Manual de Prácticas Biología Molecular-2017-QBP-2020

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

PE QUÍMICO BIÓLOGO PARASITÓLOGO
PE DE BIOTECNOLOGÍA
BIOLOGÍA MOLECULAR
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Dra. Verónica Antonio Véjar

Dra. Iris Paola Guzmán Guzmán
Dr. Miguel Ángel Mendoza Catalán
Dr. Napoleón Navarro Tito

Dr. Oscar del Moral Hernández
Edición 2020
Biología Molecular
PRESENTACIÓN
Con el descubrimiento de la estructura secundaria del DNA por Watson y Crick en

1953 se inauguró una nueva era en la ciencia moderna. El nacimiento de la
biología molecular fue sin duda el gran paso que la humanidad necesitaba para
profundizar en el conocimiento de la estructura y funcionamiento de las
biomoléculas, del flujo genético de la información y de todos los mecanismos
inherentes a la vida. A partir de este descubrimiento esta ciencia ha tenido un
avance muy notable, ya que se ha logrado aplicar prácticamente a todos los niveles
de la investigación. Para tener un mayor conocimiento acerca del flujo de la
información genética y de las herramientas que se han desarrollado para intervenir
en ese flujo es necesario que los estudiantes de licenciatura practiquen y aprendan
en el laboratorio haciendo uso de las técnicas básicas de biología molecular. Por lo
tanto se presenta este manual de prácticas del curso de biología molecular que junto
con la secuencia didáctica y el programa de la unidad de aprendizaje ayudara al
estudiante en la construcción de su conocimiento para adquirir las competencias
planteadas en dicha unidad de aprendizaje.
2
Biología Molecular
CONTENIDO
PRESENTACIÓN 2
COMPETENCIAS 5
LINEAMIENTOS EN EL LABORATORIO: 5
EVALUACIÓN DEL LABORATORIO 6
PRÁCTICA 1 7
ENTRENAMIENTO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR 7
(USO DE UNIDADES Y EQUIPO ESPECIAL) 7
PRÁCTICA 2 11
OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA CROMOSOMAL 11
PRÁCTICA 3 12
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACION DE DNA POR ESPECTROFOTOMETRÍA
12
PRÁCTICA 4 15
ELECTROFORESIS DE DNA 15
PRÁCTICA 5 18
DIGESTIÓN DEL DNA 18
PRÁCTICA 6 21
ANÁLISIS DE LA DIGESTIÓN DEL DNA 21
PRÁCTICA 7 24
DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS 24
PRÁCTICA 8 26
PCR VIRTUAL 26
PRÁCTICA 9 28
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 29
PRÁCTICA 10 32
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS 32
PRÁCTICA 11 34
3
Biología Molecular
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 34
PRÁCTICA 12 37
INTEGRIDAD DE PROTEÍNAS: ELECTROFORESIS VERTICAL (SDS-PAGE) 37
PRÁCTICA 13 40
TRANSFORMACIÓN DE ESCHERICHIA COLI 40
PRÁCTICA 14 43
OBTENCIÓN DE DNA PLASMÍDICO 43
PRÁCTICA 15 46
BÚSQUEDA DE PLÁSMIDOS RECOMBINANTES 46
Y NO RECOMBINANTES 46
4
Biología Molecular
COMPETENCIAS
a) Adquiere destreza y habilidad en el manejo de técnicas básicas de biología

molecular para su aplicación en el estudio de procesos biológicos o en el
diagnóstico molecular de enfermedades mediante el uso adecuado del
equipo e instalaciones del laboratorio, mostrando disposición e interés en un
ambiente de cordialidad y respeto.
b) Aplica los conocimientos sobre el flujo de la información genética a través de

experimentos de laboratorio, mediante análisis y discusión de resultados
individuales y por equipo en un ambiente de respeto y tolerancia para
coadyuvar en el diagnóstico de enfermedades humanas.
RECOMENDACIONES ESPECIALES:
LINEAMIENTOS EN EL LABORATORIO:
El estudiante deberá leer cada práctica antes de presentarse a la sesión de

laboratorio, ya que este curso está dirigido hacia la aplicación de técnicas de estudio
de la Biología Molecular. Para lo cual se pide el diseño y control sobre los
experimentos que se estén realizando.
El estudiante deberá cumplir como mínimo en cada sesión de prácticas con lo

siguiente:
1. Manual de prácticas de Biología Molecular.
2. El estudiante deberá mostrar buena conducta dentro del laboratorio y cumplir

con los lineamientos que marca el reglamento interno de los laboratorios de
docencia:
3. El uso de la bata en el laboratorio es obligatorio y NO se permitirá el acceso

al mismo a ningún estudiante si no la porta en ese momento.
4. El estudiante deberá tener limpio su lugar de trabajo, por tal motivo deberá
depositar la basura en los cestos y no en el suelo y no se permite la ingesta
de alimentos ni bebidas dentro del laboratorio.
5. Al término de la práctica todo el material de cristalería utilizado debe estar

perfectamente lavado y sus mesas de trabajo limpias.
5
Biología Molecular
6. Trabaje en orden, evitando distraer a sus compañeros cuando estén

realizando experimentos. El estudiante desordenado será suspendido de la
sesión en curso.
7. Está prohibido el uso de celulares dentro del laboratorio como medio de

comunicación. Solo podrán ser utilizados para la toma de fotografías de las
preparaciones cuando así lo requieran y para una mayor calidad en el
reporte.
EVALUACIÓN DEL LABORATORIO
 Se pasará lista de asistencia dentro de los primeros 15 min de la sesión,

después de este tiempo se contará como falta y no se le permitirá la entrada
a ningún estudiante al laboratorio.
 La evaluación final de la parte práctica tendrá un puntaje máximo de 3.0 (30%

de la calificación final) la cual será sumada a la calificación teórica
correspondiente. Ambas calificaciones (teórica y práctica), deberán ser
aprobatorias, de lo contrario automáticamente tendrán que presentar el
examen extraordinario.
6
Biología Molecular
PRÁCTICA 1
ENTRENAMIENTO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

(Uso de unidades y equipo especial)
INTRODUCCIÓN
En el laboratorio de Biología Molecular, se trabaja con concentraciones y volúmenes

muy pequeños de reactivos, por lo que es fundamental el buen uso de instrumentos
para tomar pequeños volúmenes con precisión, así como conocer las unidades de
medición utilizadas y la conversión a otras unidades.
Las micropipetas son un instrumento usado para absorber y transferir pequeños

volúmenes de líquidos que son necesarios en una amplia variedad de técnicas
científicas en el laboratorio. Existen varios tipos de micropipetas, las cuáles se
utilizarán en función de las necesidades en la técnica a realizar; variarán en la
capacidad mínima y máxima del volumen a absorber, volumen fijo o variable,
pipetas multicanal, automatizadas, etcétera. Es importante conocer los diferentes
tipos de pipetas y su forma adecuada de uso y operación, las técnicas de pipeteo,
así como los cuidados y mantenimiento del equipo, dado que de no utilizarlas con
extremo cuidado se descalibran con facilidad y deben ser calibradas nuevamente
por un profesional. Es muy importante medir ÚNICAMENTE volúmenes para los
cuales fueron diseñadas y jamás colocar una micropipeta en uso (es decir con
líquido succionado), de forma horizontal sobre la mesa de trabajo pues dañaría el
mecanismo de funcionamiento.
Las micropipetas más comunes miden intervalos de 0.5 µL a 1,000 µL, que utilizan
puntas desechables para succionar el líquido. La mayoría de las micropipetas
indican el intervalo de volumen que miden, es recomendable verificarlo antes de
usarlas y familiarizarse con la escala.
Para evitar confusiones en el sistema de medidas y tener un criterio homogéneo, se

creó el Sistema Internacional de Unidades, que entre otras, contempla las cuatro
unidades fundamentales: longitud, masa, tiempo y carga eléctrica. Estas
dimensiones serán muy utilizadas en el laboratorio de Biología Molecular.
HABILIDAD
- Maneja adecuadamente los equipos del laboratorio de Biología Molecular.

