Abstracto

Las nanopartículas biomiméticas mediadas por proteínas debido a la simplicidad

de su síntesis, la adsorción inespecífica moderada, la farmacocinética mejorada y la
biocompatibilidad han recibido una atención creciente recientemente. Sin
embargo, solo se han desarrollado unas pocas proteínas para la síntesis
biomimética. Peor aún, la mayoría de ellos están limitados a usos de función única
en química. La exploración de nuevas proteínas funcionales, especialmente
aquellas con restos dentados múltiples para la química biomimética de funciones
múltiples, sigue siendo un desafío sustancial. Aquí, informamos sobre una proteína
endógena humana, glutatión S-transferasa (GST), con motivos de aminoácidos
favorables, que tiene talentos innatos en la incubación de nanopartículas de oro de
alta calidad sin agregar agentes reductores a temperatura fisiológica, y en
particular, puede anclar más iones de gadolinio sin añadir quelantes
adicionales. Los AuNP paramagnéticos resultantes @ GST Gd exhibe una alta
cristalización y un tamaño uniforme de aprox. 10 nm. En comparación con los
agentes de contraste clínicos (Iopamidol, Magnevist), AuNPs @ GST Gd muestra un
mejor rendimiento de imagen (por ejemplo, mayor relajación y mayor eficiencia de
atenuación de rayos X) con evidencia clara de la simulación de Monte Carlo
yresultados experimentalesin vitro. Másimágenesin vivodemuestran una buena
dirección tumoral y aclaramiento de AuNPs @ GST Gd sin toxicidad sistémica
obvia. Particularmente, baja inmunogenicidad de AuNPs @ GST Gdestá certificado
por la evaluación del estado inmunológico de las células T después de estimuladas
con ellas. Este estudio demuestra por primera vez la manipulación de una proteína
humana para la química biomimética de múltiples funciones en función de sus
motivos de aminoácidos únicos y su incorporación en un agente sintético para
abordar potencialmente algunos problemas críticos en los nanoteranósticos del
cáncer, como la metodología sintética, la biocompatibilidad y la función.
integración, focalización e inmunogenicidad.

Gráficamente abstracto

Demostramos la superioridad de una proteína endógena en la síntesis biomimética

multifuncional del agente AuNPs @ GST Gd de doble modalidad para la obtención
de imágenes mejoradas por tumores.

