La cristalografía de rayos X (o difracción de rayos X) utiliza los cristales de las proteínas, que se

bombardean con un haz fino de rayos X (FIGURA 18-33). La radiación que es dispersada
(difractada) por los electrones de los átomos de la proteína golpea un detector sensible a los
electrones colocado detrás del cristal. El patrón de difracción producido por un cristal está
determinado por la estructura dentro de la proteína; la gran cantidad de moléculas en el cristal
refuerza los reflejos, haciendo que se comporte como si fuera una molécula gigante. Las
posiciones e intensidades de los reflejos, como las de la placa fotográfica de la figura 2.33,
pueden relacionarse matemáticamente con las densidades de los electrones dentro de la
proteína, porque son los electrones de los átomos los que los produjeron. La resolución
obtenida por la difracción de rayos X depende del número de puntos que se analizan.

La mioglobina fue la primera proteína cuya estructura se determinó por difracción de rayos X.
La proteína se analizó sucesivamente a 6, 2 y 1.4 À, con años transcurridos entre cada
determinación completa. Teniendo en cuenta que los enlaces covalentes tienen una longitud
de entre 1 y 1.5 À y los enlaces no covalentes de entre 2.8 y 4 A , la información recopilada para
una proteína depende de la resolución obtenida. Esto se ilustra mediante una comparación de
la densidad electrónica de una molécula orgánica pequeña en cuatro niveles de resolución
(FIGURA 18-34). En la mioglobina, una resolución de 6 A fue suficiente para mostrar la manera
en que se pliega la cadena polipeptídica y la ubicación del resto hemo, pero no fue suficiente
para mostrar la estructura dentro de la cadena. A una resolución de 2 À, los grupos de átomos
podrían estar separados unos de otros, mientras que a 1.4 Á, se determinaron las posiciones
de los átomos individuales. Hasta la fecha, las estructuras de varios cientos de proteínas se han
determinado con una resolución atómica <1.2 A y unas pocas tan bajas como 0,66 A.

A lo largo de los años, la tecnología de difracción de rayos X ha mejorado muche. Max Perutz
tardó 22 años en resolver la estructura de la hemoglobina (figura 2.406), una tarea que hoy
podría llevar algunas semanas. En la mayoría de los estudios actuales: 1) los sincrotrones
generan haz de rayos X intensos y altamente enfocados (consúltese la página 96), que son
aceleradores de partículas de alta energía que producen rayos X como producto secundario, y
2) los detectores electrónicos altamente Sensibles (dispositivos de carga acoplados a CCD) que
proporciona una lectura digital de los datos de difracción han reemplazado las placas
fotográficas. El uso de sus instrumentos en conjunto con las computadoras cada vez más
potentes permiten a los investigadores recopilar y analizar datos suficientes para determinar la
estructura terciaria de la mayoría de las proteínas en cuestión de horas. Como resultado de
estos avances, la cristalografía de rayos X se ha aplicado al análisis de las estructuras
moleculares cada vez más grandes. Probablemente, esto se ilustra mejor por el éxito alcanzado
en la determinación de la estructura del ribosoma, que se analiza en el capítulo 11. En la
mayoría de los casos, como ocurrió en el estudio del ribosoma, el mayor desafío en este campo
es obtener cristales utilizables.
La cristalografía de rayos X es ideal para determinar la estructura de las proteínas solubles que
se prestan a la cristalización, pero puede ser un gran desafío para el estudio de las estructuras
complejas de varias unidades, como los ribosomas o los proteasomas, o para las proteínas de
la membrana, donde es difícil obtener los cristales tridimensionales requeridos para el análisis.
El análisis estructural de estos tipos de muestras a menudo se realiza utilizando una técnica
alternativa que aprovecha el tremendo poder de resolución del microscopio electrónico y las
técnicas de procesamiento de imágenes basadas en la computadora.