- Conoce las unidades de medición y la conversión de unidades.
MATERIAL Y EQUIPO
7
Biología Molecular
Micropipetas automáticas de volumen variable (20, 200 y 1000 µl)
Espectrofotómetro
Tubos Eppendorf 600 µl
Puntas para micropipetas
Papel Parafilm
Hoja milimétrica
REACTIVOS
Agua destilada
Colorante vegetal azul, rojo y amarillo
Azul de Coomasie R-250 10%
Glicerol
PROCEDIMIENTO. Uso correcto de las micropipetas automáticas (técnicas de

pipeteo)
1. Preparación: Tomar la micropipeta en forma vertical con la posición de inicio

y oprimir suavemente el émbolo utilizando el dedo pulgar, hasta el primer
tope.
2. Aspiración: Sumergir la punta de la micropipeta en el líquido, mover el dedo

pulgar hacia arriba muy lentamente hasta que el émbolo se encuentre en la
posición de inicio.
3. Distribución: Colocar la micropipeta en un ángulo de 10 ° a 45° y pegar la

punta de la micropipeta a la pared interior del recipiente que recibirá el
líquido. Oprimir suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer tope.
4. Purga: Esperar una segundos, oprimir firmemente el émbolo hasta el

segundo tope. Esto removerá cualquier cantidad remanente del líquido
dispensado en la punta.
5. Descanso: Liberar el émbolo de la presión ejercida por el pulgar hasta que

éste alcance la posición de inicio.
PROCEDIMIENTO:
1. Sobre un fragmento de 3x3 cm de papel Parafilm, en la parte baja colocar

cinco gotas de 5µl de agua destilada con colorante amarillo separadas
horizontalmente de forma homogénea.
2. De forma vertical a cada gota del punto anterior (0.5 cm de distancia
máximo), coloca una gota de 10µl de agua destilada con colorante rojo.
3. De forma vertical a cada una de las gotas del punto 2, colocar 20µl de agua
con colorante azul.
8
Biología Molecular
4. Colocar tres gotas de 10µl de glicerol a la derecha de las gotas de la última
serie (Columna a la derecha).
5. Comparar el diámetro y documentar las gotas sobre el papel; las gotas deben
estar separadas una de otra.
Preparación de soluciones
1. Etiquetar 3 tubos eppendorf como A, B y C

2. Colocar 375 µl de agua destilada en un tubo eppendorf en el tubo A y agregar
25 µl de Azul de Coomasie al 10%.
3. En el tubo B, colocar 350 µl de agua destilada y agregar 50 µl de Azul de
Coomasie al 10%.
4. En el tubo C, colocar 300 µl de agua destilada y agregar 100 µl de Azul de
Coomasie al 10%.
5. Homogenizar muy bien las soluciones y leer la absorbancia en el
espectrofotómetro a 595 nm.
6. Considerando cada serie como una observación independiente, promediar
las observaciones de cada tubo y graficar los datos en formato de dispersión.
7. Obtener el valor de R2 del gráfico y calcular el error estándar.
Uso de unidades de medición
1. Realizar en el laboratorio los ejercicios de conversión de unidades,

propuestos por el profesor en la sesión práctica.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las unidades de concentración, masa y volumen usadas en el

laboratorio de Biología Molecular?
2. ¿Qué diferencia hay entre las unidades de masa, volumen y concentración?
3. Menciona brevemente la forma correcta de uso de las micropipetas.
4. ¿Cuál es el fundamento de la espectrofotometría?
5. ¿Qué diferencia hay entre espectrofotometría VIS y UV?
6. Menciona las características de la luz UV y por qué debes protegerte al
trabajar con equipos que usen luz UV.
7. Partiendo de 10-2, enlista los submúltiplos de las dimensiones masa y
volumen, hasta 10-9
9
Biología Molecular
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
Amador, Á. 2002. Manual de uso de equipo y cuidados básicos. Instituto

Tecnológico de Costa Rica.
Cooper, T.G. 1980. Instrumentos y técnicas de Bioquímica, Ed. Reverté.
Manuales de uso de cada instrumento de laboratorio.
10
Biología Molecular
PRÁCTICA 2
OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA CROMOSOMAL
INTRODUCCIÓN
La molécula de DNA está formada por dos polímeros extremadamente largos

sostenidos entre sí por enlaces de hidrógeno y enrollados en lo que se conoce como
doble hélice. Cada uno de los dos polímeros está formado por numerosas
subunidades llamadas nucleótidos, enlazadas covalentemente formando las
cadenas. Cada nucleótido está compuesto por tres partes: un compuesto de fósforo
llamado fosfato, un azúcar de 5 carbonos simples y una base nitrogenada. Existen
cuatro bases nitrogenadas en el DNA, por lo tanto hay cuatro diferentes nucleótidos.
Su ordenamiento lineal específico dentro del polímero constituye el código químico
(código genético).
El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y

distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de
ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y
liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El
detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.
Es de gran importancia la extracción de ácido desoxirribonucléico (DNA) humano

de alta pureza a partir de glóbulos blancos, para su aplicación en infinidad de
estudios moleculares, como diagnóstico de enfermedades genéticas, determinación
de polimorfismos, enfermedades infecciosas, pruebas de paternidad etc. Existen
diversas técnicas que pueden ser utilizadas dependiendo del tipo de muestra que
se estudie y el uso que se le pretenda dar, lo importante es obtener la mayor
cantidad de DNA con un alto grado de pureza.
HABILIDAD
- Extrae, purifica y cuantifica DNA cromosomal.
MATERIAL Y EQUIPO
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Biología Molecular
Sistema de extracción de sangre periférica, con EDTA
Microcentrífuga
Agitador Vortex
Micropipetas automáticas de volumen variable (20, 200 y 1000 µl).
Tubos Eppendorf
Gradilla para tubos Eppendorf
Piceta con agua destilada
Guantes de látex
Papel absorbente
REACTIVOS
Buffer TKM1 (Tris-HCl 10mM pH 7.6, KCl 10mM, MgCl2 10 mM, EDTA 2mM, NP-40
2.5%)
Buffer TKM2 (Tris-HCl 10mM pH 7.6, KCl 10mM, MgCl2 10 mM, EDTA 2mM, NaCl
0.4M, SDS 0-5%)
Tritón X100
SDS al 10%
NaCl 5 M
Isopropanol
Etanol al 70% (FRIO)
Etanol absoluto (FRIO)
H2O desionizada estéril
PROCEDIMIENTO
1. Extraiga 3 ml de sangre venosa periférica con anticoagulante.
Extracción de DNA mediante una técnica rápida, no enzimática, en muestras

de sangre periférica.
2. Transferir 700 µl de sangre periférica a un tubo Eppendorf estéril de 1.5 ml

3. Adicionar 700 µl de buffer TKM1 y 18 µl de Tritón X100, agitar en el vortex
hasta disolver totalmente.
4. Centrifugar a 3,500 rpm por 5 min a temperatura ambiente y desechar el
sobrenadante.
5. Repetir los pasos 3 y 4 hasta observar el botón blanco (libre de hemoglobina).
6. Adicionar 700 µl de buffer TKM1.
7. Centrifugar a 3,500 rpm a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
8. Resuspender el botón en 120 µl de buffer TKM2 y adicionar 15 µl de SDS al
10%. (Para muestras de saliva agregar 3.8 µl de proteinasa K y resuspender
totalmente e incubar 30 minutos a 65 °C o hasta la digestión).
9. Agregar 60 µl de NaCl 5 M y resuspender por agitación suave.
10
Biología Molecular
10. Centrifugar a 12,000 rpm a temperatura ambiente.
11. Recuperar el sobrenadante (que contiene el DNA) en un tubo Eppendorf
estéril y desechar el precipitado proteico.
12. Agregar dos volúmenes de etanol absoluto frio e invertir varias veces
suavemente el tubo hasta que el DNA se precipite.
13. Centrifugar a 5,000 rpm a 4 °C por 10 min y decantar el exceso de etanol,
después agregar 400 µl de etanol al 70% frio.
14. Centrifugar a 5,000 rpm a 4 °C por 10 min y decantar el exceso de etanol y
secar al vacio.
15. Resuspender el DNA con 100 µl de agua desionizada estéril
NOTA: antes de cuantificar se debe hidratar muy bien la muestra, posteriormente

realizar una o varias diluciones de la muestra (por ejemplo, 1:100, 1:200, 1:500) con
agua desionizada estéril.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento teórico de la técnica de extracción del DNA?