1 . Introducción
El uso de nanosensas de imágenes moleculares puede aumentar la precisión del
diagnóstico de tumores [ [1] , [2] , [3] , [4] , [5] , [6] ]. Sin embargo, sus procesos de
fabricación, como la descomposición térmica a alta temperatura [ 7 ], los métodos
hidrotermales [ 8 ] y la coprecipitación [ 9], a menudo son complicados, consumen
mucho tiempo y se consideran tóxicos. Además, las partículas resultantes con
dominios hidrófobos suelen causar un efecto de unión inespecífico severo y
posibles problemas de bioseguridad, lo que disminuye la especificidad y limita su
aplicación en el campo biomédico. En los últimos años, la estrategia emergente de
síntesis biomimética mediada por proteínas se ha encontrado robusta,
bioinspirada, ambientalmente benigna y sencilla. Además, las nanopartículas
resultantes están recubiertas por proteínas, que proporcionan un cierto número de
ventajas farmacológicas para los teranósticos del cáncer in vivo , como una
excelente biocompatibilidad, mayor acumulación de tumores, funcionalidad
versátil, capacidad de adsorción inespecífica significativamente reducida
[ [10] , [11] ,[12] , [13] ].
Los logros en la síntesis mediada por proteínas han ganado cada vez más atención
desde que se utilizó albúmina de suero bovino (BSA) para sintetizar nanoclusters
de oro altamente fluorescentes en 2009 [ 14 ]. Otras nanopartículas metálicas con
gran potencial en aplicaciones biomédicas como los puntos cuánticos (QD)
de Ag 2 S fluorescentes en el infrarrojo cercano (NIR) [ 15 ], QD de HgS [ 16 ], CuS
[ 17 , 18 ], MnO 2 [ 19 , 20 ] y Bi 2 S 3 [ 21] fueron sintetizados sucesivamente
mediados por BSA. Además de las nanopartículas fotosensibles anteriores, BSA
preparó nanopartículas paramagnéticas a base de gadolinio de nuestro grupo
como un potente agente de contraste de la reserva de sangre de resonancia
magnética (MR) con alta relajación y ventana de imagen prolongada [ 22 ]. Más
sabiamente, se sintetizaron otras nanoestructuras multifuncionales, como los
nanoclusters híbridos de oro-gadolinio [ 23 ], QD paramagnéticos Ag 2 S @
BSA Gd [ 24 ] y otras estructuras de imagen modal triple [ 25 ]. Además de BSA, sólo
un pequeño grupo de proteínas, como la transferencia [ 26 ], la proteína de
colágeno [ 27 ], la lisozima [ 28], la pepsina [ 29 ] y la insulina [ 30 ] se han
aprovechado para sintetizar nanopartículas, que se resumen en nuestro trabajo de
revisión anterior [ 31 , 32 ]. No se puede negar que los logros alcanzados en este
nuevo campo están ejerciendo efectos positivos sobre la nanomedicina. Sin
embargo, el descubrimiento de nuevas proteínas, especialmente aquellas con
dominios múltiples para la síntesis biomimética de nanoestructuras multimodales,
es muy histerético y siempre se considera un gran desafío en la química
biomimética, que se atribuye principalmente al mecanismo sintético
desconocido. Eso es comprensible, ya que las proteínas generalmente constan de
cientos de aminoácidos y, mientras tanto, poseen estructuras de múltiples capas,
todas las cuales probablemente estén involucradas en el proceso de síntesis.
El efecto de la composición o secuencias de aminoácidos sobre la síntesis
biomimética puede ser relativamente más fácil de estudiar mediante la unión de
aminoácidos potenciales en péptidos cortos. Con base en esta estrategia, algunos
investigadores y nosotros encontramos que la cisteína (C), la tirosina (Y) y el
triptófano (W) pueden incubar nanopartículas de oro. Específicamente, el motivo
de cisteína puede capturar [AuCl 4 ] - por sus grupos SH y además in situ -
reducirlos específicamente en nanoestructuras de oro por el grupo fenólico de
tirosina o triptófano [ 33 , 34 ]. Además, recientemente verificamos que el ácido
aspártico y el ácido glutámico con residuos de grupos carboxilo pueden quelar
Gd 3+ [ 35]. A partir de la evidencia bibliográfica se desprende claramente que la
cisteína (C), la tirosina (Y), el triptófano (W), el ácido aspártico (D) y el ácido
glutámico (E) desempeñan papeles cruciales en la síntesis biomimética de
nanoestructuras. Siguiendo este razonamiento, se han diseñado pequeños
péptidos u oligopéptidos para la síntesis biomimética de nanosondas para
bioimagen, sin embargo, en comparación con las proteínas, existen algunas
limitaciones de los péptidos, como la endógenaidad no humana, la falta de
bioactividad y una eficiencia de reacción relativamente menor [ 36]. Por lo tanto, en
este trabajo, se seleccionó la proteína GST y se encontró con los aminoácidos
mencionados anteriormente (C, Y, W, D y E). Es importante destacar que las cuatro
cisteínas de GST se ubican en el mismo lado, y el ácido aspártico y el ácido
glutámico se distribuyen como vecinos o simplemente separados por uno o dos
aminoácidos en la estructura de la proteína ( Fig. S1 ). Este patrón de distribución
único conduce no solo a la captura de iones, sino también a una mayor química
biomimética. Además, los valores de GST, incluida la endógenaidad, la estructura
esférica y el peso molecular apropiado (23-29 kDa), favorecen la aplicación
biomédica in vivo [ [37] , [38] , [39]], que no está disponible en las otras proteínas
notificadas, como BSA, y oligopéptidos. Con base en estas características, en este
estudio, GST se expresa y se espera que explote su talento en la síntesis
biomimética de nanoprobes bimodales para imágenes biomédicas.
2 . Materiales y métodos
2.1 . Materiales
Se adquirieron trihidrato de cloruro de oro (III) (HAuCl 4 · 4H 2 O) y cloruro de
gadolinio (III) hexahidratado (GdCl 3 · 6H 2 O) de Sigma-Aldrich. El hidróxido de
sodio (NaOH) y el citrato trisódico deshidratado se solicitaron a
Sinopharm. Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos los productos
químicos se utilizaron sin purificación adicional, y se utilizó agua desionizada
(DDIW, resistividad de 18,2 MΩ cm a 25 ° C) durante todo el estudio.
2.2 . Caracterización
El tamaño y la morfología de las AuNPs @ GST Gd sintetizadas se analizaron
mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) en un
instrumento ajem-2100f operado a un voltaje de 200 kV. Los espectros de
difracción de rayos X (XRD) de AuNP (rango 2θ: 10-80 °) se obtuvieron en un
difractómetro de rayos X Rigaku D / MAX-2500 (Rigaku, Tokio, Japón) a una
velocidad de barrido de 5 ° / min. . Las imágenes de microscopía de fuerza atómica
(AFM) se adquirieron en el aire utilizando un AFM multimodo Pico Force (Bruker,
CA) equipado con sustrato de mica. Las mediciones de espectroscopía de
fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizaron en el sistema PHI-5000 CESCA (Perkin
Elmer) con radiación de fuente de rayos X de Al K α (1486,6 eV). El diámetro
hidrodinámico (HD) y el espectro de absorción UV-vis de AuNPs @ GST Gdse
midieron mediante dispersión de luz dinámica (Nano ZS, Malvern) y
espectrofotómetro Cary 50 (Varian), respectivamente. Los espectros de dicroísmo
circular (CD) de GST pura y AuNPs @ GST Gd se obtuvieron mediante un sistema de
espectropolarímetro (BioLogic, MOS-450).
2.3 . Expresión y purificación de GST
Se usó PCR para GST a partir de ADNc usando cebadores para introducir sitios de
restricción Nco I y Xho I que flanquean los codones de inicio y parada normales. El
producto de PCR de doble digestión se ligó en el plásmido PET-28a digerido
con Nco I / Xho I con ADN ligasa de T4 y la mezcla de ligación se usó para
transformar células competentes de Escherichia coli Top10 mediante
procedimientos estándar. Los plásmidos resultantes se verificaron mediante
secuenciación de ADN y luego se usaron para transformar la cepa de expresión E.
coli BL21 (DE3).
Las células de E. coli BL21 (DE3) se transformaron con este plásmido y las células se
cultivaron en medio LB a 37ºC en presencia de 100 mg / ml de ampicilina. Hasta
que se alcanzó una DO600 de 0,8. Para la inducción, se añadió IPTG 1 mM al cultivo
y el cultivo se calentó a 37ºC durante 4 h. Las células recolectadas se
resuspendieron en Tris-Cl 40 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM, glicerol al
10%. Después de la sonicación, el lisado celular se centrifugó a 14.000 g durante 30
min para eliminar los restos celulares. La proteína del sobrenadante se purificó
mediante cromatografía de afinidad usando una columna GST (GE). La filtración en
gel también se realizó en una columna Superose 6 usando agua como fase
móvil. La concentración de proteína se determinó a partir de la absorbancia de la
proteína pura a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 42,860 M − 1 cm.-
1
que se calculó a partir de la composición de aminoácidos de la proteína
utilizando la herramienta Expasy ProtParam.
2.4 . Síntesis biomimética de AuNPs @ GST y AuNCs @ BSA
La síntesis de nanopartículas de oro se llevó a cabo mediante una estrategia de
mineralización biomimética de acuerdo con nuestros informes anteriores
[ 17 , 35 ]. Típicamente, se mezclaron 300 μl de HAuCl 4 · 4H 2 O (25 mM) con 1 mL
de solución de GST (3 mg / mL) con agitación magnética a 37 ° C. Tres minutos
más tarde, se introdujo una solución de NaOH (0,5 M, 128 μL) y el pH se ajustó a
11. Luego, se dejó que la reacción prosiguiera con agitación constante a 37 ° C
durante 5 h. La solución de color rojo vino obtenida se dializó 4 h contra agua
ultrapura para eliminar el exceso de iones seguido de centrifugación (16.000 rpm,
30 min). Al final, la precipitación obtenida se volvió a dispersar en H 2O para un uso
posterior. Las nanoprobes AuNCs @ BSA se sintetizaron de acuerdo con el
protocolo anterior sin ningún cambio [ 14 ].
2.5 . Integración biónica de Gd 3+ con AuNPs @ GST
Se agregaron 160 μL de solución de GdCl 3 · 6H 2 O (19 mg / mL, disuelto en 0.05 M
pH 5.6 de acetato de sodio) a la solución acuosa preparada de 1 mL de AuNPs @
GST (2 mg / mL, disuelto en 0.1 M solución de citrato de sodio). Después, la mezcla
se agitó magnéticamente a 37ºC durante 24 h, seguido de ultrafiltración usando
filtros de 10 kDaMWCO durante al menos tres veces.
2.6 . Medición del tiempo de relajación y estabilidad.
El tiempo de relajación longitudinal (T 1 ) y transversal (T 2 ) de AuNPs @ GST Gd se
midieron con un analizador minispec mq 60NMR de 1,41 T (Bruker, Alemania) a 37
° C. Los valores de relajación ( r 1 y r 2 ) se calcularon ajustando las curvas 1 / T 1 y 1
/ T 2 (s −1 ) frente a la concentración de Gd 3+ (mM). La estabilidad de la relajación se
evaluó controlando el tiempo longitudinal dependiente del tiempo (T 1 ) de AuNPs
@ GST Gd durante todo el período de almacenamiento hasta 7 días.

