT) (Joo et al.2008). En respuesta a la
hiperoxia en HPACE, Src puede fosforilar p47zorroen su residuo
de tirosina para inducir la activación de la NADPH oxidasa y
aumentar la producción de ROS (Chowdhury et al.2005). Ese c-
Src podría inducir p67zorroLa biosíntesis y la activación de la
NADPH oxidasa en respuesta a ATO en los queratinocitos es un
hallazgo novedoso (Fig.6). Sin embargo, los mecanismos
subyacentes a cómo c-Src regula la activación de la NADPH
oxidasa aún no se han dilucidado.
Además, la producción de superóxido estimulada por ATO
conduce a la fosforilación de residuos de tirosina de EGFR. La
transactivación de EGFR puede ser estimulada por varias especies
de ROS, como el peróxido de hidrógeno, el superóxido y el
peroxinitrito (Joo et al.2008; Meves et al.2001; Sato et al.2003;
Zhang et al.2000). Además, el peróxido de hidrógeno puede inducir
la activación de c-Src y la fosforilación de EGFR-Y845 para aumentar
la expresión de p21 en células A431 (Sato et al.2003). También se ha
informado que la interacción EGFR-ligando produjo peróxido de
hidrógeno para facilitar la actividad celular.

123
Arco Toxicol (2012) 86:935–945 943

(A) (B)
8

Recuentos de células (104células/ml)

Control
ATO (μM) 0 20 20 0
- - + +
wtSrc (0.5µgramo)
p67-shARN
6 wtSrc (1µgramo)
escindido
PARP
4
b-actina
*
*
2 **

0
Tiempo (días) 1 2 3

(C) Control ATO ATO+p67-ARNsh p67-shARN

0,3% 1,8% 1,4% 7,1% 0,4% 1,7% 0,6% 1,5%
Pi

97,6% 0,4% 88,6% 3,0% 97,6% 0,3% 97,5% 0,4%

Anexina V

figura 5Participación de la señalización de c-Src/NADPH oxidasa en la detención/
apoptosis celular inducida por ATO. Las células se transfectaron con varias dosis de
wtSrc durante diferentes períodos de tiempo.aEl número de células se contó
después de teñir con azul tripano en células A431. Las células se transfectaron
transitoriamente con vectores vacíos o 2yog de shRNA de p67foxdurante 24 h,
seguido de tratamiento con o sin 20yoM ATO durante 24 h como se indica.bLa
expresión de la proteína PARP escindida se determinó mediante transferencia
Western.b-Actina se utilizó como control interno.
CUtilizando la tinción con anexina V/PI conjugada con FITC seguida de un análisis de
citometría de flujo, elGráfica de puntosSe demostró que los diagramas representan
poblaciones celulares de apoptosis. Elabajo a la izquierdalos cuadrantes de los
paneles representan células vivas (Anexina V-/PI-); elinferior derechalos cuadrantes
representan células apoptóticas tempranas (Anexina V?/PI-); elarriba a la izquierda
los cuadrantes representan células de necrosis (Anexina V-/PI?); y elsuperior derecha
Los cuadrantes representan células apoptóticas tardías (¿Anexina V?/PI?).

ATO El superóxido puede reaccionar con el óxido nítrico para formar un

NADPH
oxidasa
Src
oh2
.-
Y845
EGFR
ERK
tata
Figura 6El esquema ilustra la participación de la producción de superóxido en la
activación de c-Src/EGFR/ERK inducida por ATO, la expresión de p21 y la detención/
apoptosis celular resultante.
señalización (DeYulia et al.2005). Curiosamente, en respuesta a
la sobreexpresión de c-Src, la expresión de p21 podría
suprimirse mediante la eliminación de p67.zorro(Higo.4). El
tratamiento previo con el inhibidor de SOD DDC, seguido del
tratamiento con ATO, podría aumentar aún más la fosforilación
de EGFR y ERK1/2 (datos no mostrados). Además, como el
superóxido exógeno también puede activar la fosforilación de
EGFR y ERK1/2 (Fig.4), sugerimos que el superóxido podría
mediar en la transactivación de c-Src a la fosforilación de EGFR.
poderoso oxidante, peroxinitrito, que también puede activar la
fosforilación de EGFR en fibroblastos de la piel humana (Klotz et al.
2000) y miofibroblastos de pulmón de rata (Zhang et al.2000).
Además, las ROS podrían inactivar las proteínas tirosina fosfatasas
tumorigénesis
(PTP) mediante la oxidación de un residuo de cisteína esencial en el
sitio activo de la fosfatasa para provocar la señalización del factor
de crecimiento (Tonks2005). En este estudio no se descartó la
participación del peroxinitrito o la inactivación de PTP en la
Arrestar
p21 regulación de la señalización de EGFR por superóxido.
apoptosis
Las ROS desempeñan múltiples funciones en los siguientes
fenómenos fisiológicos y patológicos: proliferación celular,
angiogénesis, hipoxia, apoptosis, envejecimiento, enfermedades
humanas y cáncer. Por lo tanto, ROS podría funcionar como un
arma de doble filo en las células cancerosas, donde, por un lado, se
sabe que el daño al ADN inducido por ROS está asociado con la
carcinogénesis celular, como roturas del ADN, modificación de
nucleótidos y enlaces cruzados del ADN; pero, por otro lado, un
nivel moderado de ROS también puede ser útil para la función y
supervivencia de las células cancerosas (Balaban et al.2005;
Fruehauf y Meyskens2007). Recientemente, la evidencia acumulada
indica que las ROS también desempeñan funciones críticas como
mensajeros secundarios en la vía de señalización de diversas
respuestas celulares, denominada "señalización redox" (Fruehauf y

123
944
Meyskens2007). Irónicamente, cuando el aumento de ROS alcanza
un nivel tóxico para superar la capacidad antioxidante de las
células, las células cancerosas serán promovidas a la muerte celular
(Trachootham et al.2009). Por ejemplo, la inhibición de la
superóxido dismutasa y la acumulación resultante de superóxido
pueden provocar daño de las membranas mitocondriales,
liberación de citocromo c y eventual apoptosis en células
leucémicas humanas (Huang et al.2000).
Las ROS son moléculas difusibles y de vida corta. Por lo
tanto, se ha sugerido que la NADPH oxidasa podría tener
localizaciones subcelulares discretas, como caveolas/balsas
lipídicas, redoxosomas y el núcleo, que le permiten localizar la
producción de ROS y activar la señalización redox al interactuar
con moléculas de señalización (Oakley et al.2009; Ushio Fukai
2009). Por lo tanto, proponemos la siguiente interacción entre
c-Src, NADPH oxidasa y activación de EGFR como se muestra en
la Fig.6. En respuesta a ATO, la transactivación de EGFR podría
compartimentarse mediante la producción de superóxido a
partir de la NADPH oxidasa o la interacción con c-Src en
caveolas/balsas lipídicas o redoxosomas, que pueden
transducir la señalización redox a la vía oncogénica mediante la
fosforilación de EGFR-Y845; o a la acción a prueba de fallos
contra la transformación mediante la fosforilación sostenida de
c-Src y ERK, el aumento de ROS a un nivel tóxico y la expresión
de p21, que luego puede inducir la detención/apoptosis de los
queratinocitos.
Expresiones de gratitudEste trabajo ha sido subvencionado por el Consejo
Nacional de Ciencias de Taiwán (números de subvención: NSC95-2320-
B-006-055-MY3 y NSC98-2320-B-006-008-MY3).
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