2. ¿Cuáles consideras son los pasos críticos en la extracción?
3. Investiga y menciona otros métodos de extracción de DNA.
4. ¿Qué utilidad tiene la extracción de DNA?
5. ¿Existe algún riesgo con los reactivos a utilizar en esta técnica?, menciona
cuáles son las medidas de seguridad al respecto.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc. 1994.
Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H.F. 1998. A simple salting out procedure for
extracting DNA from human cell. Nucleid Acids Research: 16(3): 1215.
Wallace, R. A., King, J.L., Sanders, G.P. 1991. Biología Molecular y Herencia. 1a
edición. Editorial. Trillas. México. Pág: 97-98.
11
Biología Molecular
PRÁCTICA 3
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE DNA POR

ESPECTROFOTOMETRÍA
INTRODUCCIÓN
Es de gran importancia la obtención de DNA humano de alta pureza a partir de

glóbulos blancos, para su aplicación en diversos estudios moleculares, sin embargo,
los tratamientos físicos y químicos involucrados en la extracción de DNA pueden
afectar la cantidad y la calidad del DNA obtenido.
Existen diversos métodos para estimar la concentración de ácidos nucleicos en una

preparación. Si la muestra es pura (no contiene cantidades significativas de
contaminantes como proteínas, fenol, agarosa o incluso otros ácidos nucleicos), su
medición mediante espectrofotometría de la luz UV absorbida por las bases
nitrogenadas es la más adecuada. Debido a su rapidez, simplicidad y ausencia de
daño, la cuantificación de DNA por espectrofotometría ha sido ampliamente
utilizada. Sin embargo, esta técnica es poco sensible, y para la mayoría de los
espectrofotómetros se requiere una concentración de DNA de al menos 1 µg.ml-1
en la muestra para poder realizar estimaciones válidas.
La determinación de la pureza del DNA se realiza en el nanodrop con base en las

lecturas de la absorbancia a 260 y 280 nm. La lectura a 260 nm se utiliza para
realizar la cuantificación del DNA (1 DO260=50 µg/ml)
Una estimación de la pureza de una muestra de DNA se obtiene por la relación de

DO a 260 y 280 nm (260/280). Para una preparación pura de DNA, la relación de
DO260/280 debe ser 1.8, valores menores indican contaminación de la muestra con
proteínas y valores mayores hasta 2.0 indican preparaciones de DNA altamente
purificado, mientras que valores mayores a 2.0 indican contaminaciones con
reactivos como fenol.
HABILIDAD
- Calcula la concentración y pureza de DNA de doble cadena por el método

espectrofotométrico.
MATERIAL Y EQUIPO
Espectrofotómetro UV/visible
Micropipetas automáticas de volumen variable (20 l).
Tubos Eppendorf
12
Biología Molecular
Guantes de látex
Papel higiénico
Recipiente
BIOLÓGICOS Y REACTIVOS
Piceta con agua destilada
DNA cromosomal
PROCEDIMIENTO UTILIZANDO EL ESPECTOFOTÓMETRO UV
1. Preparar una dilución 1:100 del DNA cromosomal en agua destilada en un

volumen total de 500 l.
2. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro UV/visible a 260 nm o leer
directamente la concentración. Si se lee la absorbancia, para calcular la
concentración se considera que 1 D.O. corresponde a 50 g/ml de DNA de doble
cadena.
PROCEDIMIENTO UTILIZANDO EL NANODROP
Figura 1. Nanodrop
1. Limpiar las burbujas del Nanodrop con un pedazo de papel seda o de baja
pelusa (kimwipes), cuidando de no tallar, sólo tocar.
2. Abrir el programa correspondiente.
3. Seleccionar el tipo de material a leer (DNA, RNA o PROTEÍNAS) y elegir la
opción “blanco”.
4. Leer el blanco (éste será la solución en la cual esté hidratado el material a
leer, puede ser agua bidestilada, por ejemplo). Colocar 1 µl del blanco en el
centro de la burbuja y bajar la tapa.
13
Biología Molecular
5. El programa preguntará si se quiere guardar la información de la lectura (el
archivo se guardará en el mismo tipo del programa pero también se puede
exportar a excel).
6. Revisar y anotar los resultados obtenidos.
7. Limpiar las burbujas como se especifica en el punto 1.
8. Colocar 1 µl del material a leer en el centro de la burbuja y bajar la tapa.
9. Leer y anotar los resultados (concentración, pureza, etc.)
10. Si se desea leer otro tipo de material, se debe cambiar la opción y volver a
leer el blanco que corresponda.
11. Al terminar las lecturas, cerrar el programa, y expulsar como una memoria
USB.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué considera que es necesario realizar la estimación de la

concentración del DNA aislado?
2. ¿Por qué se debe realizar una dilución de la muestra antes de medir la D.O.
en el espectrofotómetro?
3. ¿Por qué sólo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimación de la
concentración del DNA? ¿Qué información nos provee la D.O. a 280 nm?
¿Por qué utilizó el valor de 50 g/ml-1 en la fórmula para calcular la
concentración de su muestra?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. 2001. Molecular cloning. A laboratory manual. Third

edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.
14
Biología Molecular
PRÁCTICA 4
ELECTROFORESIS DE DNA
INTRODUCCIÓN
La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y

caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su
tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma
distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis
se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido)
se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En esta práctica, se
pretende que el estudiante comprenda el fundamento teórico de esta técnica y sus
aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en gel de agarosa de
DNA humano que el mismo estudiante va a aislar y purificar. Hay dos fuerzas de
acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza
eléctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es
directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone
a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula.
HABILIDAD
- Realiza la separación electroforética del DNA y lo visualiza con bromuro de

etidio.
MATERIAL Y EQUIPO
Cámara de electroforesis horizontal

Fuente de poder
Balanza analítica
Tripié y rejilla de asbesto
Mechero
Matraz Erlenmeyer de 100 ml
Tubos Eppendorf
Puntas para micropipeta
Microespátula
Guantes de látex
Papel higiénico
Recipiente para tinción con bromuro de etidio.
Papel parafilm
15
Biología Molecular
Agarosa
Amortiguador de electroforesis (TAE 1X)
Amortiguador de corrimiento de la muestra (Loading buffer)
Marcador de peso molecular
DNA digerido del fago lambda
DNA cromosomal
PROCEDIMIENTO
Preparación del gel de agarosa
1. Preparar un gel de agarosa al 1% en 20 ml de amortiguador para electroforesis

(Amortiguador TAE 1X). Para ello, pesar 0.2 g de agarosa y colocarla en un
matraz Erlenmeyer de 100 ml. Adicionar 20 ml de amortiguador para
electroforesis.
2. Fundir la agarosa, calentando hasta el punto de ebullición y mezclando
continuamente, asegurándose de que todas las partículas de agarosa se
disuelvan. Retirar del fuego.
3. Enfriar hasta aproximadamente 60°C.
4. Preparar la base de la cámara de electroforesis horizontal colocando el molde
del gel dentro de ella y los aditamentos que sirven para evitar que la agarosa
salga del molde.
5. Colocar el peine del lado del cátodo (negro). El DNA migrará hacia el ánodo
(rojo).
6. Vaciar la agarosa y dejar que solidifique.
7. Remover cuidadosamente el peine del gel y los aditamentos que sirvieron para
formar el gel de agarosa en el molde.
8. Adicionar amortiguador de electroforesis (TAE 1X) hasta que el gel quede
sumergido.
Preparación de la muestra de DNA
1. Calcular el volumen que contenga 3 µg de DNA cromosomal.

2. En un pedazo de papel parafilm, colocar el volumen correspondiente a 3 µg de
DNA cromosomal obtenido de células sanguineas y adicionar 5 µl de
amortiguador de corrimiento. Mezclar con la punta de la micropipeta.
3. Utilizando otra punta, en un pedazo de papel parafilm colocar 2 µl de DNA
digerido del fago lambda y adicionar 5 µl de amortiguador de corrimiento.
Mezclar con la punta de la micropipeta.
4. Colocar cada muestra en los pozos del gel de agarosa.
5. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis sin mover las muestras.
6. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y correr los geles a
100 V durante aproximadamente 30 minutos. El tiempo debe ser el necesario
16
Biología Molecular
para que el colorante del Amortiguador de corrimiento llegue a aproximadamente
1 cm antes del final del gel.
Tinción del DNA y visualización
1. Sacar el gel de la cámara de electroforesis y colocarlo en un recipiente que

contenga 100 ml. de agua destilada con 5 µl de bromuro de etidio de 10 mg/ml.
Agitar durante 20-30 min. Este procedimiento debe realizarse con guantes
ya que el bromuro de etidio es un mutágeno.
2. Lavar el gel de agarosa con agua para eliminar el exceso de colorante.
3. Colocar el gel en un transiluminador UV para la visualización y análisis del DNA.
El complejo DNA-bromuro de etidio se ilumina a una longitud de onda de 300
nm.
4. Fotografiar el gel utilizando un sistema de fotodocumentación.
5. Analizar el gel.
Preparación de reactivos
TAE 50X Amortiguador de corrimiento

242 g de tris base 5 ml de glicerol
57.1 ml de ácido acético glacial 1 ml de azul de bromofenol al 1%
100 ml. de EDTA 0.5 M, pH 8.0 2 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8.0
Aforar a 1 l con H2O destilada 2 ml de EDTA 0.5M, pH 8.0
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la utilidad de la electroforesis?