2.7 . Ensayo de estabilidad coloidal

Las AuNP preparadas con GST Gd se dispersaron en PBS (pH = 7,4, 1x) y medio de
águila modificado de dulbecco (DMEM) que contenía penicilina estreptomicina (PS)
al 1% y suero bovino fetal al 10% (FBS), respectivamente. Luego, las HD
dependientes del tiempo se monitorearon cuidadosamente mediante la medición
de DLS durante todo el período de almacenamiento de hasta 7 días.
2.8 . Evaluación de cultivo celular, citotoxicidad, hemocompatibilidad e
inmunogenicidad
Las células HeLa se cultivaron en DMEM (Hyclone, Invitrogen, EE.UU.) containing1%
de penicilina estreptomicina (PS) y suero bovino fetal al 10% (FBS) en presencia de
5% de CO 2 a 37 ° C. La citotoxicidad potencial in vitro inducida por AuNPs @
GST Gd se evaluó mediante un ensayo estándar de bromuro de 3- (4, 5-
dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT). Típicamente, las células HeLa (1 ×
10 4 / pocillo) se sembraron en dos placas de cultivo celular de 96 pocillos, seguido
por incubación durante la noche (37 ° C, 5% de CO 2 ), permitiendo la unión
celular. Después de enjuagar con PBS (pH = 7,4), AuNPs @ GST Gddispersados en
DMEM a diferentes concentraciones (de 12,5 μg / mL a 200 μg / mL) se agregaron a
los pocillos. A continuación, las células en dos placas se incubaron durante 6 hy 24
h, respectivamente. Se añadió MTT (10 μL, 0,5 mg / mL), incubando con células
durante 4 h más en la oscuridad. Al final, se descartaron los sobrenadantes y se
añadió dimetilsulfóxido (DMSO, 150 µl) a cada pocillo para disolver el formazán
producido. Después de agitar durante 10 min, se midió la absorbancia a 490 nm
(DO 490 ) usando un lector de microplacas basado en monocromador Tecan Infinite
M200. Se aplicó la siguiente fórmula universal para calcular la viabilidad celular:
Viabilidad celular (%) = (valor medio del grupo experimental - valor medio del
grupo de control) / valor medio del grupo de control × 100%.
2.8.1 . Ensayo de hemólisis
La solución de glóbulos rojos (RBC, 2%) se recogió mediante centrifugación a 2000
rpm durante 10 min y se lavó con PBS durante al menos tres veces hasta que el
sobrenadante se volvió transparente. Luego, se mezclaron 300 μL de la suspensión
de RBC con 1,2 mL de AuNPs @ GST Gd a diferentes concentraciones (12,5 μg / mL,
25 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL). Se utilizaron agua desionizada y
PBS como grupo de control positivo y negativo, respectivamente. Después de la
incubación durante 2 h, las mezclas anteriores se centrifugaron a 14.000 rpm
durante 15 min. La absorbancia a 570 nm del sobrenadante obtenido se midió
usando un lector de microplacas basado en monocromador Tecan Infinite M200. La
relación de hemólisis se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Relación de
hemólisis (%) = (Valor medio de A (Muestra, 570 nm) -A(Negativo, 570 nm) ) / (Valor medio de
A (Positivo, 570 nm) -A (Negativo, 570 nm) ).
2.8.2 . Aislamiento de linfocitos del bazo
Se sacrificaron ratones C57BL ∖ 6 y se recogió el bazo. Coloque el bazo en el
colador de células y homogeneice / rompa con la tapa de la jeringa de 1
ml. Agregue de 3 a 5 ml de PBS en un colador de células para facilitar la
homogeneización. Recoger el flujo a través (contiene células) y centrifugar a 1400
rpm durante 7 min. Se resuspendieron las células con 2 mL de tampón de lisis de
glóbulos rojos y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Se agregaron
6 mL de tampón y se volvió a filtrar con un colador celular. A continuación, la
suspensión de células se centrifugó a 1400 rpm durante 7 min. Las células se
resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% a una
concentración de 1 x 106 células / ml.
2.8.3 . Citometría de flujo
Todos los anticuerpos se adquirieron en Biolegend (San Diego, CA). A menos que
se indique lo contrario, la citometría de flujo se realizó con FACS Calibur y los
datos se analizaron con el software FlowJo (Tristar, San Carlos, CA).
2.8.4 . Proliferación
Se agregaron 0.5 mL de solución de tinción CFSE (Thermo) a 0.5 mL de células de
linfocitos del bazo gradualmente, se incubaron las células durante 20 min en un
baño de agua a 37 ° C, luego se agregaron 4 mL de RPMI 1640 frío a las células e
incubar durante 5 min. Se centrifugaron las células durante 5 min a 300 gy se
resuspendieron en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10%. Esas células
se cultivaron con diferente concentración de AuNPs @ GST Gd (0 μg / mL, 10 μg /
mL, 20 μg / mL y 40 μg / mL) en 96 pocillos de placa. Cuarenta y ocho horas más
tarde, se recolectaron las células y se detectaron las proporciones de proliferación
de las células T CD3 + mediante citometría de flujo.
2.8.5 . Detección de apoptosis y muerte celular
Lavar las células dos veces con PBS frío y luego resuspender el tampón de unión a
las células a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. Transferir 100 μL de la
solución y agregar anexina V-PE y 7-AAD. Agite suavemente las células e incube
durante 15 min a temperatura ambiente (25 ° C) en la oscuridad. Agregue 400 μl de
tampón de unión 1 × a cada tubo. Analizar por citometría de flujo en 1 h.
2.8.6 . Activación
Para detectar las actividades de las células T, se utilizaron anticuerpos de control
de isotipo y CD3, CD25 y CD38 y los linfocitos se tiñeron con los anticuerpos
mencionados anteriormente durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
2.8.7 . Tinción de citocinas intracelulares
Para la tinción intracelular de IFN-γ y TNF-α, se incubaron células de linfocitos del
bazo con diferente concentración de AuNPs @ GST Gd (0 μg / mL, 10 μg / mL, 20 μg
/ mL y 40 μg / mL) en 96 pocillos de placa en 0,2 ml de medio RPMI 1640
suplementado con FBS al 10% durante 48 h. Luego, las células se lavaron con PBS,
se tiñeron con anticuerpos de superficie (CD3), se lisaron con solución de lisis FACS
(BD PharMingen) y se permeabilizaron adicionalmente, se tiñeron con los
anticuerpos intracelulares correspondientes (IFN-γ y TNF-α), se fijaron y se
analizaron usando FACS. Software Calibur y FlowJo (Tristar, San Carlos, CA).
2.9 . Establecimiento de modelos animales e imágenes de tumores por TC / RM in
vivo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo
estándar aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la
Universidad de Tongji. Los modelos tumorales se establecieron inyectando
subcutáneamente células Hell (1 x 10 6 ), suspendidas en 80 μL de PBS, en el muslo
derecho de cada ratón Balb / c hembra (cinco semanas de edad, peso
corporal: ca. 23 g).
Para la obtención de imágenes por TC in vivo , primero se anestesió a un ratón con
tumor Hela con hidrato de cloral al 7% (8 μL / g) seguido de una exploración en un
sistema de imágenes clínicas GE Light Speed VCT (EE. UU.). Luego, el ratón fue
inyectado intratumoralmente con AuNPs @ GST Gd dispersado en PBS (dosis: 60
nmol / kg Au, 80 μL). Después de 2 h después de la inyección, se tomó una imagen
de TC utilizando los siguientes parámetros de exploración de TC: voltaje del tubo,
120 kV; campo de visión (FOV), 512 mm; corriente de tubo, 200 mA; grosor de la
rodaja, 2,5 mm; tono, 1: 1; tiempo de rotación del pórtico, 1 s.
La resonancia magnética in vivo se llevó a cabo en un escáner de resonancia
magnética clínica de 3,0 T (Siemens MAGNETOMVerio) con una bobina receptora
para roedores hecha a medida (Chenguang Med Tech, Shanghai, China). Después
de la anestesia mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (dosis: 7%, 8
μL / g ratones), los ratones se colocaron dentro de la bobina y se escanearon antes
y después de la inyección intravenosa de AuNPs @ GST Gd (dosis = 0,08 mmol Gd /
kg ratones) en momentos determinados (2 h, 4 hy 6 h). A continuación, se
adquirieron las imágenes de eco de espín 2D correspondientes utilizando una
secuencia de imágenes con los parámetros establecidos de la siguiente manera:
campo de visión (FOV) = 80 mm × 100 mm, tiempo de repetición (TR) = 620 ms,
tiempo de eco (TE) = 15 ms, rodajas = 6, grosor = 2 mm.