Hay dos enfoques generales para el estudio de partículas individuales con el microscopio
electrónico. En un enfoque, las partículas se colocan en una rejilla del microscopio electrónico,
se tiñen negativamente y luego se secan al aire (como se explica en la página 705). En el
enfoque alternativo, que se conoce como crio-microscopía electrónica o crio-EM, las partículas
se colocan en una rejilla en un estado hidratado y se congelan de forma rápida en nitrógeno
líquido sin fijarse ni teñirse (FIGURA 18-35). Para estudios de mayor resolución, el uso de
muestras teñidas negativamente ha sido reemplazado en gran medida por partículas
congeladas e hidratadas, que tienen muchas menos probabilidades de generar artefactos y son
mucho más adecuadas para el estudio de las características internas dentro de la estructura de
la partícula. En cualquier caso, las rejillas se colocan en la columna del microscopio y se toman
fotografías de las partículas. Cada fotografía es una imagen bidimensional de una partícula
individual en la orientación en que se supone descansaba en la cuadricula. Cuando las
imágenes bidimensionales de decenas de miles de especímenes diferentes en cada orientación
concebible se promedian mediante análisis computarizados de alta potencia, se puede generar
una reconstrucción tridimensional de la partícula a una resolución de -10 . En esta resolución,
los investigadores pueden rastrear la cadena polipeptídica de una proteína e incluso identificar
la ubicación de las cadenas laterales de los aminoácidos voluminosos.
Un modelo de un ribosoma eucariótico basado en crio-EM se ilustra en la figura 2.57, un
modelo de una vesícula recubierta de clatrina en la figura 8.40c, y un modelo de una partícula
snRNP U1 en la figura 11.31. Esta técnica, conocida como reconstrucción de partícula única,
también es útil para capturar imágenes de una estructura, como un ribosoma, en diferentes
etapas durante un Proceso dinámico, como la etapa de elongación en la síntesis de las
proteínas. Utilizando este enfoque, se han revelado varios de los principales cambios
conformacionales que se producen durante cada paso de la traducción.

Además, las estructuras de resolución atómica determinadas por la cristalografía de rayos X

pueden ajustarse en las reconstrucciones microscópicas electrónicas de resolución más baja
para mostrar cómo interactúan las moléculas individuales que forman un complejo de
múltiples subunidades y cómo pueden funcionar juntas para llevar a cabo una actividad
particular. La FIGURA 18-36 muestra la estructura terciaria de un filamento compuesto de
actina y ADF (un miembro de la familia de las cofilinas, sección 9.13). Las estructuras de las dos
proteínas se determinaron mediante estudios cristalográficos de rayos X separados y luego se
ajustaron a un modelo microscópico electrónico de un filamento de actina-ADF. La
reconstrucción mostrada en esta figura sirvió como base para un mecanismo propuesto por el
cual las proteínas de la familia de las cofilinas pueden inducir el corte y la despolimerización de
un filamento de actina (sección 9.10).
El análisis microscópico electrónico de muestras congeladas también se puede utilizar en el
estudio de las proteínas de la membrana, como el receptor nicotínico de acetilcolina (consulte-
se la vía experimental para el capítulo 4). Este tipo de análisis requiere que las proteínas de la
membrana estén empaquetadas a temperaturas muy bajas (por ejemplo, -195 °C) en matrices
cristalinas bidimensionales dentro del plano de la membrana. Esta técnica ofrece una ventaja
sobre los estudios cristalográficos de rayos X de las proteínas de la membrana, ya que estas
permanecen durante todo el proceso dentro de su propia membrana natural en lugar de ser
extraídas mediante detergente y cristalizada en un entorno no membranoso. Las estructuras
ilustradas en la sección 4.12 se determinaron a partir de las imágenes combinadas, de alta
resolución, con microscopía electrónica de muchas moléculas de proteínas diferentes tomadas
en varios ángulos con respecto al haz de electrones. Esta técnica es conocida como
cristalografía electrónica.

Sólo en los últimos años, el desarrollo de un nuevo hardware de detección de electrones y de

software de procesamiento de imagen ha dado lugar a la resolución de las estructuras de nivel
casi atómico utilizando crio-EM. Con el avance continuo de la tecnología y la preparación de las
muestras, los investigadores predicen que la técnica crio-EM pronto