2. ¿Qué tipo de moléculas se pueden separar por electroforesis?
3. ¿Qué información nos da?
4. ¿Qué es la agarosa?
5. Defina voltaje y amperaje
6. ¿Por qué se tiñe el DNA con bromuro de etidio?
7. ¿Qué es un marcador de peso molecular?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
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Biología Molecular
PRÁCTICA 5
DIGESTIÓN DEL DNA
(Primera parte)
INTRODUCCIÓN:
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de

diversos ensayos útiles en investigación clínica, desde la determinación de
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length
polymorphism, RFLP), así como en la construcción de vectores con DNA
recombinante y clonación de secuencias de DNA provenientes de humano, virus,
bacterias y demás microorganismos de interés para la generación de conocimiento
o para su aplicación en el área de la medicina.
Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen

bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del DNA en una secuencia específica
denominada secuencia diana. El uso de estas enzimas como herramienta
biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas de DNA
genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños. El empleo
de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos, como
la ligasa, permitió desarrollar la metodología del DNA recombinante.
HABILIDAD:
- Realiza la digestión con enzimas de restricción de DNA cromosomal humano

(DNA de alto peso molecular y de un plásmido).
MATERIAL Y EQUIPO
Baño metabólico
Termómetro
Micropipetas automáticas de volumen variable (20 µl).
Tubos Eppendorf de 1.7 ml
Recipiente para tinción con bromuro de etidio.
REACTIVOS
Enzimas de restricción: PstI y BamHI.
Buffer de las enzimas de restricción
RNasa
DNA cromosomal
Fragmento de 450 pares de bases del gen L1 del virus del papiloma humano (VPH).
18
Biología Molecular
Plásmido pUC
PROCEDIMIENTO
Digestión del DNA

1. Se realizará la digestión de:
a) DNA cromosomal con las enzimas de restricción PstI y BamHI.
b) De un fragmento de DNA de 450 pares de bases proveniente del genoma del
virus del papiloma humano, con las enzimas de restricción PstI y BamHI.
c) DNA del fago Lamda sin digerir.
2. La digestión se realizará preparando la siguiente mezcla y colocándola en un

tubo Eppendorf de 1.5 ml.
Componente Concentración final Volumen (µl)

DNA (cromosomal o plásmido) 2-3 µg
Buffer de la enzima 10X 1X
RNasa 0.1 mg/ml
Enzima de restricción 2-3 U/µg de DNA
H2O desionizada Aforar al volumen final
Volumen final 20 µl
CONDICIONES
Muestra PstI BamHI

1 DNA cromosomal - -
2 DNA cromosomal + -
3 DNA cromosomal - +
4 Producto PCR - -
5 Producto PCR + -
6 Producto PCR - +
3. Incubar a 37°C en baño metabólico durante 2-3 horas. Colocar los tubos
Eppendorf en hielo o congelar a –20 °C para su uso posterior.
4. Los DNAs digeridos contenidos en los tubos Eppendorf serán analizados
haciendo un corrimiento electroforético.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es una enzima de restricción y cuál es la importancia de su uso en

biología molecular?
2. ¿Qué factores afectan la actividad de las enzimas de restricción?
19
Biología Molecular
3. ¿Cómo se define una unidad (U) de enzima de restricción?
4. ¿Cómo se logra la mayor eficiencia en la actividad de las enzimas de
restricción?
5. ¿Aumenta la eficiencia de la actividad de restricción si se rebasa el tiempo
recomendado de incubación? Explica tu respuesta
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. 2013.
McGraw Hill. Páginas 120-125
20
Biología Molecular
PRÁCTICA 6
ANÁLISIS DE LA DIGESTIÓN DEL DNA

(Segunda parte)
Continuación:
HABILIDAD
- Analiza el corrimiento electroforético del DNA digerido.
1. Realizar un corrimiento electroforético en un gel de agarosa al 1% de las

siguientes muestras (a todos los DNAs habrá que agregar 3 a 5 µl de
amortiguador de corrimiento):
1. Marcador de peso molecular

2. DNA cromosomal sin digerir (2 µg).
3. DNA cromosomal digerido con PstI (10 µl de la digestión)
4. DNA cromosomal digerido con BamHI (10 µl de la digestión)
5. Fragmento de 250 pares de bases sin digerir
6. Fragmento de 250 pares de bases digerido con PstI (10 µl de la digestión).
7. Fragmento de 450 pares de bases digerido con BamHI (10 µl de la digestión).
Preparación del gel de agarosa
2. Preparar un gel de agarosa al 1% en 20 ml de amortiguador para electroforesis

(Amortiguador TAE 1X). Para ello, pesar 0.2 g. de agarosa y colocarla en un
matraz Erlenmeyer de 100 ml. Adicionar 20 ml. de Amortiguador para
electroforesis.
3. Fundir la agarosa, calentando hasta el punto de ebullición y mezclando
continuamente, asegurándose de que todas las partículas de agarosa se
disuelvan. Retirar del horno de microondas y enfriar hasta aproximadamente
60°C.
4. Preparar la base de la cámara de electroforesis horizontal colocando el molde
del gel dentro de ella y los aditamentos que sirven para evitar que la agarosa
salga del molde.
5. Colocar el peine del lado del cátodo (negro). El DNA migrará hacia el ánodo
(rojo).
6. Vaciar la agarosa y dejar que solidifique.
7. Remover cuidadosamente el peine del gel y los aditamentos que sirvieron para
formar el gel de agarosa en el molde.
8. Adicionar amortiguador de electroforesis (TAE 1X) hasta que el gel quede
sumergido.
Preparación de la muestra de DNA
21
Biología Molecular
9. En un fragmento de papel parafilm, colocar 3 µl de los DNAs que se van a

estudiar y a cada uno, adicionar 5 µl de amortiguador de corrimiento. Mezclar
con la punta de la micropipeta. Utilizar una punta por cada DNA.
10. Utilizando otra punta, en un pedazo de papel parafilm colocar 2 µl del marcador
de DNA y adicionar 5 µl de amortiguador de corrimiento. Mezclar con la punta
de la micropipeta.
11. Colocar cada muestra en los pozos del gel de agarosa.
12. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis sin mover las muestras.
13. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y correr los geles a
100 V durante aproximadamente 30 min. El tiempo debe ser el necesario para
que el colorante del amortiguador de corrimiento llegue a aproximadamente 1
cm antes del final del gel.
Tinción del DNA y visualización
14. Sacar el gel de la cámara de electroforesis y colocarlo en un recipiente que

contenga 100 ml. de agua destilada con 5 µl de bromuro de etidio (BrEt) de 10
mg/ml. Agitar durante 20-30 min. Este procedimiento debe realizarse con
guantes ya que el bromuro de etidio es un mutágeno.
15. Lavar el gel de agarosa con agua para eliminar el exceso de colorante.
16. Colocar el gel en un transiluminador UV para la visualización y análisis del DNA.
El complejo DNA-bromuro de etidio se ilumina a una longitud de onda de 300
nm.
17. Fotografiar el gel utilizando un sistema de fotodocumentación.
18. Analizar el gel.
CUESTIONARIO
1. Si estuviéramos trabajando con un DNA lineal como el que se muestra en la
figura siguiente, ¿cuál es el tamaño en pares de bases (pb) de los fragmentos
de DNA que se obtienen al realizar las digestiones con las enzimas d, e, f y
con las distintas combinaciones entre las mismas? Los números
corresponden al número de pares de bases del DNA (en total su tamaño es
de 1500 pb).
2. Explique cuáles son las semejanzas y diferencias entre los dos tipos de
endonucleasas de DNA.
3. Señale las razones por las cuales son utilizadas las endonucleasas de
restricción tipo II en la tecnología del DNA recombinante.
22
Biología Molecular
4. Esquematice la forma en la que se cortan los enlaces fosfodiéster de un
fragmento de DNA generando extremos romos y uno donde se generen
extremos pegajosos o cohesivos. Señale la ventaja de utilizar enzimas de
restricción que generan extremos “pegajosos” o cohesivos en la tecnología
del DNA recombinante.
5. Explique dos aplicaciones de la tecnología del DNA recombinante.
6. Señale al menos tres posibles aplicaciones de los mapas de restricción.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
23
Biología Molecular
PRÁCTICA 7
DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)

(AMPLIFICACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA ESPECÍFICO)
INTRODUCCIÓN:
La amplificación de un fragmento de DNA de interés, será específico gracias a la

complementariedad de secuencias cortas de DNA que reconozcan y delimiten la
región de DNA a amplificar mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR). La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también
llamados primers u oligonucleótidos, de cuyo diseño adecuado depende el éxito de
la PCR. Los iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras secundarias
entre ellos ni hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.
HABILIDAD:
- Diseña oligonucleótidos in silico para el reconocimiento y amplificación de un

fragmento de DNA de interés.
RECURSOS:
Plataformas en línea para la generación de oligonucleótidos: Primer3Plus
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
GenBank
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
BLAST
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
PROCEDIMIENTO:
Diseñar oligos para la región codificante de un gen.