2.10 . Exámenes de sangre e histológicos

Se solicitaron ratones Balb / c hembra sanos (4-5 semanas de edad) a Shanghai
Slac Laboratory Animal Co., Ltd. Después de la inyección intravenosa con AuNPs @
GST Gda una dosis de 20 mg / kg de ratones durante 15 días, los ratones del grupo
de control (sin ningún tratamiento) y del grupo experimental (n = 5 por grupo)
fueron anestesiados. Luego, las muestras de sangre (∼800 μL) se recolectaron para
bioquímica sanguínea y examen completo del panel de sangre en el Shanghai
Model Organisms Center, Inc (SMOC). Simultáneamente, los ratones anestésicos
fueron sacrificados y disecados. Se extrajeron sus órganos principales, incluidos
hígado, corazón, riñón, bazo y pulmón, seguido de la fijación con
paraformaldehído (4%). Luego, los tejidos fijados se deshidrataron, se incluyeron
en parafina, se seccionaron en rodajas en un micrótomo (grosor: 4 μm) y se tiñeron
con hematoxilina y eosina (H&E), de acuerdo con los protocolos de rutina
informados anteriormente. Todas las muestras de biopsia obtenidas se observaron
con un microscopio digital (LeicaQWin).
3 . Resultados y discusión
3.1 . Síntesis biomimética multifunción y caracterizaciones de AuNPs @ GST Gd
AuNPs paramagnéticos @ GST Gd se sintetizó mediante una ruta fácil bioinspirada
por GST, como se demuestra en el Esquema 1 . Las secuencias genéticas y de
aminoácidos de GST se muestran en la Fig. S2 y la Fig. S3 , respectivamente. Según
los análisis de SDS-PAGE, la GST expresada es homogénea con un peso molecular
de ~ 29 kDa ( Fig. S4 ).