1. Identificar la secuencia de nucleótidos del gen p53 (GenBank: AB082923.1)
y Tubulina alfa 1 (NCBI Reference Sequence: NM_006009.3).
2. Convertir la secuencia del gen a formato FASTA.
24
Biología Molecular
3. Delimitar la región codificante del gen (inicio verde, terminación rojo).
4. Pegar la secuencia de interés en la plataforma Primer3Plus para el diseño de
oligonucleótidos (Pick Primers).
5. Seleccionar dos juegos de primers de interés para cada gen.
6. Validar que los oligonucleótidos reconozcan la secuencia de DNA de interés,
mediante un BLAST de nucleótido.
7. Organizar los primers en una tabla como Forward y Reverse, el porcentaje
de GC de cada uno, así como el tamaño esperado del producto.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia de considerar el contenido en G/C y cadenas de

polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G) en el diseño de oligonucleótidos?
2. Resuma en una tabla los criterios positivos a considerar en el diseño de

oligonucleótidos.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
25
Biología Molecular
PRÁCTICA 8
PCR VIRTUAL
(VALIDACIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS)
INTRODUCCIÓN
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera una de las técnicas

más sensibles y específicas de las pruebas moleculares. Fue desarrollada en 1986
por el Dr. Kary Mullis, en los laboratorios de CETUR Corporation, en Estados
Unidos, lo que le hizo merecedor del premio Nobel en 1993. La idea se fundamentó
en la necesidad de obtener un gran número de copias de fragmentos específicos de
DNA de manera rápida y económica, los cuales no podían obtenerse por otros
métodos hasta ese momento. Esta técnica se basa en una replicación exponencial
in vitro de una molécula de DNA genómico (DNAg) o DNA complementario (DNAc),
mediante ciclos repetitivos, que constan de tres temperaturas. En cada uno de los
ciclos las moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan.
HABILIDAD:
- Realiza la amplificación de DNA in silico validando el diseño de los

oligonucleótidos a utilizar en la técnica de PCR para garantizar la detección
y amplificación real del gen de interés.
RECURSOS:
http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html
PROCEDIMIENTO:
1. Copiar los oligonucleótidos diseñados (Sentido y antisentido) y colocarlos en
la plataforma de PCR virtual (Bioinformatics).
2. Pegar la secuencia de DNA en formato FASTA sobre la que se diseñaron los
oligonucleótidos
3. Dar click en enviar para que la plataforma calcule el tamaño esperado del
producto de PCR.
4. Anotar el tamaño del producto de PCR para cada par de oligonucléotidos.
26
Biología Molecular
5. Validar que los productos de PCR correspondan con la secuencia del gen de
interés.
6. Organizar los resultados de forma que se describan los oligos diseñados, el
producto de PCR, el tamaño del fragmento y el resultado del BLAST
(alineamiento, % Id).
7. Colocar evidencia de cada paso en el reporte de resultados para cada gen y
cada par de oligonucleótidos.
CUESTONARIO:
1. ¿Qué es la PCR?
2. ¿Cuáles son las principales aplicaciones de la PCR?
3. Describe el procedimiento y fundamento de la PCR
4. Además del DNA ¿cuáles son los reactivos necesarios en la técnica de PCR?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
27
Biología Molecular
PRÁCTICA 9
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
INTRODUCCIÓN
La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método

simple pero poderoso, inventado por K. B. Mullis y patentado inicialmente por la
compañía Cetus (California, USA), para amplificar fragmentos de DNA mediante la
incubación sucesiva a diferentes temperaturas. Por lo general, se emplea una doble
cadena de DNA que es desnaturalizada por calentamiento (94-95°C), se permite el
alineamiento de dos cebadores (iniciadores u oligonucleótidos) complementarios en
los extremos 3’ de cada cadena (a una temperatura que depende de los cebadores)
y finalmente se permite la elongación de las cadenas a una temperatura de 72-74
°C. Todo este PRÁCTICA se conoce como un ciclo y estos pasos se repiten hasta
obtener una amplificación de los segmentos de DNA de al menos 1x105 veces y
potencialmente hasta 1x109 veces.
La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta, pero presenta algunos

inconvenientes como son el hecho de que exista la probabilidad relativamente alta
de obtener falsos positivos por contaminación y que no es una técnica cuantitativa,
sino semi-cuantitativa. Para resolver el primer problema se debe de optimizar la
secuencia de los cebadores, así como la temperatura precisa para que estos se
unan al DNA correctamente y realizar una adecuada manipulación de los reactivos.
HABILIDAD
- Detecta y amplifica un fragmento del gen L1 del virus del papiloma humano
(VPH) a partir de DNA cromosomal obtenido de células cervicales y utilizando
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
MATERIAL Y EQUIPO
Termociclador
Micropipetas automáticas de volumen variable (20, 200 y 1000 l)
Cámara para electroforesis
Fuente de poder
Balanza analítica
Microcentrífuga
Microespátula
Tubos Eppendorf de 1.5 y 0.2 l
Pinzas de disección
28
Biología Molecular
Mechero
Recipiente de plástico para tinción con bromuro de etidio
Papel parafilm
Papel absorbente
Algodón
Termo con hielo
REACTIVOS
Cloro 10%
Etanol 70%
Agarosa
Amortiguador de corrimiento de la muestra (Loading buffer)
Buffer para PCR 10X
Mezcla de 4 deoxinucleótidos 10mM (A, G, C, T)
MgCl2 25 mM
Iniciadores MY09 y MY11 10 M
Taq DNA polimerasa 5U/l
PROCEDIMIENTO
1. En condiciones de esterilidad preparar la mezcla para 6 reacciones de PCR de

la manera siguiente:
H2O 129.6 l
Buffer PCR 10X 30 l
dNTPs 10 mM 18 l
MgCl2 50 mM 12 l
MY09 10 M 24 l
MY11 10 M 24 l
Taq DNA polimerasa 2.4 l
Volumen total 240 l
2. Agitar la mezcla unos segundos y centrifugar.

3. Dividir la mezcla de reacción (240 l) en 6 tubos Eppendorf de 0.2 l con
40 l cada uno.
4. Adicionar a cada tubo10 l compuestos por H2O desionizada estéril + DNA
problema o control (el DNA debe colocarse en la pared del tubo para evitar
que esté en contacto con la mezcla de PCR) como sigue:
29
Biología Molecular
DNA H2O
DNA cervical (1)
DNA cervical (2)
DNA cervical (3)
DNA del VPH tipo 18 (Céls. HeLa) 1 l 9 l
DNA del VPH tipo 16 (1 ng) 1 l 9 l
H2O 10 l
5. Centrifugar para bajar el DNA y homogeneizar la reacción, la cual tendrá un

volumen total de 50 µl.
6. Colocar los tubos en el termociclador y correr el programa de PCR para VPH.
Ciclo 1: 5 min 95ºC, ciclo 2: 1 min 95ºC, 1 min 54ºC, 1 min 72oC (40 pasos),
ciclo 3: 10 min 72°C.
7. Transcurrido el tiempo de amplificación (aproximadamente 3 h y media)
deberá correrse una electroforesis en gel de agarosa al 1.5% como se ha
especificado en prácticas anteriores para verificar los productos de la PCR.
CUESTIONARIO:
1. Señale brevemente los fundamentos de la técnica de PCR y esquematiza y

describe lo que sucede en cada uno de los tres pasos básicos de la técnica
de PCR.
2. Señale las ventajas de utilizar DNA polimerasas termoestables.
3. Mencione una variación a la técnica de PCR (Q-PCR, RT-PCR, RAPD) y
describa las semejanzas y diferencias con la técnica de PCR convencional.
4. Mencione la función de cada uno de los componentes de la mezcla de
reacción de PCR: a) buffer de reacción, b) MgCl2, c) mezcla de dNTP’s, d)
oligonucleótidos e) DNA polimerasa y f) DNA molde.
5. Explique por qué razón la temperatura de alineamiento es variable y depende
de la secuencia de los oligonucleótidos.
6. Señale qué problemas se pueden suscitar si la concentración del ión
magnesio (Mg2+) es más alta o más baja de la concentración óptima en
reacciones de PCR.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
30
Biología Molecular
REFERENCIAS
Bauer, H.M., C.E., Greer y M.M. Manos. 1992. Determination of genital human
papaillomavirus infection by consensus PCR amplification, 131-152. En: C.S.
Herringtong y J.O. McGee (ed.). Diagnostic Molecular Pathology: A Practical
Approach. Oxford University Press, Oxford.
31
Biología Molecular
PRÁCTICA 10
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son polímeros de aminoácidos que ejecutan la mayor parte de las
funciones vitales de las células: el reconocimiento molecular, el transporte de
moléculas, la función estructural, la catálisis de las reacciones químicas, inclusive
la regulación de la expresión de los genes está determinada por proteínas que
interactúan con el DNA.
Cada proteína presenta una secuencia específica de aminoácidos, esta secuencia

también llamada estructura primaria contiene la información necesaria para que
estas biomoléculas se plieguen o adquieran una estructura tridimensional específica
para desarrollar una función.
HABILIDAD
- Extrae proteínas de células eucariotas en cultivo para su estudio.
MATERIALES Y EQUIPO
Centrífuga refrigerada
Tubos eppendorf 1.5ml
Micropipetas de volumen variable
REACTIVOS
PBS 1x
Buffer RIPA (50 mM TrisHCl pH7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1%
SDS)
PROCEDIMIENTO
1. Retirar el medio de cultivo de las células

2. Hacer un lavado con PBS frío (4 °C) a las células en la placa de cultivo y
desechar el PBS.
3. Agregar 300 µl de buffer de lisis a la placa de cultivo de 60 mm y raspar las
células con una espátula de plástico.
4. Recuperar el lisado celular en un tubo Eppendorf limpio
5. Centrifugar a 14,000 rpm durante 10 min.
6. Recuperar el sobrenadante en un tubo Eppendorf limpio.
32
Biología Molecular
7. Agregar inhibidores de proteasas a 1x (en caso de que el Buffer RIPA no los
tenga).
8. Preparar alícuotas de 50 µl de las proteínas extraídas.
NOTA: es indispensable que después de retirar el medio de cultivo, todos los

procedimientos se realicen en frío (colocar los materiales y reactivos en hielo).
CUESTIONARIO
1. Describe el fundamento de la extracción de proteínas usando Buffer RIPA.

2. ¿Por qué son importantes los inhibidores de proteasas?
3. ¿Cuál es la temperatura óptima de almacenamiento de las proteínas? ¿por
qué?
4. ¿Qué son los inhibidores de fosfatasas? ¿Cuándo se utilizan?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
33
Biología Molecular
PRÁCTICA 11
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN
La cuantificación de la cantidad de proteínas en una muestra es posible en un

espectrofotómetro simple. Existen varios métodos para la determinación de
proteínas, basados en distintas características químicas de las proteínas, que
reaccionarían con un sustrato químico provocando un cambio de color, cuya
densidad óptica puede ser detectada en un espectrofotómetro y la intensidad del
color será proporcional a la cantidad de proteína en la muestra, tomando como
referencia una proteína purificada de la que ya se conoce su concentración. Entre
los métodos más utilizados para la determinación de proteínas se encuentra la
absorción UV (280nm), el método de Lowry, el ensayo de ácido bicinconínico (BCA)
y el método de Bradford.
El método de Bradford se considera una técnica más rápida, simple y más sensible
que el método de Lowry o BCA. Este ensayo se basa en la unión del colorante azul
de Coomassie G250 a la proteína. La cantidad de proteína en una muestra se
determina por la cantidad de colorante azul en su forma iónica a la proteína, lo cual
es medido usualmente determinando la absorbancia del colorante a 595nm.
La concentración de proteínas debe determinarse realizando una curva de al menos
tres puntos de concentración de una proteína de referencia, comparando la
absorbancia del colorante unido a la proteína en cada punto, lo cual deberán
graficarse obteniendo los datos de la ecuación de la recta: y=mx+b y el valor de R2
para medir la precisión o dispersión de la curva.
HABILIDAD
- Aplica técnicas de laboratorio para la determinación de la cantidad de

proteínas en una muestra.
MATERIAL Y EQUIPO
Espectrofotómetro
Computadora portátil
Cubetas para espectrofotómetro
Gradilla para tubos Eppendorf de 0.2 ml (colocada sobre hielo)
Gasas
34
Biología Molecular
 Extracto de proteínas
 Solución de albúmina sérica bovina (10mg/ml)
 Agua desionizada
 Reactivo de Bradford
 Alcohol al 70%
 Hielo
PROCEDIMIENTO
Curva de concentración
IMPORTANTE: toda la preparación de diluciones debe realizarse en frío.

1. Preparar los puntos de concentración de albúmina sérica bovina como se
detalla a continuación:
Concentración BSA Agua Bradford Vol. final
10mg 20 µl 0 µl
8mg 16 µl 4 µl
6mg 12 µl 8 µl 220 µl
200 µl
4mg 8 µl 12 µl
2mg 4 µl 16 µl
0mg (Blanco) 0 µl 20 µl
Problema
2. Calibrar el espectrofotómetro midiendo la densidad óptica del Blanco

3. Medir la densidad óptica de cada punto de concentración
4. Capturar los datos correspondientes a cada tubo en el software Excel y
graficarlos utilizando un gráfico de dispersión.
5. Agregar ecuación lineal, línea de tendencia y valor R en el gráfico.
Determinación de la concentración de proteínas
6. Tomar 2 µl de la muestra problema y colocarlos en un tubo con 18 µl de agua

desionizada, homogenizar.
7. Agregar 200 µl del reactivo de Bradford y medir la absorbancia en el
espectrofotómetro.
35
Biología Molecular
8. Utilizando los valores de la ecuación de la recta obtenida con la curva de
concentración, determinar la concentración de proteínas en la muestra,
considerando que Y=absorbancia de la muestra.
9. Reportar la concentración de proteínas por ml y por µl de muestra.
CUESTIONARIO
1. Describe el fundamento y aplicaciones de los métodos para la determinación

de concentración de proteínas:
 Bradford
 Método del ácido nítrico
 Lowry
 BCA
 Absorción de UV
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
Preparación del reactivo de Bradford:

A. Diluir 50 mg de Azul de Coomassie G250 en 25 ml de etanol al 95%.
B. Mezclar la solución con 50 ml de ácido fosfórico al 85%
C. Aforar a 500 ml con agua destilada.
36
Biología Molecular
PRÁCTICA 12
INTEGRIDAD DE PROTEÍNAS: ELECTROFORESIS VERTICAL (SDS-PAGE)
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son la base química funcional de la célula, compuestas por una
secuencia de aminoácidos única para cada proteína. Una vez sintetizadas, la
mayoría de las proteínas deben ser modificadas post-traduccionalmente en el
retículo endoplasmático o en el Golgi, según su naturaleza, para que puedan ser
funcionales. Estas modificaciones post-traduccionales pueden ser de muchos tipos
e involucran el plegamiento de proteínas por la generación de enlaces peptídicos,
la adición de ácidos grasos (farnesilación, geranilación, sumoilación, etc.), la adición
de carbohidratos (glucosilación), entre otras. Finalmente, algunas proteínas
deberán viajar al Golgi a través del transporte anterógrado en el tráfico vesicular y
posteriormente vía tráfico vesicular ser llevadas al sitio subcelular que le
corresponda o ser secretadas a la matriz extracelular.
La secuencia de aminoácidos y sus modificaciones pos-traduccionales de una

proteína determinarán su peso molecular y sus características químicas, que
pueden ser aprovechadas para poder separarlas en un gel de poliacrilamida. La
concentración del gel de poliacrilamida puede variar en función del tamaño de las
proteínas de interés; entre más concentrado sea el gel los poros serán mucho más
estrechos, lo que permitirá sólo el paso y separación de bajo peso molecular y
viceversa.
HABILIDAD
- Aplica la técnica de electroforesis y tinción en gel para validar la integridad

de proteínas a partir de una muestra biológica.
MATERIAL Y EQUIPO
Cámara para electroforesis vertical