En una síntesis típica de AuNPs @ GST Gd , se agregaron iones [AuCl 4 ] - a la

solución de proteína GST a 37 ° C, después de lo cual los iones [AuCl 4 ] - pueden
ser capturados por los grupos tiol ( SH) de la cisteína, en para formar
intermedios de tiolatos de Au bidentados [ 14 ]. Después de agitar durante 3 min,
el valor de pH de la solución se ajustó a ∼ 11 con NaOH 0,5 M, proporcionando un
ambiente alcalino para iniciar la reducción de [AuCl 4 ] - a AuNPs a través del grupo
fenólico de tirosina y triptófano. El mecanismo de reacción detallado se discutió en
la literatura [ 14 , 34, 36 , 40 ]. Posteriormente, se introdujeron
3+
iones paramagnéticos Gd en la solución resultante de AuNPs @ GST para
quelación mediante el fuerte efecto de anclaje del ácido aspártico y el ácido
glutámico con grupos carboxilo libres en GST.
Se investigaron las principales propiedades fisicoquímicas de AuNPs @
GST Gd . Según las imágenes HRTEM ( Fig. 1 A y B) y los patrones de difracción de
electrones de área seleccionada (SAED) ( Fig. 1 C), se puede ver que los AuNP
biomiméticos son altamente policristalinos y de tamaño uniforme. La observación
HRTEM a diferentes aumentos revela que las AuNP obtenidas presentan una
morfología esférica y no agregada con un diámetro uniforme de aprox. 10 nm. El
recuadro de la Fig. 1 B muestra que los AuNP tienen una alta cristalinidad y sus
redes se observan claramente. El espaciado de las franjas se mide en 0,233 nm, que
está cerca del plano (111) de la estructura cúbica centrada en la cara (fcc) de oro
(0,235 nm). Un patrón SAED típico de AuNPs @ GST (La Fig. 1 C) muestra
claramente los anillos (111), (200), (220), (311) y (222), lo que indica además la
estructura cristalina fcc de AuNPs @ GST. La Fig. 1 D muestra los patrones XRD de
AuNPs @ GST, haciendo eco del resultado de SAED. El pico ancho a 2θ = 24,6 ° son
los dominios cristalinos que forman la secuencia y las conformaciones de los
aminoácidos de la proteína GST. Los picos de difracción a 2θ = 38,184 °, 44,142 °,
46,347 °, 77,547 ° y 81,771 ° están de acuerdo con los planos cristalinos (111), (200),
(220), (311) y (222) de AuNP. (fcc), respectivamente (tarjeta JCPDS NO: 04-0784). La
Fig. 1 E proporciona una imagen AFM de AuNPs @ GST Gd . La altura observada
determinada por AFM linescan es de 10 a 12 nm, que es similar al tamaño medido
por TEM.
Para optimizar las condiciones de reacción, se investigaron algunos parámetros
clave de síntesis, como la relación molar de GST / [AuCl 4 ] - precursores, el valor de
pH y el tiempo de reacción. En primer lugar, en una [AuCl fijo 4 ] - concentración de
precursor (25 mM, 300! L), mediante la variación de las concentraciones de GST a
partir de 7,0 mg / ml a 1,0 mg / ml, se encuentra que AuNPs pueden obtenerse en
este intervalo de concentración, pero AuNP agregados formados en el caso de 1.0
mg / mL de GST ( Fig. S5A ). El estado de agregación se refleja en el pico de
absorción ampliado a 530 nm ( Fig. S5B ). Indica que demasiado [AuCl 4 ] -son
difíciles de unir por una cantidad tan pequeña de proteína GST, lo que resulta
fácilmente en agregación. Al aumentar la concentración de GST a 3,0 mg / ml, se
obtuvo una solución rojo vino ópticamente transparente estable con un pico de
absorción característico a 517 nm ( Figs. S5C y S5D ), lo que indica la formación de
AuNP uniformes. Si aumentamos aún más la concentración de GST a 7,0 mg / ml,
la solución se vuelve casi incolora y el pico de absorción se vuelve plano ( Figs. S5E
y S5F ). Curiosamente, esta muestra emite fluorescencia azul verdosa a 472 nm
bajo una excitación ultravioleta por una lámpara de 365 nm ( Fig. S6). Indica que en
la alta concentración de GST se formaron nanoclusters de Au fluorescentes en su
lugar. Desafortunadamente, la longitud de onda de emisión corta (472 nm) y el
bajo rendimiento cuántico dificultan sus futuras aplicaciones in vivo . En este
estudio, por lo tanto, la muestra preparada en 3.0 mg / mL de GST fue
seleccionada para una investigación adicional.
La adición de NaOH se considera fundamental para la síntesis de AuNP, ya que la
capacidad de reducción de tirosina y triptófano puede mejorarse en gran medida
solo cuando el pH de la reacción es superior al pKa (∼10) de sí mismo [ 14 ]. De lo
contrario, ninguna de las AuNP se forma como resultado de la falta de un proceso
de reducción, incluso la reacción se prolonga hasta 5 h ( Fig. S7 ). Además, el
tiempo de reacción óptimo se determinó a las 5 h mediante el seguimiento del
espectro de absorción ultravioleta-visible (UV-vis Abs) dependiente del
tiempo. Como se muestra en la Fig. S8 , la absorción máxima de plasmón de AuNP
a 517 nm se presenta discreta al comienzo de la reacción (10 min) y se vuelve
aguda a medida que se extiende el tiempo de reacción. Después de 5 h, el pico se
mantiene sin cambios, lo que indica que la reacción tiende a terminar.
Para tener una idea intuitiva de la formación de AuNP, se realizaron observaciones
TEM de las muestras en las etapas iniciales de reacción (10 min y 20 min),
respectivamente. Puede verse que se formó una gran cantidad de semillas de sol
de oro al comienzo de la reacción (10 min) ( Fig. S9 ). Y, curiosamente, estas
semillas masivas desaparecieron y en su lugar se formaron diferentes dimensiones
de AuNP, pero con baja cristalinidad. Al final, el tamaño de los AuNP se ve
relativamente uniforme y sus cristalinidades mejoran significativamente ( Fig.
1 B). Este hallazgo se hace eco de la línea de tendencia del espectro UV-Abs de las
muestras de AuNP en cada punto de tiempo de reacción ( Fig. S8 ).

Se realizaron análisis del sistema diferencial electrónico (EDS) y de espectroscopía