Fuente de poder
Mechero de alta combustión con tripié
Peine para electroforesis (8-10 pozos)
Tubos de 200 µl
Gradilla para tubos Eppendorf de 0.2 ml (colocada sobre hielo)
37
Biología Molecular
Muestra de proteínas
Buffer de corrida
Buffer de muestra
Hielo
Acrilamida/Bisacrilamida 30% (29:1)
TEMED
Persulfato de amonio al 10%
Tris-HCL pH 6.8 y pH 8.8
Agua desionizada
Marcador de peso molecular de proteínas.
PROCEDIMIENTO
Preparación del gel
Preparación de la muestra y carga en el gel.
IMPORTANTE: toda la preparación de diluciones debe llevarse a cabo en frío.
1. De acuerdo con la concentración de proteínas (µg/µl), calcular el volumen

necesario de muestra para cargar 10, 20 y 30 µg de proteínas.
2. Tomar el volumen necesario de muestra y colocarlo en un tubo limpio,
agregar buffer de muestra 4X de tal modo que en la dilución final su
concentración sea 1X.
3. Mezclar muy bien la preparación y colocar los tubos en ebullición durante 5
min.
4. Inmediatamente colocar los tubos en hielo durante 10 minutos.
5. Cuidadosamente cargar las muestras en el gel al 10% montado en la cámara
de electroforesis.
38
Biología Molecular
6. Someter a electroforesis durante 10 min a 80V constantes.
7. Posteriormente aumentar el voltaje a 140V durante 30 min.
8. Desmontar la cámara de electroforesis, extraer el gel.
9. Colocar el gel de poliacrilamida en colorante Azul de Coomasie R-250 al
0.2% por 30 min.
10. Con cuidado, pasar el gel a solución desteñidora (Metanol-Ácido acético).
11. Colocar el gel sobre un acetato, capturar la imagen en un fotodocumentador.
(En caso de no tener acceso al equipo: colocar el gel sobre un acetato y a su
vez sobre una hoja blanca y documentar la presencia de bandas con una
fotografía en un ambiente con suficiente claridad.
Preparación de reactivos
10% SDS
10 g. SDS
H2O 100 ml
Almacenar hasta 6 meses a temperatura ambiente.
10% Persulfato de amonio

0,05 g Ammoniun persulfate
H2O destilada, 0,5 ml.
No almacenar, prepararlo en el momento de usar
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la diferencia entre la electroforesis en condiciones

desnaturalizantes y en condiciones nativas?
2. ¿Qué es y cómo funciona el SDS?
3. Describe los fundamentos de la electroforesis de proteínas.
4. ¿Cuál es el mecanismo de acción del Azul de Coomasie R-250?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
39
Biología Molecular
PRÁCTICA 13
TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli
INTRODUCCIÓN.
La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente
en el medio extracelular. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas
bacterias, aunque la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a
otras. Para que la transformación ocurra, la bacteria tiene que encontrarse en el
llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones
fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y
membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula, de
manera natural el estado de competencia es transitorio y generalmente se debe a
un crecimiento rápido o a falta de nutrientes. En el laboratorio se ha conseguido
poner a punto técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no
lo presentan de forma natural, como es el caso de Escherichia coli.
Estas técnicas se basan en tratamientos químicos o físicos que producen

microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA exógeno
(transformación) de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es la
electroporación, consistente en inducir la competencia mediante la aplicación de un
pulso eléctrico muy breve e intenso. Dicha competencia se puede inducir con
tratamientos químicos utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Hay que tener
en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del cultivo
se hacen competentes dado que cuando el DNA foráneo ingresa a la célula puede
ocurrir que el DNA se degrade o bien se incorpore al cromosoma bacteriano por
recombinación, y si el DNA es un plásmido incluso puede quedar como un elemento
replicativo autónomo dentro de la célula.
HABILIDAD
- Transforma células competentes de Escherichia coli con DNA de un plásmido
que contiene un gen de resistencia a la ampicilina.
MATERIAL Y EQUIPO
Incubadora a 37°C
Microcentrífuga
Baño metabólico a 37°C
Baño metabólico a 42ºC
Mechero
Termómetros
40
Biología Molecular
Tubos Eppendorf estériles

Puntas para micropipetas estériles de volúmenes variables
Dispersadores de vidrio
Vaso de precipitados de 250 ml estéril
Células competentes de Escrerichia coli DH5α

Plásmido (phbAB, 8089 pb y/o pLOI 510, 10000 pb)
Caldo LB estéril
Placas de LB sin antibiótico
Placas de LB con ampicilina (100 µg/ml)
PROCEDIMIENTO
Transformación de E. coli
1. En un tubo Eppendorf de 1.5 ml colocar una relación 2:1:

 50 µl de células competentes
 25 µl de plásmido.
2. En otro tubo Eppendorf de 1.5 ml colocar sólo 50 µl de células competentes.
3. Incubar ambos tubos 30 min en hielo.
4. Dar choque térmico a 42°C durante 45 seg sin pasarse.
5. Incubar durante dos minutos en hielo.
6. Adicionar 450 µl de caldo LB para llevar a un volumen de 500µl.
7. Expresar incubando en baño metabólico a 37°C durante 1 hora con agitación
leve.
8. Plaquear como sigue:
 50 µl de células competentes en una placa de LB sin antibiótico.

 50 µl de células competentes en una placa de LB con ampicilina.
 50 µl de células competentes + plásmido en una placa de LB con
ampicilina.
 50 µl de células competentes + plásmido concentrado.
Obtención del concentrado: después de plaquear 50 µl del cultivo de

expresión (competentes + plásmido), centrifugar a 2500 rpm durante 5 min,
decantar dejando aproximadamente 50 µl de medio para resuspender el paquete
bacteriano.
Para plaquear, se coloca la cantidad señalada y con un dispersador previamente

esterilizado, se dispersan las células haciendo rotaciones de la placa,
aproximadamente 100 veces.
41
Biología Molecular
9. Incubar las placas a 37°C durante 24 horas.

10. Revisar si hay transformantes, analizar los resultados y conservar las placas a
4°C.
CUESTINARIO
1. ¿Qué es un vector de expresión?

2. ¿Cuál es la utilidad de la clonación?
3. Explique concisamente el mecanismo de transformación bacteriana
4. ¿Por qué se usa un antibiótico de selección en el medio de cultivo?
5. Explique cada paso de la transformación bacteriana
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
Dale J.,W., Schantz M.V. 2002. From Genes to Genomes: Concepts and
Applications of DNA Technology. John Wiley & Sons, Ltd.
42
Biología Molecular
PRÁCTICA 14
OBTENCIÓN DE DNA PLASMÍDICO
INTRODUCCIÓN.
Los plásmidos son moléculas de DNA circular, extracromosómico, presente en

bacterias, capaces de llevar a cabo su replicación en forma autónoma y portan uno
o más genes que, por lo general, codifican para proteínas que le confieren
resistencia a los antibióticos, por lo que han sido útiles vehículos en la clonación
molecular. En esta práctica se aislará DNA plasmídico del resto de los componentes
celulares bacterianos por el método de lisis alcalina, donde se rompen las células
mediante un choque alcalino (NaOH) y un detergente (dodecil sulfato de sodio;
SDS) y se precipita el plásmido con etanol. El plásmido que con frecuencia se utiliza
para realizar clonaciones y el que mejor se conoce es el pBR322. Éste fue el primer
plásmido artificial en donde un investigador mexicano, el Dr. Francisco G. Bolívar
Zapata participó en la construcción y se convirtió en una de las primeras
herramientas para la introducción de genes específicos en una bacteria, según lo
requiera el investigador.
El plásmido pBR322 (4,361 pares de bases; pb) contiene un origen de replicación,

así como un gen de resistencia a la ampicilina y uno a tetraciclina, los cuales le
confieren a las bacterias portadoras la capacidad de crecer en medios
bacteriológicos en presencia de dichos antibióticos. El trabajo consistió en introducir
el gen que se quería producir (en este caso, el de la insulina) en el interior del gen
de resistencia a la ampicilina, reemplazándolo, de tal manera que si el gen nuevo
estaba presente, la bacteria perdería la capacidad de crecer en el medio con el
antibiótico y, por lo tanto, señalaría que es portadora del gen de interés. Esto es
llamado “selección negativa”, porque se busca que la colonia de bacterias pierda
una función; en este caso, la de resistir a la ampicilina. Esto permitió separar a las
células que poseen el gen de insulina de las que no lo incorporaron. El plásmido
pBR322 (figura 2) además contiene sitios de restricción (corte) donde se pueden
introducir fragmentos de DNA extraño sin afectar la autorreplicación del mismo, los
fragmentos con longitud de entre 5 y 10 kilopares de bases (1 Kb = 1000 pb) son
clonados en este vector de manera muy eficiente, fragmentos más largos tienden a
ser inestables.
HABILIDAD
- Extrae y purifica DNA plasmídico de Escherichia coli transformada con

pUC12 y/o con pUC que contiene un fragmento de DNA cromosomal
humano.
43
Biología Molecular
MATERIAL Y EQUIPO
Baño metabólico con agitación a 37ºC

Microcentrífuga
Agitador Vortex
Bomba de vacío
Desecador
Micropipetas automáticas de volumen variable (20, 200 y 1000 µl).
Tubos Eppendorf
Gradilla metálica
Guantes de látex
Recipiente con hielo
Papel absorbente
Recipiente para desechos
Tubos de 16x150 estériles
Pipeta Pasteur
BIOLÓGICOS Y REACTIVOS.
Colonias transformantes de Escherichia coli

Caldo 2xYT
Ampicilina de 100 mg/ml
Amortiguador SET (Sacarosa 50mM, Tris-HCl 25 mM pH=8.0, EDTA 10 mM)
Solución de lisis (NaOH 0.2 N, SDS 1%)
Acetato de potasio 5 M
Fenol/Cloroformo amortiguado a pH 8.0
Etanol absoluto
Etanol al 70%
PROCEDIMIENTO
1. Inocular con la cepa de E. coli transformada en un tubo de 16x150 con 2 ml de

caldo 2xYT que contenga 100 µg/ml de ampicilina. Incubar 16-24 h a 37ºC con
agitación.
2. Transferir 1.5 ml a un tubo Eppendorf y centrifugar en una microcentrífuga a
13,000 rpm durante 30 seg. Aspirar con una pipeta Pasteur y adicionar el resto
del cultivo. Centrifugar 30 seg.
3. Resuspender el paquete celular en 100 µl de amortiguador SET. Las células
deben ser completamente resuspendidas.
4. Adicionar 200 µl de solución de lisis (NaOH/SDS). Invertir los tubos 15 veces
para mezclar. Incubar en hielo durante 5 min.
44
Biología Molecular
5. Adicionar 150 µl de acetato de potasio frío 5 M. Invertir los tubos 15 veces para
mezclar. Incubar en hielo durante 5 min.
6. Centrifugar los tubos a 13,000 rpm durante 10 min en frío. Transferir
aproximadamente 400 µl de sobrenadante a un tubo nuevo y descartar el
paquete.
7. Adicionar 300 µl de fenol/cloroformo, mezclar con vortex por 45 seg y centrifugar
a 13,000 rpm durante 3 min. Transferir aproximadamente 400 µl de la fase
acuosa a un tubo nuevo.
8. Adicionar 1 ml de etanol absoluto frío, mezclar suavemente y dejar a temperatura
ambiente durante 10 min.
9. Centrifugar a 13,000 rpm en frío por 10 min. Descartar el etanol, enjuagar el
paquete con 1 ml de etanol al 70% frío, descartar el etanol al 70%. Escurrir bien
los tubos sobre papel higiénico y secar los paquetes durante 12 min al vacío o a
temperatura ambiente.
10. Resuspender el paquete en 30 µl de H2O desionizada estéril. Conservar a –
20ºC.
CUESTIONARIO
1. Explique cómo y por qué se logra separar el DNA plasmídico del DNA
cromosómico durante la lisis alcalina.
2. ¿En qué paso del protocolo se elimina al ARN? ¿Con qué tratamiento
adicional podría eliminar al ARN?
3. ¿Cómo se eliminan los lípidos de la preparación?
4. ¿Por qué se realiza un lavado con etanol al 70%?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
45
Biología Molecular
PRÁCTICA 15
BÚSQUEDA DE PLÁSMIDOS RECOMBINANTES

Y NO RECOMBINANTES
INTRODUCCIÓN.
El descubrimiento de los plásmidos y las enzimas de restricción en las bacterias es

un ejemplo clásico de cómo los hallazgos de una investigación básica pueden
revolucionar una disciplina. Sin el descubrimiento de estas biomoléculas, quizás
nunca se hubieran producido los grandes avances en la comprensión de los
procesos fundamentales de la vida y en el desarrollo de productos que salvan vidas.
Cuando los biólogos clonan un gen para producir insulina humana, crean un
plásmido recombinante que tiene el gen de la insulina humana. Para hacer esto,
usan enzimas de restricción para crear fragmentos de DNA que contienen los
componentes del plásmido, y luego usan ligasa de DNA para unir esos fragmentos
entre sí. Como parte del proceso de clonación de genes, los biólogos deben verificar
que hayan creado el plásmido recombinante que necesitan; es decir, el que tiene el
gen de interés y todos los componentes necesarios para la proteína de interés que
se producirá.
HABILIDAD
- Buscar plásmidos en los que se haya clonado DNA cromosomal humano y

plásmidos que no contengan DNA cromosomal a partir del DNA plasmídico
obtenido de colonias transformantes de Escherichia coli
MATERIAL Y EQUIPO
Baño metabólico a 37ºC

Refrigerador
Cámara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Balanza analítica
Micropipetas automáticas de volumen variable (20 µl).
Tubos Eppendorf
Microespátula
Mechero
46
Biología Molecular
Recipiente de plástico para tinción
Papel parafilm
Papel absorvente
REACTIVOS
Agarosa
Amortiguador de corrimiento de la muestra
Marcador
Enzima de restricción PstI
H2O desionizada
DNA plasmídico
PROCEDIMIENTO
1. Digerir el DNA plasmídico obtenido de las colonias transformantes de

Escherichia coli con PstI como sigue:
Buffer para PstI 2 µl

RNasa (10 mg/ml) 0.2 µl
DNA plasmídico 3 µl
PstI (10U/µl) 0.3 µl
H2O desionizada 14.5 µl
Volumen total 20 µl
2. Incubar a 37°C durante 1:30 h.

3. Hacer la electroforesis en un gel de agarosa al 1% colocando las muestras como
sigue:
Carril 1: Marcador de peso molecular (2 µl de fago λ digerido con HindIII).
Carril 2 en adelante: 5 µl de DNA plasmídico digerido con PstI.
4. Revisar cuantos fragmentos se obtuvieron de cada digestión, calcular su tamaño

utilizando los marcadores de peso molecular.
5. Establecer si los plásmidos obtenidos contienen un fragmento de DNA

cromosomal humano o si no lo contienen. Si lo contienen, calcular el tamaño del
fragmento clonado.
47
Biología Molecular
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué es importante verificar que tienes el plásmido recombinante

correcto?
2. ¿Ves alguna banda que no esperabas? ¿Qué podría explicar el origen de
esas bandas inesperadas?
3. ¿El gel muestra que tu digestión con enzimas de restricción y los
procedimientos de ligación fueron exitosos? Describe la evidencia que usaste
para hacer esta evaluación.
4. Compara los carriles que tienen fragmentos lineales con los carriles que
tienen plásmidos. ¿Hay alguna diferencia en la forma de las bandas entre
estas dos formas de DNA?
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
48

Manual de Prácticas Biología Molecular-2017-QBP-2020

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3. El uso de la bata en el laboratorio es obligatorio y NO se permitirá el acceso

5. Al término de la práctica todo el material de cristalería utilizado debe estar

6. Trabaje en orden, evitando distraer a sus compañeros cuando estén

7. Está prohibido el uso de celulares dentro del laboratorio como medio de

EVALUACIÓN DEL LABORATORIO

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 La evaluación final de la parte práctica tendrá un puntaje máximo de 3.0 (30%

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2. Aspiración: Sumergir la punta de la micropipeta en el líquido, mover el dedo

3. Distribución: Colocar la micropipeta en un ángulo de 10 ° a 45° y pegar la

4. Purga: Esperar una segundos, oprimir firmemente el émbolo hasta el

5. Descanso: Liberar el émbolo de la presión ejercida por el pulgar hasta que

1. Sobre un fragmento de 3x3 cm de papel Parafilm, en la parte baja colocar

1. Etiquetar 3 tubos eppendorf como A, B y C

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