de fotoelectrones de rayos X (XPS) para confirmar la composición y el estado
químico detallado de la nanoestructura formada. Un espectro EDS típico en la Fig.
1 F confirma claramente la existencia de elementos Au y Gd en AuNPs @
GST Gd . Un estudio del espectro XPS en la Fig. 1 G muestra claramente picos
distintivos de Au, Gd y O de AuNPs @ GST Gd . En detalle, los dos picos de energía
de enlace fuerte a 87,7 eV y 84,0 eV se pueden asignar a Au 4f 5/2 y Au 4f 7/2,
respectivamente ( Fig.1 H), que son consistentes con Au en estado de oxidación
cero (Au 0 ) [ 41 ], que indica el [AuCl 4 ] -se redujeron con éxito en solución de
proteína GST. Los espectros de Gd 4d dan un pico a 142,45 eV, correspondiente al
estado de quelación de Gd 3+ por los grupos carboxilo en GST ( Fig. 1 I).
La existencia de proteínas GST en AuNPs @ GST Gd se muestra en la Fig. 2 A. La
imagen de TEM de tinción negativa revela que las AuNP están estabilizadas por
una capa compacta de GST. De la ilustración generada del modelo GST por el
software PyMOL ( Fig.2 B), se puede ver que las cuatro cisteína (C) están en un lado
en la estructura de GST, lo que favorece la unión de Au S, la formación de
semillas de oro y mayor crecimiento de cristales. Además, el ácido aspártico (D) y el
ácido glutámico (E) con residuos carboxilo terminales se distribuyen como vecinos
o simplemente separados por uno o dos aminoácidos, lo que conduce a
la quelación de iones Gd 3+ ( Fig. S3). Beneficiado de la protección de la proteína
GST, los AuNP resultantes tienen una buena estabilidad coloidal sin agregados ni
siquiera almacenados durante un mes. El diámetro hidrodinámico efectivo (HD) de
AuNPs @ GST Gd medido por dispersión dinámica de luz (DLS) es ∼23 nm (PDI:
0.135), mayor que el determinado por TEM (∼10 nm) principalmente debido a la
encapsulación de la superficie exterior de GST proteínas ( Fig. 2 C). El potencial zeta
se mide en −10,2 mV. Además, comparamos los espectros de CD de GST para
examinar el cambio de estructura secundaria antes y después del proceso químico
biomimético. Como puede verse en la Fig.2D, los dos picos negativos a 212 nm y
233 nm revelan su estructura de alta hélice alfa de GST en estado intacto. Sin
embargo, se encuentra que el pico a 212 nm se desplaza hacia el azul a 206,5 nm, y
el pico a 223 nm se vuelve evidente tras la participación de la reacción, lo que
sugiere un aumento de las estructuras espirales aleatorias en la proteína GST. Este
cambio en la estructura secundaria se debe principalmente a la fuerte condición
alcalina (pH = ∼11). De hecho, en el campo de la síntesis biomimética de
nanopartículas, la actividad proteica remanente intacta sigue siendo un gran
desafío, ya que la adición de hidróxido de sodio (NaOH) suele ser necesaria (pH =
11-12). En los últimos años, nuestro grupo hizo todo lo posible por ofrecer
estrategias para abordar este problema. Por ejemplo, Au (III) se puede prerreducir a
Au (I), reduciendo sus cargas, y seguido de incubación con proteína en ausencia de
NaOH, o podemos buscar proteínas que puedan resistir a una alcalinidad fuerte
para la síntesis de nanopartículas. En este estudio, la proteína GST desempeñó
múltiples funciones de estabilizador, reductor y quelante en el proceso de síntesis
química. Como GST es una proteína endógena humana y la formación de
nanopartículasin situ en el GST, en nuestra opinión, este proceso químico se puede
llamar síntesis biomimética, en lugar de una biomineralización real. Vale la pena
señalar que este cambio en la estructura es beneficioso para controlar la síntesis de
nanopartículas en algunos casos [ 42 ].
3.2 . Estudio in vitro de propiedades de imágenes de TC / RM de AuNPs @ GST Gd
El Au, como una especie de elemento de alto número atómico (Z), tiene un gran
coeficiente de absorción de rayos X, que puede servir como agente de contraste
para imágenes de TC. Para demostrar la capacidad de obtención de imágenes por
TC de AuNPs @ GST, el agente de contraste comercial a base de yodo (Iopamidol)
y AuNCs @ BSA (una nanopartícula de oro mucho más pequeña con un núcleo de
Au de ∼1,5 nm y un potencial zeta de −13,2 mV preparado por BSA- estrategia
biomimética mediada [ 14 ], y sus principales propiedades fisicoquímicas se
muestran en las Figs. S10-S13 ) se seleccionaron para la comparación. Fig. 3A y B
muestran una mejor mejora de las imágenes de TC de AuNPs @ GST, en
comparación con las de Iopamidol o AuNCs @ BSA usados clínicamente. Como era
de esperar, todas las imágenes fantasma de los agentes aumentan de brillo al
aumentar la concentración de Au o I. Es bastante fácil de entender que el número
atómico de Au (79) es mayor que el de I (53), lo que produce una mayor X-
coeficiente de absorción de rayos a nanopartículas de Au.
En cuanto a una comparación entre AuNPs @ GST y AuNCs @ BSA, ambos
fabricados por proteínas con componente de Au pero con diferentes tamaños,
simulamos las propiedades de atenuación de AuNCs @ BSA y AuNPs @ GST
midiendo la fluencia de fotones antes y después de que pasaron los rayos X a
través de la vesícula de modelado a través de simulaciones de Monte Carlo
basadas en el trabajo previo de nuestro grupo [ 43]. Las propiedades de
atenuación de rayos X más altas fueron representativas de mejores propiedades de
imágenes de TC para mostrar la fluencia de fotones más baja en las simulaciones
de Monte Carlo. La fluencia total de fotones emitidos para AuNCs @ BSA y AuNPs
@ GST cayó mucho más (P <0.05) que el control (agua pura sin Au) por debajo del
nivel de fluencia incidente, con la mayor disminución de ∼16 para AuNPs de ∼10
nm @ GST. La relación de mejora de la atenuación, definida como la relación de la
fluencia de los fotones emitidos en comparación con la fluencia incidente, muestra
una fuerte sensibilidad a los tamaños de AuNP. Encontramos que las AuNP de ~ 10
nm @ GST exhibieron una mayor atenuación de la fluencia de fotones que la de
AuNC de ~ 1,5 nm @ BSA ( Fig. 3 D y E).
La Fig. 3 F – I muestra la superioridad en relaxividad de AuNPs @ GST Gd sobre el
magnevista comercial (Gd-DTPA). La química para paramagnetizar AuNPs @ GST
también es simple simplemente agregando Gd 3+ a la solución de AuNPs @ GST
con agitación magnética durante varias horas a 37 ° C. Hasta donde sabemos, es la
primera vez que se aprovechan los motivos de aminoácidos de una proteína para
la unión de Gd 3+ . Para optimizar la relajación, se preparó una cierta cantidad de
AuNPs @ GST con diferentes cantidades de GdCl 3 • 6H 2 O añadidas (2 mg, 4 mg y
6 mg). La concentración final de Gd 3+ de cada muestra se determinó mediante
espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). El
longitudinal (T 1) Y transversal (T 2 de relajación) veces de cada muestra se midieron
en un analizador de 1,41 T RMN a 37 ° C. En la figura 3 F y G se muestran
los valores de relax r 1 y r 2 calculados de tres muestras . En este estudio,
los valores r 1 de AuNPs @ GST Gd son casi 2-3 veces mayores que los del
magnevista comercial (r 1 = 3,64 mM −1 s −1 ). Esta mejora de la relajación se
atribuye principalmente al aumento del tiempo de correlación rotacional
[ 44 , 45 ]. La muestra de 4 mg es particularmente digna de mención ya que
presenta una relajación de r 1 mejorada aún más de 6,83 mM-1 s -1 a 9,57 mM -1 s -
1
en comparación con la muestra de 2 mg, debido al aumento de la quelación
de Gd 3+ con proteínas GST. Sin embargo, se encontró una relajación
de r 1 ligeramente disminuida en la muestra de 6 mg, que puede ser causada por
Gd 3+ inservible , por lo tanto, reduciendo la pendiente de la curva ajustada entre
la concentración de Gd 3+ (mM) y 1 / T 1 (s −1 ). En consecuencia, se eligió la muestra
de 4 mg (r 1 = 9,57 mM −1 s −1 ) para la siguiente aplicación biomédica. En
particular, la relativa baja r 2 / r 1valor (1.27) favorece AuNPs @ GST Gd como
T 1 agente de contraste de RM-ponderada [ 46 ].
Además in vitro RM de AuNPs @ GST Gd y Magnevist con diferentes
Gd 3+ concentraciones de 0,06 mM a 1,0 mM fueron realizados, y el resultado se
muestra en la Fig. 3 H. Mediante el uso de T 1 -ponderada de espín-eco secuencias,
se Se encuentra que la señal se intensifica gradualmente con el aumento de
la concentración de Gd 3+ . Este patrón de mejora es consistente con
la característica de contraste T 1 de AuNPs @ GST Gd . El resultado también revela
que AuNPs @ GST Gd exhibe señales de T 1 mejoradas más fuertes que Magnevist
en el mismo Gd 3+concentración. La intensidad de la señal de MR correspondiente
de AuNPs @ GST Gd es aproximadamente 2 veces la de Magnevist ( Fig. 3 I). De
acuerdo con los resultados anteriores, se indica que AuNPs @ GST Gd pueden
actuar como un altamente eficiente T 1 agente -Mejora MR contraste para
imágenes biomédicas.
3.3 . Estudio de estabilidad coloidal de AuNPs @ GST Gd
La estabilidad coloidal de AuNPs @ GST Gd se investigó antes de las aplicaciones
biomédicas. Como se muestra en la Fig. 4 A y B, AuNPs @ GST Gd presenta patrones
de espectro de absorción de HD y UV-vis casi similares, en comparación con los de
AuNPs @ GST sin quelación de Gd 3+ . Sin embargo, sus tiempos de relajación (T 1 y
T 2 ) se acortan significativamente ( Fig. 4 C). Indica que los iones Gd 3+ se anclaron
con éxito en la proteína GST pero sin efectos secundarios sobre el tamaño de
partícula y la absorbancia. HD dependientes del tiempo de AuNPs @ GST Gdse
registraron después de la co-incubación con PBS (1x, pH = 7,4) y DMEM que
contenía FBS al 10% y al 1% (PS), respectivamente. Como se muestra en la Fig. 4 D
y E, después de 7 días de incubación, la HD se encuentra casi constante. No se
observa ningún precipitado evidente. El potencial zeta de AuNPs @ GST Gd en H 2 O
y DMEM se presenta estable sin fluctuaciones obvias ( Fig. S14 ). Estos resultados
indican la excelente estabilidad coloidal de AuNPs @ GST Gd tanto en PBS como en
DMEM. Esto se atribuye principalmente al recubrimiento compacto de
biomacromolécula (GST) en las AuNP, que imparte una buena solubilidad en agua
a las nanopartículas y previene la agregación.

Además, los tiempos de relajación (T 1 , T 2 ) de AuNPs @ GST Gd se controlaron

continuamente durante un período de 7 días. Como se muestra en la Fig.4 F, los
r 1 yr 2 / r 1 calculados permanecen casi sin cambios, lo que sugiere que no hay
fugas del Gd 3+ anclado de AuNPs @ GST Gd y la excelente estabilidad de AuNPs @
GST Gd desde otro punto de vista . Esta alta estabilidad podría atribuirse a la
distribución adecuada de ácido aspártico y ácido glutámico en GST, lo que permite
bloquear firmemente los iones Gd 3+ ( Fig.2B) y la buena capacidad amortiguadora
de la proteína GST evitando la agregación de las nanopartículas.
3.4 . Estudio de citotoxicidad y hemólisis de AuNPs @ GST Gd
Para investigar la biocompatibilidad de las AuNPs @ GST Gd preparadas , se realizó
el ensayo colorimétrico basado en metil tiazoliltetrazolio (MTT) incubando AuNPs
@ GST Gd con células Hela a diferentes concentraciones (0-200 μg / mL). Como se
ve en la Fig. 5 A, las viabilidades de las células Hela están por encima del 90% (6 h)
y el 87% (24 h), lo que indica la buena biocompatibilidad celular de AuNPs @
GST Gd en el rango de concentración investigado. Además, la compatibilidad de la
sangre se investigó incubando la solución de glóbulos rojos (2%) con AuNPs @
GST Gd en un rango de concentración de 0 a 200 μg / mL. Puede verse en la Fig.5 B
que no se encuentra ningún color rojo obvio en cada AuNPs @ GSTMuestra de Gd ,
mientras que el grupo positivo (H 2 O) presenta un importante color rojo debido a
la hemoglobina disuelta en el agua. Las proporciones de hemólisis
correspondientes de AuNPs @ GST Gd a concentraciones variables se calculan en
0,09%, 0,54%, 0,1%, 0,3% y 1,4%, respectivamente, lo que es mucho más bajo que
el 5% que es el estándar de seguridad clínica [ 47 ]. . Esta buena
biocompatibilidad se atribuye principalmente a la química verde biomimética y los
materiales no tóxicos o no tóxicos utilizados en este trabajo.

3.5 . Estudio de imágenes biomédicas in vivo de AuNPs @ GST Gd

Con un alto número atómico (Z = 79) y un gran coeficiente de atenuación de rayos
X, los AuNP tienen un gran potencial en imágenes de contraste mejoradas por
rayos X o tomografía computarizada (TC) con menos interferencia ósea y tisular,
logrando así un mejor contraste con dosis de rayos X más bajas. [ 48 , 49 ]. En este
estudio, se llevaron a cabo imágenes de TC in vivo en ratones
desnudos portadores de tumores mediante inyección intratumoral de AuNPs @
GST Gd (60 nmol / kg Au, 80 μL). Como se muestra en la Fig. 6A , el tumor muestra
una mejora significativa de la señal después de la inyección en comparación con la
preinyección. El valor de CT del sitio del tumor aumenta a 188 HU desde 60 HU
( Fig.6B), lo que sugiere que estas AuNPs @ GST Gd bioinspiradas pueden ser un
agente de contraste de TC calificado para la obtención de imágenes de cáncer. Las
imágenes mediante inyección intravenosa se realizarán en un futuro próximo.
Ha habido pocas mejoras fundamentales en los agentes de contraste clínicos de
rayos X o TC en más de dos décadas y la química del iohexol o análogos usados
clínicamente no ha cambiado. Los agentes moleculares yodados pequeños son
estables en sus estructuras moleculares, pero deficientes en potenciación,
especificidad y tiempo de retención en el torrente sanguíneo. Estas barreras
restringen significativamente sus aplicaciones en imágenes y angiografías
específicas de objetivos. Por lo tanto, existe una gran necesidad de buscar agentes
de contraste biocompatibles con una gran ventana de tiempo de obtención de
imágenes y una alta sensibilidad y especificidad. AuNP recubiertas de proteína de
tamaño nanométrico @ GST Gd con capacidad de prolongar el tiempo de
circulación in vivo, que permite una mayor probabilidad de alcanzar el área
objetivo y supera algunas limitaciones importantes de los agentes a base de yodo,
podría ser un candidato prometedor para resolver los problemas críticos
anteriores.
Posteriormente, se realizó la obtención de imágenes por RM in vivo en ratones
desnudos portadores de tumores en un escáner de RM de 3,0 T clínico. Las
imágenes de RM antes y después de la inyección intravenosa de AuNPs @
GST Gd se muestran en la Fig. 6 C (dosis: 0,08 mmol Gd / kg de peso
corporal). Aparentemente, el tumor sigue una tendencia de mejora de la imagen
dependiente del tiempo, y la intensidad de la señal de RM alcanza el máximo
después de 2 h de inyección, lo que indica una acumulación máxima de AuNPs @
GST Gd en el tumor a través del efecto EPR [ 50 , 51 ]. Además, se encuentra que
tanto el hígado como el riñón presentan una mejora evidente del contraste, lo que
sugiere la captura de AuNPs @ GST Gdpor macrófagos en el hígado y la posibilidad
de filtración renal de AuNPs @ GST Gd en los riñones.
Vale la pena señalar que las cortezas renales se visualizan claramente en la
resonancia magnética mediante AuNPs @ GST Gd . Evidentemente, AuNPs @
GST Gd está bien filtrado por los riñones; por tanto, pueden servir como un agente
ideal para investigar las enfermedades renales. Generalmente, según los estudios
sobre la biodistribución dependiente del tamaño de nanopartículas para la
acumulación renal, las nanopartículas con un diámetro inferior a 20 nm se
encontraron fácilmente en los riñones [ 26 , 52 , 53 ]. Recientemente, un estudio
muestra que la eficacia del aclaramiento renal aumentó exponencialmente en la
fase de eliminación temprana con una disminución de la densidad de partículas
[ 54 ]. En este estudio, AuNP recubiertos con GST @ GST Gdes de alrededor de 20
nm en HD y particularmente blando con una capa externa de baja densidad,
posiblemente favoreciendo el aclaramiento renal.
El análisis cuantitativo de la Fig. 6 D proporciona además las intensidades medias
de la señal de RM en el hígado, el riñón y el tumor, que se incrementan en 1,55, 1,4
y 1,3 veces, después de la inyección intravenosa de AuNPs @
GST Gd respectivamente. Después de la obtención de imágenes biomédicas, los
ratones fueron anestesiados y disecados, y se llevó a cabo un estudio de
biodistribución. De acuerdo con los resultados de ICP-MS en la Fig. 6 E, tanto los
elementos Au como Gd se encuentran en los principales órganos y tumores,
especialmente en los órganos del sistema retículo endotelial (RES), lo que está muy
de acuerdo con los resultados de la RM. En particular, los elementos Au y Gd tienen
patrones de biodistribución similares en los órganos principales y el
tumor. Además, verifica la buena estabilidad estructural de AuNPs @ GST Gd in vivo,
que es fundamental para la obtención de imágenes bimodales.
3.6 . Estudio de inmunogenicidad de AuNPs @ GST Gd
La inmunogenicidad de los agentes de formación de imágenes es siempre un
motivo de preocupación en las aplicaciones biomédicas. La inmunogenicidad de
los agentes desarrollados debe ser lo más baja posible a menos que se utilicen
para inmunoterapia. En este estudio, se incubaron AuNPs @ GST Gd con células de
bazo de linfocitos, y evaluamos su inmunogenicidad mediante el ensayo una serie
de indicadores, tales como la proliferación, la apoptosis, la activación y la
producción de citoquinas de células T . Como se muestra en las figuras 7A-B y 7 F-
G, en comparación con el grupo de control, no hay diferencias significativas en la
proliferación (0,253%, 0,291% y 0,309%) y apoptosis (1,40%, 1,55%, 1,62%) de
células T cuando son estimuladas por AuNPs @ GST Gden las concentraciones de
prueba (10 μg / mL, 20 μg / mL y 40 μg / mL). Los niveles de secreción de IFN-γ y
TNF-α (dos marcadores típicos de inmunidad celular) no exhiben elevación
aparente del control no tratado a la concentración de 10 μg / mL y 20 μg / mL
(valor de P <0.05). El grupo de 40 μg / mL presenta un leve aumento que otros
grupos, lo que se atribuye al efecto de la concentración ([Au] = 40 μg / mL, 40.000
células). Pero los niveles de está muy por debajo del 1%, lo que es difícil de
inducir inmunogenicidad in vivo ( Fig. 7 C y H). Para determinar aún más si el
tratamiento con AuNPs @ GST Gd podría facilitar la activación de las células T, se
evaluó el estado de maduración de las células T usando citometría de flujo
mediante la tinción conjunta de sus marcadores de maduración (CD38 y
CD25). Como se muestra enFig. 7D-E y 7I-7 J, muestra que AuNPs @ GST Gd no
tiene un efecto significativo sobre la promoción de la maduración de las células T
en comparación con los grupos no tratados. Todos estos datos sugieren que las
células T difícilmente pueden ser activadas por AuNPs @ GST Gd en
concentraciones que van desde 10 μg / mL a 40 μg / mL. La baja inmunogenicidad
de las AuNPs @ GST Gd preparadas puede atribuirse a la naturaleza endógena de la
proteína GST y al proceso químico suave, que puede ocultar las partículas para que
no sean reconocidas por las células o el sistema inmunológico.
3.7 . Evaluaciones histológicas in vivo y estudio bioquímico sanguíneo de AuNPs @
GST Gd
Se realizaron bioquímica sanguínea, análisis de sangre de rutina y evaluaciones
histológicas para evaluar la potencial toxicidad in vivo de AuNPs @ GST Gd . 15 días
después de la inyección intravenosa de AuNPs @ GST Gd (20 mg / kg), se
recolectaron las muestras de sangre y los órganos principales (corazón, hígado,
bazo, pulmón y riñón), respectivamente. Como se ve en los resultados de la
bioquímica sanguínea en la Fig.8 A – D, tanto los marcadores de función hepática,
como AST, ALP, ALT, ALB y la relación A / G, como el marcador de función renal
(BUN) de ratones tratados con AuNPs @ Las GST Gd son normales en comparación
con las del grupo de control (ratones sanos no tratados). En los análisis de sangre
de rutina, índices principales, incluidos WBC, RBC, HGB, PLT, HCT, MCV, MCH, y
MCHC, y no hay una diferencia significativa en comparación con el grupo de
control, lo que indica que AuNPs @ GST Gd no indujo efectos secundarios obvios en
los ratones tratados ( Fig. 8 E – L).
Análisis H & E-tinción presenta en la Fig. 8 M revela que no hay anormalidades
notables, o inflamación o lesión del tejido después de la exposición a AuNPs @
GST Gd en comparación con el grupo control, lo que sugiere AuNPs @ GST Gd es
biocompatible y se puede aplicar para in vivo experimentos con animales . La
evidencia colectiva de la citotoxicidad in vitro y el estudio histológico in vivo y el
análisis de sangre sugieren que AuNPs @ GST Gd es poco tóxico. Esta buena
biocompatibilidad se atribuye principalmente a la ruta de síntesis verde, materias
primas seguras y protección de la proteína GST.
4. Conclusion
En resumen, hemos demostrado la superioridad de una proteína endógena en
la síntesis biomimética multifunción del agente AuNPs @ GST Gd dual-modal sin
utilizar agentes reductores o quelantes y el buen rendimiento de imagen
con contraste de la nanoestructura resultante en tumores portadores de tumores.
ratones. Esta síntesis se encuentra bioinspirada, ambientalmente benigna y
sencilla. Bajo una condición de reacción suave, los AuNP altamente cristalizados,
uniformes y estables se sintetizan con una nanoestructura bien definida. La
nucleación y el crecimiento cristalino de las AuNP en la solución de proteína GST
se encuentran rápidos y las AuNP resultantes están bien protegidas por la proteína
GST. Particularmente, los motivos de aminoácidos afines a Gd 3+en GST todavía
muestran una fuerte capacidad de quelación después de la formación de
AuNP. Esta delicada nanoarquitectura de AuNPs @ GST Gd fue analizada mediante
una serie de caracterizaciones físicas y químicas . Además, la obtención de
imágenes biomédicas in vivo muestra una buena capacidad de direccionamiento
selectivo de tumores de AuNPs @ GST Gd . Gracias a esta estrategia de síntesis
biomimética, no se encuentra ninguna toxicidad
o inmunogenicidad obvia . Aunque el mecanismo operativo intrínseco de GST en la
síntesis no se comprende bien, la estrategia sintética propuesta manifiesta una
realidad viable mientras, al mismo tiempo, podría ser de gran relevancia para
inspirar otras proteínas funcionales para la síntesis biomimética para teranósticos.